CN110967482B

CN110967482B - 一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN110967482B
Application number: CN201811165892.5A
Authority: CN
Inventors: 沈克飞; 徐登峰; 付利芝; 张素辉; 杨柳; 付文贵; 许国洋
Original assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN110967482A

Abstract

本发明提供了一种检测山羊化脓隐秘杆菌间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被有山羊化脓隐秘杆菌重组溶血素rPLO的酶标板；所述rPLO的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用山羊化脓隐秘杆菌溶血素重组蛋白rPLO建立一种可准确检测山羊感染化脓隐秘杆菌的间接ELISA试剂盒。本试剂盒特异性强、灵敏度高、重复性好。

Description

一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及制备方法、使用方法。

技术背景

化脓隐秘杆菌是牛、羊、猪等经济型家畜黏膜的一种共生菌，主要寄生于动物呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为正常菌群的组成部分。化脓隐秘杆菌是一种条件性致病菌，可经皮肤、黏膜破损处入侵引起临近的组织、器官感染，也可被吸入肺部引起肺部和胸部化脓性肺炎、化脓性胸膜炎等。

化脓隐秘杆菌是引起山羊体表淋巴结炎和山羊呼吸道疾病的主要病原之一(张素辉等，2015)。临床上病羊日渐消瘦，呼吸急促，伴有体表淋巴结炎、怀孕母羊流产等现象。剖解可见到肺脏有黄豆大小的化脓灶，肺脏与胸壁脓性等病变。病理切片可见心肌纤维变性，肺和肾小管管腔内有浆液－纤维素性变性，淋巴结脂肪变性，肝脏有炎性细胞浸润，脾呈浆液－化脓性炎症。由于肺部血药浓度低，肺部感染治疗难度较大。该病广泛流行于西南地区，给地区山羊养殖造成了严重经济损失。

已鉴定的化脓隐秘杆菌的毒力因子有溶血素(Pyolysin，PLO)、胶原结合蛋白(collage-binding protein，CbpA)、神经氨酸酶(neuraminidases，Nan)NanH和NanP。PLO是化脓隐秘杆菌分泌的唯一外毒素，所有的化脓隐秘杆菌分离株均能产生PLO。Billington等于1997年克隆得到化脓隐秘杆菌plo基因，获得其全基因序列。plo开放性阅读框共有1605bp，编码534个氨基酸，分子量57.9ku。plo基因位于2.7kb的基因岛上，其上游是orf121开放性阅读框架，下游为fstY、ffh基因。PLO属于胆固醇依赖性的溶细胞素家族(Family ofcholesterold pendent cytolysin，CDC)成员，像肺炎链球菌的溶血素(pneumolysin，PLY)、单增李斯特氏菌的(listeriolysin O，LLO)等都是CDC家族成员。这类毒素通过在真核细胞上形成孔隙从而发挥其溶细胞活性。CDC可影响宿主体内多种生理过程，包括补体激活、上调细胞因子水平、抑制呼吸爆发和多形核白细胞和单核细胞的杀菌活性，对多形核白细胞和巨噬细胞有细胞毒性。PLO也是一种重要的宿主保护抗原(Jost et al.,1999)。含PLO基因的DNA疫苗和含IL-1β的真核表达质粒联合免疫，增强了被免疫小鼠抗化脓隐秘杆菌感染的能力(Huang etal.,2016)。此外，本实验室证实人工感染小鼠和自然感染羊只能产生针对PLO的抗体。这些研究结果显示PLO可用于化脓隐秘杆菌免疫制剂产品开发。

闫明慧(2016)制备了针对PLO的2株单克隆抗体，并证实这2株单克隆抗体针对的抗原关键区域是PLO第64位到79位氨基酸(即VPVTKDQLKDG TYTVF)和第58位到75位氨基酸(即GESIENVLKDGT)。这部分内容也体现在专利申请号CN201510616098.8中。在CN201510616098.8中，同时使用了孟祥莉等(2013，中国预防兽医学报,2013,35(06):477-480)构建的含化脓隐秘杆菌plo基因的重组质粒pET-30a(+)-plo，以诱导表达不含信号肽的重组PLO，采用此重组PLO包被的间接ELISA方法来检测单抗杂交瘤培养细胞上清或小鼠腹水纯化单抗。在CN201510616098.8的权利要求中提到用化脓隐秘杆菌PLO的此“抗原表位多肽在制备检测抗化脓隐秘杆菌PLO蛋白的抗体试剂中的应用”，其中并未涉及如何使用重组PLO建立一种特异、敏感、重复性好的化脓隐秘杆菌间接ELISA试剂盒的内容。

化脓隐秘杆菌是山羊的新发病原，对山羊的危害正在逐渐被认识。有效防控需要准确便捷的诊断方法作为技术支撑，ELISA方法是检测、诊断山羊化脓隐秘杆菌感染的可选方法之一。目前，缺乏适合基层的化脓隐秘杆菌ELISA诊断试剂盒。

发明内容

为此，本发明利用山羊化脓隐秘杆菌溶血素重组蛋白rPLO建立一种可准确检测山羊感染化脓隐秘杆菌的间接ELISA试剂盒。本试剂盒特异性强、灵敏度高、重复性好。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种检测山羊化脓隐秘杆菌间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被有山羊化脓隐秘杆菌重组溶血素rPLO的酶标板；所述rPLO的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述rPLO在96孔酶标板包被量为0.2μg-1μg/孔，包被条件37℃2-4h。

所述重组溶血素rPLO的制备方法包括以下步骤：通过PCR扩增山羊化脓隐秘杆菌PLO基因片段，将rPLO基因片段克隆到pET28a，通过原核系统表达重组蛋白。

进一步地，所述rPLO基因片段克隆到pET28a的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，加入IPTG进行诱导表达；利用6×His标签和镍柱亲和纯化表达产物rPLO，获得纯化的重组rPLO抗原。

本发明将山羊化脓隐秘杆菌PLO基因片段克隆到pET28a中，在大肠杆菌BL21(DE3)中使用IPTG诱导表达，免疫印迹分析证实化脓隐秘杆菌免疫的山羊血清、化脓隐秘杆菌自然感染的山羊血清、化脓隐秘杆菌人工感染的小鼠血清能识别该表达产物，所述能被化脓隐秘杆菌特异血清识别的重组溶血素rPLO的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明得到的rPLO以包涵体的形式高效表达，能够大量表达、纯化，使之能满足工业化生产需求。

更进一步地，所述包被有化脓隐秘杆菌rPLO的酶标板的制备方法包括如下步骤：

1)将rPLO用0.05mol/L pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释，加入酶标板中，包被量为0.2-1μg/孔；

2)将酶标板用封板膜覆盖，置于37℃孵育2h；

3)弃去酶标板孔内液体，向孔中加入洗涤液，静置1min，重复3-5次。每次弃去孔中液体后，将残留液体在吸水纸上拍干；

4)用含5％脱脂奶粉或1-5％明胶的0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液封闭酶标板；

5)将酶标板置于37℃2h，孵育后弃去孔内液体，在吸水纸上拍干；

6)向酶标板孔中加入含5％-20％蔗糖的0.01mol/L pH的磷酸盐缓冲液室温孵育3-5h，弃去孔内液体，自然晾干后，用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存。

进一步地，所述试剂盒包含酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。所述酶标抗体分装为25mL/瓶。

进一步地，所述试剂盒还包括：样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。

更进一步地，所述阳性对照血清为化脓隐秘杆菌或rPLO免疫山羊后，采集含有PLO抗体的山羊血清。

进一步地，所述样品稀释液和洗涤液中含有ProClin300。

所述阴性对照血清为未感染过化脓隐秘杆菌的健康山羊血清。

具体地，所述样品稀释液、洗涤液、底物显色液A、B和终止液的配方如下：

样品稀释液：PBS：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，3.58g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.272g/LKH₂PO₄，1.0g/L BSA，1.0mL/L ProClin300，溶于去离子水。分装为40mL/瓶。

10倍浓缩洗涤液：80g/L NaCl，2g/L KCl，35.8g/L Na₂HPO₄·12H₂O，2.72g/LKH₂PO₄，10mL/L ProClin300，溶于去离子水。分装为40mL/瓶。

底物显色A液：醋酸钠6.8g/L，柠檬酸0.8g/L，30％过氧化氢0.15ml/L，溶于蒸馏水。分装于棕色瓶，15mL/瓶。

底物显色液B：乙二胺四乙酸二钠0.1g/L，柠檬酸0.475g/L，甘油25mL/L，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)粉末0.075g/L(0.15g的TMB粉末先溶于3mL DMSO中)，溶于蒸馏水。分装于棕色瓶，15mL/瓶。

终止液：每891.3mL蒸馏水中逐滴加入浓硫酸(98％)108.7mL，即得2mol/L的硫酸溶液，混匀。分装为15mL/瓶。

本发明还提供了所述试剂盒在检测山羊化脓隐秘杆菌感染方面的应用。

一种检测山羊化脓隐秘杆菌间接ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)从试剂盒中取出酶标板(已包被有rPLO)，用样品稀释液将待检血清样本作50倍稀释。吸取100μL稀释血清至酶标板中，同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，100μL/孔；

2)37℃下孵育30min；

3)弃去孔内液体，向孔内加入300μL/孔洗涤液，静置1min，重复洗涤3次，在吸水纸上拍干孔内残留液体；

4)每孔加入100μL酶标抗体；

5)在37℃下孵育30min；

6)弃去孔内液体，向孔内加入300μL/孔洗涤液，静置1min，重复洗涤3次，在吸水纸上拍干孔内残留液体；

7)每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50μL，轻微震荡混匀，避免孔内液体溢出；

8)37℃孵育15min；

9)加入终止液50μL/孔；

10)测量并记录被检样品和对照的OD₄₅₀值。

本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD₄₅₀小于0.4，阳性对照的平均值大于1.0试验方为有效。

S为样品OD₄₅₀值，P为阳性对照的OD₄₅₀平均值。如果S/P值大于0.5，则样品应判定为化脓隐秘杆菌感染阳性。如果S/P值小于或等于0.5但大于0.4，样品应重测。如果测试结果不变，应间隔一定时间后重新采样检测。重测结果如果S/P值小于0.5，则样品应判定为化脓隐秘杆菌感染阴性。如果实验无效应重做。

有益效果

1.本发明提供了可被山羊化脓隐秘杆菌免疫的山羊特异血清识别的重组溶血素rPLO。该蛋白以包涵体形式实现了高效表达，每100mL培养物至少可得到40mg纯化的rPLO，具有高产率，可满足产业化生产需求。

2.本发明利用化脓隐秘杆菌重组溶血素rPLO建立检测山羊化脓隐秘杆菌感染的间接ELISA试剂盒及使用方法，具有以下有效效果：(1)特异性强，可区分化脓隐秘杆菌感染于常见山羊化脓性细菌感染；(2)敏感性高；(3)操作简单，适合于基层快速诊断，无需按传统方法对病原菌进行分离、培养、鉴定；(4)检测时间短，2小时内完成检测；(5)2-8℃条件下保存期达到1年。

附图说明

图1为重组质粒pET28a-plo双酶切结果

M：Marker；1：重组质粒pET28a-plo

图2为PLO基因诱导表达情况分析

M：蛋白质Marker；1：rPLO；2：未诱导。

图3为rPLO被化脓隐秘杆菌培养物免疫的山羊血清识别的结果(免疫印迹)M：蛋白质Marker；1：rPLO。

图4为rPLO可溶性表达分析

M：蛋白质Marker；1：沉淀；2：上清；3：未诱导。

图5为rPLO纯化结果

M：蛋白质Marker；1：纯化的rPLO；2：包涵体溶解；3：包涵体洗涤。

图6为阻断实验结果。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1 rPLO的制备

1.表达载体与重组菌株构建

通过PCR扩增山羊化脓隐秘杆菌PLO基因片段，将目的基因克隆到pET28a中，构建BL21(DE3)重组菌株。被克隆表达的PLO的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重组溶血素rPLO理论分子量为33.5kD。

2.诱导表达

挑取将上述重组工程菌单菌落接种于2mL液体LB培养基(含50mg/L卡那霉素)中，37℃振摇培养过夜，以1％比例转接新鲜的液体LB培养基(含50mg/L卡那霉素)，37℃振摇培养至细菌浓度达到OD₆₀₀＝0.6时，按0.1mmol/L加入IPTG，37℃，180r/m振摇培养3h。采用SDS-PAGE分析重组蛋白诱导表达情况。

由图2可见，rPLO有明显表达。

3.抗血清制备

配制TSB培养基，121℃高压灭菌15min。挑取山羊化脓隐秘杆菌单菌落接种TSB培养基，37℃振摇72h培养。向培养物中加入0.1％的甲醛溶液置于37℃进行灭活，每5h振摇一次，灭活24h。加入弗氏佐剂进行乳化，首免使用弗氏完全佐剂制备的乳化剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂制备的乳化剂。按5mL/只肌肉注射乳化剂免疫山羊，每次免疫间隔2周，免疫前采血分离血清，最后一次免疫后2周采集血液，分离血清。

4.抗体识别

取上述诱导培养物1mL，12000g/min离心1min，沉淀加入100μL 2×上样缓冲液，悬浮菌体后沸水浴10min，进行SDS-PAGE，作免疫印迹分析。一抗为上述山羊化脓隐秘杆菌免疫制备的抗血清，抗血清作1:1000稀释，二抗为碱性磷酸酶标记的驴抗羊IgG抗体，作1:2000稀释。显色剂为BCTP/NBT。

由图3可见，rPLO被山羊化脓隐秘杆菌免疫的山羊抗血清识别，产生与预期大小相符的特异条带。

5.可溶性表达分析

按上述方法进行诱导表达rPLO，离心收集菌体，每100mL培养物加20mL PBS以悬浮菌体沉淀，冰水浴中超声裂解菌悬液(超声功率为300W，工作4s间歇5s，超声裂解15min)。取100μL裂解物12000g/min离心1min，沉淀和上清分别进行SDS-PAGE，分析rPLO的可溶性表达情况。

由图4可见，rPLO在诱导培养物沉淀中大量出现，上清中无明显rPLO存在，表明rPLO以包涵体形式表达。

6.重组蛋白纯化

采用8mol/L尿素溶解包涵体，经过上样、洗杂蛋白和咪唑溶液洗脱，采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。采用SDS-PAGE分析重组蛋白纯化效果，用Image Lab3.0对目的条带进行灰度扫描以分析纯度，使用BCA试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

由图5可见，通过Ni-NTA亲和纯化从包涵体溶解物中纯化到rPLO，经BCA试剂盒测定和Image Lab3.0分析得出，每100mL培养物可纯化到40mg rPLO。

发明人同时采用SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6所示片段进行上述试验，这些片段并不能被山羊化脓隐秘杆菌免疫的山羊抗血清识别，不能形成包涵体、不能在诱导培养物沉淀中出现。

实施例2间接ELISA条件的优化

1.最佳包被浓度及最佳血清稀释度的确定

用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将提取的rPLO做1:100(8.55μg/mL)、1:200(4.28μg/mL)、1:400(2.14μg/mL)和1:800(1.07μg/mL)倍稀释，并分别加入酶标板孔中，每孔100μL，4℃过夜。次日，用PBST洗板3次，200μL/孔，每次5min。200μL/孔2％BSA，37℃2h全部封闭。封闭后用PBST洗板3次，每次5min。将阳性、阴性血清按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600稀释，组成方阵，做两个重复。将辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标抗体做1:10000稀释，加入酶标板中，100μL/孔，37℃1h。洗4次。其余步骤按常规间接ELISA程序进行。具体实施方式中各实施例采用的酶标板是96孔酶标板。

结果判定：方阵法滴定结果中以P/N值最大的抗原抗体工作浓度为最佳稀释度。

2.包被温度和时间优化

以确定的rPLO浓度包被酶标板，将包被条件设为4℃条件下分别放12h、24h，37℃条件下分别放1h、2h、3h、4h，共6组，每组做两个重复。以确定的最佳稀释倍数稀释血清，HRP标记的酶标抗体作1:10000稀释，其余按常规间接ELISA程序进行试验。以P/N值最大的一组为抗原最适包被条件。

3.封闭剂种类及封闭时间的选择

3.1封闭剂的选择

以最佳条件包被酶标板，以不封闭组为对照组，设7个试验组，分别以10％胎牛血清、5％脱脂奶粉、1％明胶、5％明胶、0.1％BSA、0.5％BSA、3％BSA为封闭剂进行封闭。封闭条件是37℃放置1.5h。HRP酶标抗体作1:10000稀释。其余按常规间接ELISA程序进行试验。选取封闭组OD值低于不封闭组，且P/N值最大的一组为最佳封闭剂。

3.2封闭时间的选择

以最佳条件包被和封闭酶标板，在37℃下分别封闭l h、1.5h和2h。以确定的最佳稀释倍数稀释血清，HRP酶标抗体作1:10000稀释，其余常规间接ELISA程序进行试验，以P/N值最大的一组为最佳封闭时间。

4.血清与抗原最适反应时间的确定

以最佳条件包被和封闭酶标板，加入以最佳稀释倍数稀释的血清，在37℃条件下分别作用0.5h、1h、1.5h和2h。HRP酶标抗体作1:10000稀释，其余按常规间接ELISA程序进行试验。以P/N值最大的一组为血清最适作用时间。

5.HRP标记抗体最适工作浓度及最适作用时间的确定

5.1 HRP标记抗体最适工作浓度

根据已确定的最佳条件试验，将HRP标记的兔抗山羊IgG的稀释度分别设为：1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:51200，其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP标记抗体最佳工作浓度。

5.2 HRP标记抗体最适工作时间

根据已确定的HRP标记抗体最适工作浓度，根据其作用时间将试验分成37℃条件下0.5h、1h、1.5h和2h共4组。其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP标记抗体最适作用时间。

6.TMB显色时间的选择

根据已确定的最佳条件进行试验，将显色时间设为37℃条件下5min、10min、15min和20min，其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为底物最适显色时间。

实验结果如下：

(1)抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

对抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度进行筛选，发现当抗原样品稀释倍数分别在80、160、320和640倍时，OD值均随着阳性血清稀释度的增加而降低。当rPLO稀释320倍(2.14μg/mL)，血清稀释50倍时，阳性血清OD₄₅₀值在1.00以上，P/N比值最大，因此抗原的最佳包被浓度为2.14μg/mL，抗原包被量可确定在0.2μg-1μg/孔；血清的最佳稀释度为1:50，结果见表1。

表1抗原和血清最适稀释度的确定

(2)包被条件的优化

在37℃条件下，阳性血清的OD值随着包被时间的延长而增加，在37℃包被2-4h，P/N值处于峰值区间。因此，可将抗原包被条件定为37℃包被2-4h。结果见表2。

表2包被条件优化试验结果

(3)封闭剂种类及封闭时间的选择

以5％脱脂奶粉或1-5％明胶当封闭剂，P/N值明显高于其他封闭剂。结果见表3。以5％脱脂奶粉或明胶为封闭剂，在封闭2h时，P/N值最大，为6.690。因此，抗原包被板的最佳封闭时间为2h。结果见表4。

表3封闭剂种类的选择

表4封闭时间的选择

(4)血清作用时间的选择

从表5可以看出，在0.5-1.5h内，随着血清作用时间的延长，阳性血清的OD值呈增长趋势，P/N值也呈增高趋势，但差异不明显。

表5血清作用时间的选择

(5)HRP标记抗体稀释倍数及孵育时间的选择

由表6可知，随着HRP标记抗体稀释倍数的增加，阳性血清和阴性血清的OD值呈递减趋势。当HRP标记抗体稀释64000倍时，P值为1.581，N值为0.295，P/N最大，为5.359。因此，HRP标记抗体的最佳稀释倍数为64000倍。

表6 HRP标记抗体稀释倍数的选择

以HRP标记抗体稀释64000倍进行HRP标记抗体最佳反应时间试验，结果见表7。当HRP标记抗体反应时间在0.5-2h内时，P/N值随时间延长呈下降趋势。结果表明HRP标记抗体最佳工作时间为37℃孵育0.5h。

表7 HRP标记二抗反应时间的选择

(6)TMB显色时间的选择

由表8可以看出，当显色15min时，P值为1.517，N值为0.318，P/N最大，为4.770。TMB的最佳显色时间为15min。

表8 TMB显色时间的选择

实施例3间接ELISA方法主要技术指标检验

1.特异性试验

1.1交叉试验

用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、伪结核棒状杆菌的培养菌液，分别制成油乳剂抗原，分别免疫山羊。分离血清，用建立的间接ELISA方法检测，并设立山羊化脓隐秘杆菌阳性血清对照和阴性血清对照。根据S/P值判定这几种菌的血清是否呈山羊化脓隐秘杆菌抗体阳性。

检测有效性及交叉反应判定标准：阴性对照的平均值OD₄₅₀小于0.4，阳性对照的平均值大于1.0试验方为有效。S为样品OD₄₅₀值，P为阳性对照的OD₄₅₀平均值。如果S/P值大于0.5，则样品应判定为交叉反应阳性。如果S/P值小于或等于0.5但大于0.4，样品应重测。如果S/P值小于0.4，交叉反应阴性阴性。

1.2阻断试验

取山羊化脓隐秘杆菌阳性血清作倍比稀释，从1:50到1:1600，共6个稀释度，将每个稀释度的阳性血清都分为两份，一份加等体积的最佳稀释倍数的rPLO蛋白，此为阻断组；另一份加等体积的包被缓冲液，此为阻断对照组。将处理后的血清在37℃孵育1.5h后，10000rpm离心20min。阴性血清也作2倍比稀释，从1:50到1:1600，共6个稀释度。按已确定的最佳反应条件进行试验，计算阻断率。阻断率的计算方法如下：

阻断率＝(阻断对照的OD值－阻断后的OD值)÷阻断对照的OD值×100％。

交叉试验检测结果见表9，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、伪结核棒状杆菌抗血清的S/P值均小于0.4，即rPLO与上述血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA方法特异性较好。

表9交叉试验

备注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

阻断试验结果见表10和图6。血清稀释倍数一定时，阻断组的OD值显著低于阻断对照组，阻断率在60％以上，说明rPLO能阻断阳性血清与它的反应。结果表明本试验建立的间接ELISA方法特异性良好。

表10阻断试验

2.重复性试验

2.1板内重复试验

取3份血清，按确定好的条件在同一块酶标板上进行试验，每份血清做6个重复，前后分3次进行检测。计算每份血清的板内变异系数。

2.2板间重复试验

取3份血清，分别在4块酶标板上按确定好的条件进行试验，每份血清做4个重复。计算每份血清的板间变异系数。

板内重复性试验结果见表11。三个血清样品的板内变异系数分别为8.11％、8.07％和4.91％，均小于10％，本试验建立的间接ELISA方法板内重复性较好。

表11板内重复性试验结果

备注：变异系数＝标准差/平均值×100％。

板间重复性试验结果见表12。三个血清样品的板间变异系数分别为8.18％、3.14％和5.16％，均小于10％。本试验建立的间接ELISA方法板间重复性较好。

表12板间重复性试验结果

备注：变异系数＝标准差/平均值×100％。

3.灵敏度试验

将化脓隐秘杆菌阳性血清作2倍比稀释，从1:200到1:6400共7个稀释度，化脓隐秘杆菌阴性血清不稀释，用建立的间接ELISA方法进行检测，确定检测结果呈阳性的最高血清稀释度。S/N>2判定为阳性，S为样品OD₄₅₀值，N为阴性对照的OD₄₅₀平均值。

由表13可以看出，随着山羊化脓隐秘杆菌阳性血清稀释倍数的升高，其OD值呈下降趋势，当该血清稀释至8000倍时，OD值为0.401，0.401/0.157＝2.554＞2，判为阳性。当该血清稀释至16000倍时，OD值为0.262，0.262/0.157＝1.669＜2，判为阴性。检测结果呈山羊化脓隐秘杆菌抗体阳性的最高血清稀释度为1:8000，本试验建立的间接ELISA方法灵敏度较高。

表13灵敏度试验结果

4.保质期

向酶标板孔内加入含5％蔗糖的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液室温孵育3h，弃去孔内液体，自然晾干后将酶标板放入含干燥剂的包装袋中，抽真空密封，置2-8℃保存。每隔一定时间取出试剂盒，检测标准阳性血清、标准阴性血清和质控血清，评估试剂盒的特异性、敏感性等主要技术指标。

经实验检验，本试剂盒在2-8℃中可放置15个月，有效期长达1年。

实施例4试剂盒的制备及组装

1.包被有化脓隐秘杆菌rPLO的酶标板的制备方法包括如下步骤：

1)将实施例1制备得到的rPLO用0.05mol/L pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释，加入96孔酶标板中，包被量为0.2-1μg/孔；

2)将酶标板用封板膜覆盖，置于37℃孵育2-4h；

3)弃去酶标板孔内液体，向孔中加入洗涤液，静置3min，重复3-5次，每次弃去孔中液体后，将残留液体在吸水纸上拍干；

5)将酶标板置于37℃下2h，孵育后弃去孔内液体，在吸水纸上拍干；

2.酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。酶标抗体分装为25mL/瓶。

3.阳性对照血清为化脓隐秘杆菌或rPLO免疫山羊后，采集含有PLO抗体的山羊血清。阳性对照血清用样品稀释液稀释，分装成1mL/管。

4.阴性对照血清为未感染过化脓隐秘杆菌的健康山羊血清。阴性对照血清用样品稀释液稀释，分装成1mL/管。

5.样品稀释液制备：PBS：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，3.58g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.272g/L KH₂PO₄，1.0g/L BSA，1.0mL/L ProClin300，溶于去离子水。分装为40mL/瓶。

6.10倍浓缩洗涤液制备：80g/L NaCl，2g/L KCl，35.8g/L Na₂HPO₄·12H₂O，2.72g/L KH₂PO₄，10mL/L ProClin300，溶于去离子水。分装为40mL/瓶。

7.底物显色A液制备：醋酸钠6.8g/L，柠檬酸0.8g/L，30％过氧化氢0.15ml/L，溶于蒸馏水。分装于棕色瓶，15mL/瓶。

8.底物显色液B制备：乙二胺四乙酸二钠0.1g/L，柠檬酸0.475g/L，甘油25mL/L，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)粉末0.075g/L(0.15g的TMB粉末先溶于3mL DMSO中)，溶于蒸馏水。分装于棕色瓶，15mL/瓶。

9.终止液制备：每891.3mL蒸馏水中逐滴加入浓硫酸(98％)108.7mL，即得2mol/L的硫酸溶液，混匀。分装为15mL/瓶。

10.试剂盒组装

根据上述制备方法制备的各组分，按每个试剂盒配置包被密封的酶标板2块，样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、底物显色液B、酶标抗体、终止液各1瓶，及操作说明书1份，进行组装。

实施例5试剂盒的使用方法

本发明所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)从试剂盒中取出已包被有rPLO的酶标板，用样品稀释液将待检血清样本作50倍稀释，吸取100μL混合液至酶标板中。同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，100μL/孔，阴性血清和阳性血清按待见血清用样品稀释液作50倍稀释；

2)37℃孵育30min；

3)弃去孔内液体，向孔内加入300μL/孔洗涤液，静置3min，重复洗涤3次，在吸水纸上拍干孔内残留液体；

4)每孔加入100μL酶标抗体；

5)在37℃下孵育30min；

6)弃去孔内液体，向孔内加入300μL/孔洗涤液，静置3min，重复洗涤3次，在吸水纸上拍干孔内残留液体；

8)37℃孵育15min；

9)加入终止液50μL/孔；

10)测量并记录被检样品和对照的OD₄₅₀值。

本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD₄₅₀小于0.4，阳性对照的平均值大于1.0试验方位有效。

S为样品OD₄₅₀值，P为阳性对照的OD₄₅₀平均值。如果S/P值大于0.5，则样品应判定为化脓隐秘杆菌感染阳性。如果S/P值小于或等于0.5但大于0.4，样品应重测。如果测试结果不变，应间隔一定时间后重新采样检测，重测S/P值小于0.5，则样品应判定为化脓隐秘杆菌感染阴性。如果实验无效，实验应重做。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆市畜牧科学院

<120> 一种检测山羊化脓隐秘杆菌感染的间接ELISA方法

<160>

<210> 1

<211> 245

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 1

TDGLSAPRAS ISPMDKVDLK SAQETNETSV DKYIRGLKYD PSGVLAVKGE SIENVPVTKD 60

QLKDGTYTVF KHERKSFNNL RSDISAFDAN NAHVYPGALV LANKDLAKGS PTSIGIARAP 120

QTVSVDLPGL VDGKNKVVIN NPTKSSVTQG MNGLLDGWIQ RNSKYPDHAA KISYDETMVT 180

SKRQLEAKLG LGFEKVSAKL NVDFDAIHKR ERQVAIASFK QIYYTASVDT PTSPHSVFGP 240

NVTAQ 245

<210> 2

<211> 253

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 2

DLKDRGVNNK NPLGYISSVS YGRQIFVKLE TTSTSNDVQA AFSGLFKAKF GNLSTEFKTK 60

YADILNKTRA TVYVVGGSAR GGVEVATGNI DALKKIIKEE STFSTKVPAV PVSYAVNFLK 120

DNQLAAVRSS GDYIETTATT YKSGEITFRH GGGYVAKFRL KWDEISYDPQ GKEIRTPKTW 180

SGNWVGRTAG FRETIQLPAN ARNIHVEAGE ATGLAWDPWW TVINKKNLPL VPHREIVLKG 240

TTLNPWVEEN VKP 253

<210> 3

<211> 125

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400> 3

TDGLSAPRAS ISPMDKVDLK SAQETNETSV DKYIRGLKYD PSGVLAVKGE SIENVPVTKD 60

QLKDGTYTVF KHERKSFNNL RSDISAFDAN NAHVYPGALV LANKDLAKGS PTSIGIARAP 120

QTVSV 125

<210> 4

<211>120

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400>4

DLPGLVDGKN KVVINNPTKS SVTQGMNGLL DGWIQRNSKY PDHAAKISYD ETMVTSKRQL 60

EAKLGLGFEK VSAKLNVDFD AIHKRERQVA IASFKQIYYT ASVDTPTSPH SVFGPNVTAQ 120

<210> 5

<211>120

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400>5

DLKDRGVNNK NPLGYISSVS YGRQIFVKLE TTSTSNDVQA AFSGLFKAKF GNLSTEFKTK 60

YADILNKTRA TVYVVGGSAR GGVEVATGNI DALKKIIKEE STFSTKVPAV PVSYAVNFLK 120

DNQL 124

<210> 6

<211>120

<212> protein

<213> Artificial(人工序列)

<400>6

AAVRSSGDYI ETTATTYKSG EITFRHGGGY VAKFRLKWDE ISYDPQGKEI RTPKTWSGNW 60

VGRTAGFRET IQLPANARNI HVEAGEATGL AWDPWWTVIN KKNLPLVPHR EIVLKGTTLN 120

PWVEENVKP 129

Claims

1.一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被有山羊化脓隐秘杆菌重组溶血素rPLO的酶标板；所述rPLO的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述试剂盒，所述酶标板rPLO包被量为0.2μg-1μg /孔。

3.如权利要求1所述试剂盒，所述rPLO的制备方法包括以下步骤：

通过PCR扩增山羊化脓隐秘杆菌PLO基因片段，将rPLO基因片段克隆到pET28a，通过原核系统表达重组蛋白。

4.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，重组载体转化至大肠杆菌BL21，加入IPTG进行诱导表达；利用6×His标签和镍柱亲和纯化表达产物rPLO，获得纯化的重组rPLO抗原。

5.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有rPLO的酶标板的制备方法包括如下步骤：

（1）将纯化的rPLO用0.05mol/L pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释，加入酶标板孔中，包被量为0.2-1μg /孔；

（2）将酶标板贴上封板膜，置于37℃孵育2-4 h；

（3）弃去酶标板孔内液体，向孔中加入洗涤液，静置1min，重复3次，每次洗涤后弃去板内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将孔内残留液体在吸水纸上拍干；

（4）用含5%脱脂奶粉或1-5%明胶的0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液封闭酶标板，37℃孵育2 h，后弃去封闭液洗涤3次，在吸水纸上拍干后晾干；

（5）用加入干燥剂的包装袋抽真空密封，2-8℃保存。

6.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。

7.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含底物显色液A和底物显色液B，所述底物显色液A和底物显色液B主要成分分别为过氧化氢和3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺。

8.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含阳性对照血清，所述阳性对照血清为灭活山羊化脓隐秘杆菌或rPLO免疫山羊后采集含有PLO抗体的山羊血清。

9.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、底物显色液B和终止液；所述样品稀释液含有ProClin300。

10.如权利要求1-9任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用样品稀释液将待检血清样本50倍稀释，取100μL稀释血清至酶标板孔中，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清各两孔，每孔100μL；

（2）在37℃下孵育30min；

（3）弃去酶标板孔内液体，向每孔中加入洗涤液300μL，静置1min，重复3次，每次洗涤后弃去板内液体，将孔内残留液体在吸水纸上拍干；

（4）每孔加入100μL酶标抗体；

（5）在37℃下孵育30min；

（6）重复步骤（3）；

（7）每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50μL，轻微震荡混匀；

（8）在37℃下孵育15min；

（9）每孔加入终止液50μL；

（10）使用酶标仪测量OD450读值；

（11）判断检验是否成立，计算S/P比值以判定待检样品的阴阳性。