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CN110951695A - 通用型car-t细胞、其制备方法及其应用 - Google Patents

通用型car-t细胞、其制备方法及其应用 Download PDF

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CN110951695A
CN110951695A CN201911407988.2A CN201911407988A CN110951695A CN 110951695 A CN110951695 A CN 110951695A CN 201911407988 A CN201911407988 A CN 201911407988A CN 110951695 A CN110951695 A CN 110951695A
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cell
3grna
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CN201911407988.2A
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姜舒
张芸
熊斌
王冰
纪惜銮
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Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种通用型CAR‑T细胞、其制备方法及其应用，该通用型CAR‑T细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)利用扩增引物P1‑P5分别对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3 CAR‑1和GPC3 CAR‑2片段进行PCR扩增，然后将获得的扩增片段依次进行连接；采用引物P6对连接产物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳鉴定，鉴定正确后转化至感受态细胞；构建获得pLenti‑3gRNA‑EF1α‑GPC3 CAR重组慢病毒质粒，包装病毒颗粒；(2)感染扩增后的T淋巴细胞，通过电转化导入Cas9 mRNA，获得所述通用型CAR‑T细胞。本发明具有免疫排斥反应低、肿瘤细胞杀伤效率高的优点。

Description

通用型CAR-T细胞、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及CAR-T技术，特别涉及一种通用型CAR-T细胞、其制备方法及其应用。
背景技术
CAR-T，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。CAR-T细胞由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，构建重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。
目前CAR-T细胞的制备方法，存在免疫排斥导致杀伤效率不高的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种通用型CAR-T细胞、其制备方法及其应用，可降低免疫排斥反应，提高肿瘤细胞杀伤效率。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种通用型CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别针对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3 CAR-2片段，依次设计扩增引物P1、P2、P3、P4和P5，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.3-4、SEQ ID No.5-6、SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.9-10所示；
设计引物P6，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-12所示；
利用扩增引物P1、P2、P3、P4和P5分别对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3CAR-1和GPC3 CAR-2片段进行PCR扩增，然后将PCR扩增后获得的扩增片段依次进行连接，获得连接产物；
采用引物P6对连接产物进行PCR扩增，将PCR扩增后获得的扩增产物进行电泳鉴定，鉴定成功后转化至感受态细胞中；构建获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR质粒，包装获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒；
(2)从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞；将分离得到的T淋巴细胞进行激活和扩增；然后用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞，获得GPC3CAR-T细胞，通过电转化导入Cas9 mRNA，获得所述通用型CAR-T细胞。
本发明还涉及上述的通用型CAR-T细胞的制备方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
以及，上述的通用型CAR-T细胞应用于制备治疗或预防癌症的药物。
本发明的有益效果在于：
通过构建上述pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR质粒，进一步包装获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒，进而用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞，进一步通过电转化导入Cas9 mRNA，经检测，可使得获得的通用型CAR-T细胞有效敲除PD1，同时具有免疫排斥反应低、高肿瘤细胞杀伤效率。
附图说明
图1为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中重组慢病毒质粒pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR的结构示意图；
图2为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中重组慢病毒质粒pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR的图谱；
图3为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中PMA刺激前流式检测GPC3CAR-T细胞的PD1表达率的比例图；
图4为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中PMA刺激后流式检测GPC3CAR-T细胞的PD1表达率的比例图；
图5为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中PMA刺激前流式检测通用型CART细胞的PD1表达率的比例图；
图6为本发明实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法中PMA刺激后流式检测通用型CART细胞的PD1表达率的比例图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：构建获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR质粒。
本发明提供的通用型CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别针对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3 CAR-2片段，依次设计扩增引物P1、P2、P3、P4和P5，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.3-4、SEQ ID No.5-6、SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.9-10所示；
设计引物P6，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-12所示；
利用扩增引物P1、P2、P3、P4和P5分别对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3CAR-1和GPC3 CAR-2片段进行PCR扩增，然后将PCR扩增后获得的扩增片段依次进行连接，获得连接产物；
采用引物P6对连接产物进行PCR扩增，将PCR扩增后获得的扩增产物进行电泳鉴定，鉴定正确后转化至感受态细胞中；构建获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒质粒，包装获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒；
(2)从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞；将分离得到的T淋巴细胞进行激活和扩增；然后用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞，获得GPC3CAR-T细胞，通过电转化导入Cas9 mRNA，获得所述通用型CAR-T细胞。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
通过构建上述pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒质粒，包装病毒颗粒，进而用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞，进一步通过电转化导入Cas9 mRNA，经检测，可使得获得的通用型CAR-T细胞有效敲除PD1，同时具有低免疫排斥、高肿瘤细胞杀伤效率的优点。
进一步的，步骤(1)中，所述感受态细胞为E.coli stbl4感受态细胞。
进一步的，步骤(1)中，扩增引物P1、P2、P3、P4和P5对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3 CAR-2片段进行PCR扩增的反应体系为：10μL 5倍PrimeSTAR Buffer，4μL 2.5mMdNTP Mixture，1-50ng/μL模板，0.5μL DNA聚合酶，以及扩增引物P1、P2、P3、P4或P5中的每条核苷酸序列各1μL，加蒸馏水至总体积为50μL；
步骤(1)中，扩增引物P1进行PCR扩增的反应条件为：98℃10s，55℃5s，72℃6min，30个循环，16℃30min；扩增引物P2、P3和P4进行PCR扩增的条件均为：98℃10s，55℃5s，72℃90s，30个循环，16℃30min；扩增引物P5进行PCR扩增的条件为：98℃10s，68℃5s，72℃60s，30个循环，16℃30min。
进一步的，步骤(1)中，获得的扩增产物进行连接的反应体系为：100ng pCDH片段，等摩尔量的3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3 CAR-2片段，5μL 2倍Monad Clone Hi-FusionCloning Mix V2，加蒸馏水至总体积为10μL。
进一步的，步骤(1)中，获得的扩增产物进行连接的反应条件为：于50℃条件下反应1h。
进一步的，步骤(2)中，获得通用型CAR-T细胞的具体方法为：于T淋巴细胞激活后的第3天，用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染T淋巴细胞，感染时添加聚凝胺，至终浓度为5μg/mL，制备获得GPC3CAR-T细胞；于感染后的第4天，采用OPTI-MEM对GPC3CAR-T细胞洗涤至少二次，然后采用OPTI-MEM进行重悬，调整细胞密度为1-3*108/mL，获得重悬液；取0.1mL重悬液与20μg Cas9 mRNA混合，采用混合后的混合液进行电转化，将电转化后获得的细胞转移至装有预热的含有300IU/ml IL-2的完全培养基中，继续培养扩增至第10天。
进一步的，本发明还涉及上述的通用型CAR-T细胞的制备方法制备获得的通用型CAR-T细胞；
以及，上述的通用型CAR-T细胞应用于制备治疗或预防癌症的药物。
请参照图1-6，本发明的实施例如下：
本实施例的通用型CAR-T细胞的制备方法，具体展开说明如下：
一、构建pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒质粒(如图1所示)。
1、设计模板扩增的引物。
设计的引物具体参见下述表1。并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。
表1
Figure BDA0002349188540000051
2、扩增模板序列。
将上述引物模板进行PCR扩增，并将PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定，获知其片段大小正确。扩增体系和扩增程序如下：
PCR反应体系具体参见下表2。
表2
Figure BDA0002349188540000061
PCR反应程序具体参见下表3。
表3
Figure BDA0002349188540000062
Figure BDA0002349188540000071
3、将电泳结束后的片段进行胶回收并连接。
连接体系和连接程序如下：
片段连接体系具体参见下表4。
表4
Figure BDA0002349188540000072
连接程序：在50℃反应1h。
同时，设计引物扩增连接产物，并进行电泳鉴定。
引物序列如下：
F:TAATAGCAACAGACATAC，(SEQ ID No.11)；
R:AACCAGGATTTATACAAG，(SEQ ID No.12)。
鉴定结果显示连接成功。
4、将上述产物转化至E.coli stbl4感受态细胞，摇菌约16h。进行菌液PCR扩增，鉴定结果显示质粒转化成功；菌液送测序，鉴定连接效果。测序结果表明连接正确，成功构建pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒质粒(参见图2)，将上述重组慢病毒质粒进行慢病毒包装并测定滴度，-80度保存备用。
二、通用型CAR-T细胞的制备
1、T淋巴细胞的分离
无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离。将外周血2000rpm，l0min离心，收集上层自体血浆。余下血液与0.01mol/L PBS液按1:1稀释吹打均匀，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤细胞，将细胞沉淀用含10％自体血浆的GTT551无血清培养基重悬，按Pan T Cell Isolation Kit II(美天妮公司)的操作说明，从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞。
2、T淋巴细胞的扩增
将分离得到的T淋巴细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，其中CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞的比例为1:1-3:1(优选3:1)，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL(300IU/mL-500IU/mL)，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为6ng/ml(5ng/mL-8ng/mL)。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
3、制备通用型CAR-T细胞
T淋巴细胞激活后第3天，用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染T细胞，感染时添加Polybrene，使其终浓度为5μg/mL，制备GPC3CAR-T细胞。病毒感染后第4天，GPC3CAR-T细胞用OPTI-MEM洗涤三次并用OPTI-MEM重悬，调整细胞密度为1-3*108/mL，取0.1mL与20μg Cas9 mRNA混匀，用电转枪吸取上述混合液，轻轻插到电转杯中，电转结束后将细胞转移至装有预热的含有IL-2(浓度为300IU/ml)的完全培养基中，继续培养扩增至第10天。流式细胞术检测CD3、HLA-1、PD1、CAR表达效率。设置GPC3 CAR-T细胞为对照组。
结果显示：CAR+细胞为90±4％，其中CD3-HLA1-PD1-细胞占38±5％。
4、通用型CART细胞功能检测
通用型CART细胞与GPC3 CAR-T细胞用1:800PMA刺激3天后，流式检测CART细胞的PD1表达率。
CART细胞的PD1表达率的具体检测方法为：将细胞悬液收集后离心，1000rpm，10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01mol/L PBS液洗涤2次，1000rpm，10min，用200μLPBS重悬细胞沉淀，细胞计数后取1*106个细胞用0.1ml预冷的0.01mol/L PBS重悬，避光加入PD1荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000 rpm，l0 min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，4℃送检，上流式细胞仪检测。结果参见图3-6。
具体的，图3表示GPC3 CAR-T细胞(PMA刺激前)PD1表达率；图4表示GPC3 CAR-T细胞(PMA刺激后)PD1表达率；图5表示通用型CART细胞(PMA刺激前)PD1表达率；图6表示通用型CART细胞(PMA刺激后)PD1表达率。
经检测，同时根据图3-6，GPC3 CAR-T细胞经刺激后PD1表达率由3.1％上调为20.2％(P<0.05)，通用型CART细胞的PD1表达率由2.87％上调为4.32％(P>0.05)，证实PD1敲除有效。
通用型CART细胞与GPC3 CAR-T细胞用1:800PMA刺激3天后，通用型CART细胞、GPC3CAR-T细胞分别与GPC3+HepG2-PDL1稳定细胞系共培养24h后，检测细胞杀伤效率和INF-γ水平。
检测细胞杀伤效率的具体方法为：分别调整效应细胞(通用型CART细胞或GPC3CAR-T细胞)和靶细胞(GPC3+HepG2-PDL1稳定细胞系)密度均为1X106/mL，按效靶比1：1、3：1、6：1往96孔板加入效应细胞悬液和靶细胞悬液，总体积为200uL，放入37℃，5％CO2培养箱中培养24h后每孔加入20μL CCK-8，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm读取OD值，杀伤率＝【1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值】*100％。实验分为空白对照组、靶细胞组、效应细胞组和实验组(通用型CART细胞组与靶细胞混合组、GPC3 CAR-T细胞与靶细胞混合组)。
检测细胞因子INF-γ的具体方法为：取出已包被抗体的酶标板，设置TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)空白显色孔，依次加入0.1mL按一定倍数稀释的标准品和用样品稀释液稀释的样品。酶标板加上盖，37℃反应90min。反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体。将生物素抗人INF-γ抗体工作液按每孔0.1mL依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤3次。将ABC工作液按每孔0.1mL依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应30min，0.01M PBS洗涤5次。按每孔90μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25min，按每孔0.1mL依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。样品OD值减去空白孔OD值后以OD值及标准品浓度为XY轴绘图，在标准曲线上查找INF-γ浓度后乘以稀释倍数，计算样本中INF-γ浓度。
结果显示：效靶比为6:1时，通用型CART细胞对GPC3+HepG2-PDL1细胞的杀伤率为94±3％，GPC3 CAR-T细胞对GPC3+HepG2-PDL1细胞的杀伤率为20±1.2％，两组相比有显著差异(P<0.05)。通用型CART细胞、GPC3 CART细胞分别与GPC3+HepG2-PDL1细胞共培养24h后，INF-γ水平分别为(25300±374)pg/mL、(4000±185)pg/mL，两组相比有显著差异(P<0.05)。
综上所述，本发明提供的通用型CAR-T细胞的制备方法具有有效敲除PD1、免疫排斥反应低、肿瘤细胞杀伤效率高的优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市茵冠生物科技有限公司
<120> 通用型CAR-T细胞、其制备方法及其应用
<130> 2019
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<400> 6
ggagaagcat ggtggctcac gacacctgaa atggaag 37
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcaggtgtcg tgagccacca tgcttctcct gg 32
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggtccgtac ttagattcct tgatctccag ctttgtgccc tgg 43
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggcacaaagc tggagatcaa ggaatctaag tacggaccgc cgccctg 47
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccagaggttg attttagcga gggggcaggg cctg 34
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
taatagcaac agacatac 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaccaggatt tatacaag 18

Claims (8)

1.一种通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别针对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3 CAR-2片段，依次设计扩增引物P1、P2、P3、P4和P5，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.3-4、SEQ ID No.5-6、SEQID No.7-8和SEQ ID No.9-10所示；
设计引物P6，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-12所示；
利用扩增引物P1、P2、P3、P4和P5分别对pCDH、3gRNA、EF1α、GPC3CAR-1和GPC3 CAR-2片段进行PCR扩增，然后将PCR扩增后获得的扩增片段依次进行连接，获得连接产物；
采用引物P6对连接产物进行PCR扩增，将PCR扩增后获得的扩增产物进行电泳鉴定，鉴定正确后转化至感受态细胞中；构建获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒质粒，包装获得pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒；
(2)从外周血单个核细胞中分离T淋巴细胞；将分离得到的T淋巴细胞进行激活和扩增；然后用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞，获得GPC3 CAR-T细胞，通过电转化导入Cas9 mRNA，获得所述通用型CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述感受态细胞为E.coli stbl4感受态细胞。
3.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增引物P1、P2、P3、P4和P5进行PCR扩增的反应体系为：10μL 5倍PrimeSTAR Buffer，4μL 2.5mMdNTP Mixture，1-50ng/μL模板，0.5μL DNA聚合酶，以及扩增引物P1、P2、P3、P4或P5中的每条核苷酸序列各1μL，加蒸馏水至总体积为50μL；
步骤(1)中，扩增引物P1进行PCR扩增的反应条件为：98℃10s，55℃5s，72℃6min，30个循环，16℃30min；扩增引物P2、P3和P4进行PCR扩增的条件均为：98℃10s，55℃5s，72℃90s，30个循环，16℃30min；扩增引物P5进行PCR扩增的条件为：98℃10s，68℃5s，72℃60s，30个循环，16℃30min。
4.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，连接产物进行连接的反应体系为：100ng pCDH片段，等摩尔量的3gRNA、EF1α、GPC3 CAR-1和GPC3CAR-2片段，5μL 2倍Monad Clone Hi-Fusion Cloning Mix V2，加蒸馏水至总体积为10μL。
5.根据权利要求4所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，连接产物进行连接的反应条件为：于50℃条件下反应1h。
6.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染扩增后的T淋巴细胞的操作具体为：于T淋巴细胞激活后的第3天，用pLenti-3gRNA-EF1α-GPC3 CAR重组慢病毒感染T淋巴细胞，感染时添加聚凝胺，至终浓度为5μg/mL，制备获得GPC3CAR-T细胞；于感染后的第4天，采用OPTI-MEM对GPC3CAR-T细胞洗涤至少二次，然后采用OPTI-MEM进行重悬，调整细胞密度为1-3*108/mL，获得重悬液；取0.1mL重悬液与20μg Cas9mRNA混合，采用混合后的混合液进行电转化，将电转化后获得的细胞转移至装有预热的含有300IU/ml IL-2的完全培养基中，继续培养扩增至第10天。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的通用型CAR-T细胞的制备方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
8.根据权利要求7所述的通用型CAR-T细胞应用于制备治疗或预防癌症的药物。
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