CN111001822A - 一种多功能性铜纳米簇的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多功能性铜纳米簇的制备方法，包括：将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合，加入强碱，反应后，得到铜纳米簇。与现有技术相比，本发明以金属硫蛋白为合成模板，既能利用蛋白质增强铜纳米簇的生物相容性，又能依赖其强抗氧化性保证铜纳米簇的长期稳定性；并且，金属硫蛋白在强碱条件下还原铜离子得到铜纳米簇，其同时作为稳定模板与还原剂，减少了合成时体系的成分，保证了合成成分的单一性和分散性；再者本发明制备的铜纳米簇既保留了金属硫蛋白的内在性质，又能发挥铜原子本身的特性，从而实现了多功能性。

Description

一种多功能性铜纳米簇的制备方法及应用

本申请要求于2018年11月20日提交中国专利局、申请号为2018113834194发明名称为“一种多功能性铜纳米簇的制备方法及应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于金属纳米材料技术领域，尤其涉及一种多功能性铜纳米簇的制备方法及应用。

背景技术

金属纳米簇是指由几个到几百个金属原子通过物理和化学结合力组成的相对稳定的聚集体。金属纳米簇作为一种特殊的金属纳米粒子已经得到了广泛的关注。

铜纳米簇是继金纳米簇、银纳米簇之后新近出现的一种经济实用，性质优良的纳米材料。与贵金属元素相比，铜纳米簇凭借其良好的光学性能、催化活性、生物相容性及成本经济性，在化学检测、工业催化、分子器件、细胞成像、生物标记等领域中展现了巨大的应用潜力。因此，铜纳米簇的制备成为一大研究热点。

铜纳米簇的合成方法主要有模板辅助法(蛋白质模板、DNA模板、聚合物模板)、配体辅助法(硫醇配体、羧基配体)、电极法、刻蚀法。目前，文献所报道的大多数铜纳米簇合成方法存在量子产率较低、稳定性差、分散性较差、功能单一等，这严重影响了所制备的铜纳米簇在各大领域的广泛应用。因此，如何制备成分单一、稳定性好、功能多样、经济实用的铜纳米簇成为了研究者们的重要目标。

近年来，科学家们为开发双功能或多功能铜纳米簇做出了不懈努力。2011年Nirmal Goswami等人以牛血清白蛋白(BSA)为稳定模板和还原剂，在pH12、55℃的条件下反应6～8h后得到具有荧光特性的BSA-CuNCs，并开发了Pb²⁺生物传感检测新方法；2013年Lianzhe Hu等人使用上述同种方法合成了BSA-CuNCs，进一步探索了它的类辣根过氧化物酶活性，并将其应用于葡萄糖的检测；2016年Shuangjiao Xu等人又将该BSA-CuNCs应用于化学发光领域测定胆固醇，其原理也是基于BSA-CuNCs的辣根过氧化物酶活性；该双功能BSA-CuNCs的合成以牛血清白蛋白为模板和还原剂，合成成分单一，在2个月内荧光性质稳定。2016年Jigna R.Bhamore等人利用鸡蛋清蛋白与Cu²⁺在微波消解的条件下反应5min后，合成了具有荧光性质和抗菌性的双功能铜纳米簇，并基于荧光性质开发了福美双和百草枯的传感检测平台；该纳米簇由于直接使用鸡蛋清进行反应，合成成分复杂，所得的铜纳米簇分散性差；同时，该纳米簇稳定性极差，以锡箔纸包覆的棕色玻璃瓶储存，其保存时间超过3天后荧光值下降十分明显，15天后荧光基本消失。2015年Hong Yan Zou等人使用多巴胺与Cu²⁺在30℃条件下反应30min后得到多功能DA-CuNCs，其具有光致发光性质、类过氧化物酶活性和抗菌性；该DA-CuNCs实现了多功能性，并依据此性质建立了荧光及光度法检测Fe³⁺的新方法；但该铜纳米簇仍存在分散性较差，尺寸过大(平均8nm左右)的缺点。此外，大部分新型铜纳米簇则仅具有荧光性质，功能单一，应用局限，因此发展多功能铜纳米簇的简便制备方法及开发相关应用研究具有重大的现实意义。

此外现有重金属元素铅、汞的分析测定方法主要有二硫腙分光光度法、原子吸收光谱法(火焰原子吸收光谱法或石墨炉原子吸收光谱法)、电感耦合等离子体发射光谱法、示波极谱法、电感耦合等离子体质谱法等。这些方法存在以下共同的缺点：需要采集的样品量较大；各类元素的干扰严重；实验操作步骤复杂；成本高需要昂贵的仪器和专业的人员。因此开发一些简便快速、成本低廉、特异性好、灵敏度高的Pb²⁺、Hg²⁺传感平台是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种分散稳定的多功能性铜纳米簇的制备方法及应用的制备方法及应用。

本发明提供了一种铜纳米簇的制备方法，包括：

将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合，加入强碱，反应后，得到铜纳米簇。

优选的，所述金属盐溶液为可氯化铜溶液、硝酸铜溶液与硫酸铜溶液中的一种或多种。

优选的，所述金属硫蛋白与可溶性铜盐的比例为(200～700)mg：1mmol。

优选的，所述金属硫蛋白以金属硫蛋白溶液的形式与可溶性铜盐溶液混合；所述金属硫蛋白溶液的浓度为1～5mg/ml；所述可溶性铜盐溶液的浓度为0.5～10mmol/L。

优选的，所述强碱选自氢氧化钾和/或氢氧化钠；所述强碱与可溶性铜盐的比例为1mol：(0.5～5)mmol。

优选的，所述强碱以强碱溶液的形式加入；所述强碱溶液的浓度为0.5～2.5mol/L。

优选的，所述反应的温度为40℃～60℃；所述反应的时间为10～24h；所述混合的温度为40℃～60℃；所述混合的时间为5～30min。

本发明还提供了上述的铜纳米簇在重金属离子生物传感器中的应用。

优选的，所述重金属离子为Pd²⁺和/或Hg²⁺。

本发明还提供了上述的铜纳米簇在荧光传感平台中的应用。

本发明提供了一种多功能性铜纳米簇的制备方法，包括：将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合，加入强碱，反应后，得到铜纳米簇。与现有技术相比，本发明以金属硫蛋白为合成模板，既能利用蛋白质增强铜纳米簇的生物相容性，又能依赖其强抗氧化性保证铜纳米簇的长期稳定性；并且，金属硫蛋白在强碱条件下还原铜离子得到铜纳米簇，其同时作为稳定模板与还原剂，减少了合成时体系的成分，保证了合成成分的单一性和分散性；再者本发明制备的铜纳米簇既保留了金属硫蛋白的内在性质，又能发挥铜原子本身的特性，从而实现了多功能性。

附图说明

图1为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的紫外光谱图；

图2为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的荧光光谱图；

图3为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的透射电镜图；

图4为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的光电子能谱图；

图5为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs在日光及紫外灯下的照片；

图6为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs放置四个月的荧光值柱形图；

图7为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的类过氧化氢酶活性柱形图；

图8为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs与双氧水对底物催化氧化后显色的照片与紫外可见吸收光谱图；

图9为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的羟自由基清除率柱形图；

图10为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的超氧阴离子自由基清除率柱形图；

图11为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的DPPH自由基清除率柱形图；

图12为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs的ABTS自由基清除率柱形图；

图13为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs检测Pb²⁺的标准曲线图；

图14为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs检测Pb²⁺的荧光光谱图；

图15为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs测定体系中各共存物质的荧光强度图；

图16为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Pb²⁺的比色图；

图17为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Pb²⁺的标准曲线图；

图18为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Pb²⁺的紫外吸收光谱图；

图19为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Hg²⁺的比色图；

图20为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Hg²⁺的标准曲线图；

图21为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Hg²⁺的紫外吸收光谱图；

图22为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Pb²⁺测试体系吸光度值变化柱形图；

图23为本发明实施例1中得到的MTs-CuNCs利用催化比色法检测Hg²⁺测试体系吸光度值变化柱形图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种铜纳米簇的制备方法，包括：

将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合，加入强碱，反应后，得到铜纳米簇。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合；金属硫蛋白是一类普遍存在在生物体内的金属结合蛋白，富含半胱氨酸，具有很强的抗氧化能力，本发明以金属硫蛋白为作为稳定模板及还原剂；所述金属硫蛋白优选以金属硫蛋白溶液的形式与可溶性铜盐溶液混合；所述金属硫蛋白溶液的浓度优选为1～5mg/ml，更优选为1.5～4mg/ml，再优选为2～3mg/ml，最优选为2.25～2.5mg/ml；所述金属硫蛋白与可溶性铜盐的比例优选为(200～700)mg：1mmol，更优选为(300～600)mg：1mmol，再优选为(400～500)mg：1mmol，最优选为450mg：1mmol；所述可溶性铜盐溶液为本领域技术人员熟知的可溶性铜盐溶液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为可氯化铜溶液、硝酸铜溶液与硫酸铜溶液中的一种或多种；所述可溶性铜盐溶液的浓度优选为0.5～10mmol/L，更优选为1～8mmol/L，再优选为2～6mmol/L，再优选为2～5mmol/L，再优选为2～4mmol/L，最优选为3mmol/L；所述混合的温度优选为40℃～60℃，更优选为45℃～60℃，再优选为50℃～55℃，最优选为55℃；所述混合的时间优选为5～30min，更优选为10～25min，再优选为10～20min，最优选为15min；所述混合的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选为震荡混合；更优选采用THERMO-SHAKER恒温混匀仪混合；所述混合的转速优选为600～1000rpm，更优选为700～900rpm，再优选为800rpm。合成过程中使用THERMO-SHAKER恒温混匀仪震荡混匀溶液，这温和的合成方式既可保留金属硫蛋白的内在性质，又能发挥铜原子本身的特性，实现多功能性。

混合后，加入强碱；所述强碱为本领域技术人员熟知的强碱即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氢氧化钾和/或氢氧化钠；所述强碱与金属盐的比例优选为1mol：(0.5～5)mmol，更优选为1mol：(1～5)mmol，再优选为1mol：(2～4)mmol，最优选为1mol：3mmol；所述强碱优选以强碱溶液的形式加入；所述强碱溶液的浓度优选为0.5～2.5mol/L，更优选为1～2mol/L，再优选为1～1.5mol/L。

加入强碱后，反应，得到金属硫蛋白铜纳米簇；所述反应的温度优选为40℃～60℃，更优选为45℃～60℃，再优选为50℃～55℃，最优选为55℃；所述反应的时间优选为10～24h。

本发明以金属硫蛋白为合成模板，既能利用蛋白质增强铜纳米簇的生物相容性，又能依赖其强抗氧化性保证铜纳米簇的长期稳定性；并且，金属硫蛋白在强碱条件下还原铜离子得到铜纳米簇，其同时作为稳定模板与还原剂，减少了合成时体系的成分，保证了合成成分的单一性和分散性；再者本发明制备的铜纳米簇既保留了金属硫蛋白的内在性质，又能发挥铜原子本身的特性，从而实现了多功能性。

进一步地，本发明利用金属硫蛋白作为稳定模板及还原剂，使用THERMO-SHAKER恒温混匀仪合成了具有蓝色荧光的MTs-CuNCs(金属硫蛋白铜纳米簇)，其合成原理为铜离子首先与金属硫蛋白的氨基紧密结合；在强碱高温条件下，金属硫蛋白释放出还原型氨基酸侧链将铜离子还原成铜原子形成由金属硫蛋白稳定的铜纳米簇。该铜纳米簇功能多样，既具有稳定的发光性质，又具有人工模拟酶活性及强大的抗氧化能力；在4℃下低温保存4个月其荧光值几乎无变化，可长期稳定存在。

本发明还提供了上述方法制备的铜纳米簇在重金属离子生物传感器中的应用；所述重金属离子为本领域技术人员熟知的重金属离子即可，并无特殊的限制，本发明中优选为Pd²⁺和/或Hg²⁺。

进一步地，本发明提供了基于MTs-CuNCs模拟酶活性的重金属离子传感平台：H₂O₂在一定条件下能催化TMB；MTs-CuNCs存在一定的抗氧化性，可抑制H₂O₂催化TMB显色；Pb²⁺、Hg²⁺与MTs-CuNCs相互作用，导致MTs-CuNCs的类过氧化物酶活性增强。根据体系的颜色变化和吸光度值的变化，可对Pb²⁺、Hg²⁺进行定量。

本发明利用MTs-CuNCs的抗氧化性和类辣根过氧化物酶活性，基于MTs-CuNCs与重金属离子Pb²⁺或Hg²⁺发生反应后其模拟酶活性增强，在不同反应条件下分别建立多通道催化比色法检测Pb²⁺与Hg²⁺的新方法，测定Pb²⁺的线性范围(0.469μM～96μM)极宽，横跨3个数量级；测Hg²⁺体系，灵敏度高，抗干扰能力强，简便可行。

本发明还提供了上述制备的铜纳米簇在荧光传感平台中的应用。

进一步地，本发明提供了基于MTs-CuNCs(金属硫蛋白铜纳米簇)的铅离子荧光传感平台：Pb²⁺与MTs-CuNCs相作用，导致MTs-CuNCs的荧光强度明显降低，在一定范围范围内体系的荧光强度的变化值与Pb²⁺的浓度成线性关系，建立测定Pb²⁺的荧光传感方法。

所述铜纳米簇基于荧光传感平台测定铅离子的条件为：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，pH值为5～5.5，更优选为5.25；金属硫蛋白铜纳米簇的体积浓度优选为5％～10％，更优选为7％～8％，再优选为7.5％；反应温度优选为20℃～25℃；反应时间优选为15～30min，更优选为20～25min。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种多功能性铜纳米簇的制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

MTs-CuNCs的制备：取600μL 2.25mg/mL金属硫蛋白溶液，置于100μL3mmol/L氯化铜溶液中，55℃恒温，震荡混匀15min后，加入1.0mol/L NaOH溶液200μL，持续恒温混匀10～24h。溶液颜色从浅蓝色变为浅紫色。制备所得的MTs-CuNCs在4℃冰箱内避光保存。

对实施例1中得到的MTs-CuNCs进行表征：

MTs-CuNCs的紫外-可见吸收光谱：取400μL铜纳米簇原液置于微量比色皿中，测定其在700～200nm范围的紫外-可见吸收光谱图，测定前用超纯水走基线并调零，观察体系是否存在铜纳米粒子特有的等离子共振吸收峰，若无则表明体系内不含大尺寸颗粒，得到其紫外光谱图如图1所示，由图1可知MTs-CuNCs并未在560nm处出现Cu的粒子尺寸依赖表面等离子体共振峰，可初步判断合成的CuNCs质量较好，不含尺寸较大的铜纳米粒子。

MTs-CuNCs的荧光光谱：取400μL铜纳米簇原液置于微量比色皿中，测定200～900nm范围的荧光光谱图，观察该纳米簇的光致发光性质，并记录最大激发波长及最大发射波长，得到其荧光光谱图如图2所示。由图2可知，通过恒温混匀仪合成的MTs-CuNCs，最大激发和最大发射分别位于325nm、390nm。

MTs-CuNCs的高分辨透射电子显微镜：利用透射电子显微镜观察铜纳米簇的形貌及尺寸。用吸管吸取铜纳米簇原液适量，滴加至碳膜上，待溶液干燥后，再滴加，如此重复三次后，将干燥的碳膜置于透镜装置中测定，得到其透射电镜图如图3所示。由图3可知，实施例1中得到的金属纳米簇分散性良好，平均尺寸小于3nm。

MTs-CuNCs的X-射线光电子能谱：在1cm×1cm的洁净干燥玻片上滴加数滴铜纳米簇原液，在真空干燥箱里干燥成粉末后，用X射线光电子能谱仪表征化学组成与其化学状态，得到其光电子能谱图，如图4所示。由图4可知，Cu2p的X射线光电子能谱图，在932.79eV和952.54eV处观察到两个特征峰，其分别为Cu(0)的2p 3/2和2p 1/2的特征峰，但在942eV处未见卫星特征峰，这表明系统中可能不存在Cu(II)；Cu(0)的2p 3/2结合能与Cu(I)仅相差0.1eV，故MTS-CuNCs中Cu元素价态很可能既含有Cu原子有含有Cu(I)，这验证铜纳米簇的产生。

MTs-CuNCs的光致发光性质：MTs-CuNCs的最大激发和最大发射分别位于325nm、390nm，将MTs-CuNCs置于365nm紫外灯下检测其光致发光特性，得到紫外灯下照片如图5所示，其中左图为日光下，右图紫外灯下的照片。由图5可知，日光下呈现粉紫色的MTs-CuNCs在365nm的紫外灯下呈现蓝色荧光。

MTs-CuNCs的荧光的长期稳定性，四个月的荧光值如图6所示。由图6可知MTs-CuNCs的荧光值在四个月(120day)内几乎无变化，说明MTs的存在大大增强了该CuNCs的长期稳定性，长期稳定性支持其具有良好的商业潜能。

MTs-CuNCs的酶活性检测：

类过氧化氢酶(CAT)活性：在2mL EP管中按顺序加入下表1的试剂，测定A₂₄₀，每隔一分钟记录一次，共记录2次。加入1.5mg/mL CAT的阳性对照的吸光度差值记为ΔA_S，未加入样品及CAT的阴性对照的吸光度差值记为ΔA₀，样品的吸光度差值记为ΔA。使用与铜纳米簇合成时所含的等量的金属硫蛋白和铜纳米簇进行比较分析；计算公式相对活性＝(ΔA－ΔA₀)/(ΔA_S－ΔA₀)，对铜纳米簇与金属硫蛋白的CAT活性进行评价，得到其类过氧化氢酶活性柱形图如图7所示。

表1 CAT活性检测方案

类辣根过氧化物酶(HRP)活性：选取ABTS、OPD、TMB、DAB四种底物进行HRP活性的测定，在EP管中按顺序加入下表2的试剂，37℃下反应30min，测定阳性对照组和样品组HRP活性，得到MTs-CuNCs与双氧水对底物催化氧化后显色的照片如图8所示，其中A中的底物为ABTS(2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)；B中的底物为TMB(3,3′,5,5′-四氨基联苯胺)；C中的底物为OPD(邻苯二胺)；D中的底物为DAB(3.3-二氨基联苯胺)；图8四幅图中a仅加入底物；b加入底物+H₂O₂；c加入底物+MTs-CuNCs；d加入底物+H₂O₂+MTS-CuNCs；得到MTs-CuNCs与双氧水对底物催化氧化后的紫外可见吸收光谱图如图8E～H所示。图8A中ABTS+H₂O₂体系(b)出现ABTS·+特征性的浅绿色，并在图8E的光谱(黑线)中有一个位于415nm处的特征吸收峰；而ABTS+MTs-CuNCs(c)与ABTS+H₂O₂+MTs-CuNCs(d)的两管均是无色，这说明MTs-CuNCs对ABTS不仅没有类辣根过氧化物酶活性，而且能够清除H₂O₂自氧化形成的·OH及ABTS氧化产生的ABTS·+。这也与本实验体外抗氧化实验的结果相符。图8B与图8A结果类似，TMB经H₂O₂氧化后呈现浅蓝色(b)且存在位于652nm处(图8F红线)的特征吸收；而当加入铜纳米簇后，蓝色变浅，吸收减弱；表明MTs-CuNCs对TMB可能没有辣根过氧化物酶，且能抑制H₂O₂氧化TMB。图8C与图8G显示H₂O₂并不能氧化OPD显色，但是MTs-CuNCs却能在不存在H₂O₂的情况下氧化OPD显浅黄色(c)在430nm处有特征吸收(图8G红线)，显示出MTs-CuNCs的氧化酶活性；OPD+H₂O₂+MTs-CuNCs并未使浅黄色增强，而且紫外可见吸收峰发生改变，可能是在此条件下发生了OPD与Cu²⁺发生了配位反应(图8G黑线)。图8D与图8H则是底物为DAB氧化结果，H₂O₂与MTs-CuNCs均能单独氧化DAB显浅棕色于460nm处有特征吸收，两者都存在的条件下DAB显色与紫外可见吸收均增强，在此MTs-CuNCs既显示出氧化酶活性又存在类辣根过氧化物酶活性。MTs-CuNCs对四大底物的作用差异主要源于供氢体的差异性与催化过程对H₂O₂的依赖性、及其本身的抗氧化性对体系的作用。

表2 HRP活性检测方案

MTs-CuNCs的体外抗氧化活性检测

羟自由基(·OH)清除实验：按表3的程序加入各试剂，室温(25℃)下混匀静置反应5min，在550nm处观察到特征吸收峰并记下此处的吸光度。使用与铜纳米簇合成时所含的等量的金属硫蛋白、维生素C(VC)和铜纳米簇进行比较分析，得到羟自由基清除率柱形图如图9所示。·OH清除率D(·OH)＝(A_S－A₀)/(A－A₀)×100％，其中A_S为加入抗氧化剂后罗丹明B的吸光度，A₀为Fe²⁺与H₂O₂产生大量·OH的体系中罗丹明B的吸光度，A为罗丹明B本身的吸光度。

表3·OH清除实验反应体系

超氧阴离子自由基(O²·-)清除实验：根据表4程序加入试剂并迅速混匀，每隔30s记录一次吸光度，测量4分钟，计算氧化速率ΔA，得到超氧阴离子自由基清除率柱形图如图10所示。O²·-清除率D(O²·-)＝(ΔA₀－ΔA)/ΔA₀×100％，其中ΔA₀为邻苯三酚的自氧化速率，ΔA为加入抗氧化剂(CuNCs、1.5mg/mlMTS、1.5mg/mlVC)后邻苯三酚的自氧化速率。

表4 O²·-清除实验反应体系

DPPH自由基清除实验：室温(25℃)下在2mL EP管中按顺序加入表5中的试剂，避光静置反应30min测定525nm处吸光度值，得到DPPH自由基清除率柱形图如图11所示。DPPH·清除率D(DPPH·)＝[A₁－(A₂－A₃)]/A₁×100％，其中A₁为DPPH的吸光度值，A₂为抗氧化剂与DPPH作用后的吸光度值，为消除抗氧化剂本身的吸收对实验结果的影响，空白为抗氧化剂的空白对照A₃。测定前使用无水乙醇与水按比例混合后进行走基线调零。

表5 DPPH·清除实验反应体系

100μM DPPH(μL)	抗氧化剂(μL)	SPA(μL)
			250	-	250
250	250(CuNCs)	-
			250	250(1.5mg/mL MTs)	-
250	250(1.5mg/mL VC)	-
			-	250(CuNCs)	250
-	250(1.5mg/mL MTS)	250
			-	250(1.5mg/mL VC)	250

ABTS自由基的清除实验：室温(25℃)下按表6的方案加入各试剂混合均匀后反应20min，观察特征吸收峰并测定其在734nm处的吸光度，得到ABTS自由基清除率柱形图如图12所示。ABTS·清除率D(ABTS·)＝(A－A_i)/A×100％，A为不加样品仅加入ABTS的吸光度；A_i为加入抗氧化剂和ABTS的吸光度。

表6 ABTS·清除实验反应体系

5mM ABTS(μL)	抗氧化剂(μL)	SPA(μL)
			450	-	50
450	30(CuNCs)	20
			450	30(1.5mg/ml MTs)	20
450	30(1.5mg/ml VC)	20

由图9至图12可知，MTs-CuNCs有效清除羟基自由基，清除率为99％以上，MTs及VC的·OH清除率均小于10％；MTs-CuNCs与VC对超氧阴离子自由基(O^2-·)的清除率均达到97％以上，MTs的清除率稍低为77.49％；MTs与MTs-CuNCs清除DPPH·的能力均较弱，吸光度无明显降低的趋势，清除率低于20％，VC清除DPPH·的效率达到97％以上；MTs及MTs-CuNCs清除ABTS·+的能力均较强，清除率分别为86.72％、80.00％、86.72％。表明该铜纳米簇具有强抗氧化性，对比其与MTs之间的清除自由基的能力，发现MTs-CuNCs的抗氧化性更强。

基于MTs-CuNCs的铅离子荧光传感平台：于2mL EP管内，依次加入MTs-CuNCs 30μL，50mM MES缓冲液(pH＝5.25)140μL，分别加入不同浓度的铅标准溶液，超纯水定容至400μL，20℃下反应20min后上机测定。在Lumina荧光分光光度计上设置波长范围为350nm～500nm，测定各实验管在390nm处的荧光强度并记录，设定ΔF＝F₀－F，F表示加入Pb²⁺的荧光值，F₀表示未加入Pb²⁺的荧光值，得到MTs-CuNCs检测Pb²⁺的标准曲线图如图13所示及相应的荧光光谱图如图14所示(光谱图与标曲的点相对应，从上至下浓度分别为0.00μM、0.75μM、1.50μM、3.00μM、6.00μM、8.00μM、10.00μM、12.00μM)。由图13与图14可知，当Pb²⁺的浓度在(0.252μM～12μM)×10^-6mol/L时，体系的ΔF值与Pb²⁺浓度存在良好的线性关系，其线性曲线为ΔF＝105.25+155.43c(×10^-6mol/L)，r＝0.9976。平行配制终浓度为1.5×10^-6mol/L、6×10^-6mol/L、12×10^-6mol/L的Pb²⁺溶液进行精密度实验(n＝11)，相对标准偏差分别为1.86％、0.78％、2.85％，均小于5％，表明此方法精密度良好。根据LOD＝3S_b/k(S_b和k分别是空白的标准偏差和标准曲线的斜率)，计算得本方法的检出限为8.4×10^-8mol/L。

在最优条件下，选择Pb²⁺浓度为5μmol/L的标准溶液作参考，实验了水样中可能存在的干扰物质进行干扰测定，得到测定体系中各共存物质的荧光强度如图15所示。在相对误差不大于±5％时，500倍的Mg²⁺、K⁺、Na⁺，250倍的Ca²⁺，100倍的Cu²⁺、Cd²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺，50倍的Ag⁺、Cr³⁺，25倍的Hg²⁺对测定没有干扰。表示该方法具有良好的选择性。

将此方法应用于实际环境水样中Pb²⁺的测定。采集湘江水样、南华大学池塘水样等5个水样，用滤纸过滤两次后，置于电炉上加热煮沸持续10min，取下冷却，测定前使用0.22μm滤膜过滤。使用本方法进行测定，得到结果见表7，样品1实验室自来水；2南华大学池塘水；3湘江水上游；4湘江水中游；5.湘江水下游，实验结果表明该方法实用可行、准确度良好。

表7环境水样中Pb²⁺的实际测定分析

基于MTs-CuNCs模拟酶活性的重金属离子传感研究

Pb²⁺的测定：在一系列2mL的洁净EP管中，依次准确加入pH4.0 200mM NaAc-HAc缓冲液80μL，MTs-CuNCs 30μL，5mM3,3′,5,5′-四氨基联苯胺(TMB)40μL，10mMH₂O₂ 60μL，以及一定量的Pb²⁺标准溶液，混匀，于40℃恒温混匀仪中反应40min。然后加入0.2MH₂SO₄终止液100μL，裸眼可视化比色测定，并拍照，得到比色图如图16所示(从左至右浓度铅离子的浓度分别为0.00μM、0.75μM、3.00μM、9.00μM、15.00μM、24.00μM、36.00μM、42.00μM、48.00μM、54.00μM、60.00μM、72.00μM、96.00μM)。同时，测定体系的吸收光谱，并记录其在λ＝450nm处的吸光度值，体系吸收光谱的变化值表示为：ΔA＝A－A₀，A表示加入Pb²⁺的吸光度值，A₀表示未加入Pb²⁺的吸光度，建立测定Pb²⁺的标准曲线图，如图17所示，得到其紫外吸收光谱图如图18所示(光谱图与标曲的点相对应，从下至上铅离子的浓度分别为0.00μM、0.75μM、1.50μM、3.00μM、6.00μM、9.00μM、12.00μM、15.00μM、18.00μM、24.00μM、36.00μM、42.00μM、48.00μM、54.00μM、60.00μM、72.00μM、96.00μM)。由图17可知c_Pb2+＝0.469～96(×10^-6mol/L)时，体系的ΔA值与Pb²⁺浓度呈良好的线性关系，其回归方程为ΔA＝0.0113c_Pb2+(×10^{- 6}mol/L)－0.034，r＝0.9987，经LOD＝3S_b/k公式计算所得的检出限为1.42×10^-7mol/L。分别对Pb²⁺浓度为1.5μM、60μM、96μM的三种标准溶液进行精密度实验(n＝11)，相对标准偏差分别为1.65％、0.5％、3.11％，表明方法精密度良好。

Hg²⁺的测定：在洗净灭菌后的2mL EP管中，依次加入pH3.0 200mM NaAc-HAc缓冲液60μL，MTs-CuNCs 20μL，5mM3,3′,5,5′-四氨基联苯胺(TMB)50μL，10mM H₂O₂ 60μL，以及一定量的Hg²⁺标准溶液，混匀，于40℃恒温混匀仪中反应40min。然后加入0.2M H₂SO₄终止液100μL，裸眼可视化比色测定，并拍照，得到其比色图如图19所示(Hg²⁺标准溶液的浓度从左至右分别为A：0.00μM、0.195μM、0.39μM、0.775μM、1.55μM、2.325μM；B：3.10μM、6.23μM、7.788μM、9.345μM、10.902μM、12.46μM、15.56μM)；同时测定体系的吸收光谱，并记录其在λ＝450nm处的吸光度值，得到其标准曲线图如图20所示，得到其紫外吸收光谱图如图21所示(光谱图与标曲的点相对应，Hg²⁺标准溶液的浓度从下至上分别为A：0.00μM、0.0975μM、0.195μM、0.39μM、0.775μM、1.55μM、2.325μM；B：0.00μM、3.10μM、3.875μM、4.673μM、6.23μM、7.788μM、9.345μM、10.902μM、12.46μM、15.56μM)。体系吸收光谱的变化值表示为：ΔA＝A－A₀，A表示加入Hg²⁺的吸光度值，A₀表示未加入Hg²⁺的吸光度。由图20得到催化显色法测定Hg²⁺的标准曲线，在c_Hg ²⁺＝0.144～2.325(×10^-6mol/L)和c_Hg ²⁺＝3.10～15.59(×10^-6mol/L)范围内，体系的ΔA值与Hg²⁺浓度均存在良好的线性关系；其回归方程分别为ΔA＝0.0231+0.0413c_Hg ²⁺(×10^-6mol/L)和ΔA＝0.0159+0.0157c_Hg ²⁺(×10^-6mol/L)；相关系数分别为0.9950和0.9961。对空白溶液进行11次测定，按LOD＝3S_b/k公式计算得到，本方法检出限为4.38×10^-8mol/L。进一步考察该方法精密度，Hg²⁺浓度为0.775μM、2.325μM、12.46μM的三个标准溶液平行测定11次，其相对标准偏差为3.02％、1.62％、2.32％，方法精密度良好。

在最佳反应条件下，考察了该方法对Pb²⁺的选择性，选择10μM的Pb²⁺标准溶液进行参照，对几种常见离子进行干扰实验，得到测试体系吸光度值变化柱形图如图22所示。由图22可知，在相对误差不大于±5％时，500倍的Zn²⁺、Na⁺；250倍的Mg²⁺、K⁺、Cd²⁺；100倍的Ca²⁺、Mn²⁺；50倍的Al³⁺；25倍的Ag⁺、Cu²⁺；10倍的Hg²⁺、Fe³⁺对测定没有干扰；表明该方法具有良好的选择性。在测Hg²⁺体系中，试验了不同的常见离子对Hg²⁺测定的影响，选择2μM的Hg²⁺标准溶液进行参照，得到测试体系吸光度值变化柱形图如图23所示。由图23可知，在相对误差不大于±5％时，500倍的K⁺、Ca²⁺；，250倍的Na⁺、Cd²⁺；，100倍的Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺；50倍的Al³⁺；25倍的Ag⁺、Cu²⁺；10倍的Fe³⁺对测定没有干扰；该方法抗干扰性良好。

采集了湘江水上、中、下游的水样和南华大学池塘水等5个水样；使用滤纸进行过滤处理后，加热煮沸持续沸腾10min，取下放冷，经0.22μm滤头过滤后待测。结果如表8、9所示，其中样品1实验室自来水；2南华大学池塘水；3湘江水上游；4湘江水中游；5湘江水下游，本实验测定Pb²⁺、测定Hg²⁺体系均具有良好的准确性及可行性。

表8环境水样中Pb²⁺的实际测定分析

表9环境水样中Hg²⁺的实际测定分析

以上实验数据都表明首次制备了一种新型、绿色的多功能MTs-CuNCs材料，并对其形成机制和特性进行探寻；发现其具有光致发光性质、长期稳定性、类过氧化氢酶(CAT)活性、类过氧化物酶(HRP)活性、氧化酶活性及强抗氧化性等优良特性；依据这些性质本发明还建立了Pb²⁺-MTs-CuNCs的荧光“turn off”体系、MTs-CuNCs-Pb催化显色体系、MTs-CuNCs-Hg催化显色体系，将其应用于重金属Pb²⁺、Hg²⁺的灵敏测定。

该多功能MTs-CuNCs潜力巨大；基于其光致发光性质可将其应用于生物成像、生物标记等领域；基于其类过氧化物酶活性可进一步开发小分子生物传感如双氧水、尿酸、胆固醇、黄嘌呤等的传感平台；基于其强抗氧化可将其应用于体外抗氧化。本发明应用前景广阔、成本低廉、商业价值强，在后续工作中可继续开发其在其他领域的应用。

Claims (10)

1.一种铜纳米簇的制备方法，其特征在于，包括：

将金属硫蛋白与可溶性铜盐溶液混合，加入强碱，反应后，得到铜纳米簇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属盐溶液为可氯化铜溶液、硝酸铜溶液与硫酸铜溶液中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属硫蛋白与可溶性铜盐的比例为(200～700)mg：1mmol。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属硫蛋白以金属硫蛋白溶液的形式与可溶性铜盐溶液混合；所述金属硫蛋白溶液的浓度为1～5mg/ml；所述可溶性铜盐溶液的浓度为0.5～10mmol/L。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述强碱选自氢氧化钾和/或氢氧化钠；所述强碱与可溶性铜盐的比例为1mol：(0.5～5)mmol。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述强碱以强碱溶液的形式加入；所述强碱溶液的浓度为0.5～2.5mol/L。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为40℃～60℃；所述反应的时间为10～24h；所述混合的温度为40℃～60℃；所述混合的时间为5～30min。

8.权利要求1～7任意一项所制备的铜纳米簇在重金属离子生物传感器中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重金属离子为Pd²⁺和/或Hg²⁺。

10.权利要求1～7任意一项所制备的铜纳米簇在荧光传感平台中的应用。

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