CN111087377B - 苯并异色满醌类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苯并异色满醌类化合物及其制备方法和应用。本发明发现苯并异色满醌类化合物对金黄色葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、白色念珠菌都具有很强的抑制作用，表明苯并异色满醌类化合物有广谱和显著的抗菌活性，具有良好的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
传染病仍是人口死亡的主要因素之一，新的病原菌不断产生，多重耐药菌的出现和传播更已成为一个严重的威胁，不断发现新的抗生素是阻止抗生素危机的唯一途径。对已知抗生素进行结构修饰或对其生物合成途径进行改造，获得成药性更好的抗生素是发展新抗生素的有效方法。
榴菌素（Granaticin）放线菌产生的次级代谢产物，是苯并异色满醌（benzoisochromanequinone，BIQ）类抗生素的重要成员，具有抗菌、抗肿瘤等多种生物活性，是最具临床应用潜力的BIQ类化合物。榴菌素能够抑制革兰氏阳性细菌，但对革兰氏阴性细菌和真菌没有抑菌活性。研究表明，榴菌素通过干扰tRNALeu氨酰化过程，即抑制亮氨酰tRNA合成酶（Leucyl-tRNA synthetase），使细胞蛋白质和RNA 合成受阻，从而抑制革兰氏阳性细菌的生长（Ogilvie, et al. Inhibition of leucyl-transfer ribonucleic-acidsynthetase in Bacillus subtilis by granaticin. Biochemical Journal, 1975,152: 511-515）。
粤蓝链霉菌（Streptomyces vietnamensis）GIMV4.0001是榴菌素的产生菌，通过编辑改造榴菌素的生物合成基因簇，可能获得活性得到提高的类似物。粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株，是通过敲除粤蓝链霉菌GIMV4000.1中的糖基转移酶基因gra-orf14构建而得到，已在此前的专利申请材料中公开（一种糖基转移酶及其应用，申请号 : CN201811493804.4）。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid，其结构式如式（1）所示：
式（1）。
本发明的第二个目的是提供式（1）所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述的化合物是从粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物中制备得到。
优选，具体步骤如下：
制备粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏；
浸膏经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷：甲醇按体积比100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:1、80:20、70:30、 50:50、0:100比例进行梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇＝96:4（v/v）的洗脱馏分，将此馏分经纯化后得到式（1）化合物。
所述的纯化是通过HPLC纯化。
所述的制备粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物，优选是将活化的粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株接入YEME液体培养基中，28℃，180 rpm，培养2 d制得种子液，将种子液以体积比4％的接种量接入到高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 rpm，振荡培养2-7 d，更优选为3 d，而制得发酵培养物。
本发明通过抗菌活性测试，发现化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid对耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 43300、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）GDMCC 1.932、白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）分别为0.5、0.5、2、2 μg/mL，榴菌素对上述供试菌株的MIC分别为0.0625、0.0625、0.5、>128（无活性）μg/mL，阳性对照药物万古霉素（Vancomycin）对上述供试菌株的MIC分别为1、1、1、>128（无活性）μg/mL，阳性对照药物制霉菌素（Nystatin）对上述供试菌株的MIC分别为>128（无活性）、>128（无活性）、>128（无活性）、2 μg/mL。实验结果表明，化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid具有广谱和显著的抗菌活性，与榴菌素相比增加了抗真菌活性，其抗真菌活性与对照药物制霉菌素相当，抗革兰氏阳性细菌活性与对照药物万古霉素接近。因此，化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid可用于制备广谱抗菌药物。
本发明的第三个目的是提供化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物优选为抗白色念珠菌、金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌的药物。
优选，所述的抗金黄色葡萄球菌药物是抗耐药金黄色葡萄球菌药物
本发明的化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid具有非常好的抗菌效果，因此可以用于制备广谱的抗菌药物，具有广阔的应用前景。
本发明涉及的粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis) GIMV4.0001，于2005年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号：CCTCC NO：M 205143，该菌株公开于专利CN 200610034149.7中。
附图说明
图1为式（1）化合物的高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)
图2 为式（1）化合物的1H-NMR谱
图3为式（1）化合物的13C-NMR谱
图4为式（1）化合物的实验ECD谱以及两种立体构型的理论计算ECD谱。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid的制备和结构鉴定
化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid是从粤蓝链霉菌（Streptomyces vietnamensis）糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株代谢产物中分离纯化得到。
将活化的粤蓝链霉菌gra-orf14敲除突变株接入YEME液体培养基（酵母提取物3g、蛋白胨5 g、麦芽提取物3 g、葡萄糖10 g，补水至1 L，pH 7.2，121℃灭菌20 min后加入2.5 mol/L MgCl2 2 mL，灭菌即得）中，28℃，180rpm，培养2 d制得种子液，将种子液以体积比4％的接种量接入到高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g 、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4 0.01 g，补水至1L，pH 7.2，121℃灭菌20 min）中，28℃，120rpm，振荡培养4 d，而制得发酵培养物。将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏，10 L发酵培养物可提取浸膏约6 g。浸膏经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇按体积比100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:1、80:20、70:30、 50:50、0:100比例进行梯度洗脱，经TLC薄层层析，合并主斑点相同的流分，共得到11个粗组分Fr.1-Fr.11。收集二氯甲烷-甲醇按体积比96:4洗脱的组分Fr.3进行反相制备液相进行层析，色谱柱为Welch ultimate XB-C18, 21.2 × 250 mm, 10 µm，流动相为甲醇-0.1%甲酸水， 25%-100%，0-40 min，流速为13 mL/min，在此条件下分离，获得6个组分Fr.3.1- Fr.3.6。将组分Fr.3.5（保留时间38 min）进行进一步的半制备，使用AgilentZORBAX Stable Bond 80Å 苯基柱（9.4 × 250 mm, 5 µm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水，50%-100%，0-40 min，流速为2 mL/min，收集保留时间在28 min的洗脱组分，得到式（1）所示的化合物（80 mg）。
综合利用高分辨率质谱、核磁共振、电子圆二色谱、旋光测定等分析测试方法，来解析式（1）所示化合物的结构。1H-NMR、13C-NMR核磁共振谱图用Bruker Advance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标，Acetone-d6作为溶解化合物的氘代试剂；质谱用Thermo Q Exactive Focus型质谱仪测定；电子圆二色谱使用Chirascan圆二色谱仪测定，旋光用MCP500旋光仪测定。式（1）化合物的高分辨率质谱图、1H-NMR、13C-NMR核磁共振谱图分别见图1、图2、图3。
式（1）化合物为红色固体，根据HR-ESI-MS m/z 317.0661 [M-H]-，计算值为317.0667，确定式（1）化合物的分子式为C16H14O7，不饱和度为10；核磁共振数据表明有16个C以及至少13个H存在（表1），与质谱数据一致，进一步比对分析发现与化合物DHK-OH的数据高度吻合，由此确定了确定 了式（1）化合物的平面结构。为确定C3、C15两个手性碳原子的立体构型，测定了式（1）化合物旋光值[ɑ]25 D=-274.6°(c=0.0015, CH3OH)，与DHK-OH旋光相反（[ɑ]25 D=+81.5°(c=0.40, CH3OH)）；进一步测定了式（1）化合物的ECD，并通过理论计算两种不同构型的ECD曲线，发现构型I的ECD曲线与实测测线具有较好的吻合度（图4）。因此，确定了该化合物的立体结构如式（1），其为2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid。
式（1）。
表1 式（1）化合物1H (600 MHz)、13C (150 MHz) 核磁数据（δ in ppm，Acetone-d6）
实施例2：
化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid最低抑菌浓度（MIC）的测试
采用微量稀释法测定式（1）化合物对耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 43300、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）GDMCC 1.932和白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231的最低抑菌浓度（MIC）。
用甲醇溶解式（1）化合物、榴菌素、万古霉素或制霉菌素，使其浓度在2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313 μg/mL。
细菌使用MH肉汤培养基，将对数生长期的菌液，调整浊度到0.5麦氏比浊标准，约含1-2×108 CFU/mL，将此菌液用培养基稀释1000倍，使终浓度含菌1-2×105 CFU/mL，即为上样菌悬液。将190 µL上样菌悬液(1-2×105 CFU/ml)分别加入 96 孔板中，再加入10 µL不同浓度的待测药品，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 μg/mL，37 °C 培养 24 h 后，肉眼观察，以浓度最低的澄清孔为最低抑菌浓度。以不加药物组（10 μL甲醇）为空白对照，实验重复 3次。
白色念珠菌使用马铃薯葡萄糖液体培养基，将对数生长期的菌液，调整浊度到0.5麦氏比浊标准，约含1-5×106 CFU/mL，将此菌液用培养基稀释1000倍，使终浓度含菌1-5×103 CFU/ml。将190 µL 稀释后的白色念珠菌的菌悬液（1-5×103 CFU/mL）分别加入 96 孔板中，再加入10 µL 不同浓度的待测药品，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL，37 °C 培养 48 h 后，肉眼观察，以浓度最低的澄清孔为最低抑菌浓度。以不加药物组（10 μL甲醇）为空白对照，实验重复 3次。
结果表明（表2），式（1）化合物对耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 43300、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）GDMCC 1.932和白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.5、0.5、2、2μg/mL，榴菌素对上述供试菌株的MIC分别为0.0625、0.0625、0.5、>128（无活性）μg/mL，阳性对照药物万古霉素（Vancomycin）对上述供试菌株的MIC分别为1、1、1、>128（无活性）μg/mL，阳性对照药物制霉菌素（Nystatin）对上述供试菌株的MIC分别为>128（无活性）、>128（无活性）、>128（无活性）、2 μg/mL。这说明，化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid（式（1）所示的化合物）具有广谱和显著的抗菌活性，与榴菌素相比增加了抗真菌活性，其抗真菌活性与对照药物制霉菌素相当，抗革兰氏阳性细菌活性与对照药物万古霉素接近。因此，化合物2-((1S,3R)-6,9-dihydroxy-1-methyl-5,10-dioxo-3,4,5,10-tetrahydro-1H-benzo[g]isochromen-3-yl)acetic acid可用于制备广谱抗菌药物。
表2 式（1）化合物、榴菌素与阳性药物MIC值比较
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种如式(1)所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述的式(1)所示的化合物是从粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物中制备得到；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
制备粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏；
浸膏经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷：甲醇按体积比100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:1、80:20、70:30、50:50、0:100比例进行梯度洗脱，收集二氯甲烷：甲醇＝96:4v/v的洗脱馏分，将此馏分经纯化后得到的式(1)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的纯化是通过HPLC纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的制备粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株的发酵培养物，是将活化的粤蓝链霉菌糖基转移酶基因gra-orf14敲除突变株接入YEME液体培养基中，28℃，180rpm，培养2d制得种子液，将种子液以体积比4％的接种量接入到高氏一号液体培养基中，28℃，180rpm，振荡培养2-7d，而制得发酵培养物。
5.如式(1)所示的化合物在制备抗菌药物中的应用；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗白色念珠菌、金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗金黄色葡萄球菌药物是抗耐药金黄色葡萄球菌药物。
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