CN111019804B - 核酸扩增装置、系统以及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种核酸扩增装置、系统以及方法，涉及核酸扩增技术领域，包括：芯片本体，芯片本体具有至少两个温区；芯片本体的内部开设有至少一条主通道，主通道包括至少两个通道段，每个温区内对应至少一个通道段，位于相邻温区的通道段处于芯片本体的不同层面；介电泳电极，介电泳电极与相邻通道段的交界位置对应设置。在上述技术方案中，核酸由一个温区位移至另一温区的过程中，各温区的反应液流动模式保持不变，仅核酸出现位移，而并不是操纵含有核酸的反应液在不同温区发生位移，因此可以显著提升核酸的升降温速率，整体耗时会明显缩短。该过程中温度操控直接针对目的DNA片段本身，所以温控效率可以大大提升，提高核酸扩增的反应速率。

Description

核酸扩增装置、系统以及方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，尤其是涉及一种核酸扩增装置、系统以及方法。

背景技术

对于核酸扩增来说，目前聚合酶链式反应(PCR)是最常用的核酸扩增方法，它以目的DNA序列为模板，利用针对目的DNA序列而设计的特异性引物，在耐热的DNA聚合酶的作用下，目的DNA序列经过多个“高温变性-低温复性-升温延伸”的循环后数量呈指数增加，从而实现快速扩增目的基因的目的。但是，现有技术中核酸扩增的反应速率较低，因此容易引起副产物的产生并导致扩增特异性降低或失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸扩增装置、系统以及方法，以解决现有技术中核酸扩增反应速率低的技术问题。

本发明提供的一种微流控芯片，包括：

芯片本体，所述芯片本体具有至少两个温区；

所述芯片本体的内部开设有至少一条主通道，所述主通道包括至少两个通道段，每个所述温区内对应至少一个所述通道段，位于相邻所述温区的所述通道段处于所述芯片本体的不同层面；

介电泳电极，所述介电泳电极与相邻所述通道段的交界位置对应设置。

进一步的，所述微流控芯片还包括：

至少一个控温通道，至少一个所述控温通道与至少一个所述主通道连通。

进一步的，所述控温通道内设置有至少一个缓冲腔。

进一步的，所述微流控芯片还包括：

至少一个加热器和至少一个温度传感器，所述温度传感器与所述加热器数据连接；

所述加热器与所述缓冲腔对应设置，所述温度传感器与所述通道段对应设置。

进一步的，位于不同层面的相邻所述通道段的部分通道端部沿层向重叠且连通，构成所述交界位置。

进一步的，所述微流控芯片还包括：

至少一个微阀，所述微阀设置在所述主通道的进口和/或出口。

进一步的，所述主通道的数量为多个，多个所述主通道相互平行。

进一步的，所述温区包括第一温区、第二温区和第三温区，所述主通道包括第一通道段、第二通道段和第三通道段；

所述第一通道段位于所述第一温区，所述第二通道段位于所述第二温区，所述第三通道段位于所述第三温区。

本发明还提供了一种核酸扩增装置，包括至少一个往复式动力源以及所述微流控芯片；

所述往复式动力源设置在所述主通道的进口和/或出口。

本发明还提供了一种核酸扩增方法，基于所述微流控芯片，或者所述核酸扩增装置，步骤如下：

利用所述介电泳电极产生的介电泳力，驱动反应液内含有的核酸在所述交界位置转移到相邻所述通道段，使反应液内的核酸在相邻温区内转移。

在上述技术方案中，核酸由一个温区位移至另一温区的过程中，各温区的反应液流动模式保持不变，仅核酸出现位移，而并不是操纵含有核酸的反应液在不同温区发生位移，因此可以显著提升核酸的升降温速率，整体耗时会明显缩短。因为该过程中温度操控直接针对目的DNA片段本身，所以温控效率可以大大提升，提高核酸扩增的反应速率。不仅如此，使用简单易行的往复流动控制代替繁琐的循环温控程序，成本也得到降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例提供的芯片本体的通道结构示意图；

图2为本发明一个实施例提供的主通道的通道段爆炸示意图；

图3为本发明一个实施例提供的主通道的立体图；

图4为本发明一个实施例提供的主通道的平面图；

图5为本发明一个实施例提供的交界位置的立体图；

图6为本发明一个实施例提供的交界位置的平面图；

图7为本发明一个实施例提供的介电泳电极的装配图。

附图标记：

1、芯片本体；2、温区；

3、主通道；4、介电泳电极；

5、控温通道；6、缓冲腔；

21、第一温区；22、第二温区；

23、第三温区；

31、通道段；32、交界位置；

33、第一通道段；34、第二通道段；

35、第三通道段。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

经过对PCR技术的原理进行分析和研究可知，PCR技术的核心在于温控，即对反应体系中的液体的温度实现连续快速且精确的控制。理论上，PCR过程的温控是针对目的DNA片段，即操控核酸的温度。但是，现有PCR方法均是利用加热/散热模块控制目的DNA片所处的反应液的温度，间接改变目的DNA片段的温度。而反应液的体积远大于目的DNA片段的体积(相比超过10⁵倍)，这种通过控制反应液整体温度而间接调控DNA片段温度的方式低效且费时。

例如，当前针对反应液整体控温的方法，升温速率一般为3-5℃/s，降温速率为2-3℃/s，则浪费在升温(55-72℃，72-94℃)和降温(94-55℃)过程的时间相当于单个循环时间的1/3，这样严重影响了反应速率，也容易引起副产物的产生并导致扩增特异性降低或失败。

因此，本申请提供了一种能够直接控制核酸温度的控温方法，进而从根本上提高核酸扩增的反应速率。

如图1至图7所示，本实施例提供的一种微流控芯片，包括：

芯片本体1，所述芯片本体1具有至少两个温区2；

所述芯片本体1的内部开设有至少一条主通道3，所述主通道3包括至少两个通道段31，每个所述温区2内对应至少一个所述通道段31，位于相邻所述温区2的所述通道段31处于所述芯片本体1的不同层面；

介电泳电极4，所述介电泳电极4与相邻所述通道段31的交界位置32对应设置。

需要说明的是，层流是与湍流相对应的流体流动状态，是指流体的层状流动。层流状态的流体流线能够与管壁相互平行。在雷诺数(与流体的流速、密度和管径正比，与粘度反比)小于3000时，层流状态就会出现。层流状态中，当几相不同颜色的流体从不同的入口进入同一个微通道时，即使它们互溶，也会形成层次分明的多相平行流动。而微通道因为通道尺寸和流体流速的限制，流体一般呈现层流的流动状态。

该微流控芯片利用了流体在微通道内的层流效果进行控温，参考图1和图2可知，该微流控芯片的通道采用分层且分段的结构，即微流控芯片的内部开设有主通道3，主通道3通过多个通道段31构成，主通道3在布置上使每个所述温区2与至少一个通道段31相互对应。

因此，含有核酸的反应液灌注在主通道3中，可以采用往复式动力源对反应液进行驱动，使反应液分别在主通道3的每段通道段31中以层流的方式往复流动，所以可以保证不同温区2的反应液温度之间不会有严重的干扰。而在相邻温区2的交界处，也即相邻通道段31的交界位置32，设置用于核酸操控的介电泳电极4，通过介电泳电极4形成的介电泳电场可以使得在交界处受到介电泳作用的核酸由一个温区2位移至另一温区2，进而实现目的DNA片段的迅速高效的温度切换，此时只有目的DNA片段自身的温度发生变化。

需要说明的是，在该核酸由一个温区2位移至另一温区2的过程中，各温区2的反应液流动模式保持不变，仅核酸出现位移，而并不是操纵含有核酸的反应液在不同温区2发生位移，因此可以显著提升核酸的升降温速率，整体耗时会明显缩短。在此过程中，可以利用外设的往复式动力源配合控制反应液往复连续地流动，实现目的DNA片段的迅速高效的温度操控，并完成核酸的扩增。因为该过程中温度操控直接针对目的DNA片段本身，所以温控效率可以大大提升，提高核酸扩增的反应速率。不仅如此，使用简单易行的往复流动控制代替繁琐的循环温控程序，成本也得到降低。

其中，所述介电泳电极4构成的介电泳为双频交流介电泳。在操控核酸时，由于核酸(尤其是DNA片段)体积极小，并且核酸的介电常数差异较小，这两个因素均对介电泳方式要求很高，所以采用介电泳电极4构成双频交流介电泳，可以提高对核酸操控的灵敏度，保证核酸的位移更为精准。另外，往复式动力源是指为芯片中液体提供往复式动力的机构，如往复电磁泵、往复柱塞泵、往复压电泵、往复隔膜泵等。液体进入通道后，往复式动力源会根据需求提供周期变化的压力(推力)和吸力(拉力)，使其在通道中周期性地前进和后退，从而实现往复式运动。而温区2的数量和主通道3的数量可以根据需求来设定，例如，温区2可以设置为三个，主通道3的通道段31设置为三段，即在一个温区2内对应有一段通道段31。

在一个实施方式中，所述温区2包括第一温区21、第二温区22和第三温区23，所述主通道3包括第一通道段33、第二通道段34和第三通道段35；所述第一通道段33位于所述第一温区21，所述第二通道段34位于所述第二温区22，所述第三通道段35位于所述第三温区23。在第一温区21、第二温区22和第三温区23中温度分别设置为低温区2、中温区2和高温区2，低温区2、中温区2和高温区2的具体温度范围可以根据需求设置，因此，可以操控反应液中的核酸在低温区2、中温区2和高温区2中往复位移，对核酸的温度进行精准且快速的操控。

而对每个温区2进行温度控制时，可以在对应温区2的位置预埋加热元件，例如加热电极，通过加热元件对主通道3周围进行加热，从而控制位于主通道3内的反应液和核酸的温度。本领域技术人员可以根据需求设置具体的加热元件类型和数量，在此便不再赘述。

在一个实施方式中，所述微流控芯片还包括：至少一个控温通道5，至少一个所述控温通道5与至少一个所述主通道3连通。继续参考图1所示，此时不同温区2中的通道段31均连通有用于控制主通道3内反应液保持恒温的控温通道5。与之配合的，还可以在所述控温通道5内设置至少一个缓冲腔6。为了在微流控芯片中构建彼此独立的温区2，所述微流控芯片内还可以设置至少一个加热器和至少一个温度传感器。

所述加热器(例如加热电极)可以与所述缓冲腔6对应设置，也可以与温控通道的其他部分对应设置，进而加热缓冲腔6内的反应液或直接加热温控通道其他部位的反应液。所述温度传感器可以与相应的所述通道段31对应设置，以实时监测各通道段31的温度。其中所述温度传感器与所述加热器可以采用预埋的方式安装在微流控芯片的内部，也可以使用外部热源(如加热板)对温区进行接触式加热，且所述温度传感器与所述加热器或相配合的外部热源数据连接。本领域技术人员可以根据需求采用任意的加热方式，在此不做限定。

例如，在缓冲腔6底部预埋加热电极可以加热流经缓冲腔6的反应液，此时缓冲腔6通过温控通道与主通道3相连通。温度传感器实时监测主通道3内的温度，当主通道3中的温度不满足需求时，可以通过调整加热电极的加热功率，改变缓冲腔6中反应液的温度，间接地改变温控通道中的温度，最终调整主通道3中的温度。

设立缓冲腔6的目的是为了增加温控通道中反应液温度的稳定性，因为该扩增方法使用了多个独立的恒温区2，而非在独立腔室内循环升降温，降低各温区2温度波动是控温的关键，此时大体积、大惯性的缓冲腔6便可以起到明显的控温效果。当然，本领域技术人员也可以选择直接对控温通道5的其他部位加热，或者采用其他的方式对控温通道5进行加热，在此不作限定。

如图3至图6所示，位于不同层面的相邻所述通道段31的部分通道端部沿层向重叠且连通，构成所述交界位置32。在该结构中，相邻通道段31的交界位置32是通过相邻通道段31的端部层叠构成的，此时交界位置32的通道结构均与相邻通道段31的通道内部相互连贯，且在层向上形成明显的层叠结构，该明显的层叠结构可以使流体在微通道内保持稳定的层流效果，从而避免不同温区2的反应液温度之间形成相互干扰。

其中，所述微流控芯片还包括：至少一个微阀，所述微阀设置在所述主通道3的进口和/或出口。该微阀可以用来控制主通道3的进口或出口开启或关闭，从而配合核酸扩增的顺利进行，以及便于后续的产物回收。

继续参考图1所示，所述主通道3的数量为多个，多个所述主通道3相互平行。此时，由于各个主通道3相连的进口和出口可以互相独立，因此能够实现不同样本的多路并行扩增。而具体的主通道3数量可以根据需求进行设定，在此不做赘述。优选的，所述控温通道5与所述主通道3之间呈120°夹角。

在利用该微流控芯片进行核酸扩增时，可以先加样和预热，即首先开启往复式动力源，向各主通道3或指定的主通道3内加入5微升石蜡油，控温通道5加入5N(N为并行主通道3数量)微升石蜡油，排走多余空气。再向各主通道3加入20微升反应液，控温通道5加入20N(N为并行主通道3数量)微升反应液，排走多余空气。然后向各通道加入5微升石蜡油，控温通道5加入5N(N为并行主通道3数量)微升石蜡油，排走多余空气。封闭微流控芯片进口和出口，将反应液控制在入口位置。此时开启加热，至各温区2温度稳定后，将核酸操控至高温区2停留预热所需时间。

石蜡油被加到主通道3中并放置在反应液的两端，其主要作用是防止反应液中出现大量气泡、挥发并引起液体损耗。同时在主通道3中有多个不同样本同时进行扩增时，也能将不同反应液隔开以避免相邻反应液间的彼此干扰。

接着进行核酸的扩增，即连通介电泳电极4，操控核酸在高温区2、低温区2、中温区2来回停留对应时间，重复操作直至到达扩增所需的循环次数。

最后进行产物回收，即操控核酸至低温区2，停留冷却所需时间后关闭加热电极，待反应物冷却至室温后开启微流控芯片的出口，回收产物或进入后端集成通道进行后续实验。

本发明还提供了一种核酸扩增装置，包括至少一个往复式动力源以及所述微流控芯片；所述往复式动力源设置在所述主通道3的进口和/或出口。由于所述微流控芯片的具体结构、功能原理以及技术效果均在前文详述，在此便不再赘述。任何有关于所述微流控芯片的技术内容均可参考前文的记载。

本发明还提供了一种核酸扩增方法，基于所述微流控芯片，或者所述核酸扩增装置，步骤如下：利用所述介电泳电极4产生的介电泳力，驱动反应液内含有的核酸在所述交界位置32转移到相邻所述通道段31，使反应液内的核酸在相邻温区2内转移。而为了对所述核酸扩增方法的技术方案进行清楚的描述，现通过如下具体实施例来说明。

实施例1单靶标单液滴的小鼠看家基因GAPDH扩增

本实施例所用的芯片结构参数如下：进口、主通道3和出口为总分总结构，进口和出口尺寸为500μm×500μm×2mm(宽×高×长)，主通道3尺寸为100μm×500μm×6mm(宽×高×长)，并行的主通道3数量为4；交界位置32的尺寸为100μm×500μm×200μm(宽×高×长)；所用20μl反应液体系包括：0.1μl Taq DNA Polymerase(5U/μl)，1.6μl GAPDH引物混合物(10μM each)，2μl模板DNA(0.2μg)，1.6μl dNTP(2.5mM each)，2μl 10X PCR Buffer(withMg2+)，去离子水；介电泳使用电压幅值分别为18V和24V的双频交流介电泳。

基于上述体系进行核酸提取和纯化的方法，包括如下步骤：

加样和预热：首先开启往复式动力源，向各主通道3加入5微升石蜡油，控温通道5加入20微升石蜡油，排走多余空气；再向各主通道3加入20微升反应液，控温通道5加入80微升反应液，排走多余空气；然后向各通道加入5微升石蜡油，控温通道5加入20微升石蜡油，排走多余空气；封闭芯片进口和出口，将反应液控制在入口位置；开启加热，至各温区2温度稳定后，将核酸操控至高温区2停留5min。

扩增：连通介电泳电极4，操控核酸在高温区2、低温区2、中温区2来回停留对应时间，重复操作30次。

产物回收：操控核酸至低温区2，停留2min后关闭加热电极；待反应物冷却至室温后开启芯片出口，回收产物或进入后端集成通道进行后续实验。

实施例2单靶标多液滴的小鼠GAPDH基因扩增

本实施例所用的芯片结构参数如下：进口、主通道3和出口为总分总结构，进口和出口尺寸为500μm×500μm×2mm(宽×高×长)，主通道3尺寸为100μm×500μm×6mm(宽×高×长)，并行的主通道3数量为3，单通道内液滴数为3；交界位置32的尺寸为100μm×500μm×200μm(宽×高×长)；所用10μl反应液体系包括：0.05μl Taq DNA Polymerase(5U/μl)，0.8μl GAPDH引物混合物(10μM each)，1μl模板DNA(0.2μg)，0.8μl dNTP(2.5mM each)，1μl10X PCR Buffer(with Mg2+)，去离子水；介电泳使用电压幅值分别为18V和24V的双频交流介电泳。

基于上述体系进行核酸提取和纯化的方法，包括如下步骤：

加样和预热：首先开启往复式动力源，向各主通道3加入2.5微升石蜡油，控温通道5加入7.5微升石蜡油，排走多余空气；再向各主通道3加入10微升反应液，控温通道5加入30微升反应液，排走多余空气；然后向各通道加入2.5微升石蜡油，控温通道5加入7.5微升石蜡油，排走多余空气；重复操作至石蜡油中夹有3个反应液滴，封闭芯片进口和出口，将反应液控制在入口位置；开启加热，至各温区2温度稳定后，将核酸操控至高温区2停留5min。

扩增：连通介电泳电极4，操控所有核酸在高温区2、低温区2、中温区2来回停留对应时间，重复操作33次。

产物回收：操控所有核酸至低温区2，停留2min后关闭加热电极；待反应物冷却至室温后开启芯片出口，回收产物或进入后端集成通道进行后续实验。

实施例3多靶标多液滴的小鼠基因扩增

本实施例的参数：本实施例所用的芯片结构参数如下：进口、主通道3和出口为多路并行结构，进口和出口尺寸为90μm×500μm×2mm(宽×高×长)，主通道3尺寸为100μm×500μm×6mm(宽×高×长)，并行的主通道3数量为4，单通道内液滴数为4；交界位置32的尺寸为100μm×500μm×200μm(宽×高×长)；所用5μl反应液体系包括：0.025μl Taq DNAPolymerase(5U/μl)，0.4μl引物混合物(10μM each)，0.5μl模板DNA(0.2μg)，0.4μl dNTP(2.5mM each)，0.5μl 10X PCR Buffer(with Mg2+)，去离子水；介电泳使用电压幅值分别为18V和24V的双频交流介电泳。

基于上述体系进行核酸提取和纯化的方法，包括如下步骤：

加样和预热：首先开启往复式动力源，向各主通道3加入2.5微升石蜡油，控温通道5加入10微升石蜡油，排走多余空气；再向各主通道3加入5微升反应液，控温通道5加入20微升反应液，排走多余空气；然后向各通道加入2.5微升石蜡油，控温通道5加入10微升石蜡油，排走多余空气；重复操作至石蜡油中夹有4个反应液滴，封闭芯片进口和出口，将反应液控制在入口位置；开启加热，至各温区2温度稳定后，将核酸操控至高温区2停留5min。

扩增：连通介电泳电极4，操控所有核酸在高温区2、低温区2、中温区2来回停留对应时间，重复操作30次。

产物回收：操控所有核酸至低温区2，停留2min后关闭加热电极；待反应物冷却至室温后开启芯片出口，回收产物或进入后端集成通道进行后续实验。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括：

芯片本体，所述芯片本体具有至少两个温区；

所述芯片本体的内部开设有至少一条主通道，所述主通道包括至少两个通道段，每个所述温区内对应至少一个所述通道段，位于相邻所述温区的所述通道段处于所述芯片本体的不同层面；位于不同层面的相邻所述通道段的部分通道端部沿层向重叠且连通，构成交界位置；

介电泳电极，所述介电泳电极为双频交流介电泳，且与相邻所述通道段的交界位置对应设置；

至少一个控温通道，至少一个所述控温通道与至少一个所述主通道连通；所述控温通道内设置有至少一个缓冲腔；

至少一个加热器，所述加热器与所述缓冲腔对应设置。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片还包括：

至少一个温度传感器，所述温度传感器与所述加热器数据连接；所述温度传感器与所述通道段对应设置。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片还包括：

至少一个微阀，所述微阀设置在所述主通道的进口和/或出口。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述主通道的数量为多个，多个所述主通道相互平行。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述温区包括第一温区、第二温区和第三温区，所述主通道包括第一通道段、第二通道段和第三通道段；

所述第一通道段位于所述第一温区，所述第二通道段位于所述第二温区，所述第三通道段位于所述第三温区。

6.一种核酸扩增装置，其特征在于，包括至少一个往复式动力源以及如权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片；

所述往复式动力源设置在所述主通道的进口和/或出口。

7.一种核酸扩增方法，其特征在于，基于权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片，或者基于权利要求6所述的核酸扩增装置，步骤如下：

利用所述介电泳电极产生的介电泳力，驱动反应液内含有的核酸在所述交界位置转移到相邻所述通道段，使反应液内的核酸在相邻温区内转移。