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CN110998310B - 生物分子的电泳分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种电泳分离装置，包括：阳极和阴极、多孔支架材料和液态分离介质，其中，所述分离介质位于所述多孔支架材料内部、与所述阴极和所述阳极接触，并且已经以限定含生物分子的样品迁移路径的定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料，其中，所述样品被所述分离介质包围。本发明还涉及一种电泳分离生物分子的方法，包括本发明的电泳分离装置、含生物分子的样品，其中，在施用分离介质之前，将所述样品施用于所述多孔支架材料，或者将所述样品施用于位于所述多孔支架材料内部的分离介质，使得所述样品被分离介质包围，其中，能够自由选择所述样品在所述分离介质的几何形状内部的位置，并且通过所述阳极和所述阴极对所述分离介质施加电压，使得所述生物分子在所述分离介质内部迁移。

Description

生物分子的电泳分离
技术领域
本发明涉及一种电泳分离装置，包括：阳极和阴极、多孔支架材料和液态分离介质，其中，所述分离介质位于所述多孔支架材料内部，与所述阴极和所述阳极接触，并且已经以限定含生物分子的样品迁移路径的定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料，其中，所述样品被所述分离介质包围。本发明还涉及一种电泳分离生物分子的方法，包括本发明的电泳分离装置和含生物分子的样品，其中，在施用所述分离介质之前将所述样品施用于所述多孔支架材料，或者将所述样品施用于位于所述多孔支架材料内部的分离介质，使得所述样品被分离介质包围，其中，能够自由选择所述样品在所述分离介质的几何形状内部的位置，并且通过所述阳极和所述阴极对所述分离介质施加电压，使得所述生物分子在所述分离介质内部迁移。
背景技术
印迹方法如Southern印迹法、Western印迹法和Northern印迹法用于检测特定生物分子，如样品中的特定序列的核酸或蛋白。最重要的步骤是用于分离样品中的生物分子的凝胶电泳、生物分子到印迹膜的转移以及生物分子的随后检测。用于带有各个步骤的常规Southern印迹法的方法步骤的基本描述能够在T.A.Brown的Enzyclopedia of LifeSciences(2001)(生命科学酶学杂志(2001))中找到。
在常规的印迹法中，在将待分析样品施用于相应的印迹方法中之前，必须知道或必须确定待分析样品的浓度。由于这些方法的灵敏度相对较低，所述样品必须含有微克范围内的生物分子。生物分子到膜的转移或印迹通常在电泳过程中发生在生物分子在凝胶中迁移路径的正交方向上。
这些电泳方法和印迹方法具有若干缺点。以传统形式进行印迹需要花费多达2天的大量时间。分离和膜转移的操作能够占所需总时间的50％以上。已经开发出所谓的微型凝胶和预制凝胶以使制备分离凝胶的时间最小化。而且，已经开发出特定的印迹系统以加速生物分子从凝胶到印迹膜的转移。然而，这些开发仅加速了该过程的各个步骤。而且，这种技术方案仍未解决难以分析低浓度样品的问题。
此外，诱导分子在与就电泳过程中的迁移路径而言的正交方向上迁移的印迹过程通常与不完全转移相关，这可能是由膜与凝胶之间存在气泡、迁移穿过印迹膜的分子的损失和分离分辨率由于弄脏(smearing)转移的分子而变差所造成。
已经开发出微流体电泳技术来克服这些限制中的一些。A.J.Hughes(PNAS，第21450-21455页，2012年12月26日)已描述了一种微流体western印迹技术。然而，这种系统代表封闭的微流体系统，并且不涉及生物分子到膜的结合或固定，从而导致有限的分析和检测选择。此外，由于无法对微流体装置内的迁移路径进行定制设计，预制的结构化微流体芯片的使用受到限制。另外，这种芯片的制造导致成本相对较高。
因此，迫切需要开发通过电泳以及分离的生物分子到分离介质或优选到膜的结合来加速并改善含生物分子的样品组分分离的微流体方法和装置。此外，与已知方法相比，必须增强检测仅少量存在的分子的灵敏度，以允许分析少量的样品组分。此外，需要定制的电泳装置以允许对在电泳装置内的特定形状的迁移路径进行设计。
发明内容
鉴于现有技术，本发明所要解决的技术问题是提供用于电泳分离生物分子的改进的电泳装置和方法，其克服了现有技术的局限性和缺点并且允许更快地分离含生物分子的样品组分以及与分离介质或膜的结合、提高检测灵敏度，并且为样品提供定制的迁移路径。
上述技术问题是通过独立权利要求的特征来解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。
因此，本发明涉及一种电泳分离装置，包括：
-阳极和阴极；
-多孔支架材料；和
-液态分离介质，其中，所述分离介质位于所述多孔支架材料内部、与所述阴极和所述阳极接触、并且已经以限定含生物分子的样品迁移路径的定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料，其中，所述样品被所述分离介质包围。
本发明的电泳分离装置允许在液态分离介质内分离含生物分子的样品的组分。液态分离介质位于多孔支架材料内部。这意味着多孔支架材料围绕液态分离介质，该液态分离介质存在于多孔支架材料的孔或中空空间或空腔中。
所述装置包括阳极和阴极，它们都与液态分离介质接触。在本发明的意义上，“与……接触”是指液态分离介质分别与阳极和阴极电连接，使得能够在各个接触点上对液态分离介质施加电场。这允许在液态分离介质内的阳极与阴极之间施加电压，从而形成电场、迁移并最终分离被液态分离介质包围的样品中所包含的组分。由于所述组分的尺寸、分子量、电荷和/或等电点(pI、pH(I)、IEP)而可能发生所述组分的分离。
在优选的实施方式中，本发明包括多个阳极和多个阴极。例如，本发明的装置能够包括两个阳极和两个阴极，使得能够在连接至不同电极的独立分离通道中对两个样品进行平行分析。
由于样品被位于多孔支架材料内部的液态分离介质包围，能够将所述样品的组分固定在支架上或在支架中，而无需常规电泳和印迹方法中所必需的样品组分从分离介质到支架材料上的转移。这导致更快且更有效的过程，因为通过将液态分离介质放置在多孔支架材料内部，已经将电泳和印迹分离这两个耗时的过程合并在单一步骤中。在本发明的优选的实施方式中，制备本发明的装置的过程、通过电泳来分离含生物分子的样品组分的过程以及将待分析的生物分子与多孔支架介质或液态分离介质结合的过程花费小于10分钟。
通过将分离介质这种令人惊讶地放置在本发明的装置的多孔支架材料内部，省去了常规电泳和印迹程序中必需的许多手动处理步骤。此外，该过程可以至少部分地自动化并且不需要人工干预。由于该方法不涉及需要样品中分离出的组分在迁移方向的正交方向上迁移的印迹步骤，因此没有丢失分离分辨率的风险。在印迹或转移过程中不会出现组分的弄脏。而且，没有像传统的印迹方法中那样通过印迹膜进行迁移而丢失样品材料的风险。
本发明的装置允许设计位于多孔支架材料内部的定制迁移路径。在本发明的意义上，术语“定制几何形状”涉及被液态分离介质覆盖的多孔支架材料的面积或空间。液态分离介质被固定在多孔支架材料内的特定地点或位置，其由于毛细管力(毛细作用)而进行最初施加，该毛细管力是由液态分离介质与周围的固体表面之间的分子间力、表面张力、内聚力和/或粘附力而产生的。这些力确保了多孔支架材料内液态分离介质的几何形状的稳定性。由于毛细管力将液态分离介质保留在多孔支架材料内的特定位置，因此用户能够根据预期的分析或实验的要求而自由地设计液态分离介质在多孔支架材料内的位置和形状，从而允许按需设计液态分离介质在多孔支架内的形状。
样品组分的迁移路径是由在分离介质分别与阳极和阴极的接触点之间的液态分离介质的几何形状所限定。术语“迁移路径”是指由液态分离介质形成的分离通道。样品组分在通过电场施加于样品组分上的力的方向上沿着液态分离介质的迁移路径迁移。
在本发明的意义上，分离介质对样品的“包围”是指多孔支架材料内的样品被分离介质包围。液态分离介质对样品的包围还包括例如样品位于多孔支架材料底部的状态，其中，支架材料能够放置在固体支持物上，因此样品被液态分离介质和多孔支架内的固体支持物包围。
在本发明的意义上，含生物分子的样品可以是任何种类的包含生物分子的样品。样品可以是液态、半固态、凝胶形式或固态的。根据本发明的样品的实例包括但不限于：细胞裂解物、组织匀浆、含生物分子的液体，其中，生物分子可以例如在溶液中或与固体珠偶联。
在本发明的意义上，生物分子包括但不限于：核酸、蛋白、酶、肽、抗体、糖分子、脂质及其组合，例如，糖基化蛋白或其他糖基化生物分子。
在本发明的上下文中，核酸包括但不限于：DNA、RNA、PNA、ssDNA、dsDNA、RNA、mRNA、tRNA、lncRNA、ncRNA、microRNA、siRNA、rRNA、sgRNA、piRNA、rmRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、gRNA、病毒RNA、修饰RNA，例如LNA。在本发明的意义上，寡核苷酸是长度约为200个核苷酸的相对短的核酸分子。
在本发明的意义上，糖分子包括碳水化合物或糖类，其包括单糖、二糖、寡糖和多糖。术语糖基化描述了导致糖分子与蛋白、脂质或其他分子结合的酶促和化学反应，其中，糖基化的产物分子被称为糖苷，其包括糖蛋白、肽聚糖和糖脂。
在本发明的上下文中，脂质是疏水性分子，其部分或完全不溶于水并且由于其低极性而溶于亲脂性或疏水性溶剂中。脂质是细胞膜的重要结构成分，被用作生物体的能量来源，并且具有信号转导的功能。脂质包括但不限于：脂肪酸、脂肪、蜡、甾醇类、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯、磷脂、鞘脂、脂多糖和类异戊二烯(类萜)。
在优选的实施方式中，由于各个生物分子的特定性质，包括但不限于电性质、等电点、尺寸、形态结构、分子量，因此在通过液态分离介质进行的迁移过程中发生了样品组分(如不同的生物分子)的分离。另外，所述分离可能受到液态分离介质以及多孔支架材料的孔径、电性质和流体性质(例如，电导率、粘度、表面张力和接触角)所影响。而且，所述分离受到像生物分子与液态分离介质和/或多孔支架之间的分子相互作用的联合效应所影响。
在本发明的优选的实施方式中，有可能仅部分多孔支架材料被液态分离介质润湿。这意味着：仅多部分孔支架材料被液态分离介质填充或覆盖，而多孔支架的其他部分保持为空或干燥。在此上下文中，空的或干燥的意味着：在这些部分中，多孔材料的中空空间或孔未被液态分离介质所填充。在本发明的其他优选的实施方式中，多孔支架材料被液态分离介质完全填充。
本发明的优选的实施方式不需要疏水性边界或边界表面来确保液态分离介质在多孔支架材料内的几何形状的稳定性。在其他优选的实施方式中，本发明包括疏水性边界来稳定液态分离介质在多孔支架材料内的几何形状。
在本发明的优选的实施方式中，液态分离介质是液体或凝胶，所述液体或凝胶选自包括液态或固态的聚丙烯酰胺类凝胶、琼脂糖类凝胶、水凝胶、梯度凝胶和缓冲溶液所组成的组中。
在本发明的意义上，术语“液态分离介质”涉及其制备需要水或其他液体(像无机或有机溶剂)或添加剂(DMSO、DMF或甘油)的任何种类的水基水溶液或凝胶。根据本发明的液态分离介质的实例包括但不限于：水基凝胶、缓冲液、盐溶液、液态凝胶、固态凝胶、液态或固态聚丙烯酰胺类凝胶、线性或交联的聚丙烯酰胺类凝胶、琼脂糖类凝胶、水凝胶(如藻酸盐、普朗尼克、明胶或甲壳质水凝胶)、梯度凝胶和缓冲溶液，以及上述凝胶类型的混合物。此外，液态分离介质能够形成分离通道，其能够包含大于一种的液体或凝胶。例如，由液态分离介质形成的分离通道能够由不同液体或凝胶类型的不同部分组装而形成。例如，分离通道能够包括由聚丙烯酰胺形成的部分，其连接至由琼脂糖形成的部分。
本发明的巨大优点是具有导电性的液体和凝胶的全部种类都适合用作液态分离介质。令人惊讶的是，在本发明的优选的实施方式中，不包含凝胶样结构的液体可以用作液态分离介质，其在多孔支架内部保持定制的、用户设计的几何形状，由于在介质和支架材料之间的毛细力作用而无需疏水性边界。关于包含凝胶作为液态分离介质的本发明的实施方式，令人惊讶的是凝胶容易渗透多孔支架材料。
在本发明的优选的实施方式中，所述分离介质形成宽度为25μm～1000μm，优选为30μm～500μm，更优选为50μm～250μm，最优选为125μm的分离通道。
分离通道的宽度是在与样品组分的迁移路径正交的方向上并且在多孔支架材料的平面内测量的，其在本发明的优选的实施方式中是二维的。分离通道的小宽度与小面积横截面相关。在微米范围内的小宽度是特别有利的，这是因为能够在施加相对较低的电流的同时产生使样品组分的分离快速且迁移速度高的高电场，从而减少热量生成，否则会对分离性能产生不利影响。
此外，分离通道的小尺寸减少了组装本发明的装置所需的分离介质的用量，因此降低了材料成本。它还与所有其他相关材料的用量减少相关。由于分离通道的规模小，因此可以大大减小分离介质中包围的样品的体积。这使得分离精度和分辨率提高。而且，样品检测的灵敏度大大提高。
在本发明的优选的实施方式中，通道具有约25μm～1000μm的宽度。该实施方式是特别有利的，这是因为能够调节通道的宽度以适应样品种类和待分析的样品体积，并且可以自由地分析极小的样品体积以及相对较大的体积(其需要分离通道的直径较大)。此外，此范围内的分离通道能够在没有复杂装置的情况下例如通过移液管施用于支架材料上并且不易蒸发。
在本发明的另一个优选的实施方式中，通道具有约30μm～500μm的宽度。该实施方式是特别有利的，这是因为小规模的优点甚至更加明显。另一个优点是，生成宽度高达500μm的线的过程自动化就所需组分的成本而言是最可行的。此外，由于人的分辨力可以区分200～400μm范围内的结构，仍然能够用肉眼观察这种规模的迁移路径。这允许在制造过程中对分离通道进行光学控制，而无需复杂的装置。
在本发明的另一个优选的实施方式中，通道具有约50μm～250μm的宽度。该实施方式是特别有利的，这是因为除了小尺寸的优点(包括高分离分辨率、快速分离、较高的检测灵敏度以及小样品体积的施用和检测)，还能够用允许产生在大约50～250μm范围内的液态分离介质的管线的装置将分离介质施用到多孔支架上，而无需通过按需打印或直接书写方法或压力驱动方法产生小于50μm的极细管线的特定的分配器、(管)喷嘴或注射泵。
在本发明的特别优选的实施方式中，通道具有约125μm的宽度。该通道宽度是特别有利的，这是因为它代表了实现了小规模的优点的最佳宽度，同时允许施用从皮升到微升规模范围的各种样品量以及容易的制造。
在本发明的优选实施方式中，所述分离介质在与所述阳极和所述阴极的接触点处形成流体储层。
术语“储层”是指分离介质在与阳极和阴极的接触点处的扩展、膨胀或扩张。这些储层是特别有利的，这是因为当将包括液态分离介质的多孔支架放置在阳极和阴极上时，它们会提供柔性，反之亦然。由于分离通道的规模小，否则将难以确保能够以这种细线施用于支架上的分离介质接触阳极和阴极。此外，通过电极与分离介质之间的储层所实现的大接触面积防止热量产生，从而防止可能导致电流不稳定的气泡形成。另外，储层供应增加量的电荷载流子，以保持电流稳定，从而保持迁移速度恒定。储层可以具有肉眼可见的规模，使得使用者知道如何相对于电极放置包含液态分离介质的支架，反之亦然。类似地，当仅在将支架放置到阳极和阴极上之后才将分离介质添加到支架中时，在阳极和阴极上施用分离介质容器以确保产生有效的接触点是有用的。随后能够通过分离介质的细微结构(如细线或曲折)连接接触点处的储层。
在本发明的优选的实施方式中，分离介质的几何形状形成复杂的结构，优选地选自包括圆形、正方形、椭圆形、交叉的T形结构、Y形结构、曲折形、宽度增加的通道及其组合的组。T形结构和Y形结构能够使基于芯片的电泳中使用的电动注射原理转移到本发明，并且它们提供了随后将不同样品或分析物注射到同一通道中的可能性。较大的结构(像正方形、圆形和椭圆形)是有利的，这是因为它们用作流体屏障或约束，以防止在由流体管线连接的不平衡储层之间引起的压力驱动流。在宽度增加的线内，电流密度连续降低，从而使生物分子减速。通过这种连续减速，所述样品变得聚焦，从而改善分离性能。
在某些优选的实施方式中，还能够将不同和/或分离的形状的液态分离介质施用于支架上，这允许平行分析分离的迁移路径(其能够具有不同的形状)中的不同样品。
在本发明的特定的实施方式中，多孔支架材料具有约0.05～1μm的孔径。这种实施方式是特别有利的，这是因为这种孔径范围允许使用具有变化孔径的不规则结构的支架。而且，孔径允许使液体介质的几何形状稳定，而不影响可溶性生物分子通过分离介质进行的迁移。然而，可能会影响与样品中所含的固体珠偶联的生物分子的迁移。
在本发明的特定实施方式中，多孔支架材料具有约0.1～0.5μm的孔径。这种孔径范围还确保了支架材料的均质结构，其允许样品组分在位于支架材料内部的分离介质内不变且连续的迁移。
在本发明的特定的实施方式中，多孔支架材料具有约0.2μm的孔径。除了上面提到的对于较宽孔径范围的优点之外，约0.2μm的孔径确保了多孔支架材料内液态分离介质的最佳稳定性。这种特定的孔径确保了高毛细作用力，使得能够设计并稳定具有仅几微米的宽度的精细且复杂的几何形状，这些几何形状是由多孔支架内部的液态分离介质形成的。
根据本发明的另一个优选的实施方式，多孔支架材料是二维的，并且具有约10～2000μm，优选为约50～1000μm，更优选为约100～400μm，最优选为约200μm的厚度。
术语“二维”是指多孔支架材料的平面形状。在优选的实施方式中，多孔支架材料是膜。膜或支架材料的厚度限定了本发明装置中分离通道的最大高度。因此，厚度能够具有对分离通道的横截面直径的重要影响。
约10～1000μm的厚度是特别有利的，这是因为能够调节分离通道的高度以适应应分析的样品的种类和体积。此外，它还提供了分析极小样品体积以及需要较大直径分离通道的相对大样品体积的灵活性。
约50～1000μm的厚度是特别有利的，这是因为分离通道的小规模直径的优点甚至更加明显。此外，低于50μm的极薄膜非常易碎，并且能够在施用分离介质或其他处理步骤中是很容易破裂的。
约100～400μm的厚度是特别有利的，这是因为除了小规模的优点(包括高分离分辨率、快速分离、较高的检测灵敏度，以及小样品体积的施用和检测)之外，它还能够使多孔支架材料内部的液态分离介质的几何形状高度稳定。
约200μm的厚度是特别有利的，这是因为它代表了分离通道的最佳高度，使得能够实现小规模的优点、从皮升到微升规模的各种样品体积的应用，以及由于多孔膜(支架材料)的稳定性而易于制造。此外，较小的高度有利于生物分子的检测，这是因为在不透明的较厚膜的情况下，仅部分分析物或样品将会被检测和量测量到。
在本发明特别优选的实施方式中，多孔支架材料或分离介质表现出对样品或样品组分的结合能力。
特别地，结合能力可以针对待分析样品的组分。例如，在分析样品中所含的DNA的情况下，支架材料或分离介质可以表现出对DNA的结合能力。相同原理适用于分析其他核酸、蛋白、糖、脂质或其他生物分子或其组合。此外，结合能力能够针对样品中所含的固体珠。这些珠能够例如通过涂覆特定的分子或化学基团而具有特定的结合属性。
在本发明的优选的实施方式中，多孔支架材料表现出对样品或样品组分的结合能力。当将电压施加于分离介质和封闭的样品上时，样品组分仍可能迁移，这是因为通过电场施加的力能够高于支架与样品组分之间的结合力。
在本发明的优选的实施方式中，液态分离介质表现出对样品或样品组分的结合能力。当将电压施加于分离介质和封闭的样品上时，样品组分仍可能迁移，这是因为通过电场施加的力能够高于分离介质与样品组分之间的结合力。
在本发明的优选的实施方式中，液态分离介质表现出对样品或样品组分的结合能力和/或对支架材料的结合能力。如果液态分离介质表现出对样品或样品组分的结合能力和对支架材料的结合能力，则样品或样品组分通过分离介质而结合至支架材料。当将电压施加于分离介质和封闭的样品上时，样品组分仍可能迁移，这是因为通过电场施加的力能够高于分离介质与样品组分之间的结合力。
在本发明的优选的实施方式中，多孔支架材料表现出对液态分离介质的结合能力，并且液态分离介质表现出对样品或样品组分的结合能力。
在本发明的特别优选的实施方式中，结合能力在施加结合刺激时被激活。在本发明的上下文中，结合刺激包括但不限于：热辐射、UV(紫外线)辐射、IR(红外)辐射或任何其他光辐射、静电相互作用、生物结合、磁性相互作用、粘附和通过化学反应的活化进行的化学修饰。特别有利的是，借助于这种刺激，样品组分能够在分离之前、在分离过程中和/或在分离之后的选定时间点结合到支架材料或分离介质上，或者甚至结合到两者上。
在本发明的优选的实施方式中，在注射样品和/或将分离介质施用于多孔支架之前将特定生物分子结合到多孔支架内的某个位置是有利的，这是因为特定生物分子物质能够在电泳迁移过程中与“预结合”的生物分子相互作用或结合。
根据本发明的优选的实施方式，多孔支架材料是聚偏二氟乙烯(PVDF)、尼龙或硝酸纤维素。
在本发明的上下文中使用PVDF是特别有利的，这是因为PVDF膜提供了高机械强度并且允许重新探测和贮藏。此外，PVDF膜具有对生物分子特别是蛋白的高结合能力。此外，PVDF是疏水性的，因此适用于疏水性生物分子的分析。
在本发明的意义上，使用硝化纤维素作为多孔支架材料是有利的，这是因为它具有对生物分子特别是蛋白的高亲和力，因此具有高保留能力。而且，它是一种相对便宜的材料。而且，硝酸纤维素很容易润湿，因此不需要使用甲醇。
使用根据本发明的尼龙膜是有利的，这是因为与其他膜材料相比，这种膜具有高机械强度。而且，生物分子与膜的结合机理是静电相互作用，并且尼龙膜的结合能力高。此外，例如使用抗体进行多重探测是可能的。而且，核酸能够通过可控地暴露于UV光(UV交联)而共价连接到尼龙膜上。
在本发明的上下文中使用带电荷的硝化纤维素和尼龙膜是有利的，这是因为由于这些膜的带电，它们能够初始结合带相反电荷的生物分子。
能够用作根据本发明的多孔支架材料的其他可能的材料包括但不限于：玻璃纤维膜、聚合物、陶瓷(如氧化铝)、聚砜、聚醚砜(PES)纤维素、纤维素酯(如醋酸纤维素或硝酸纤维素)、再生纤维素(RC)、硅氧烷、聚酰胺/尼龙(例如PA6、PA 6.6、PA 6.10、PA 6.12、PA 11、PA 12)、聚酰胺酰亚胺、聚酰胺尿素、聚碳酸酯、陶瓷、钢、银、硅、沸石(铝硅酸盐)、聚丙烯腈(PAN)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)和聚哌嗪酰胺(polypiperazinamide)。
在本发明的优选的实施方式中，将多孔支架材料放置在包括阳极和阴极的衬底基板上。在优选的实施方式中，基板是平面的。基板可以由任何期望的材料制成，如玻璃、硅、塑料、陶瓷、半导体等。
本发明的阳极和阴极能够由基板提供，例如，呈作为平面基板一部分的平面或扁平电极的形式。在将多孔支架材料放置在包括阳极和阴极的平面基板上之后，能够在多孔支架材料下方的阳极和阴极的位置处例如以储层的形式添加液态分离介质，以使液体分离介质与阳极和阴极接触。可替代地，当将支架材料放置在平面支撑物上时，液态分离介质能够已经位于多孔支架材料内部。在这种情况下，能够以使液态分离介质与阴极和阳极接触的方式放置多孔支架材料。该实施方式是特别有利的，这是因为能够选择任何种类的多孔支架材料并且将其放置在包括阳极和阴极的支撑物上。
在本发明的优选的实施方式中，在产生流体分离系统之后，例如通过将电极浸入储层中，经由用作阳极或阴极的棒状或针状电极从顶部电接触多孔支架内的分离介质。这种方法的优点是不需要修改衬底基板或多孔支架。这些电极能被安装到放置在多孔支架上方或周围的框架上，或者在自动化方面它们被安装到处理装置上。
在本发明的另一优选的实施方式中，多孔支架材料包括阳极和阴极。在这种情况下，阳极和阴极已被整合到多孔支架材料中，并且在组装本发明的装置时，液态分离介质能被施用于阳极和阴极在支架材料内的位置。这种实施方式是特别有利的，这是因为支架材料已经与阳极和阴极组装在一起，并且不需要其他组装步骤。
本发明还涉及一种用于制造本发明的电泳分离装置的方法，其中，所述分离介质以限定样品迁移路径的定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料的表面上并且穿透所述多孔支架材料。多孔支架材料的渗透是指液态分离介质从支架材料的表面迁移到中空空间或孔中，使得液态分离介质位于多孔支架材料内部。
在本发明的特别优选的实施方式中，将液态分离介质放置在表面上，然后通过毛细管力将其吸入多孔支架材料中。可替代地，能够通过在已被液态分离介质覆盖的区域下方施用于支架材料上的真空将液态分离介质吸入多孔支架材料中，或者通过离心力来介导液态分离介质迁移到多孔支架介质中。
在本发明的优选的实施方式中，所述分离介质通过半接触式书写(semi-contactwriting)、非接触式分配(non-contact dispensing)或接触式分配(contact dispensing)而被施用于所述多孔支架材料的表面上。在另一优选的实施方式中，通过注射器或蠕动泵将分离介质施用到多孔支架材料的表面上。
在本发明的上下文中，使用这些方法的很大优点是：能够以自动化的、软件辅助的方式将液态分离介质以所需的用户定义的几何形状施用于膜上。
在本发明的上下文中，液态分离介质的施用能够通过借助于皮升或纳升分配器分配单滴或多滴来进行。结构化、注射、过载、检测和施加电压所需的所有仪器都能够安装在三轴系统上，并且能够进行自动控制。也可以基于软件并且自动化地实现所需的几何形状。唯一的手动步骤可以是分配器的填充以及基板和多孔支架的放置。
半接触式书写是指将液态分离介质施用于多孔支架材料上的本发明另一优选方法(Gutzweiler等人，J.Micromech.Microeng.26(2016)045018(10pp))。因此，使喷嘴靠近多孔支架材料的表面移动，并且在支架材料和喷嘴之间形成毛细管桥。由于毛细流，通过多孔支架材料或喷嘴的可控移动能够产生流体线或任何其他几何形状。在本发明的方法中，使用半接触式书写是特别有利的，这是因为它有利于按需施加液态分离介质，因此理想地适合于快速设计用户定制的几何形状。此外，它能够实现低至100μm的结构宽度和范围为从书写单层的5.5μm直至堆叠的100μm的可控结构高度。作为独特的性质，能够通过施用局部堆叠来实现横跨基板可自由选择的高度变化。另外，喷嘴不接触支架材料，因此支架上存在的组分(例如，先前施用的样品)污染喷嘴或从喷嘴喷射的分离介质的风险极低。
非接触式分配涉及一种用于生产体积通常小于一微升的液体介质剂量的方法，其中，液滴形成在喷嘴的末端，但与支架材料上的目标区域相距足够远，使得液滴在它撞击支架材料的表面之前与喷嘴分离。在连续分配液体的同时，通过多孔支架材料或喷嘴的可控移动能够产生流体线或任何其他几何形状。使用非接触式分配来制造本发明的装置是特别有利的，这是因为该方法非常快并且允许在短时间内将复杂形状的液态分离介质施用于支架材料上。此外，在支架材料与喷嘴之间没有接触并且没有桥接形成。因此，几乎没有支架材料上存在的物质污染液态分离介质的风险。
接触式分配是指液滴形成在喷嘴或小尖端的出口处并通过接触而沉积而液滴仍在喷嘴或尖端上的方法。通过多孔支架材料或喷嘴的受控移动能够产生流体线或任何其他几何形状。在本发明的方法中，使用接触式分配是特别有利的，这是因为它允许非常准确且精确地分配极薄且复杂的结构，而不会对分配的液态分离介质产生压力。
本发明还涉及一种用于电泳分离生物分子的方法，包括：
-提供电泳分离装置，所述电泳分离装置包括：
-阳极和阴极；
-多孔支架材料；和
-液态分离介质，
其中，所述分离介质位于所述多孔支架材料内部、与所述阴极和所述阳极接触、以及已经以限定样品迁移路径的定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料，其中，所述样品被所述分离介质包围，以及
-含生物分子的样品，其中，
-在施用所述分离介质之前，将所述样品施用于所述多孔支架材料上，或者
-将所述样品施用于位于所述多孔支架材料内部的分离介质，使得所述样品被所述分离介质包围，
其中，能够自由选择所述样品在所述分离介质的几何形状内的位置，
-通过所述阳极和所述阴极对所述分离介质施加电压，使得所述生物分子在所述分离介质内部迁移。
根据本发明的电泳分离生物分子的方法，能够在施用液态分离介质之前或在施用液态分离介质之后将样品施用于多孔支架材料。在这两种情况下，在已将样品和液态分离介质施用于多孔支架材料之后，样品会被位于多孔支架材料内部的分离介质的几何形状所包围或环绕。
在本发明的实施方式中，将样品施用于多孔支架材料涉及将样品施用于多孔支架材料的表面上，以及随后通过例如毛细力、真空、压力或离心力将样品渗透到支架材料的孔中，其中，液态分离介质能够已经位于多孔支架材料内，或者会在施用样品之后施用。
在本发明的另一实施方式中，将样品施用于多孔支架材料涉及将样品注射到多孔支架材料中，其中，注射能够以用于注射的器械的尖端或喷嘴穿透多孔支架材料的方式进行。在这种情况下，液态分离介质能够已经位于多孔支架材料内，或者会在样品注入后进行施用。在液态分离介质已经位于多孔支架材料内部的情况下，能够将样品注入液态分离介质中。
用户能够自由选择样品的位置或定位。样品能够位于由阳极与阴极之间的液态分离介质形成的迁移路径内或位于容器(如果存在的话)内的任何位置。
液态分离介质内的阳极与阴极之间施加电压会引起样品中所含组分迁移并最终分离。组分可能由于其尺寸、分子量、分子结构、电荷和/或等电点(pI、pH(I)、IEP)而发生分离。
在本发明的优选的实施方式中，所述样品通过半接触式书写或非接触式分配或接触式分配进行施用。在本发明的意义上，“施用样品”能够涉及将样品施用至支架材料的表面上或将样品注入分离介质中。
根据本发明的优选的实施方式，所述样品包含生物分子，所述生物分子优选选自包括DNA、RNA、蛋白、脂质、碳水化合物以及它们组合的组。
在本发明的优选的实施方式中，样品体积为约1pl～1000nl，优选为约10pl～100nl，更优选为约100pl～10nl，最优选为约1nl。
约1pl～1000nl的范围是特别有利的，这是因为它涉及小样品体积来产生高分离分辨率。
约10μl～100nl的范围甚至是更优选的，这是因为除了高分离分辨率的优点之外，还需要较小的最大体积来更有效地使用样品材料。
约100pl～10nl的样品体积范围是特别优选的，这是因为除了上述优点之外，它还能够实现样品体积的精确剂量，而同时最大体积仍然小到足以允许使用能够容纳样品而液态分离介质的几何形状不会变形的非常薄的迁移路径。此外，这种样品体积能够实现样品组分的高灵敏度或检测，并同时分离精度非常高。
在本发明的上下文中，约1nl的样品体积是最优选的，这是因为由于样品的体积小，能够减少本发明方法中涉及的所有其他材料的用量。
在本发明的优选的实施方式中，一种或多种生物分子在迁移过程中进行可视化和/或定量。迁移过程中生物分子的可视化和/或定量能够借助于激光诱导的荧光来进行。因此，在该实施方式的上下文中，应该荧光标记待检测的生物分子。这能够通过将生物分子与荧光团偶联来实现。
能够在本发明的上下文中使用的荧光团(或荧光染料)是能够在光激发时重新发光的荧光化合物。用作构建本发明的标记生物分子中的标记的荧光团包括，但不要求穷举：罗丹明及衍生物，如德州红(Texas Red)；荧光素及衍生物，如5-溴甲基荧光素；荧光黄(Lucifer Yellow)；IAEDANS；7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯；7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯；7-NH2-4CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)；单溴二烯；三磺酸酯，如层叠蓝(Cascade Blue)和单溴三甲基氨基双满(monobromotrimethyl-ammoniobimane)；FAM；TET；CAL萤石金540(CALFluor Gold 540)；HEX；JOE；VIC；CAL萤石橙560(CAL Fluor Orange560)；Cy3；NED；Quasar570；Oyster 556；TMR；CAL萤石红590(CAL Fluor Red 590)；ROX；LC红610(LC red 610)；CAL萤石红610(CAL Fluor Red 610)；德州红(Texas red)；LC红610(LC red 610)；CAL萤石橙610(CAL Fluor Red610)；LC红640(LC red 640)；CAL萤石红635(CAL Fluor Red 635)；Cy5；LC红670(LC red 670)；Quasar 670；Oyster 645；LC red 705；Cy5.5；BODIPY FL；俄勒冈绿488(Oregon Green 488)；罗丹明绿(Rhodamine Green)；俄勒冈州绿514(OregonGreen 514)；卡尔金(Cal Gold)；BODIPY R6Gj；亚基马黄(Yakima Yellow)；JOE；HEX；Cal橙(Cal Orange)；BODIPY TMR-X；Quasar-570/Cy3；TAMRA；罗丹明红X(Rhodamine Red-X)；罗丹明B(Rhodamine B)；罗丹明6G(Rhodamine 6G)；罗丹明红(Redmond Red)；BODIPY 581/591；Cy3.5；卡尔红/德州红(Cal Red/Texas Red)；BODIPY TR-X；BODIPY 630/665-X；Pulsar-650；Quasar-670/Cy5。
可替代地，本发明的生物分子可以是固有荧光性的，例如荧光蛋白。在另一优选的实施方式中，荧光生物分子能够与待检测的生物分子连接。能够在本发明的上下文中使用的荧光蛋白的非限制性实例包括：光蛋白，如水母发光蛋白；欧伯林蛋白(obelin)；水母荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP、EGFP、AcGFP1)、青色荧光蛋白(CFP、ECFP)、蓝色荧光蛋白(BFP、EBFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP、EYFP)、紫外荧光蛋白(GFPuv)，其荧光增强变体，其肽去稳定变体等；珊瑚礁荧光蛋白，例如香菇珊瑚(Discosoma)红色荧光蛋白(DsRed、DsRed1、DsRed2和DsRed-Express)、美国海葵(Anemonia)红色荧光蛋白(AsRed和AsRed2)、夏威夷海葵(Heteractis)远红色荧光蛋白(HcRed、HcRed1)、美国海葵青色荧光蛋白(AmCyan、AmCyan1)、花群海葵(Zoanthus)绿色荧光蛋白(ZsGreen、ZsGreen1)、花群海葵黄色荧光蛋白(ZsYellow、ZsYellow1)，其荧光增强变体，其肽去稳定变体等；海洋腔肠(Renilla reniformis)绿色荧光蛋白(Vhrity hrGFP)，其荧光增强变体，其肽去稳定变体等；以及大星珊瑚荧光蛋白，例如高星珊瑚(Montastrea Cavernosa)荧光蛋白(Fluorescent Protein)，其荧光增强变体，其肽去稳定变体等。本领域技术人员理解这些荧光蛋白和多种其他荧光蛋白可用作本发明方面的荧光蛋白，参见，例如Jennifer Lippincott-Schwartz和George H.Patterson的Development and Use ofFluorescent Protein Markers in Living Cells,300(5616)Science 87-91(2003)；以及Jin Zhang等人的3(12)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.906-918(2002)。本领域技术人员理解：这些和许多其他荧光蛋白包括上述天然存在的荧光蛋白的物种直系同源物和旁系同源物以及工程化的荧光蛋白，能够用作本说明书各方面中公开的荧光蛋白。
在本发明的另一优选的实施方式中，嵌入的荧光染料能够用于检测核酸分子。特别地，这些染料包括但不限于：溴化乙锭、碘化丙啶、Hoechst 33258，Hoechst 33342、吖啶橙、溴化乙锭均二聚体、EverGreen，以及SYBR和SYTO系列的所有染料。这样的染料还包括来自Molecular Probes(俄勒冈州尤金)的POPO、BOBO、YOYO和TOTO。
在本发明方法的优选的实施方式中，所述生物分子在施用结合刺激时被固定在所述多孔支架材料或所述分离介质上。在本发明的上下文中，结合刺激包括但不限于：热辐射、UV(紫外线)辐射、IR(红外)辐射或任何其他光辐射、静电相互作用、生物结合、磁性相互作用、粘附和通过化学反应的活化进行的化学修饰。本发明方法的特定优点是能够通过特定刺激来诱导生物分子与分离介质或支架材料的特异性结合。令人惊讶地，该特征允许在生物分子与支架材料和分离介质接触时将其分离并且仅在施加刺激时才发生结合，或者通过为使生物分子迁移通过分离介质所施加的力来抑制或克服刺激。因此，在本发明的上下文中，常规印迹程序的转移步骤可能是多余的，这是因为生物分子能够在与膜接触时迁移。
根据本发明的优选的实施方式，所述生物分子通过检测物进行检测，所述检测物优选选自与所述生物分子特异性结合的荧光标记、核酸探针、抗体、适体和分子所组成的组中。各种检测的机构能够包括特定的标记，例如但不限于：荧光标记、发光标记、特定的反应性化学基团、金颗粒、银颗粒、磁颗粒、金属氧化物颗粒、含标记粒子的珠、非荧光染料或放射性标记。
在本发明的另一优选的实施方式中，在迁移过程中通过紫外(UV)吸收检测来检测生物分子，而无需任何标记。此外，生物分子能够在电化学迁移过程中电化学地经由需要例如能够在衬底基板中实现特定测量电极设置的阻抗检测而被无标记地检测。
在本发明的优选的实施方式中，该检测步骤能够在生物分子已经结合到支架材料上之后进行。在那种情况下，能够洗去液态分离介质和/或已接触支架材料的其他物质，以实现对已结合到支架材料上的生物分子更有效的检测。
在本发明的优选的实施方式中，能够在样品组分已被分离并且生物分子已经结合到支架材料上之前、之后，在检测样品的相同位置处将检测的机构注射到液态分离介质中。在这种情况下，在向液态分离介质施加电压时，检测的机构随后沿着分离通道迁移并且当到达生物分子已经结合至支架材料的位置时特异性地结合至待检测的生物分子。可替代地，能够在施用和分离含生物分子的样品之前施用检测的机构并将其结合至支架材料。当迁移经过检测的机构与支架材料结合的位置时，生物分子随后会与检测的机构结合。
在本发明的优选的实施方式中，一种或多种样品能被施用于位于所述多孔支架材料内部的相同或多个独立的几何形状以进行平行分析。例如，液态分离介质的若干分离通道能被施用作为在多孔支架材料内彼此平行的平行线，并且不同的样品能够在不同的分离通道中平行分析。可替代地，同一样品也可以在相同几何形状的不同分离通道中进行分析以进行分析的技术复制，或在不同分离通道中使用不同的检测的机构分析同一样品。在本发明的另一实施方式中，可以在具有不同几何形状的不同分离通道中分析同一样品。
本发明的小规模使得能够将例如50个宽度为200μm且通道之间的间隙为200μm的液态分离介质的平行分离通道施用至宽度为2cm的膜，从而在单个膜上平行执行50个实验。这个实例说明了本发明方法的可能性和灵活性。
在本发明的另一优选的实施方式中，分离介质至少部分地被不可混溶的流体覆盖以防止蒸发。不可混溶的流体包括油、硅氧烷或氟碳油。在本发明的另一实施方式中，分离介质也能够被盖子或箔覆盖，和/或本发明的装置能够被冷却以避免液体的蒸发。
本领域技术人员知道：上述针对本发明的电泳分离装置的特征、属性和优点以及制造这种装置的方法同样适用于本发明电泳分离的方法。显而易见的是，该装置的优选特征和该装置的制造方法能被整合到本发明的电泳分离方法中，这是因为该方法利用了该装置。
例如，显而易见的是，在电泳分离方法的一个实施方式中，分离介质能够是液态或固态聚丙烯酰胺类凝胶，其在与阳极和阴极的接触点处形成流体储层，形成宽度为25～2000μm的分离通道，并且通过半接触式书写而被施用于多孔支架材料的表面上。因此，在电泳分离方法的上下文中还已公开了该装置和该装置的制造方法的所有特征和优点。
相反地，在电泳分离方法的上下文中已公开的特征也适用于电泳分离装置和制造这种装置的方法。
具体实施方式
通过以下附图进一步描述本发明。这些并非旨在限制本发明的范围，而是代表本发明方面的优选的实施方式，以更好地说明本文所述的发明。
附图说明
图1：本发明方法的示意图。请注意，步骤1和2能够互换
图2：在多孔膜上生成液态分离介质的几何限定结构的可能施用方法的介绍。通过在平面基板上进行非接触式分配和半接触式书写可实现几何限定的结构。
图3：在硝酸纤维素膜内聚丙烯酰胺类凝胶中2个DNA片段的分离。
图4：DNA片段的迁移的实时观察。
附图的详细说明：
图1示出了本发明的装置和方法的优选实施方式的示意图。右下方的插图示出了用非接触式分配器将单个液滴施用于硝酸纤维素膜中的示例注射。剂量给料150pL的含相同长度的片段的DNA溶液(28-bp；100μM，染料：Rhodamin6G)。在这种过程中，步骤1和2也是可互换的，以便将样品直接注入膜内的分离介质中。
图2示出了将液态分离介质施用于多孔支架材料(在这种情况下为膜)上的两种可能的方法。a)示出了在剂量给料装置的运动的同时单滴的连续给料以在膜上产生结构。b)示出了所谓的“半接触式书写”方法。使喷嘴靠近膜移动，并且在基板与喷嘴之间形成毛细管桥。由于毛细流，能够例如通过基板或喷嘴的可控运动来产生流体线。c)示出了通过在平面基板上进行非接触式分配和半接触式书写可实现几何限定的结构，如点、正方形、交叉T形结构。底部的部分示出了在平面基板上的电泳分离系统，包括：由线性聚丙烯酰胺类凝胶制成的分离通道，其具有用于电接触阳极和阴极的两个储层以及作为蒸发保护的油盖。如本文所述，这种系统能被转移到膜中。
图3示出了膜(硝酸纤维素，厚度为125μm)内聚丙烯酰胺类凝胶中2个DNA片段的分离。该片段通过正极附近的激光诱导的荧光来点检。
图4示出了等长DNA片段的迁移的实时观察(28bp，rhodamine 6G，λem＝555nm)。带有线光学器件λex＝532nm)的激光器(用于照亮整条线，并且带有高通滤光片(λ截止＝550nm)的CCD摄像机用于检测发射光。
实施例
通过以下实施例进一步描述本发明。这些并非旨在限制本发明的范围，而是代表本发明方面的优选的实施方式，以更好地说明本文所述的发明。
实施例1：
将具有扁平电极的平面基板用作衬底材料。将多孔膜跨过电极(阳极和阴极)放置在该基板上。在第一处理步骤中，通过非接触式方法将1nl滴液的样品施用于膜上。
在第二处理步骤中，将分离介质以限定的几何形状施用于所述膜上，使得先前施用的样品位于分离介质的几何形状内。以线的形式施加介质以产生分离通道。为了使分离通道连接阳极和阴极，将分离介质以储层的形式施用于膜上的电极接触点上。由于存在膜孔，所述介质通过毛细作用力被吸入所述膜中。以这种方式，不仅在膜内产生了液体分离通道，而且还产生了位于衬底基板上的电极的接触点。为了利用微米级的优点，分离通道具有200μm的宽度。该系统已冷却并被油完全覆盖以防止蒸发。
在第三步骤中，经由电极施加电压，由此沿分离介质的几何形状形成电场，并且引起生物分子在介质内的迁移。在该过程中通过激光诱导的荧光方法进行可视化并同时进行定量的生物分子的分离之后，通过UV暴露将生物分子与膜结合。随后，从膜上洗去分离介质和油，并通过检测生物分子对膜进行分析。这种方法被示意性地描述于图1中。
实施例2：
能够以各种方式将分离介质施用于多孔支架材料上。原则上，所述方法的任何可以想到的可能或组合能被用于此目的。图2示出了选择性施用分离介质的两种可能的方法。a)示出了在给料装置的移动的同时单滴的连续给料以在多孔膜上产生结构。b)示出了所谓的“半接触式书写”方法。使喷嘴靠近多孔膜移动，并且在基板与喷嘴之间形成毛细管桥。由于毛细流，能够例如通过基板或喷嘴的可控运动来产生流体线。
实施例3：
图3示出了使用前述方法进行两个不同长度(56&112bp；Cy5；150pL@100nM浓度)的DNA片段的首次分离的结果。使用硝酸纤维素膜(0.2μm孔径)。由聚丙烯酰胺类聚合物溶液组成的分离通道具有250μm的宽度。对应于125μm的膜厚度，分离通道的横截面为250×125μm2。膜中分离通道的制备以及注入和用油覆盖花费2分钟。如图所示，分离(在这种情况下)花费3～4分钟。因此，准备电泳装置并进行实验的总时间为5～6分钟。通过UV暴露将DNA随后固定在膜上花费60秒。
实施例4：
图4示出了相同长度的片段(28bp，用罗丹明6G标记)的实时迁移。为了检测，带有线光学器件的激光器(λex＝532nm)完全照射膜内的分离通道。此外，在传统的CCD摄像机(λ截止＝550nm)的前面安装了高通滤波器。在施加200V/cm的电场期间，记录了迁移过程以证明其适用性。使用1.5nL的样品体积和100μM的DNA浓度进行可视化(与实施例3(图3)中的高灵敏度检测相比：10×较大体积，1000×较高浓度)。从图4a)可以看出，在不施加电场的情况下就能够检测到没有迁移。在图4b)中，施加了电场。在不同时间记录迁移。由于贴附在3轴系统上的摄像机随迁移样品一起移动，因此不能从图像中读取迁移距离(由虚线所示)。在图4c)中，除了激光器外，还添加了10W LED，以对膜内的凝胶线(分离通道)进行可视化。因此，CCD摄像机前面的高通滤光片允许高于550nm的多个波长通过滤光片。以这种方式，能够看见膜内凝胶线的限定部分。

Claims (22)

1.电泳分离装置，包括：
-阳极和阴极；
-多孔支架材料；和
-液态分离介质，其中，所述分离介质
i.位于所述多孔支架材料内部，其中，所述多孔支架材料围绕液态分离介质，所述液态分离介质存在于多孔支架材料的孔或空腔中，
ii.与所述阴极和所述阳极接触，并且
iii.形成定制几何形状，所述定制几何形状仅填充部分所述多孔支架材料且形成限定样品的迁移路径的、宽度为25～1000μm的通道，其中，所述样品被所述分离介质包围，并且其中所述多孔支架材料具有0.05μm～1μm的孔径。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述液态分离介质是液体或凝胶，所述液体或凝胶选自包括液态或固态的聚丙烯酰胺类凝胶、琼脂糖类凝胶、水凝胶、梯度凝胶和缓冲溶液所组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述通道的宽度为30μm～500μm。
4.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述分离介质在与所述阳极和所述阴极的接触点处形成流体储层。
5.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述分离介质的几何形状形成复杂结构，所述复杂结构选自包括圆形、正方形、椭圆形、交叉的T形结构和Y形结构以及它们的组合所组成的组。
6.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述多孔支架材料具有平面形状，并且具有10μm～1000μm的厚度。
7.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述多孔支架材料或所述分离介质表现出对所述样品或所述样品的组分的结合能力。
8.根据权利要求7所述的装置，其中，所述结合能力在施用结合刺激时被激活。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述多孔支架材料是PVDF、尼龙或硝酸纤维素。
10.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述多孔支架材料被放置在包括所述阳极和所述阴极的衬底基板上。
11.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述多孔支架材料包括所述阳极和所述阴极。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的电泳分离装置的制造方法，其中，所述分离介质以限定样品的迁移路径的几何形状施用于所述多孔支架材料的表面上并且穿透所述多孔支架材料。
13.根据权利要求12所述的装置的制造方法，其中，所述分离介质通过半接触式书写、非接触式分配或接触式分配而被施用于所述多孔支架材料的表面上。
14.电泳分离生物分子的方法，包括：
-提供电泳分离装置，所述电泳分离装置包括：
i.阳极和阴极，
ii.多孔支架材料，和
iii.液态分离介质，其中，所述分离介质
1.位于所述多孔支架材料内部，其中，所述多孔支架材料围绕液态分离介质，所述液态分离介质存在于多孔支架材料的孔或空腔中，
2.与所述阴极和所述阳极接触，并且
3.已经以定制几何形状的形式施用于所述多孔支架材料，所述定制几何形状仅填充部分所述多孔支架材料且形成限定样品的迁移路径的、宽度为25～1000μm的通道，其中，所述样品被所述分离介质包围，并且其中所述多孔支架材料具有0.05μm～1μm的孔径，以及
-提供含生物分子的样品，其中，
i.在施用所述分离介质之前，将所述样品施用于所述多孔支架材料上，或者
ii.将所述样品施用于位于所述多孔支架材料内部的所述分离介质，使得所述样品被所述分离介质包围，其中，能够自由选择所述样品在所述分离介质的几何形状内的位置，
-通过所述阳极和所述阴极对所述分离介质施加电压，使得所述生物分子在所述分离介质内部迁移。
15.根据权利要求14所述的分离生物分子的方法，其中，所述样品通过半接触式书写或非接触式分配或接触式分配进行施用。
16.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，所述样品包含生物分子，所述生物分子选自包括DNA、RNA、蛋白、脂质、碳水化合物以及它们组合所组成的组。
17.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，所述样品的体积为1pl～1000nl。
18.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，一种或多种生物分子在迁移过程中被可视化和/或被定量。
19.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，所述生物分子在施用结合刺激时被固定在所述多孔支架材料或所述分离介质上。
20.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，所述生物分子通过检测物进行检测，所述检测物选自包括与待检测的生物分子特异性结合的荧光标记、核酸探针、抗体、适体和分子所组成的组。
21.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，一种或多种样品能够被施用于位于所述多孔支架材料内部的相同或多个独立的几何形状以进行平行分析。
22.根据权利要求14或15所述的分离生物分子的方法，其中，所述分离介质至少部分地被不可混溶的流体覆盖以防止蒸发。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116134308A (zh) * 2020-05-19 2023-05-16 10X基因组学有限公司 电泳盒和仪器

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637202A (en) * 1993-10-27 1997-06-10 California Institute Of Technology Porous electrophoresis sponges

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5651295B2 (zh) * 1974-11-15 1981-12-04
US4992172A (en) * 1987-09-14 1991-02-12 Gelman Sciences, Inc. Blotting methods using polyaldehyde activated membranes
US5384025A (en) * 1994-03-07 1995-01-24 Applied Biosystems, Inc. Notched spacer for slab-gel electrophoresis
WO2001055721A2 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Applied Hydrogel Technology Corporation Detection of biomolecules in gels following electrophoresis
US6833060B2 (en) * 2000-05-05 2004-12-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Electrophoresis gel support
CA2428441A1 (en) * 2000-11-20 2002-06-20 20/20 Genesystems, Inc. Methods, devices, arrays and kits for detecting and analyzing biomolecules
US20030032201A1 (en) 2001-08-10 2003-02-13 Flesher Robert W. Method and device for electrophoresis and blotting
US7192693B2 (en) * 2004-02-24 2007-03-20 University Of Washington Methods for photopatterning hydrogels
DE102005020134A1 (de) * 2005-04-29 2006-11-02 Becton, Dickinson And Co. Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines parallelen und simultanen Mehrfachprozesses der trägerfreien isoelektrischen Fokussierung
JP4915527B2 (ja) * 2007-09-27 2012-04-11 凸版印刷株式会社 電気泳動兼転写用積層体、電気泳動兼転写用チップ、電気泳動兼転写装置、電気泳動兼転写方法、電気泳動兼転写用積層体の製造方法
EP2260297B1 (en) * 2008-04-03 2018-08-01 The Regents of The University of California Ex-vivo multi-dimensional system for the separation and isolation of cells, vesicles, nanoparticles and biomarkers
US9976984B2 (en) * 2013-05-10 2018-05-22 The Regents Of The University Of California Free-standing microfluidic gel electrophoresis devices and methods
JP2016109511A (ja) * 2014-12-04 2016-06-20 シャープ株式会社 サンプル分離器具およびサンプル分離吸着装置

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637202A (en) * 1993-10-27 1997-06-10 California Institute Of Technology Porous electrophoresis sponges

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