CN110960884A

CN110960884A - 离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分的方法

Info

Publication number: CN110960884A
Application number: CN201911317088.9A
Authority: CN
Inventors: 李昌勤; 王金梅; 刘振花; 崔丽丽; 康文艺; 崔一平; 梁振华; 卢洁
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110960884B

Abstract

本发明公开一种利用离子液体结合正交设计设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D两种活性成分和预测萃取量的方法，其以总萃取量为指标，采用离子液体结合正交设计进行提取考察，从而得到灵芝中两个活性成分的最佳提取工艺为：离子液体浓度1.4 mol/L、超声功率400W、超声时间20 min，离心转速4000 r/min、固液比1 g:33.3 mL。在此条件下，灵芝中个活性成分的提取量为3.31 mg/g（n=3）。结果表明，在所考虑的实验条件下，神经网络模型能够有效地模拟实验数据和再现过程行为，使用BP神经网络模型可以低能耗，高效地，准确地预测目标化合物萃取总量，为灵芝的开发应用提供了科学依据。

Description

离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种利用离子液体与超声辅助提取(正交设计和BP神经网络优化提取)灵芝中灵芝酸A，灵芝酸D和预测萃取量的方法。

背景技术

中药灵芝为多孔菌科赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体，有两千多年的药用历史。中国药典记载：味甘，性平，归心、肺、肝、肾经，具有补气安神，止咳平喘的功能。

研究表明，灵芝具有免疫调节，抗肿瘤，保肝，降血糖，抗氧化，改善睡眠等药理活性。目前已从灵芝中分离并鉴定了400多种化合物，而灵芝萜类是重要的活性成分。灵芝酸A(Ganoderic acid A,GA-A)和灵芝酸D(Ganoderic acid D,GA-D)是灵芝三萜类化合物的主要成分之一，普遍存在于灵芝属植物。据报道灵芝酸-A具有镇痛、抗氧化、保肝和抗癌等药理活性。近年研究发现，灵芝酸-A对人骨瘤细胞、淋巴瘤细胞、脑膜瘤细胞和乳腺癌细胞均表现出显著的抗癌活性，还可以提高HepG2细胞对铂的化疗敏感性。因此，灵芝酸-A有可能成为新型抗癌药物的候选药。灵芝酸-D可抑制宫颈癌细胞的增殖；灵芝酸-D通过IRT3/cypd信号通路，调节结肠癌细胞能量代谢，进而抑制结肠癌。

离子液体(ionic liquid，IL)是一种新型溶剂，由有机阳离子和无机或有机阴离子组成。离子液体作为继水和超临界二氧化碳后的又一大类绿色溶剂，具有独特的物理化学属性，如可忽略的蒸气压、良好的热稳定性和化学稳定性、对有机物和无机物的高溶解性以及可修饰的化学结构。作为绿色环保溶剂，离子液体现已广泛应用于天然产物活性成分提取领域。

文献调研发现，利用离子液体辅助萃取灵芝中三萜类成分的研究还未有报道。因此，本申请运用离子液体-超声辅助技术结合正交实验，并且建立BP神经网络模型，利用HPLC法同时对灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D 2种成分进行含量测定，得出最优的提取工艺参数，为灵芝三萜类成分的合理应用提供科学依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝酸A和灵芝酸D两种活性成分和预测萃取量的方法，在单因素实验的基础上，采用IBM SPSS Statistics 19设计五因素三水平正交试验，最后得到灵芝酸A和灵芝酸D两种活性成分的最佳提取工艺；并且以单因素和正交实验结果作为样本，建立BP神经网络模型，该模型可以成为预测该萃取量的有效工具。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以灵芝酸A和灵芝酸D的总萃取量为指标，首先选择合适的溶剂来对灵芝进行提取；

2)在1)的基础上，通过对离子液体阴阳离子的选择，确定最佳的离子液体类型以及最佳的萃取剂类型；

3)在2)的基础上，通过单因素试验确定提取条件的因素水平；

4)在3)的基础上，以单因素试验得到的因素水平为基础，采用IBM SPSSStatistics 19设计五因素三水平的正交试验，根据正交试验结果进行极差分析和方差分析，根据正交试验的极差分析得到各因素对总提取量影响的大小顺序，根据正交试验的方差分析得到显著性检验，确定各因素是否显著，确定最优的提取工艺(离子液体浓度为1.4mol/L，超声功率400W，超声时间20min，离心转速4000r/min，固液比1g：33.3mL)；

5)利用MATLAB软件，以单因素和正交试验结果作为样本，建立BP神经网络模型，对总萃取量量进行模拟预测。进一步地，所述步骤5)中，以单因素和正交试验结果作为样本，最终建立隐层9个神经元的结构，最小MSE(0.09622)和高相关系数(R＝0.9332)的BP神经网络模型；并对正交试验总萃取量进行模拟预测。结果表明，在所考虑的实验条件下，神经网络模型能够有效地模拟实验数据和再现过程行为，使用BP神经网络模型可以低能耗，高效地，准确地预测来目标化合物萃取总量。

具体的，所述步骤1)中，分别以水、70％乙醇和甲醇为溶剂对灵芝进行提取，筛选出甲醇对目标分析物灵芝酸A和灵芝酸D的提取率最好，确定甲醇为合适的溶剂。

具体的，所述步骤2)中，比较[BMIM]Br，[BMIM]BF4、[BMIM]PF6、[HMIM]Br、[OMIM]Br五种离子液体对目标分析物灵芝酸A和灵芝酸D的萃取量，确定[HMIM]Br/甲醇为最佳萃取剂。

具体的，所述步骤3)中，以萃取剂浓度A、超声功率B、超声时间C、离心转速D、固液比E共五个因素进行单因素试验。

本发明还提供了一种离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其将灵芝粉末与萃取剂混合后，于室温条件下200W～500W超声萃取10～60min，萃取结束后离心，取上清液，即得；

所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为[BMIM]Br，[BMIM]BF4、[BMIM]PF6、[HMIM]Br和[OMIM]Br中的一种或两种以上。

进一步优选的，萃取剂中离子液体的浓度为0.4～2.0mol/L，所述灵芝粉末与萃取剂按固液比1g：10～100mL混合添加。

进一步优选的，所述萃取剂由[HMIM]Br与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体浓度为1.4mol/L；超声功率400W，超声萃取时间20min，离心转速4000r/min，固液比1g：33.3mL。

灵芝酸A和灵芝酸D两个活性成分的萃取量的检测过程为：精密称取灵芝样品粉末(20目)，精密称定，精密加入最佳萃取剂，超声萃取，离心后，吸取上层清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品溶液；将供试品溶液用高效液相色谱仪在254nm处检测峰面积，与灵芝酸A和灵芝酸D标准曲线比较，计算灵芝酸A和灵芝酸D的萃取量；萃取剂浓度、超声时间、离心转速、固液比根据设计水平确定。提取时的色谱条件如下。

和现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明利用离子液体-超声辅助提取结合正交设计设计和和BP神经网络优化及预测中药有效成分提取工艺的应用将为中药研究者们提供新的思路和途径。本实验建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为灵芝的综合利用提供实验依据。

附图说明

图1 灵芝混合对照品(1)和供试品(2)的HPLC图：a.灵芝酸A，b.灵芝酸D；

图2 不同提取溶剂对萃取率的影响(n＝3)；

图3 不同类型阴离子对萃取率的影响(n＝3)；

图4 不同类型阳离子对萃取率的影响(n＝3)；

图5 萃取剂浓度对萃取率的影响(n＝3)；

图6 超声功率对萃取率的影响(n＝3)；

图7 超声时间对萃取率的影响(n＝3)；

图8 离心转速对萃取率的影响(n＝3)；

图9 固液比对萃取率的影响(n＝3)；

图10 BP神经网络模型训练性能曲线；

图11 BP神经网络模型参数。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

1、仪器与试剂

灵芝药材于2017年采购，经国家食用菌加工技术研发专业中心李昌勤教授鉴定为多孔菌科赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体，标本存于国家食用菌加工技术研发专业中心。

灵芝酸A(批号：JOT-10947，购于成都普菲德生物技术有限公司，HPLC检测纯度大于98％)；灵芝酸D(批号：JOT-11170购于，购于成都普菲德生物技术有限公司，HPLC检测纯度大于98％)；溴化1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐[BMIM]Br(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIM]BF4(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIM]PF6(默克股份两合公司，德国)、1-己基-3-甲基咪唑溴化盐[HMIM]Br(东京化成工业株式会社，日本)，1-辛基-3-甲基咪唑溴化盐[OMIM]Br(东京化成工业株式会社，日本)。乙腈、甲醇(HPLC级)，乙酸(天津市富宇精细化工有限公司)，水为纯净水(杭州娃哈哈百利食品有限公司)。

岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪(日本岛津)：LC-20AT液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱数据处理系统；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，江苏)；TGL-16型高速离心机(江苏金坛市中大仪器厂)；AB135-S型十万级电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)。

2、实验方法与结果

2.1 灵芝中两个活性成分灵芝酸A和灵芝酸D含量测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备

取灵芝酸A，灵芝酸D适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度分别为0.62、0.218mg/mL的混合标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取灵芝样品粉末适量，按照一定的固液比加入适量的萃取液，超声一定时间后离心，吸取上层清液，即得供试品溶液(试验中依次改变单一变量萃取剂浓度、超声功率、固液比、超声时间、离心转速，各试验均平行3次)。

2.1.3 色谱条件和系统适用性实验

表1 灵芝含量测定的色谱条件

按照以上色谱条件，分别进样即得灵芝对照品及供试品的HPLC图(图1)。如图1可知，在此色谱条件下，样品中灵芝酸A和灵芝酸D的保留时间与对照品一致，灵芝酸A和灵芝酸D两种成分的色谱峰分离度良好，与其它成分无干扰，理论塔板数不低于5000。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液，稀释不同浓度，按上述色谱条件进样测定，记录各组分的峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，进样质量(X，μg)为横坐标，作图得线性回归方程，见表2：

表2 线性方程及检测范围

精密吸取供试品溶液20μL，进入HPLC分析，测定峰面积，计算灵芝酸A和灵芝酸D化合物的总和，总提取量的计算见公式：

总提取量(mg·g^-1)＝(m_灵芝酸A+m_灵芝酸D)/m_灵芝。

2.1.5 精密度试验

在最佳的色谱条件下，取混合对照品溶液连续进样6次，每次20μL，分别记录各峰面积，计算RSD分别为1.68％，1.38％。结果表明仪器的精密度良好。

2.2 萃取剂的选择

由于离子液体多为粘稠的液体，所以选择合适的溶剂来溶解离子液体尤为重要，并且能进一步地提高样品中的目标成分的萃取。试验中首先选择水、甲醇、70％乙醇三种不同的分散剂萃取，这三种分散剂都能将目标化合物萃取出来，而甲醇对目标化合物的萃取含量最高(图2)。

离子液体理化性质由其结构决定，会显著影响目标化合物的萃取率。因此选择合适的离子液体是有效萃取的关键步骤。

本试验选择了不同阴离子和阳离子的五种离子液体：[BMIM]Br，[BMIM]BF4、[BMIM]PF6、[HMIM]Br、[OMIM]Br。结果如图3，4所示。

图3表明，离子液体的阳离子结构相同时，不同阴离子的离子液体的萃取效果不同，其萃取率大小是Br^－＞BF4^－＞PF6^－。这些阴离子可能与目标化合物的羟基存在某种相互作用，特别是氢键、π-π共轭、π-n和离子/电荷-电荷等作用力，有利于目标化合物的溶解和提取。另一方面，Br^－的离子半径较大，在外加电场作用下容易极化变形，由此产生的诱导偶极矩增强了溶液体系吸收外加磁场能量的能力。因此，含Br^－的离子液体较之其他两种阴离子的离子液体的提取效果更佳。

图4表示，[BMIM]Br、[HMIM]Br、[OMIM]Br具有相同的阴离子，但阳离子的烷基链长由己基增加到辛基，发现烷基链的长度对萃取率的影响较大。其萃取率大小是[HMIM]⁺＞[BMIM]⁺＞、[OMIM]⁺。萃取率随烷基链长的增加先升高后降低。这可能是由于碳链越长疏水性越强，范德华力越强，萃取率有所提高；但碳链的增加会使离子液体的黏度增加，传质受到阻碍，萃取率反而降低。

因此综合考虑，选择[HMIM]Br/甲醇作为最佳的萃取溶剂。

2.3 单因素试验

2.3.1 萃取剂浓度的选择

离子液体的浓度是影响萃取率的重要参数。浓度不同，其提取能力和溶解能力亦有所不同。结果如图5所示，[HMIM]Br浓度从0.8增加到1.2mol/L时，萃取率呈增加的趋势；但当[HMIM]Br浓度大于1.2mol/L时，萃取率反而有所降低。当[HMIM]Br浓度在较低水平时，离子液体对目标化合物的溶解能力随着浓度的增加而增加；当[HMIM]Br浓度大于一定值后，离子液体粘度增加，使得溶剂难以进入样品中，且提取出的目标化合物也不易扩散。因此，选择1.2mol/L为最佳的萃取剂浓度，进行后续操作。

2.3.2 超声功率的选择

有效的细胞分裂和有效的传质是导致超声功率增加萃取率的主要因素。由图6可知，超声功率小于350W时，目标化合物的萃取率随着超声功率的增加而提高；当功率大于350W后，萃取率反而下降。这可能是因为在低功率下，超声功率的增强，可快速地破坏植物细胞，加速目标化合物的溶解，从而提高萃取率；但过高的超声功率，有可能破坏目标化合物，导致萃取率的下降。因此选择350W作为最佳的超声功率。

2.3.3 超声时间的选择

由图7所示，20min之前，随着超声时间的延长，目标化合物的萃取率随之提高；在超声时间为20min时，萃取率达到最大；之后随着时间的增加，目标化合物的萃取率呈现下降趋势。这可能是因为离子液体渗透到植物组织中，目标化合物的溶出需要一定的时间。当提取时间过长时，离子液体和目标化合物的结构被破坏。综上所述，选择20min进行后续实验。

2.3.4 离心转速的选择

合适的离心转速既能够提高工作效率又可以减少能源消耗，经济节约。在上述优化条件下，考察对萃取率的影响。结果如图8所示，离心转速为4000r/min时，目标化合物的萃取率达到最大。综合考虑，选择4000r/min进行后续操作。

2.3.5 固液比的选择

固液比是影响萃取率的重要因素。固液比太小使得样品与萃取剂不完全接触，萃取不足；固液比太大，溶剂太多则会造成溶剂浪费，增加成本。图9表明，当固液比小于1g：20mL时，目标化合物的萃取率随着固液比的增大而增大；当固液比大于1g：20mL时，萃取率呈下降趋势。这可能是因为溶剂体积的增加，使得样品与提取溶剂充分接触，目标产物溶出增加；随着溶剂体积的继续增加，则可能会增加萃取溶剂的粘度和非目标化合物的产量，从而导致目标化合物的萃取不完全。

2.4 正交试验设计

通过SPSS 19.0设计五因素三水平正交实验(如表3所示)，筛选目标成分的最佳提取条件。并按照表所设计条件制备样品，按2.1.3项下色谱条件进行HPLC分析，计算目标物产量。

表3 正交试验因素和水平表

根据表4的极差分析，各因素对目标化合物产量的影响的大小顺序为D>B>C>E>A，根据表5方差分析可知，D因素对萃取率有显著性影响，其余4个因素对萃取率无显著性影响。可得最优组合工艺为A₃B₃C₂D₂E₃。即离子液体浓度为1.4mol/L，超声功率400W，超声时间20min，离心转速4000r/min，固液比1g：33.3mL。以此最佳工艺重复提取3次，得到萃取率为3.31mg/g。

表4 正交设计及极差分析

表5 方差分析

2.5 BP神经网络分析与建模

2.5.1 网络层数的选择

BP神经网络在非线性函数拟合方面是最典型的，只要在隐含层选择合适的神经元数目，就可以以任意精度逼近一个非线性函数。故本实验选择3层结构的BP神经网络系统，以此来完成试验数据的分析与建模，所用分析软件为Matlab。

2.5.2 样本数据的标准化

BP神经网络对输入没有限制，但是当各输入样本和输出样本的单位和数量级不同，会影响网络的训练精度，为此在实际训练神经网络之前，通常需要先将数据标准化，对样本数据进行归一化、无量纲化处理，去除数据的单位限制。本研究在MATLAB软件中采用函数mapminmax来实现样本数据的归一化处理。

2.5.3 网络学习参数的选择

以单因素和正交实验中每组实验5个因素的数值作为输入样本，以萃取率作为输出样本。本实验使用Matlab建立3层结构的BP神经网络系统：输入层为5、输出层为1。其中输入层与隐层之间使用S型的正切函数tansig传递函数，隐层与输出层之间使用纯线性purelin函数。学习函数为梯度下降权值/阀值的Levenberg-Marquardt，用函数trainlm来训练(调整)网络。训练样本的均方误差函数(MSE)、决定系数(R²)作为神经网络的性能指标，来衡量网络对训练样本的学习程度。

隐含层神经元数按照经验公式

计算，其中N为隐含层节点数，n为输入层节点数，m为输出层节点数，a为[1，10]之间的常数。根据经验公式可知隐含层中神经元的数量为3到12，以最小的MSE和最大R²的作为评价标准，通过训练不同神经元数的神经网络，发现当隐含层节点数为9时，该网络能达到一定的精确度，而且训练次数少，因此确定隐含层节点数为9。在经过多次神经网络训练之后，确定采用5－9－1结构的三层BP神经网络。

2.5.4 BP网络模型的仿真和预测功能

在上述最佳网络参数的基础上，70％的实验结果用于训练网络，15％用于验证训练，其余15％用于测试。并对最终选择的网络结构进行4次迭代训练。训练网络的均方误差为0.09622，回归系数为0.93332。训练网络的性能图以及训练和验证的回归图分别如图10和图11所示。这些线性拟合表明BP神经网络模型能够模拟和再现离子液体在灵芝三萜酸萃取中的应用，并且具有较高的精确度。

利用训练好的神经网络对提取工艺条件进行仿真预测，得到仿真数据见表6，由表6可以看出BP神经网络模型预测值与实验值能够较好的拟合。该结果表明BP神经网络模型能够模拟和再现离子液体在灵芝三萜酸萃取中的应用，并且具有较高的精确度。该模型可以成为预测目灵芝三萜酸萃取量的有效工具。

表6 BP神经网络预测值结果

2.5..5 输入变量的影响

权重是人工神经元之间的系数，类似于真实生物神经元轴突和树突之间的突触强度，用来评估每个输入变量对输出变量的相对重要性。如表7所示，5个因素对目标化合物的萃取总量的相对权重分别为16.9％、21.80％、20.19％、21.90％、19.21％。因此，从目前的分析来看，本研究中所有变量都不可以被忽略。其中D因素相对权重最高，与正交试验方差分析结果一致。

表7 五个因素与萃取总量的相对权重

2.6 稳定性试验

精密称取灵芝样品1份，按上述最优条件制备样品，并按照2.1.3项下色谱条件进样分别在0，3，6，12，18，24h进样20μL，结果灵芝酸A和灵芝酸D的RSD分别为0.25％和0.42％，表明供试液中灵芝酸A和灵芝酸D在24h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精确称量灵芝样品6份，按上述最优条件制备样品，并按照2.1.3项下色谱条件进样20μL，结果灵芝酸A和灵芝酸D的RSD分别为4.66％和3.49％，表明本试验方法重复性好。

2.8 加样回收率试验

称取已知灵芝酸A和灵芝酸D含量的灵芝样品6份，按优化条件制备供试品溶液，进行测定样品中所含灵芝酸A和灵芝酸D的含量，再分别加入相当于样品中灵芝酸A和灵芝酸D质量的80％的标准品，按照2.1.3项下色谱条件进样20μL，灵芝酸A和灵芝酸D的平均加样回收率分别为98.21％和88.61％，其RSD值分别为2.09％和1.67％。

对比例

称取灵芝样品(20目)30mg，加入1mL萃取剂中，室温400W超声萃取20min，超声萃取结束后，4000r/min离心，取上清液即得；所述萃取剂为甲醇。

经检测可知：上清液中中2个目标成分的总萃取量为2.43mg/g(n＝3)。

实施例1

称取灵芝样品(20目)30mg，加入1mL萃取剂中，室温400W超声萃取20min，超声萃取结束后，4000r/min离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为[HMIM]Br，萃取剂中离子液体的浓度为1.4mol/L。

经检测可知：上清液中中2个目标成分的总萃取量为3.31mg/g(n＝3)。

实施例2

称取灵芝样品(20目)30mg，加入0.6mL萃取剂中，室温400W超声萃取20min，超声萃取结束后，3000r/min离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为[HMIM]Br，萃取剂中离子液体的浓度为1.2mol/L。

经检测可知：上清液中中2个目标成分的总萃取量为2.78mg/g(n＝3)。

实施例3

称取灵芝样品(20目)30mg，加入0.43mL萃取剂中，室温300W超声萃取10min，超声萃取结束后，3000r/min离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为[HMIM]Br，萃取剂中离子液体的浓度为1mol/L。

经检测可知：上清液中中2个目标成分的总萃取量为2.66mg/g(n＝3)。

由对比例和实施例1可知，灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D两个目标成分的总萃取量提高了36.21％。加入离子液体后，灵芝中两个目标成分的总萃取量可达到3.31mg/g。结果表明，离子液体-超声辅助是一种有效的提取方法，结合正交试验设计筛选最佳提取工艺。

BP神经网络模型

以单因素和正交实验为基础采用Levenberg-Marquardt反向传播算法对三层神经网络进行优化，预测离子液体在灵芝萃取过程中的应用。最终建立隐层9个神经元的结构，均以最小MSE(0.09622)和高相关系数(R＝0.9332)的BP神经网络模型。

利用训练好的神经网络对提取工艺条件对正交实验进行仿真预测，得到仿真数据见表6，由表6可以看出BP神经网络模型预测值与实验值能够较好的拟合。该结果表明BP神经网络模型能够模拟和再现离子液体在灵芝萃取中的应用，并且具有较高的精确度。该模型可以成为预测目灵芝提取量的有效工具，对灵芝的开发应用提供了科学依据。

结论：离子液体-超声辅助提取对中药中黄酮类、香豆素类、皂苷及萜类等化学成分的萃取效果明显优于传统溶剂的提取。本试验采用[HMIM]Br/甲醇溶液为萃取剂，结合超声辅助对灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D两个化合物进行有效提取，并通过正交试验优化了提取工艺参数。与传统提取方法对比，离子液体-超声辅助提取是一种环境友好、效率较高的方法，为灵芝的深层次开发提供了理论依据。并且以单因素和正交试验的结果为基础，建立BP神经网络模型，并进行了预测仿真，预测值与实验值能够较好的拟合。结果表明，在所考虑的实验条件下，神经网络模型能够有效地模拟实验数据和再现过程行为，使用BP神经网络模型可以低能耗，高效地，准确地预测来目标化合物萃取总量，对灵芝的开发应用提供了科学依据。

Claims

1.离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）以灵芝酸A和灵芝酸D的总萃取量为指标，首先选择合适的溶剂来对灵芝进行提取；

2）在1）的基础上，通过对离子液体阴阳离子的选择，确定最佳的离子液体类型以及最佳的萃取剂类型；

3）在2）的基础上，通过单因素试验确定提取条件的因素水平；

4）在3）的基础上，以单因素试验得到的因素水平为基础，采用IBM SPSS Statistics19设计五因素三水平的正交试验，根据正交试验结果进行极差分析和方差分析，根据正交试验的极差分析得到各因素对总提取量影响的大小顺序，根据正交试验的方差分析得到显著性检验，确定各因素是否显著，确定最优的提取工艺；

5）利用MATLAB软件，以单因素和正交试验结果作为样本，建立BP神经网络模型，对总萃取量量进行模拟预测。

2.如权利要求1所述离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，所述步骤1）中，分别以水、70%乙醇和甲醇对灵芝进行提取，筛选出甲醇对目标分析物灵芝酸A和灵芝酸D的提取率最好，确定甲醇为合适的溶剂。

3.如权利要求1所述离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，所述步骤2）中，比较［BMIM］Br，［BMIM］BF4、［BMIM］PF6、［HMIM］Br、［OMIM］Br 五种离子液体对目标分析物灵芝酸A和灵芝酸D的萃取量，确定［HMIM］Br/甲醇为最佳萃取剂。

4.如权利要求1所述离子液体与超声辅助提取结合正交设计和BP神经网络优化提取灵芝中灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，所述步骤3）中，以萃取剂浓度A、超声功率B、超声时间C、离心转速D、固液比E共五个因素进行单因素试验。

5.一种离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，将灵芝粉末与萃取剂混合后，于室温条件下200 W~500 W超声萃取10~60 min，萃取结束后离心，取上清液，即得；

所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为［BMIM］Br，［BMIM］BF4 、［BMIM］PF6 、［HMIM］Br和［OMIM］Br中的一种或两种以上。

6.如权利要求5所述离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，萃取剂中离子液体的浓度为0.4~2.0 mol/L，所述灵芝粉末与萃取剂按固液比1g：10 ~100 mL 混合添加。

7.如权利要求6所述离子液体与超声辅助提取灵芝中活性成分灵芝酸A和灵芝酸D的方法，其特征在于，所述萃取剂由［HMIM］Br与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体浓度为1.4mol/L；超声功率400 W，超声萃取时间20 min，离心转速4000 r/min，固液比1 g：33.3 mL。