CN110869763B - 错误折叠tau蛋白质的检测 - Google Patents
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Abstract
提供用于扩增和检测来自样品的错误折叠tau蛋白质的方法和试剂盒，所述样品例如来自患有阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹等疾病的患者。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月16日提交的美国临时专利申请No.62/507,166的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
背景技术
Tau蛋白病可以包括例如阿尔茨海默氏病(AD)，帕金森氏病(PD)，进行性核上性麻痹(PSP)，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基底节变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)，颅脑外伤(TBI)，慢性颅脑外伤(CTE)和拳击员痴呆(DP)等。错误折叠tau聚集体和原纤维可以通过成核和生长而形成并积累。错误折叠tau聚集体可能会引起细胞功能障碍和组织损伤、以及其他影响。
实时震动诱导转化(RT-QuiC)已显示可引起来自从皮克氏病受试者抽取的脑匀浆和脑脊液样品中的3重复(3R)tau同工型的复制，从而可以灵敏地检测到这种罕见疾病和与其他tau蛋白病之间的差异。然而，令人惊讶的是，对于包含4R tau错误折叠的临床上重要的更常见的tau蛋白病，RT-QuiC的疗效降低了3至5个数量级，使其在临床和实验室使用中无效且不切实际。此类不良结果是通过接种含有来自CBD、AgD、FTDP-17、PSP、AD、4R+3R tau蛋白病的主要4重复(4R)tau聚集体的脑样品获得的。一些AD和PSP样品给出的信号超出检出限，但与皮克氏病脑样品相比，这些信号离群且弱得多。另外，因考虑污染，没有分析产生弱响应的AD和PSP样品。一般而言，对4R或4R+3R tau蛋白病的RT-QuiC分析与使用没有免疫组织化学检测tau蛋白病的患病受试者的对照相比，似乎没有显著差异。此类对照包括对老年变化(SC)、脑血管疾病(CVD)、弥散性路易体病(DLBD)、伴TDP-43(FTD-TDP)的额颞叶痴呆和肌萎缩性侧索硬化(ALS)的诊断。总而言之，RT-QuiC分析对于包含4R为主和4R+3R混合型tau蛋白病在内的4R tau蛋白病通常无效且不切实际。
本申请认识到例如为了诊断相关疾病而检测错误折叠tau蛋白质可能是具有挑战性的努力。
发明内容
在一个实施方式中，提供一种用于确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否的方法。所述方法可以包括执行第一蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau蛋白质。第一PMCA步骤可以包括在有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。
在另一个实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在与第一错误折叠蛋白质聚集体相对应的tau蛋白病的方法。所述方法可以包括提供来自受试者的样品。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括tau同工型。第一底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第一错误折叠蛋白质聚集体。第一PMCA步骤可以包括在有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一PMCA步骤可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中是否存在tau蛋白病。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。所述方法可以规定，当第一个底物蛋白质由单体3R tau组成时，tau蛋白病不包括皮克氏病。
在一个实施方式中，提供一种使用捕获来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否的方法。所述方法可以包括从样品中捕获第一错误折叠蛋白质聚集体，以形成所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体与摩尔过量的第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第一错误折叠蛋白质聚集体。摩尔过量可以大于所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的蛋白质单体的量。所述方法可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第一底物蛋白质错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。
在另一个实施例中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病(AD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中AD的存在与否。
在一个实施例中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括帕金森氏病(PD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过在第一温育混合物中检测第一扩增的折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中PD的存在与否。
在另一个实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括进行性核上性麻痹(PSP)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4Rtau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中PSP的存在与否。
在一个实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括额颞叶痴呆(FTD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中FTD的存在与否。
在另一个实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括皮质基底节变性(CBD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中CBD的存在与否。
在一个实施方式中，提供一种用于确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体的试剂盒。试剂盒可包括可包含4R tau的第一底物蛋白质。试剂盒可以包括第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一错误折叠蛋白质聚集体可以对应于tau蛋白病。试剂盒可以包括缓冲液。试剂盒可以包括肝素。试剂盒可以包括盐。试剂盒可以包括说明书。说明书可以引导使用者获得样品。说明书可以引导使用者执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质、第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂、缓冲液，肝素和盐接触而形成第一温育混合物。可以以以下一个或多个浓度形成第一温育混合物：第一底物蛋白质小于约20μM；肝素小于约75μM；盐如NaCl小于约190mM；第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂如硫黄素T小于9.5μM。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。说明书可以引导使用者根据第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂来分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体，由此确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。
附图说明
附图结合在说明书中并构成说明书的一部分，其示出实施例的方法和结果，并且仅用于示出实施例和实施方式。
图1A示出在0h、5h、10h和24h温育时拍摄的电子显微照片。
图1B是可溶性寡聚Aβ蛋白质聚集体的蛋白质印迹。
图2A是示出将通过ThT荧光测量的未扩增淀粉样蛋白质形成作为随时间的函数的图，其用实施例1的各种浓度合成可溶性寡聚Aβ蛋白质接种。
图2B是示出将通过ThT荧光测量的循环加速扩增的淀粉样蛋白质形成作为随时间的函数的图，其用实施例1的各种浓度合成可溶性寡聚Aβ蛋白质接种。
图3A是淀粉样蛋白质形成随时间的图，测量为ThT荧光标记的函数，示出用来自5个代表性样品的CSF接种的Aβ聚集的平均动力学，该5个代表性样品来自AD、NND和NAND组。
图3B是在存在来自AD、NND和NAND组的样品时以h为时间单位的用于Aβ聚集的滞后相的图。
图3C是示出在存在来自AD、NND和NAND患者的CSF样品时在180个Aβ-PMCA循环后例如在90h温育(P90)后获得的淀粉样蛋白质形成程度的图。
图4A-D是使用如图3B所示的滞后相位值对于不同的截止点使用真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图，其示出AD对NAND(图4A)、AD对NND(图4B)以及AD对所有对照样品(图4C)。图4D估计了不同组的组比较的最可靠的截止点。
图5的表1示出使用滞后相数计算的Aβ-PMCA测试的敏感性、特异性和预测值的估计值。
图6是在存在来自AD和对照患者的CSF样品时在300个Aβ-PMCA循环后例如在150h温育(P90)后获得的样品的以h为时间单位的滞后相的图。
图7A是示出使用掺入到人CSF中的合成制备的Aβ寡聚物的免疫耗竭结果的蛋白质印迹。
图7B是示出用对照和免疫耗竭的CSF样品接种的Aβ聚集的动力学的图。
图7C是示出由仅用A11构象抗体耗尽的、对照和免疫耗竭的CSF样品接种的Aβ聚集的动力学的图。
图8A是用于从复杂生物样品中捕获Aβ寡聚物的ELISA固相方法的示意图。
图8B是用于从复杂的生物样品中捕获Aβ寡聚物的磁珠固相方法的示意图。
图9的表2示出特异性抗体捕获Aβ寡聚物的能力。
图10是淀粉样蛋白质形成随时间的图，其示出通过掺入到人血浆中的不同量的合成寡聚物的存在来加速Aβ聚集。
图11是示出在存在来自AD患者和对照的血浆样品时在Aβ-PMCA测定中达到50％聚集的时间的图。
图12是示出在蛋白酶消化后在存在用蛋白质印迹监测的不同数量的合成Aβ寡聚物时，通过温育/超声处理循环的Aβ聚集体的扩增结果的蛋白质印迹。
图13A是硫黄素T荧光随时间的图，其示出通过PD-PMCA的对αS种子的检测。
图13B是将达到50％聚集的时间绘制成αS种子指示量的函数的图。
图14示出通过PD-PMCA的对来自人PD患者与阿尔茨海默氏病(AD)或非神经退行性疾病(NND)对照的CSF中的αS种子的检测。
图15的表3表明不同序列或构象抗体捕获αS寡聚物的能力。
图16A是用于捕获αS寡聚物的ELISA固相方法的示意图。
图16B是用于捕获αS寡聚物的磁珠固相方法的示意图。
图17A、17B和17C是示出使用三种不同的α-突触核蛋白质抗体从人血浆中免疫沉淀/聚集α-突触核蛋白质寡聚物的结果的一系列图。图17A示出使用抗体N-19的结果。图17B示出使用抗体211的结果。图17C示出使用抗体C-20的结果。
图18A、18B和18C是示出CSF样品中的αS种子的检测结果的一系列图。图18A示出对照样品中的结果。图18B示出PD患者的结果。图18C示出患有多系统萎缩症(MSA)的患者的结果。
图19是示出重组全长4R tau蛋白质的制备和纯化的流程图。
图20A是根据ThT荧光以％计各种初始量的tau种子和对照的聚集图。图20A中的值是两次重复的平均值，误差线表示标准偏差。
图20B是通过ThT荧光测量的达到50％聚集的时间T50与以fmol为单位的寡聚tau种子的量的对数的图。
图20C是通过ThT荧光随时间追踪的聚集图。
图20D是tau寡聚物的量与Tau-PMCA信号(达到50％聚集的时间)之间的关系图。
图20E-20L是显示基于8种测试条件的ThT荧光的聚集结果的一系列图，其包括4个不同的时间点(0、7、14和30天)样品的冷冻和解冻的经过与否以及缓冲液或CSF的存在。
图20E是基于0天时的第一种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20F是基于7天时的第一种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20G是基于14天时的第一种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20H是基于30天时的第一种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20I是基于0天时的第二种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20J是基于7天时的第二种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20K是基于14天时的第二种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20L是基于30天时的第二种子制备的ThT荧光的聚集图。
图20M是示出16种不同条件下的可重复性的T50值的表格。
图20N是用1pm的tau、Aβ40、AB42、HisαSyn、HuαSyn与没有种子的对照接种的tau测定的ThT荧光随时间的图。
图21A是示出AD患者、MCI患者、其他tau蛋白病患者、使用掺有合成Tau寡聚物(12.5fmol)的健康CSF样品的阳性对照、不使用Tau种子的健康CSF样品的阴性对照、以及其他神经系统疾病患者对照在温育447h时的ThT荧光的图。
图21B示出用于tau-PMCA的来自患有AD或其他tau蛋白病的患者的样品的荧光信号，其与包括重组tau寡聚物的样品中观察到的荧光信号相当。
图22是示出受到AD、FTD(额颞痴呆)、CBD(皮质基底节变性)和PSP(进行性核上性麻痹)影响的患者与来自对照的代表性CSF样品的基于ThT的聚集％随时间的图。
具体实施方式
提供用于检测或表征样品中错误折叠tau蛋白质的方法和试剂盒，包括用于确定或诊断采集样品的受试者中的tau蛋白病。tau蛋白质的错误折叠聚集体可能会形成并积累。错误折叠聚集体可能引起细胞功能障碍和组织损伤等其他作用。例如，tau蛋白病可能包括那些主要考虑4R错误折叠或4R和3R混合物错误折叠的疾病：阿尔茨海默氏病(AD)，帕金森氏病(PD)，进行性核上性麻痹(PSP)，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基底节变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)，创伤性脑损伤(TBI)，慢性创伤性脑病(CTE)，拳击员痴呆(DP)等。
在一些实施方式中，本文的tau蛋白病可以排除皮克氏病。在一些实施方式中，本文所述的tau蛋白病可以排除主要考虑3R tau错误折叠的那些，例如皮克氏病。
所述方法可以包括蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)，其可以通过在体外人工加速和扩增错误折叠和聚集过程，从而提供对错误折叠蛋白质聚集体例如tau的超灵敏检测。先前已经通过实验证明了朊病毒(Soto等人，WO2002/04954；Estrada等人，美国专利申请公开第20080118938号，每个文献均通过引用整体并入本文)和对于其他蛋白质错误折叠的PMCA的基本概念，例如阿尔茨海默氏病中的“Aβ”或“β淀粉样蛋白质”和帕金森氏病中的α突触核蛋白质(Soto等人，WO2016/040907，其通过引用整体并入本文)。然而，在本文件的提交日期之前，没有参考文献描述PCMA用于扩增和检测与任何主要涉及4R错误折叠或关于4R tau存在下的3R tau错误折叠相关的错误折叠tau蛋白质，或用于除皮克氏病以外的任何Tau蛋白病。本文件公开了使PMCA技术能够检测错误折叠tau聚集体的存在与否的特定实施例和细节，并且在各种实施方式中，一个或多个附加的PMCA步骤可用于检测其他错误折叠蛋白质，例如阿尔茨海默氏病中的错误折叠Aβ和帕金森氏病中的α突触核蛋白质。这样的一个或多个附加的PMCA步骤可以在各种tau蛋白病之间提供区分，例如，将AD和PD彼此区分开以及从PSP、FTD、CBD、MCI、AgD、TBI、CTE、DP等中区分开。
如本文所用，“Aβ”或“β淀粉样蛋白质”是指通过淀粉样蛋白质前体蛋白质(APP)的顺序切割形成的肽。各种Aβ同工型可包括38-43个氨基酸残基。当APP通过β-和/或γ-分泌酶以任何组合处理时，可以形成Aβ蛋白质。Aβ可能是患有或怀疑患有AD的个体的大脑中淀粉样蛋白质斑的成分。各种Aβ同工型可以包括但不限于Abeta40和Abeta42。各种Aβ肽可能与AD相关神经元损伤有关。
如本文所用，“αS”或“α-突触核蛋白质”是指全长140个氨基酸的α-突触核蛋白质，例如“αS-140”。其他同工型或片段可以包括“αS-126”，α-突触核蛋白质-126，其例如因外显子3的缺失而缺少残基41-54；和“αS-112”，α-突触核蛋白质-112，其例如因外显子5的缺失而缺少残基103-130。αS可能存在于患有PD或怀疑患有PD的个体的大脑中。各种αS同工型可以包括但不限于αS-140、αS-126和αS-112。各种αS肽可能与PD相关神经元损伤有关。
如本文所用，“tau”所指的蛋白质是来自单个基因例如人的MAPT(微管相关蛋白质tau)的可变剪接的产物。Tau蛋白质包括任何tau同工型的全长和截短形式。各种同工型包括但不限于已知存在于人脑组织中的六个tau同工型，其对应于tau基因外显子2、3和10中的可变剪接。三个同工型具有三个结合结构域，其他三个同工型具有四个结合结构域。Tau错误折叠可能存在于患有AD或怀疑患有AD的个体的大脑中，或其他像AD一样在4R和3R tau同工型存在下都认为错误折叠的tau蛋白病中。Tau错误折叠也可能存在于主要涉及4R tau同工型错误折叠的疾病中，例如进行性核上性麻痹(PSP)，tau依赖性额颞叶痴呆(FTD)，肾上腺皮质变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)等。
如本文所用，“错误折叠蛋白质聚集体”是部分或全部包括蛋白质的结构构象的蛋白质，该结构构象不同于在参与生物系统中典型的非致病性正常功能时存在的结构构象。错误折叠蛋白质可能会聚集。错误折叠蛋白质可能位于蛋白质聚集体中。错误折叠蛋白质可能是非功能性蛋白质。错误折叠蛋白质可能是该蛋白质的致病性构象异构体。单体蛋白质组合物可以以天然的、致病性构象异构体提供，而没有与种子相关的错误折叠、寡聚化和聚集的催化活性(能够在PMCA条件下催化错误折叠的错误折叠蛋白质寡聚物)。单体蛋白质组合物可以无种子形式提供。
如本文所用，“单体蛋白质”是指单一蛋白质分子。“可溶性，聚集的错误折叠蛋白质”是指保留在溶液中的寡聚物或单体蛋白质的聚集体。可溶性错误折叠蛋白质的示例可以包括任何数量的蛋白质单体，只要错误折叠蛋白质保持可溶即可。例如，可溶性错误折叠蛋白质可以包括2至约50个单位的单体蛋白质的单体或聚集体。
单体和/或可溶性错误折叠蛋白质可聚集形成不溶性聚集体、高寡聚物和/或tau原纤维。例如，Aβ或tau蛋白质的聚集可导致初原纤维、原纤维，并最终导致在AD或tau蛋白病受试者中观察到的错误折叠的斑块或缠结。“种子”或“核”是指错误折叠蛋白质或短片段的原纤维，特别是具有催化活性的可溶性错误折叠蛋白质，其用于进一步的错误折叠、寡聚和聚集。这种核依赖性的聚集可以以缓慢的滞后相为特征，其中可以形成聚集核，然后可以催化其他聚集体和较大的寡聚物和聚合物的快速形成。可以通过添加预先形成的核或种子来最小化或消除滞后相。可以提供不具有与错误折叠的种子相关的错误折叠和聚集的催化活性的单体蛋白质组合物。单体蛋白质组合物可以无种子形式提供。
如本文所用，“可溶性”物质可在生理条件下在生物流体中形成溶液，而“不溶性”物质可在生理条件下以沉淀、原纤维、沉积物、缠结或其他非溶解形式存在于此类生物流体中。此类生物流体例如可以包括流体或由以下一个或多个表达的流体：羊水；胆汁；血液；脑脊髓液；耳垢；皮肤；渗出物；粪便；胃液；淋巴液；牛奶；黏液，例如鼻分泌物；粘膜，例如鼻粘膜；腹膜液；血浆；胸膜液；脓水；唾液；皮脂；精液；汗水；滑液；眼泪；尿；等等。不溶性物质例如可以包括Aβ、αS、4R tau、3R tau的原纤维，其组合如3R tau+4R tau等。在生理条件下溶解在非生物流体中但不溶于上述生物流体之一的物质可被认为是不溶性。例如，Aβ、αS、4Rtau、3R tau、它们的组合如3R tau+4R tau等的原纤维可以溶解在例如表面活性剂的溶液如十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液中，但在生理条件下仍可能不溶于一个或多个上述生物流体。
在一些实施方式中，样品可以排除错误折叠蛋白质的不溶性种类例如Aβ、αS、4Rtau、3R tau、它们的组合如3R tau+4R tau等，作为在生理条件下可能不溶于一个或多个所述生物流体的沉淀物、原纤维、沉积物、缠结、斑块或其他形式。
例如，在一些实施方式中，样品可以排除原纤维形式的tau。样品可以排除不溶形式的错误折叠的tau蛋白质，例如，样品可以排除沉淀物、原纤维、沉积物、缠结、斑块或其他不溶形式例如原纤维形式的错误折叠的tau蛋白质。本文所述的方法可以包括通过排除不溶形式的错误折叠蛋白质来制备样品，例如，通过从样品中排除沉淀物、原纤维、沉积物、缠结，斑块或其他不溶形式例如原纤维形式的错误折叠的tau蛋白质来制备样品。本文所述的试剂盒可以包括说明书，该说明书引导使用者通过从样品中排除沉淀物、原纤维、沉积物、缠结、斑块或其他不溶形式例如原纤维形式的错误折叠tau蛋白质制备样品。从样品中排除所描述的错误折叠蛋白质的这种不溶形式可以是实质性的或完全的。
如本文所用，错误折叠蛋白质的聚集体是指蛋白质的非共价结合，包括可溶性错误折叠蛋白质。错误折叠蛋白质的聚集体可以被“解聚”，或被破坏而分解或释放可溶性错误折叠蛋白质。可溶性错误折叠蛋白质种子的集合的催化活性可以扩大，至少部分地取决于混合物中此类种子的数量。因此，破坏混合物中错误折叠蛋白质的聚集体而释放错误折叠蛋白质种子可以导致对单体蛋白质的寡聚或聚集的催化活性增加。
在各种实施方式中，提供一种用于确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否的方法。所述方法可以包括第一蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)步骤的执行。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau蛋白质。第一PMCA步骤可以包括在有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。
在各种实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在与第一错误折叠蛋白质聚集体相对应的tau蛋白病的方法。所述方法可以包括提供来自受试者的样品。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括tau同工型。第一底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第一错误折叠蛋白质聚集体。第一PMCA步骤可以包括在有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一PMCA步骤可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中是否存在tau蛋白病。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。所述方法可以规定，当第一个底物蛋白质由单体3R tau组成时，tau蛋白病不包括皮克氏病。
在各种实施方式中，提供一种使用捕获来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否的方法。所述方法可以包括从样品中捕获第一错误折叠蛋白质聚集体，以形成所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体与摩尔过量的第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第一错误折叠蛋白质聚集体。摩尔过量可以大于所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的蛋白质单体的量。所述方法可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第一底物蛋白质错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。
在各个实施例中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病(AD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中的AD的存在与否。
在一些实施方式中，确定受试者中的AD的存在与否可以包括通过确定AD tau蛋白质聚集体的标志来将AD与一个或多个其他tau蛋白病区分开。AD tau蛋白质聚集体的标志可以包括以下一个或多个：与如下PMCA动力学参数对应的一个或多个AD特异性：滞后期，T50，扩增速率和扩增程度；使用对AD tau蛋白质聚集体的构象表位具有选择性的抗体的测定；对AD tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂；以及AD tau蛋白质聚集体的光谱特征。
在各种实施例中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括帕金森氏病(PD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中的PD的存在与否。
一些实施方式中，确定受试者中的PD的存在与否可以包括通过确定PD tau蛋白质聚集体的标志来将PD与一个或多个其他tau蛋白病区分开。PD tau蛋白质聚集体的标志可以包括以下一个或多个：与如下PMCA动力学参数对应的一个或多个PD特异性：滞后期，T50，扩增速率和扩增程度；使用对PD tau蛋白质聚集体的构象表位具有选择性的抗体的测定；对PD tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂；以及PD tau蛋白质聚集体的光谱特征。
在各种实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括进行性核上性麻痹(PSP)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中的PSP的存在与否。
在一些实施方式中，确定受试者中的PSP的存在与否可以包括通过确定PSP tau蛋白质聚集体的标志来将PSP与一个或多个其他tau蛋白病区分开。PSP tau蛋白质聚集体的标志可以包括以下一个或多个：与如下PMCA动力学参数对应的一个或多个PSP特异性：滞后相，T50，扩增速率和扩增程度；使用对PSP tau蛋白质聚集体的构象表位有选择性的抗体的测定法；对PSP tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂；以及PSP tau蛋白质聚集体的光谱特征。
在各种实施例中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括额颞叶痴呆(FTD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中的FTD的存在与否。
在一些实施方式中，确定受试者中的FTD的存在与否可以包括通过确定FTD tau蛋白质聚集体的标志，将FTD与一个或多个其他tau蛋白病区分开。FTD tau蛋白质聚集体的标志可以包括以下一个或多个：与如下PMCA动力学参数对应的一个或多个FTD特异性：滞后期，T50，扩增速率和扩增程度；使用对FTD tau蛋白质聚集体的构象表位有选择性的抗体的测定；对FTD tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂；以及FTD tau蛋白质聚集体的光谱特征。
在各种实施方式中，提供一种用于确定受试者中是否存在tau蛋白病的方法，所述tau蛋白病包括皮质基底节变性(CBD)。所述方法可以包括提供受试者。所述方法可以包括从受试者中获得样品。样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述方法可以包括执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物。第一底物蛋白质可以包括4R tau。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。每个温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。每个温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第一PMCA步骤可以包括通过检测第一温育混合物中第一扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第一错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定受试者中的CBD的存在与否。
在一些实施方式中，确定受试者中的CBD的存在与否可以包括通过确定CBD tau蛋白质聚集体的标志来将CBD与一个或多个其他tau蛋白病区分开。CBD tau蛋白质聚集体的标志可以包括以下一个或多个：与如下PMCA动力学参数对应的一个或多个CBD特异性：滞后相，T50，扩增速率和扩增程度；使用对CBD tau蛋白质聚集体的构象表位有选择性的抗体的测定；对CBD tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂；以及CBD tau蛋白质聚集体的光谱特征。
在其他实施例中，本文上面描述的每个方法可以结合以下特征中的一个或多个。具体而言，应当理解，参照任何蛋白质底物、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物、PMCA步骤、样品的一部分等描述的每个特征选择为独立于其他各种实施方式中的任何其他蛋白质底物、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物，PMCA步骤、样品的一部分等。例如，在一些实施方式中，针对“第一”蛋白质底物描述的特征也可以选择为独立于“第二”蛋白质底物的描述；针对“第一”错误折叠蛋白质聚集体描述的特征也可以选择为独立于“第二”错误折叠蛋白质聚集体的描述；针对“第一”温育混合物描述的特征也可以选择为独立于“第二”温育混合物的描述；针对“第一”PMCA步骤描述的特征也可以选择为独立于“第二”PMCA步骤的描述等。此外，例如，应当理解，关于参照“每个”蛋白质底物、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物、PMCA步骤、样品的一部分等描述的特征选择为独立于其他各种实施方式、任何其他枚举元素例如“第一”、“第二”、“第三”等、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物、PMCA步骤，样品等。例如，针对“每个底物蛋白质”描述的特征也可以选择为独立于“第一底物蛋白质”、“第二底物蛋白质”、“第三底物蛋白质”等的描述和支持。
在几个实施方式中，通常针对列举或指定的元素而描述的特征，例如“第一”、“第二”、“每个”等可以独立地选择为相同或不同。例如，在一些实施方式中，第一底物蛋白质可以包括4R tau，第二底物蛋白质可以包括Aβ；可以针对第一和第二PMCA步骤等独立地选择诸如温度的条件。在几个实施方式中，通常针对此类第一和第二元件描述的一些特征可以选择为相同或重叠，而针对此类第一和第二元件通常描述的其他特征可以独立地选择为不同。例如，在一些实施方式中，当在混合的温育混合物中使用不同的第一和第二底物蛋白质例如4R tau和Aβ以并行或串联进行相应的第一和第二PMCA步骤时，样品的第一和第二部分可以相同或混合，并且第一和第二温育混合物可以相同或混合。
在几个实施方式中，可以为每个蛋白质底物、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物、PMCA步骤、样品的一部分等独立地选择一种、两种或更多种情况。例如，各种方法实施方式可以包括使用4R tau作为第一底物蛋白质的第一PMCA步骤、使用Aβ作为第二底物蛋白质的第二PMCA步骤、使用α突触核蛋白质作为第三底物蛋白质的第三PMCA步骤、使用3R tau作为第四底物蛋白质的第四PMCA步骤等。可以对样品例如实验室样品或从受试者例如患有tau蛋白病的受试者中抽取的样品执行这样的多个PMCA步骤。可以针对每个蛋白质底物、错误折叠蛋白质聚集体、扩增的错误折叠蛋白质聚集体、温育混合物、PMCA步骤、样品的一部分等并行执行这样的多个PMCA步骤，例如如下。
在各种实施方式中，所述方法可以包括确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在。所述方法可以包括执行至少第二PMCA步骤以确定样品中至少第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物。第二底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第二错误折叠蛋白质聚集体。第二PMCA步骤可以包括在有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在第二错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第二底物蛋白质错误折叠和/或聚集的第二温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第二温育混合物。第二PMCA步骤可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。所述第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。
在一些实施方式中，所述方法可以包括确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体和第二错误折叠蛋白质聚集体的存在。所述方法可以包括执行至少第三PMCA步骤以确定至少第三错误折叠蛋白质聚集体在样品中的存在与否。第三PMCA步骤可以包括通过使样品的第三部分与第三底物蛋白质接触而形成第三温育混合物。第三底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第三错误折叠蛋白质聚集体。第三PMCA步骤可以包括在有效形成第三扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育周期可以包括在第三错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第三底物蛋白质错误折叠和/或聚集的第三温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第三扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第三温育混合物。第三PMCA步骤可以包括通过分析第三温育混合物中第三扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第三错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第三错误折叠蛋白质聚集体可以包括第三底物蛋白质。第三扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第三底物蛋白质。
在几个实施方式中，所述方法可以包括确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体、第二错误折叠蛋白质聚集体和第四错误折叠蛋白质聚集体的存在。所述方法可以包括执行至少第四PMCA步骤以确定样品中第四错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第四PMCA步骤可以包括通过使样品的第四部分与第四底物蛋白质接触而形成第四温育混合物。第四底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第四错误折叠蛋白质聚集体。第四PMCA步骤可以包括在有效形成第四扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育周期可以包括在第四错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第四底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第四温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第四扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第四温育混合物。第四PMCA步骤可以包括通过分析第四温育混合物中第四扩增的错误折叠的蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第四折叠的蛋白质聚集体的存在与否。第四错误折叠蛋白质聚集体可以包括第四底物蛋白质。第四扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第四底物蛋白质。
在各种实施方式中，第一底物蛋白质可独立地包括tau同工型，例如3R tau、4Rtau等。在一些实施方式中，第一底物蛋白质可包括4R tau。第一底物蛋白质可以包括3Rtau。例如，当样品对应于皮克氏病或来自患有皮克氏病的受试者时，第一底物蛋白质可能不包括3R tau。第一底物蛋白质可以是可溶性的。第一底物蛋白质可以是单体的。第一底物蛋白质可以处于天然体内构象，例如折叠。第一底物蛋白质可以彼此不同。
在各种实施方式中，第二底物蛋白质可独立地包括以下之一：tau同工型，例如3Rtau，4R tau等；Aβ，α突触核蛋白质等。第二底物蛋白质可以包括以下之一：3R tau，Aβ，α突触核蛋白质等。第二底物蛋白质可以包括3R tau。第二底物蛋白质可以包括Aβ。第二底物蛋白质可以包括α突触核蛋白质。第二底物蛋白质可以基本上由以下之一组成或由以下之一组成：3R tau，4R tau，Aβ或α突触核蛋白质。第二底物蛋白质可以是可溶性的。第二底物蛋白质可以是单体的。第二底物蛋白质可以是天然的体内构象，例如折叠。第二底物蛋白质可以彼此不同。
在各种实施方式中，第三底物蛋白质可独立地包括以下之一：tau同工型，例如3Rtau，4R tau等；Aβ，α突触核蛋白质等。第三底物蛋白质可以包括以下之一：3R tau，Aβ，α突触核蛋白质等。第三底物蛋白质可以包括3R tau。第三底物蛋白质可以包括Aβ。第三底物蛋白质可以包括α突触核蛋白质。第三底物蛋白质可以基本上由以下之一组成或由以下之一组成：3R tau，4R tau，Aβ或α突触核蛋白质。第三底物蛋白质可以是可溶性的。第三底物蛋白质可以是单体的。第三底物蛋白质可以处于天然体内构象，例如折叠。第三底物蛋白质可以彼此不同。
在各种实施方式中，第四底物蛋白质可独立地包括以下之一：tau同工型，例如3Rtau，4R tau等；Aβ，α突触核蛋白质等。第四底物蛋白质可以包括以下之一：3R tau，Aβ，α突触核蛋白质等。第四底物蛋白质可以包括3R tau。第四底物蛋白质可以包括Aβ。第四底物蛋白质可以包括α突触核蛋白质。第四底物蛋白质可以基本上由以下之一组成或由以下之一组成：3R tau，4R tau，Aβ或α突触核蛋白质。第四底物蛋白质可以是可溶性的。第四底物蛋白质可以是单体的。第四底物蛋白质可以处于天然体内构象，例如折叠。第四底物蛋白质可以彼此不同。
在一些实施方式中，样品可以取自受试者。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。
在几个实施方式中，所述方法可以包括进行至少第二PMCA步骤以确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体、例如包含第二底物蛋白质的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物。第二底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第二错误折叠蛋白质聚集体。所述方法可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二底物蛋白质可以包括以下之一：淀粉样-β(Aβ)，α突触核蛋白质和3R tau。
在一些实施方式中，样品可以取自受试者。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。所述方法可以包括执行至少第二PMCA步骤以确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物。第二底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第二错误折叠蛋白质聚集体。第二PMCA步骤可以包括在有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。每个温育循环可以包括在第二错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第二底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第二温育混合物。每个温育周期可以包括破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第二温育混合物。第二PMCA步骤可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增、错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。
在各种实施方式中，受试者可以患有tau蛋白病。所述方法可以包括根据以下来表征受试者中tau蛋白病的身份：样品中存在第一错误折叠蛋白质聚集体；样品中是否存在第二错误折叠蛋白质聚集体。第二底物蛋白质可以包括以下之一：淀粉样-β(Aβ)，α突触核蛋白质和3R tau。例如，作为第一错误折叠蛋白质聚集体的错误折叠的4R tau聚集体和作为第二错误折叠蛋白质聚集体的Aβ的存在可能表明受试者的tau蛋白病是AD；作为第一错误折叠蛋白质聚集体的错误折叠的4R tau聚集体和作为第二错误折叠蛋白质聚集体的α突触核蛋白质的存在可能表明受试者的tau蛋白病是PD；作为第一错误折叠蛋白质聚集体的错误折叠的4R tau聚集体的存在、以及包含Aβ、α突触核蛋白质或3R在内的第二错误折叠蛋白质聚集体的缺失可能表明存在4R tau蛋白病，例如PSP，CBD，AGD等。
在各种实施方式中，tau蛋白病可以包括原发性tau蛋白病或继发性tau蛋白病。Tau蛋白病可以至少部分地以4R tau蛋白质的错误折叠和/或聚集为特征。所述tau蛋白病可以至少部分地以4R tau蛋白质和3R tau蛋白质的错误折叠和/或聚集为特征。表征tau蛋白病的至少一部分的错误折叠和/或聚集的4R tau蛋白质与错误折叠和/或聚集的3R tau蛋白质的比率为以下之一：约1:99，5:95，10:90，15:85，20:80，25:75，30:70，35:65，40:60，45:55，50:50，55:45，60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5和99：1，或者上述任何两个比率之间的范围，例如，介于1:99和99:1之间。
在几个实施方式中，所述方法可以包括通过分析第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体或者用于以下至少一种的标志的一个或多个相应PMCA动力学参数，来表征tau蛋白病的身份：阿尔茨海默氏病(AD)，帕金森氏病(PD)，进行性核上性麻痹(PSP)，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基底节变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)，颅脑外伤(TBI)，慢性颅脑外伤(CTE)和拳击员痴呆(DP)。例如，表征tau蛋白病的身份可以包括确定一个或多个相应PMCA动力学参数，该参数包括滞后相，T50，扩增速率和扩增程度中的一项或多项。表征tau蛋白病的身份可以包括将一个或多个相应PMCA动力学参数与一个或多个相应的预定的相应PMCA动力学参数进行比较，以确定有效表征tau蛋白病的身份的相似性或差异，所述PMCA动力学参数是tau蛋白病的身份的特征。
在一些实施方式中，所述方法可以包括使用对于对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的构象表位具有选择性的抗体来表征tau蛋白病的身份。所述方法可以包括使用对于对每个tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂来表征tau蛋白病的身份。对于对每个tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体具有选择性的指示剂可以包括小分子，肽，或DNA或RNA适配体等。所述方法可以包括使用每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的光谱特征来表征tau蛋白病的身份。
在一些实施方式中，所述方法可以包括例如通过分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的蛋白水解抗性来表征tau蛋白病的身份。例如，以0.1到5000μg/mL的蛋白酶浓度，在20℃至120℃的不同温度下和不同时间例如1分钟至4h时，每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体可以与蛋白酶例如蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等接触。每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的蛋白水解抗性可以被表征，并用于区分各种对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体。
在几个实施方式中，所述方法可以包括通过分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体对于变性的稳定性来表征tau蛋白病的身份。例如，可以在充分升高的温度下用胍盐或尿素处理每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体，以诱导每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的蛋白质变性。胍盐或尿素的浓度范围可以从0.1M到8M。温度范围可以在20℃到120℃之间。每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的稳定性都可以被表征并用于区分各种对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体。
所述方法可以包括每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的沉降。所述方法可以包括凝胶色谱法以表征每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的大小。所述方法可以包括每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的圆二色光谱。所述方法可以包括傅里叶变换红外光谱法，以分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的二级结构。所述方法可以包括核磁共振波谱法，以分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的结构。所述方法可以包括质谱法例如片段和碰撞诱导的解离，以分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的二级和三级结构。所述方法可以包括显微镜检查例如原子力显微镜检查、冷冻电子显微镜检查等，以分析每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体的形态。这些方法中的每一种都可以使用质量、磁性和/或同位素稳定性不同的原子同位素进行取代，以补充这些方法；例如，核磁共振波谱法可以在每个对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau蛋白质聚集体中与氘交换结合，以获得结构信息。
在各种实施例中，这些方法可以规定，使tau蛋白病明确排除皮克氏病。在各种实施例中，皮克氏病的排除不包括皮克氏病的其余部分。
在几个实施方式中，所述方法可以包括确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病，包括将样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否与取自对照受试者的对照样品进行比较。该检测可以包括检测样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量。该样品可以取自受试者。所述方法可以包括通过将样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量与预定的阈值量进行比较来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。根据认知测试，样品可以取自没有表现出痴呆症临床体征的受试者。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。根据对比成像，可以从没有表现出皮质斑块或缠结的受试者中获取样品。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。根据认知测试，样品可以取自表现出痴呆症临床体征的受试者。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否，来确定或诊断是否存在tau蛋白病作为导致痴呆症的临床体征的因素。根据认知测试，样品可以取自没有表现出痴呆症临床体征的受试者。根据基因测试，受试者可能表现出对痴呆症的易感性。基因测试可能表明，例如，根据ApoE4等位基因的一个或两个副本、脑源性神经营养因子(BDNF)基因如val66met等位基因的变体、其中AA位置66的缬氨酸被蛋氨酸取代等，tau蛋白病的风险会增加。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者中是否存在tau蛋白病。
在一些实施方式中，所述方法可以包括第一温育混合物的制备，其以以下的至少一种浓度来表征：小于约20μM的第一底物蛋白质；小于约75μM的肝素；小于约190mM的NaCl；小于约9.5μM的硫黄素T。
在各种实施方式中，所述方法可以包括制备包含第一基质蛋白质的第一温育混合物，所述第一基质蛋白质的浓度是以μM为单位的以下中的一个或多个：约0.001，0.01，0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1,5，1.75，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，13.5，14，14.5，15，15.5，16，16.5，17，17.5，18，18.5，19，19.5，20，25，50，70，100，150，200，250，500，750，1000，1500或2000，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约0.001μM和约2000μM之间。所述方法可以包括制备以肝素为表征的第一温育混合物，其浓度是以μM为单位的以下中的一个或多个：约0.001，0.01，0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1,5，1.75，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10 11，12，12.5，15，17.5，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70和75，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约0.001μM和约75μM之间。所述方法可以包括制备第一温育混合物，该第一温育混合物包括以下中的一个或多个缓冲液组合物：Tris-HCL，PBS，MES，PIPES，MOPS，BES，TES和HEPES。所述方法可以包括制备包含第一缓冲混合物的第一温育混合物，其总浓度为以下中的一个或多个：约1μM，10μM，100μM，250μM，500μM，750μM，1mM，10mM，100mM，250mM，500mM，750mM和1M，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约1μM和约1M之间。所述方法可以包括制备包含盐组合物的第一温育混合物，其总浓度为以下中的一个或多个：约1μM，10μM，100μM，250μM，500μM，750μM，1mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，110mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，250mM，500mM，750mM和1M，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约1μM和约1M之间。盐组合物可包括以下一个或多个：NaCl和KCl。
在各种实施方式中，所述方法可以包括在一个或多个以下pH下制备或维持第一温育混合物：约5，5.5，6，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5或9，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约pH5和约pH值9。
在一些实施方式中，所述方法可以包括制备包含指示剂的第一温育混合物，其总浓度为以下中的一个或多个：约1nM，10nM，100nM，250nM，500nM，750nM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，9.5μM，10μM，25μM，50μM，100μM，250μM，500μM，750μM，1mM，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约1nM和大约1mM之间。
在所述方法的一些实施方式中，所述温育可以包括在以℃为单位的以下中的一个或多个温度下加热或维持第一温育混合物：约5，10，15，20，22.5，25，27.5，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，50，55，60，或者任何两个前述值之间的范围，例如，介于约5℃和约60℃之间。
在几个实施方式中，所述方法可以包括使第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂与第一温育混合物接触。第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂可以通过在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下的指示状态和在没有第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下的非指示状态来表征。确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在可以包括检测第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂的指示状态。指示剂的指示状态和指示剂的非指示状态可以通过荧光的差异来表征。确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在可以包括检测荧光的差异。所述方法可以包括使摩尔过量的第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂与第一温育混合物接触。所述摩尔过量可以大于第一底物蛋白质中包含的蛋白质单体与第一温育混合物中第一错误折叠蛋白质聚集体的总摩尔量。第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂可以包括以下一个或多个：硫黄素，例如硫黄素T或硫黄素S；刚果红，m-I-二苯乙烯，柯胺G，PIB，BF-227，X-34，TZDM，FDDNP，MeO-X-04，IMPY，NIAD-4，发光共轭聚噻吩，荧光蛋白质如绿色荧光蛋白质和黄色荧光蛋白质的融合物，其衍生物等。
在各种实施方式中，所述方法可以包括确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量。例如，可以将已知量的体外合成错误折叠蛋白质聚集体种子添加到健康患者例如CSF的生物流体的各个部分中。随后，可以在各个部分上执行PMCA。在各个部分的每一个中，错误折叠蛋白质聚集体的荧光指示剂可以被添加，并且荧光可以测量为例如PMCA循环数的函数，以确定各种PMCA动力学参数，例如，PMCA循环数、最大荧光信号、到最大荧光信号的50％的PMCA循环数、荧光信号增加的滞后相、荧光信号相对于PMCA循环的增加速率等。校准曲线显示所添加的合成种子浓度与PMCA动力学参数之间的关系。可以测量未知样品的动力学参数，并将其与校准曲线进行比较，以确定特定样品中预期的种子量。可替代地，可以通过一系列已知的样品稀释液以及每个系列稀释液的PMCA来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量，以确定是否可以在特定稀释度下检测到第一错误折叠蛋白质聚集体。可以基于已知的稀释度来估计未稀释样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量，该稀释度会导致PMCA未检测到第一错误折叠蛋白质聚集体。在另一个实施例中，可以通过一系列已知的样品稀释液和PMCA来确定样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量，以确定每个系列稀释液中的检测信号。一系列稀释液中收集的检测信号可以例如通过最小二乘分析来匹配，以确定是否可以在特定稀释液中检测到第一错误折叠蛋白质聚集体。在另一个实施例中，样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量可以通过已知的针对第一错误折叠蛋白质聚集体的抗体的量来确定。
在一些实施方式中，所述方法可以包括以至少一个或多个以下的灵敏度检测样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量：约70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％，例如至少约70％。所述方法可以包括检测小于以下的一个或多个的样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量：约625，62.5，6.25，630μg，63μg，6.3μg，630ng，63ng，6.3ng，630pg，200pg，63pg，6.3pg，630fg，300fg，200fg，125fg，63fg，50fg，30fg，15fg，12.5fg，10fg，5fg或2.5fg。所述方法可以包括检测小于以下的一个或多个的样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量：约100nmol，10nmol，1nMol，100pmol，10pmol，1pmol，100fmol，10fmol，3fmol，1fmol，100attomol，10attomol，5attomol，2attomol，1attomol，0.75attomol，0.5attomol，0.25attomol，0.2attomol，0.15attomol，0.1attomol和0.05attomol，例如，小于约100nmol。所述方法可以包括以与样品中所包含的第一底物蛋白质之间的摩尔比，来检测样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的量。摩尔比可以小于以下的一个或多个：约1:100，1:10,000，1:100,000和1:1,000,000，例如，小于约1:100。所述方法可以包括确定与对照样品相比样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量。
在几个实施方式中，所述方法可以包括用以下的一个或多个的特异性检测样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体：约70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％，例如至少约70％。所述方法可以包括检测第一错误折叠蛋白质聚集体，包括以下一个或多个：蛋白质印迹测定，斑点印迹测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光蛋白质/肽结合测定，硫黄素结合测定，刚果红结合测定，沉降测定，电子显微镜，原子力显微镜，表面等离子体共振和光谱学。ELISA可以包括双面夹心ELISA。所述光谱可以包括以下一个或多个：准光散射光谱，多光谱紫外光谱，共焦双色荧光相关光谱，傅立叶变换红外光谱，带光谱检测的毛细管电泳，电子自旋共振光谱，核磁共振光谱和荧光共振能量转移(FRET)光谱。检测第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括使第一温育混合物与蛋白酶接触；以及在以下一个或多个方法中使用抗错误折叠蛋白质抗体或对错误折叠tau聚集体具有特异性的抗体检测第一错误折叠蛋白质聚集体：蛋白质印迹分析，斑点印迹分析和ELISA。
在各种实施方式中，所述方法可以包括提供标记形式的第一底物蛋白质。标记形式的第一底物蛋白质可以包括以下中的一个或多个：共价结合的放射性氨基酸，共价结合的同位素标记的氨基酸和共价结合的荧光团。所述方法可以包括检测掺入到第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体中的标记形式的第一底物蛋白质。
在一些实施方式中，样品可以包括一个或多个生物流体，例如血液，生物材料，例如耳垢、均质化的组织和细胞裂解液。样品可以包括以下一个或多个：羊水；胆汁；血液；脑脊髓液；耳垢；皮肤；渗出物；粪便；胃液；淋巴液；milk；黏液；粘膜；腹膜液；血浆；胸膜液；脓水；唾液；皮脂；精液；汗水；滑液；眼泪和尿。样品可以来源于以下一个或多个细胞或组织：皮肤，脑，心脏，肝脏，胰腺，肺，肾，胃肠，神经，粘膜，血细胞，腺体和肌肉。所述方法可以包括从受试者中获得样品，诸如通过抽取生物流体或生物材料，进行组织活检等。例如以液体或均质形式以添加到特定PMCA反应中的样品各部分的体积(例如以流体或均质形式)可以是以μL为单位的以下的一个：约5,000，4,000，3,000，2,000，1000，900，800，750，700，650，600，550，500，450，400，350，300，250，200，150，125，100，90，80，70，60，50，40，30，25，20，15，10，5或1，或者上述任何两个比率之间的范围，例如，介于约1μL和约1000μL之间。在一些实施方式中，当样品是CSF时，添加到特定PMCA反应中的每个部分的量可以是以μL为单位的任何前述体积，例如，约80，70，60，50，40，30，25，20，15或10中之一的体积，或者前述值中的任何两个之间的范围，例如，从约10μL至约80μL，例如，约40μL。在一些实施方式中，当样品是血浆时，添加到特定PMCA反应中的每个部分的量可以是以μL为单位的任何前述体积，例如，约750，700，650，600，550，500，450，400，350，300，250，，或者上述任何两个比率之间的范围，例如，从约250μL至约750μL，例如，约500μL。在一些实施方式中，当样品是血液时，添加到特定PMCA反应中的每个部分的量可以是以μL为单位的任何前述体积，例如，约5,000，4,000，3,000，2,000，1000，900，800，750，700，650，600，550，500，450，400，350，300，250或200，或者上述任何两个比率之间的范围，例如，从约200μL至约1000μL。
在几个实施方式中，受试者可以是以下之一：人，小鼠，大鼠，狗，猫，牛，马，鹿，麋鹿，绵羊，山羊，猪和非人灵长类。所述受试者可以是以下一个或多个：处于患有tau蛋白病的风险，患有tau蛋白病的疾病和正在接受tau蛋白病的治疗。所述方法可以包括通过比较样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量与在跟样品不同的时间从受试者获取的第一错误折叠蛋白质聚集体的量来确定受试者中tau蛋白病的进展或稳态。可以用调节tau蛋白病的疗法治疗受试者。所述方法可以包括将样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量与比较样品中的第一错误折叠蛋白质聚集体的量进行比较。在tau蛋白病的调节疗法下，可以在一段时间内的不同时间从受试者获取样品和比较样品。所述方法可以包括确定受试者是以下之一：根据一段时间内第一错误折叠蛋白质聚集体的变化对tau蛋白病调节疗法有反应，或根据第一错误折叠蛋白质的稳态对tau蛋白病调节疗法没有反应。所述方法可以包括用所述tau蛋白病调节疗法来治疗确定为对所述tau蛋白病调节疗法有反应的受试者。所述方法可以包括用调节tau蛋白病的疗法治疗受试者，以抑制第一底物蛋白质的产生或抑制第一错误折叠蛋白质聚集体的聚集。
在一些实施方式中，可以用蛋白质错误折叠障碍(PMD)调节疗法治疗受试者。所述方法可以包括将样品中每个错误折叠蛋白质聚集体的量与比较样品中每个错误折叠蛋白质聚集体的量进行比较。在每个错误折叠蛋白质聚集体调节疗法下，可以在一段时间内的不同时间从受试者获取样品和比较样品。所述方法可以包括确定或诊断受试者是以下之一：根据一段时间内每个错误折叠蛋白质聚集体的变化对每个错误折叠蛋白质聚集体调节疗法有反应，或根据一段时间内每个错误折叠蛋白质聚集体的稳态对每个错误折叠蛋白质聚集体调节疗法没有反应。所述方法可以包括用每个错误折叠蛋白质聚集调节疗法来治疗确定为对每个错误折叠蛋白质聚集调节疗法有反应的受试者。对于AD，例如，PMD调节疗法可以包括以下一个或多个的给药：BACE1抑制剂(β-分泌酶1)；γ-分泌酶抑制剂；以及Aβ稳态的调节剂，例如Aβ稳态的免疫治疗调节剂。Aβ调节疗法可以包括以下一个或多个的给药：E2609；MK-8931；LY2886721；AZD3293；司马西特(LY-450139)；avagacestat(BMS-708163)；索拉珠单抗；克雷内治单抗；巴比珠单抗；BIIB037；CAD106；8F5或5598或其他针对Aβ球聚体的抗体，例如，Barghorn等所述的“Globular amyloidβ-peptide1-42 oligomer--ahomogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer’s disease”J.Neurochem.，2005，95，834-847，其全部教导通过引用并入本文；ACC-001；V950；Affitrope AD02；等等。
对于PD，例如，PMD调节疗法可以包括主动免疫，例如PD01A+或PD03A+，被动免疫，例如PRX002，等等。PMD调节疗法还可以包括使用以下的治疗：GDNF(胶质细胞源神经营养因子)，肌苷，钙通道阻滞剂，尤其是Cav1.3通道阻滞剂如伊拉地平、尼古丁和尼古丁受体激动剂，GM-CSF，谷胱甘肽，PPAR-γ激动剂如吡格列酮，以及包括D2/D3多巴胺受体激动剂和LRRK2(富含亮氨酸的重复激酶2)抑制剂的多巴胺受体激动剂。
在一些实施方式中，可以使用PMCA在来自患者的样品中测量错误折叠蛋白质的量。错误折叠蛋白质测量值升高的患者的PMD可以采用疾病调节疗法进行治疗。正常的错误折叠蛋白质测量值的患者可能无法接受治疗。可以跟踪患者对疾病调节疗法的反应。例如，可以在治疗干预开始时在患者样品中测量错误折叠蛋白质水平。在对患者进行了临床上有意义的一段时间的治疗后，可以获取另一个患者样品，并可以测量错误折叠蛋白质水平。在治疗干预后表现出错误折叠蛋白质水平变化的患者可被视为对治疗有反应。表现出错误折叠蛋白质水平不变的患者可被视为没有反应。所述方法可以包括检测患者样品中的错误折叠蛋白质聚集体，所述患者样品包括可能干扰PMCA反应的组分。
在各种实施方式中，所述方法可以包括在一个或多个样品和第一温育混合物中选择性地浓缩第一错误折叠蛋白质聚集体。选择性地浓缩第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括在形成第一温育混合物之前对样品进行预处理。选择性地浓缩第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括在温育第一温育混合物之前对第一温育混合物进行预处理。选择性地浓缩第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括使能够结合第一错误折叠蛋白质聚集体的一个或多个抗体接触以形成捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体。能够结合第一错误折叠蛋白质聚集体的一个或多个抗体可以包括以下一个或多个：对第一错误折叠蛋白质聚集体的氨基酸表位序列具有特异性的抗体，以及对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体。对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体可以对于对tau蛋白病具有特异性的错误折叠tau聚集体的构象表位具有选择性。能够结合第一错误折叠蛋白质聚集体的一个或多个抗体可以与固相偶联。固相可以包括磁珠和多孔板中的一个或多个。
例如，ELISA板可以用抗体包覆，所述抗体用于从患者样品中捕获第一错误折叠蛋白质聚集体。可以将用抗体包覆的ELISA板与患者样品一起温育，可以洗去未结合的物质，并可以进行PMCA反应。抗体也可以与珠子偶联。珠子可以与患者样品一起温育，并用于从患者样品的其余部分中分离出第一错误折叠蛋白质聚集体-抗体复合物。
在一些实施方式中，使样品与第一底物蛋白质接触以形成第一温育混合物可以包括使摩尔过量的第一底物蛋白质与包含所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体的样品接触。第一底物蛋白质的摩尔过量可以大于所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体中包含的蛋白质单体的总摩尔量。在所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体的存在下，温育可以有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物，以形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体。
在几个实施方式中，破坏第一温育混合物可以包括物理破坏和/或热破坏。例如，破坏可以包括以下中的一个或多个：超声处理，搅拌，摇动，冷冻/解冻，激光照射，高压釜温育，高压和均质化。破坏第一温育混合物可以包括循环搅拌。循环搅拌可以进行以下一个或多个：约每分钟50转(RPM)至10,000RPM，介于约200RPM和约2000RPM之间，以及约500RPM。破坏第一温育混合物可以在以下一个或多个的各温育周期中进行：介于约5秒和约10分钟之间，介于约30秒和约1分钟之间，介于约45秒和约1分钟之间，以及约1分钟。可以在以下一个或多个的各温育周期中独立进行第一温育混合物的温育：介于约1分钟和约5小时之间，介于约5分钟和约5小时之间，介于约10分钟和约2小时之间，介于约15分钟和约1小时之间，以及介于约25分钟和大约45分钟之间。各温育周期可以包括以如下一个或多个的方式独立地温育和破坏第一温育混合物：温育约1分钟至约5小时，并破坏约5秒至约10分钟；温育约5分钟至约5小时，并破坏约5秒至约10分钟；温育约10分钟至约2小时，并破坏约30秒至约1分钟；温育约15分钟至约1小时，并破坏约45秒至约1分钟；温育约25分钟至约45分钟，并破坏约45秒至约90秒；温育约29分钟和约1分钟；温育约1分钟，并破坏约1分钟。可以以以下一个或多个重复进行温育循环：介于约2倍至约1000倍之间，介于约5倍至约500倍之间，介于约50倍至约500倍之间，以及介于约150倍至约250倍之间。
在各种实施方式中，可以在生理条件下进行使样品与第一底物蛋白质接触以形成第一温育混合物。所述方法可以包括使样品与摩尔过量的第一底物蛋白质接触以形成第一温育混合物。摩尔过量可以大于样品的第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的蛋白质单体的总摩尔量。
在一些实施方式中，所述方法可以包括使样品与硫黄素例如硫黄素T或硫黄素S以及摩尔过量的第一底物蛋白质接触，以形成第一温育混合物。摩尔过量可以大于样品的第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的第一底物蛋白质的量。所述方法可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育循环。各温育循环可以包括在第一错误折叠蛋白质聚集体的存在下温育有效引起第一底物蛋白质的至少一部分的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。各温育周期可以包括摇动有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。所述方法可以包括通过检测对应于第一错误折叠蛋白质聚集体的硫黄素的荧光来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在。
在几个实施方式中，可以通过以下方法之一来生产第一底物蛋白质：化学合成，重组生产以及从非重组生物样品中提取。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括可溶性第一错误折叠蛋白质聚集体和不溶性第一错误折叠蛋白质聚集体中的一个或多个。第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括一个或多个：可溶部分和不溶部分。第一错误折叠蛋白质聚集体可以基本上是可溶性第一错误折叠蛋白质聚集体。在一些实施方式中，所述方法可以提供不包括tau原纤维的样品。例如，可以将样品过滤或离心以去除tau原纤维。
在各种实施方式中，第二底物蛋白质可以不同于第一底物蛋白质。第二底物蛋白质可以包括以下之一：淀粉样β(Aβ)，α突触核蛋白质，3R tau和4R tau。第一底物蛋白质可以包括4R tau。
在一些实施方式中，所述方法可以包括执行至少第二PMCA步骤以确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物。第二底物蛋白质可以在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成第二错误折叠蛋白质聚集体。第二PMCA步骤可以包括在有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。各温育循环可以包括在第二错误折叠蛋白质聚集体存在下温育有效引起第二底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第二温育混合物。各温育周期可以包括破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第二温育混合物。第二PMCA步骤可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。
在几个实施方式中，所述tau蛋白病可存在于受试者中。所述方法可以包括根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在来表征受试者中的tau蛋白病的身份。所述方法可以包括根据样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来表征受试者中tau蛋白病的身份。
在一些实施方式中，所述方法可以提供：所述tau蛋白病并不是以3R tau蛋白质的错误折叠和/或聚集为主要特征。例如，表征tau蛋白病的至少一部分的错误折叠和/或聚集的4R tau蛋白质与错误折叠和/或聚集的3R tau蛋白质的比率为以下之一：约1:99，5:95，10:90，15:85，20:80，25:75，30:70，35:65，40:60，45:55，50:50，55:45，60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5和99:1，任何两个上述比率之间的范围，例如，介于1:99和99:1之间。
在各种实施方式中，所述方法可以包括使样品与硫黄素例如硫黄素S或硫黄素T、以及摩尔过量的第一底物蛋白质接触，以形成第一温育混合物。摩尔过量可以大于样品的第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的蛋白质单体的量。所述方法可以包括有效进行两次或更多次温育周期以形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体。各温育循环可以包括在第一错误折叠蛋白质聚集体的存在下温育有效引起第一底物蛋白质的至少一部分的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。各温育周期可以包括摇动有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第一温育混合物。所述方法可以包括通过检测对应于第一错误折叠蛋白质聚集体的硫黄素的荧光来确定样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。
在所述方法的一些实施方式中，可以使用对第一错误折叠蛋白质聚集体具有特异性的一个或多个抗体来从样品中捕获第一错误折叠蛋白质聚集体以形成所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体。对第一错误折叠蛋白质聚集体具有特异性的一个或多个抗体可以包括以下一个或多个：对第一错误折叠蛋白质聚集体的氨基酸表位序列具有特异性的抗体和对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体。对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体可以对于对tau蛋白病具有特异性的第一错误折叠蛋白质聚集体的构象表位具有选择性。对第一错误折叠蛋白质聚集体构象具有特异性的抗体可能对应于以下一个：阿尔茨海默氏病(AD)，帕金森氏病(PD)，进行性核上性麻痹(PSP)，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基底膜变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)，颅脑外伤(TBI)，慢性颅脑外伤(CTE)和拳击员痴呆(DP)。可将对第一错误折叠蛋白质聚集体具有特异性的一个或多个抗体偶联至固相。固相可以包括磁珠和多孔板中的一个或多个。使样品与第一底物蛋白质接触以形成第一温育混合物可以包括使摩尔过量的第一底物蛋白质与样品接触。第一底物蛋在所捕获的第一错误折叠蛋白质聚集体的存在下，温育可以有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物，以形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体。第一底物蛋白质可以包括4R tau蛋白质。
在各种实施方式中，所述方法可以包括执行至少第二PMCA步骤以确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物，第二底物蛋白质可以经受病理性错误折叠和/或聚集。第二PMCA步骤可以包括在有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育循环。各温育循环可以包括在第二错误折叠蛋白质聚集体的存在下温育有效引起第二底物蛋白质错误折叠和/或聚集的第二温育混合物。各温育周期可以包括破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的第二温育混合物。第二PMCA步骤可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。Tau蛋白病可能存在于受试者中。所述方法可以包括根据以下特征表征受试者中tau蛋白质并的身份：样品中存在第一错误折叠蛋白质聚集体；以及样品中是否存在第二错误折叠蛋白质聚集体。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二底物蛋白质可以不同于第一底物蛋白质。第二底物蛋白质可以包括以下之一：淀粉样β(Aβ)，α突触核蛋白质和3R tau。
在一些实施方式中，所述方法可以包括通过分析每个分别对应于Aβ、α突触核蛋白质和3R tau之一的一个或多个错误折叠聚集体的至少一个标记，来将每个tau蛋白病与一个或多个其他tau蛋白病区分开。各标记可以对应于以下一个或多个：使用对一个或多个错误折叠聚集体中任何一个的构象表位具有选择性的抗体的测定；使用对一个或多个错误折叠聚集体中任何一个的构象表位具有选择性的抗体的测定；一个或多个错误折叠聚集体的一个或多个PMCA动力学参数，包括以下一项或多项：滞后相，T50，扩增速率和扩增程度；对一个或多个错误折叠聚集体中任何一种具有选择性的指示剂；以及一个或多个错误折叠聚集体中任何一个的光谱特征。
此外，例如，特异性抗体可用于第二错误折叠蛋白质聚集体。例如，对于AD，淀粉样蛋白质抗体可以包括以下一个或多个：6E10，4G8，82E1，A11，X-40/42，16ADV等等。这样的抗体可以如下获得：6E10和4G8(Covance，普林斯顿，美国新泽西州)；82E1(IBL America，明尼阿波利斯，美国明尼苏达州)；A11(Invitrogen，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)；X-40/42(MyBioSource，Inc.，圣地亚哥，美国加利福尼亚州)；以及16ADV(AcumenPHarmaceuticALS，利弗莫尔，美国加利福尼亚州)。
此外，对于PD，例如一个或多个突触核蛋白质特异性抗体可以包括PD特异性抗体，所述PD特异性抗体包括以下中的一个或多个：α/β-突触核蛋白质N-19；α-突触核蛋白质C-20-R；α-突触核蛋白质211；α-突触核蛋白质Syn 204；α-突触核蛋白质2B2D1；α-突触核蛋白质LB 509；α-突触核蛋白质SPM451；α-突触核蛋白质3G282；α-突触核蛋白质3H2897；α/β-突触核蛋白质Syn 202；α/β-突触核蛋白质3B6；α/β/γ-突触核蛋白质FL-140等等。在一些实施例中，一个或多个特异性抗体可包括以下一个或多个：α/β-突触核蛋白质N-19；α-突触核蛋白质C-20-R；α-突触核蛋白质211；α-突触核蛋白质Syn 204等等。这样的抗体可以如下获得：α/β-突触核蛋白质N-19(目录号SC-7012，圣克鲁斯生物技术公司，达拉斯，美国德克萨斯州)；α-突触核蛋白质C-20-R(SC-7011-R)；α-突触核蛋白质211(SC-12767)；α-突触核蛋白质Syn 204(SC-32280)；α-突触核蛋白质2B2D1(SC-53955)；α-突触核蛋白质LB 509(SC-58480)；α-突触核蛋白质SPM451(SC-52979)；α-突触核蛋白质3G282(SC-69978)；α-突触核蛋白质3H2897(SC-69977)；α/β-突触核蛋白质Syn 202(SC-32281)；α/β-突触核蛋白质3B6(SC-69699)；或α/β/γ-突触核蛋白质FL-140(SC-10717)。
在各种实施方式中，提供一种用于确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体的试剂盒。试剂盒可包括第一底物蛋白质，其可包括4R tau。所述试剂盒可以包括第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂。第一错误折叠蛋白质聚集体可以包括第一底物蛋白质。第一错误折叠蛋白质聚集体可以对应于tau蛋白病。所述试剂盒可以包括缓冲液。所述试剂盒可以包括肝素。试剂盒可以包括盐。所述试剂盒可包括说明书。所述说明书可以引导使用者获得样品。所述说明书可以引导使用者执行至少第一PMCA步骤。第一PMCA步骤可以包括通过使样品的第一部分与第一底物蛋白质、第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂、缓冲液、肝素和盐接触而形成第一温育混合物。可以以以下一个或多个浓度形成第一温育混合物：第一底物蛋白质小于约20μM；肝素小于约75μM；盐如NaCl小于约190mM；以及第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂如硫黄素T小于约9.5μM。第一PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。各温育循环可以包括在存在第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第一温育混合物。各温育循环可以包括破坏有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。所述说明书可以引导使用者通过根据第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂分析第一温育混合物中是否存在第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定样品中是否存在第一错误折叠蛋白质聚集体。
在几个实施方式中，试剂盒可以包括本文所述方法的任何要素。此外，所述试剂盒可以包括引导使用者进行本文所述方法的任何步骤的说明书。
在一些实施例中，例如，说明书可以包括引导使用者从受试者中获得样品。所述样品可以包括以下一个或多个：生物流体，生物材料，均质化的组织和细胞裂解液。所述说明书引导使用者根据样品中第一错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定或诊断受试者的tau蛋白病。
在各种实施方式中，试剂盒可以包括第二底物蛋白质和第二错误折叠蛋白质聚集体的指示剂。第二错误折叠蛋白质聚集体可以包括第二底物蛋白质。第二底物蛋白质可以不同于第一底物蛋白质。第二底物蛋白质可以包括以下之一：淀粉样β(Aβ)，α突触核蛋白质，3R tau和4R tau。说明书可以引导使用者执行至少第二PMCA步骤。第二PMCA步骤可以包括通过使样品的第二部分与第二底物蛋白质和第二错误折叠蛋白质聚集体的指示剂接触而形成第二温育混合物。第二PMCA步骤可以包括进行两次或更多次有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期。各温育循环可以包括在第二错误折叠蛋白质聚集体的存在下温育有效引起第二底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的第二温育混合物。各温育周期可以包括破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育混合物。第二PMCA步骤可以包括通过分析第二温育混合物中第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的存在与否来确定样品中第二错误折叠蛋白质聚集体的存在与否。所述说明书还可以引导使用者根据以下来表征样品中tau蛋白病的身份：样品中存在第一错误折叠蛋白质聚集体；样品中是否存在第二错误折叠蛋白质聚集体。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括PMCA设备。PMCA设备可以包括以下一个或多个：多壁微量滴定板；微流控板；摇动装置；光谱仪和温育器。所述设备可以作为单个板或设备中的一个或多个、作为组合装置等而被包括在内。例如，摇动的酶标仪可用于进行温育和摇动的循环，并在实验过程中自动测量ThT荧光发射(例如，FLUOstar OPTIMA，BMG LABTECHInc.，凯瑞，美国北卡罗来纳州)。
对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体可以对应于以下之一：阿尔茨海默氏病(AD)，帕金森氏病(PD)，进行性核上性麻痹(PSP)，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基底节变性(CBD)，轻度认知障碍(MCI)，嗜银粒病(AgD)，颅脑外伤(TBI)，慢性颅脑外伤(CTE)和拳击员痴呆(DP)。所述说明书可以包括根据对第一错误折叠蛋白质聚集体的构象具有特异性的抗体的结合测定法的使用来确定受试者中AD、PD、PSP、FTD、CBD、MCI、AgD、TBI、CTE和DP的存在与否。
实施例
实施例1：合成Aβ寡聚物的制备
Aβ1-42是在耶鲁大学的W.Keck设施中使用固相N-叔丁氧羰基化学合成的，并通过反相HPLC纯化。将最终产物冻干并通过氨基酸分析和质谱来表征。为了制备不含聚集的、错误折叠Aβ蛋白质的储备溶液，将聚集体溶解在高pH下，并通过30kDa截止值的过滤器过滤，以除去残留的聚集体。为了制备不同类型的聚集体，将无种子Aβ1-42(10μM)溶液在25℃、0.1M Tris-HCL、pH7.4下在不同的时间在搅拌下温育。该制剂包括不同比例的Aβ单体以及原纤维、初原纤维和可溶性错误折叠Aβ蛋白质的混合物，该比例取决于温育时间。聚集程度通过ThT荧光发射、负染色后的电子显微镜、使用A11构象抗体的斑点印迹研究以及使用4G8抗Aβ抗体的凝胶电泳后的蛋白质印迹来表征。
不同大小的Aβ寡聚物的混合物在原纤维形成过程中产生。具体而言，通过在搅拌下于25℃温育单体合成Aβ1-42(10μM)来制备可溶性错误折叠Aβ蛋白质。温育5小时后，在负染色后通过电子显微镜观察到外观呈球状的、大量可溶性错误折叠Aβ蛋白质，仅观察到少量的初原纤维和原纤维。在10h时，大多数是初原纤维，而在24h时，观察到大量的长原纤维。图1A示出在0h，5h，10h和24h温育时拍摄的电子显微照片。
根据Kayed等人“ComMon structure of soluble amyloid oligomers impliescomMon mechanism of pathogenesis,”SCience 2003，300，486-489的方法，使用A11抗寡聚物特异性抗体，将可溶性错误折叠Aβ蛋白质聚集体测试为阳性。在10小时和24小时进一步温育后，观察到初原纤维和原纤维结构。聚集体的大小通过在SDS-PAGE分离后用已确定孔径的过滤器过滤并进行蛋白质印迹来测定。通过温育5小时形成的可溶性错误折叠Aβ蛋白质被保留在30kDa截止值的过滤器中，并通过1000kDa截止值的过滤器。图1B是可溶性错误折叠Aβ蛋白质聚集体的蛋白质印迹。这种可溶性错误折叠Aβ蛋白质的电泳分离表明，大多数物质作为～170kDa抗SDS的聚集体而迁移，并在17kDa处出现一条较小的带。
实施例2：Aβ-PMCA检测合成Aβ寡聚物
实施例2A.Aβ聚集的接种通过在硫磺素T的存在下使用或不使用不同量的合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质(对照(无Aβ寡聚物)；或者合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质中的3，80，300，and 8400飞摩尔)温育无种子Aβ1-42溶液来学习。Aβ-PMCA通用步骤：将2μM无聚集体Aβ1-42在0.1M Tris-HCL pH7.4中的溶液(总体积200μL)置于不透明的96孔板中，单独温育或在合成Aβ聚集体(通过如实施例1中所述的方法温育5h来制备)或40μL的CSF等分试样存在下温育。在22℃的恒温下，将样品在5μM硫黄素T(ThT)存在下温育，并使用艾本德混合仪(Eppendorf thermomixer)进行循环搅拌(在500RPM下1分钟，然后不摇动29分钟)。在各个时间点，使用平板分光荧光计在435nm激发后在485nm板中测量ThT荧光。图2A是使用所指示的飞摩尔浓度的合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质种子，通过硫黄素T荧光测量的淀粉样蛋白质形成(无循环扩增)随时间的图。监测缓冲液的肽浓度、温度和pH值，以控制实验中的滞后相和可重复性。在这些条件下，在进行实验的时间(125h)内未检测到自发的Aβ聚集体。在0.3至8.4fmol的实施例1的合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质的存在下观察到单体Aβ1-42蛋白质的聚集。
实施例2B：采用扩增循环，其结合了温育和物理破坏的阶段。图2A中的样品在循环搅拌下温育(以500RPM搅拌1分钟，然后不摇动29分钟)。使用平板荧光分光光度计(激发：435；发射：485nm)，通过硫黄素T(ThT)与淀粉样蛋白质原纤维的结合，随时间测量聚集。图示出3次重复的平均值和标准误差。Aβ寡聚物的浓度在将平均分子量假设为170kDa的前提下估计。图2B是示出通过ThT荧光测量的循环加速扩增的淀粉样蛋白质形成的图，其是由各种浓度的实施例1的合成可溶性寡聚Aβ蛋白质接种的随时间的函数。在这些条件下，用8400、300、80和3fmol的合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质诱导的单体Aβ1-42蛋白质的聚集更快且更容易与不存在合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质时观察到的聚集区分开。该结果表明，在这些条件下，给定样品中的检出限为3fmol可溶性错误折叠Aβ蛋白质或更少。
实施例3：Aβ-PMCA检测AD患者脑脊髓液中的错误折叠Aβ
从50名AD患者、39名受非变性神经系统疾病(NND)影响的认知正常个体、以及37名受包括其他形式的痴呆症(NAND)的非AD神经变性疾病影响的患者中获得CSF的等分试样。CSF测试样品从50名可能诊断为用DSM-IV和NINCDS-ADRA指南(McKhann等，1984)定义的AD的患者中获取，并使用包括常规医学检查、神经系统评估、神经心理学评估、磁共振成像、以及Aβ1-42、总Tau和磷酸化Tau的CSF水平测量的各种测试来测定。采样时的AD患者的平均年龄为71.0±8.1岁(范围49-84)。CSF对照样品从39名受非变性神经系统疾病(NND)影响的患者中获取，其包括12例常压性脑积水、7名周围神经病患者、7例各种形式的脑肿瘤、2例ICTUS、1例严重头疼、3例脑炎、1例高血压和6例诊断不清。被采集CSF样品的该组患者的平均年龄为64.6±14.7岁(范围31-83)。CSF对照样品还从37名受非AD神经退行性疾病(NAND)影响的个体中采集，其包括10例额颞痴呆(5种行为和5种语言变异)、6例帕金森氏病(包括4例与痴呆相关的患者和1例运动神经元疾病)、6例进行性核上性麻痹、6例脊髓小脑性共济失调(1例与痴呆有关)、4例患有肌萎缩性侧索硬化、2例患有亨廷顿氏病、1例患有MELAS、1例患有路易体痴呆和1例患有血管性痴呆。被采样的该组的平均年龄为63.8±11.1岁(范围41-80)。在一夜禁食后，用无创针头在L4/L5或L3/L4间隙穿刺腰椎后，在聚丙烯管中收集CSF样品。将样品在4℃下以3,000g离心3分钟，等分试样并在-80℃下保存直至分析。测定CSF细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度。白蛋白质通过速率散射比浊法测定。为了评估血脑屏障的完整性和鞘内IgG的产生，计算了白蛋白质商(CSF白蛋白质/血清白蛋白质)X 103和IgG指数(CSF白蛋白质/血清白蛋白质)/(CSF IgG/血清IgG)。该研究是根据《赫尔辛基宣言》的规定进行的，并得到了道德委员会的批准。
实验以及分析的初始部分是盲目进行的。图3A是淀粉样蛋白质形成随时间的图，其测量为ThT荧光标记的函数，示出用来自5个代表性样品的CSF接种的Aβ聚集的平均动力学，该5个代表性样品来自AD、NND和NAND组。
结果表明，与对照CSF相比，来自AD患者的CSF显著加速了Aβ聚集(P<0.001)。通过单向方差分析，然后通过图基(tukey)多重比较后检验，来分析人CSF样品存在下Aβ聚集动力学差异的重要性。显著性水平设定为P<0.05。AD与其他两组样品之间的差异非常显著，P<0.001(***)。
图3B是来自AD、NND和NAND组的样品的以h为时间单位的滞后相的图。为了确定各个样品对Aβ聚集的影响，估计了滞后相，定义为减去对照缓冲液样品后ThT荧光大于40个任意单位的时间。选择该值时要考虑到其对应于对照缓冲液样品读数的～5倍。
图3C是示出在180个Aβ-PMCA循环例如90h温育(P90)后获得的淀粉样蛋白质形成程度的图。实验组之间的滞后相和P90的比较表明，AD和来自患有非变性神经系统疾病或患有非AD神经变性疾病的个体的对照样品之间存在显著差异。此外，在聚集参数和AD患者的年龄之间未检测到相关性，这表明标记物的水平对应于患者CSF中聚集的Aβ蛋白质，而不是患者年龄。
图5的表1示出使用滞后相数计算的Aβ-PMCA测试的敏感性、特异性和预测值的估计值。
为了研究可再现性，用不同的样品、试剂和一批新的Aβ肽作为Aβ-PMCA的底物独立完成类似于图3A-C的实验。在每位患者中测量了经过300次Aβ-PMCA循环例如150h(P150)温育后获得的淀粉样蛋白质形成程度。对照组包括受其他神经退行性疾病影响的人和非神经病患者。每个样品的数据代表重复试管的平均值。通过学生t检验分析统计差异。图6是在300个Aβ-PMCA循环例如150h温育(P90)后获得的样品的以h为时间单位的滞后相的图。
在研究过程中，即使在掺入高浓度的合成寡聚物后，来自第四位置的整套CSF样品也根本没有聚集。预计样品收集过程中试剂污染会干扰测定。
通过估计包括滞后相、A50和P90的各种不同动力学参数，来评估不同样品之间聚集动力学的差异。滞后相定义为达到ThT荧光比单独的缓冲液背景值高5倍所需的时间。A50对应于达到最大聚合的50％的时间。P90对应于90h时的聚集程度(以ThT荧光测量)。使用该数据确定敏感性、特异性和预测值，并使用MedCalc软件(MedCalc软件，奥斯坦德，比利时)通过接收器操作特性(ROC)曲线分析确定截止阈值。
实施例4：确定用于CSF中AD的Aβ-PMCA检测的错误折叠Aβ的阈值
为了支持图5的表1，使用滞后相数据确定敏感性、特异性和预测值，并且使用MedCalc软件(12.2.1.0版，MedCalc，比利时)通过接收器操作特性(ROC)曲线分析确定截止阈值。如图5的表1所示，对于由年龄匹配的患有非变性神经系统疾病的个体组成的对照组，估计90.0％的敏感性和84.2％的特异性。相比之下，为了使AD与包括其他形式痴呆症的其他神经退行性疾病在临床上的相关性更高，估计其敏感性为100％，特异性为94.6％。Aβ-PMCA区分AD与其他形式的神经退行性疾病的能力在临床上很重要。考虑所有对照个体的总体敏感性和特异性分别为90％和92％。
为了评估Aβ-PMCA测试的性能以区分AD患者与对照，针对不同的截止点将真阳性率(敏感性)绘制为错误阳性率(特异性)的函数。为了进行该分析，使用了AD对NAND(图4A)、AD对NND(图4B)和AD对所有对照样品(图4C)的滞后相位值。以曲线下面积估算的测试性能分别为0.996±0.0033、0.95±0.020和0.97±0.011，用于AD与NAND、NND和所有对照的比较。使用MedCalc ROC曲线分析软件(版本12.2.1.0)进行统计分析，结果表明该测试可以将AD与对照组区分开，P<0.0001。为了估计不同组的组比较的最可靠的截止点，绘制了每个截止值的灵敏度(蓝线)和特异性(红线)(图4D)。该图示出AD与所有对照样品(包括NAND和NND组)的曲线和95％置信区间。这些截止值用于估计图5的表1中的敏感性、特异性和预测值。
实施例5：Aβ-寡聚物免疫耗竭去除人脑脊髓液中的Aβ种子并确认Aβ-PMCA检测到AD CSF中可溶性错误折叠Aβ蛋白质
进行免疫耗竭实验以证实Aβ-PMCA检测到与CSF中存在的可溶性错误折叠Aβ蛋白质相关的接种活性。有效免疫耗竭可溶性错误折叠Aβ蛋白质的方法首先通过使用合成制备的可溶性错误折叠Aβ蛋白质来优化。免疫耗竭通过用与特异性识别Aβ(4G8)和构象(A11)抗体序列的抗体混合物结合的免疫磁珠的温育来进行。图7A是示出使用掺入到人CSF中的合成制备的Aβ寡聚物的免疫耗竭结果的蛋白质印迹。通过这种免疫耗竭，有效地去除了可溶性错误折叠Aβ蛋白质。
图7A和7B是通过硫黄素T荧光测量的淀粉样蛋白质形成随时间的图，表明通过可溶性错误折叠Aβ蛋白质免疫耗竭去除了AD CSF中的接种活性。4G8和A11抗体免疫耗竭之前或之后的AD CSF样品在Aβ-PMCA测定中用于接种Aβ聚集。免疫耗竭应用于3AD CSF。图7B是示出对照和免疫耗竭的CSF样品的动力学的图。图7B示出对于免疫耗竭的AD CSF，Aβ-PMCA反应中Aβ聚集的动力学与CSF对照样品中观察到的动力学相当，并且两者均与免疫耗竭之前用AD CSF观察到的聚集显著不同。图7C是显示对照和免疫耗竭的CSF样品的动力学的图，所述样品仅用A11构象抗体消耗并且通过Aβ-PMCA测定监测聚集。图7C示出相似的结果，其通过使用特异性识别错误折叠Aβ的A11构象抗体经免疫消耗的AD CSF获得。这些结果证实Aβ-PMCA检测到AD CSF中的可溶性错误折叠的β蛋白质。
实施例6：固相免疫捕获
图8A和8B是用于从复杂样品例如血浆中捕获可溶性错误折叠Aβ蛋白质的两种固相方法的示意图。策略1使用的ELISA板预先涂有结合至ELISA板上固相的特异性抗体。洗涤板后，在相同板中进行Aβ-PMCA反应。策略2使用磁珠作为包覆特异性抗体的固相。这种方法提供了样品的浓度。
实施例7：免疫捕获的特异性
图9示出表2，表明特异性抗体捕获Aβ寡聚物的能力。最上面的框示出本研究中使用的各种序列抗体的Aβ蛋白质上的表位识别位点的示意图。图9中的表2表明不同序列或构象抗体捕获Aβ寡聚物的效率。通过在健康的人血浆中掺入合成Aβ寡聚物并通过Aβ-PMCA检测来测量捕获寡聚物的能力。符号表示使用不同抗体的检出限为：<12fmol(+++)；10-100fmol(++)之间；>1pmol(+)且不显著高于没有捕获试剂(-)的情况。
实施例8：掺入到人血浆中的Aβ寡聚物的检测
图10是通过硫黄素T荧光测量的淀粉样蛋白质形成随时间的图，其示出掺入到人血浆中的可溶性错误折叠Aβ蛋白质的检测。将预先涂有蛋白质G的ELISA板涂上抗构象抗体(Acumen的16ADV)。之后，将板与人血浆(100μL)一起温育(对照)，或掺入不同浓度的合成可溶性错误折叠Aβ蛋白质。温育后，在Aβ40单体(2μM)和ThT(5μM)存在的情况下，将板进行Aβ-PMCA(温育29分钟，摇动30s)。通过硫黄素荧光测量淀粉样蛋白质的形成。图10代表了使用工作相似的3种不同抗体的几个实验。
实施例9：从AD患者样品和对照中捕获可溶性错误折叠Aβ
图11是示出在来自AD患者和对照的血浆样品中的Aβ-PMCA测定中达到50％聚集的时间的图。通过用抗Aβ抗体(82E1)包覆的珠子来温育来自受AD、非AD神经退行性疾病(NAD)影响的患者和健康对照的血浆样品。如实施例2中所述那样进行Aβ-PMCA。在每组的个体患者中达到50％聚集所需的时间被记录。通过单向方差分析(ANOVA)，然后通过图基(Tukey)事后检验，来分析差异。此数据的ROC分析显示，从对照中正确识别AD患者的敏感性为82％、特异性为100％。
实施例10：各种检测方法均可有效进行超声处理和振动
图12是蛋白质印迹，其示出通过使用超声处理而不是摇动作为片段聚集体的手段来扩增Aβ聚集体的结果。在不同数量的合成Aβ寡聚物存在下进行了实验。将10μg/ml的无种子单体Aβ1-42样品单独温育(泳道1)，或用300(泳道2)、30(泳道3)和3(泳道4)fmols的错误折叠Aβ温育。将样品冷冻而不扩增(未扩增)或进行96个PMCA循环(扩增)，每个循环包括30分钟的温育后进行20秒的超声处理。用蛋白酶K(PK)处理样品后，使用抗Aβ抗体通过蛋白质印迹检测聚集的Aβ。在我们的实验中，观察到使用硫黄素T荧光的检测不能与超声处理兼容，但作为物理破坏方法，在摇动下效果很好。图12示出对于Aβ聚集体使用不同的检测方法，在这种情况下为蛋白质印迹、超声处理以及摇动均起作用。
实施例11：生产单体Aβ作为PMCA底物
通过尺寸排阻色谱法获得无种子单体Aβ。简而言之，使用Superdex 75柱以0.5mL/min的速度用10mM磷酸钠(pH7.5)洗脱，由此分离二甲基亚砜中制备的1mg/mL肽溶液的等分试样。峰将通过220nm处的UV吸光度检测。收集对应于4-10kDa分子量的含有Aβ单体/二聚体的峰，并通过氨基酸分析来确定浓度。将样品冻干保存在-80℃。
实施例12：Aβ的生产和纯化
携带pET28 GroES-Ub-Aβ42质粒的大肠杆菌细胞在Luria肉汤(LB)中于37℃生长，并用0.4mM IPTG诱导表达。4小时后，收集细胞并在裂解缓冲液(20mM Tris-Cl，pH8.0，10mMNaCl，0.1mM PMSF，0.1mM EDTA和1mMβ-巯基乙醇)中裂解，并在18,000RPM离心30分钟。将包涵体重悬在含有6M尿素的重悬缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.0，150mM NaCl和1mM DTT)中。通过以18,000RPM离心30分钟除去不溶蛋白质。收集含有GroES-Ub-Aβ42融合蛋白质的上清液。为了从融合蛋白质上切下Aβ42，将融合蛋白质用重悬缓冲液稀释2倍，并在37℃下用重组去泛素化酶(Usp2cc)以1:100的酶与底物摩尔比处理2小时。之后，将样品加载到C18色谱柱(25mM x 250mM，Grace Vydac，美国)上。用溶剂系统缓冲液1(30mM醋酸铵，pH10，2％乙腈)和缓冲液2(70％乙腈)以10ml/min的流速使用缓冲液2的20–40％线性梯度35分钟来纯化Aβ42。将纯化的Aβ42冻干并保存在-80℃，直至使用。
实施例13：通过PD-PMCA检测αS种子
实施例13A：在硫黄素T存在下，在有或没有不同量的合成可溶性寡聚αS蛋白质的情况下，通过温育无种子αS溶液来研究αS聚集的种子：对照(无αS寡聚物)；或1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL的合成可溶性寡聚αS蛋白质种子。αS-PMCA通用步骤：将100μg/mLαS无种子αS在pH7.4的PBS中的溶液(总体积200μL)置于不透明的96孔板中，单独温育或者在指定浓度的合成αS聚集体或40μL CSF等分试样存在下温育。将样品在5μM硫黄素T(ThT)存在下温育，并使用艾本德混合仪在22℃的恒温下进行循环搅拌(在500RPM下1分钟，然后不摇动29分钟)。在各个时间点，使用平板分光荧光计在435nm激发后在485nm板中测量ThT荧光。图13A是硫黄素T荧光随时间的图，其示出使用所示浓度的合成可溶性寡聚αS蛋白质种子通过PD-PMCA对αS种子的检测。监测缓冲液的肽浓度、温度和pH值，以控制实验中的滞后相和可重复性。单体αS蛋白质的聚集在1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL的合成可溶性寡聚αS蛋白质种子存在下会被观察到。
实施例13B：使用实施例1A中的样品确定达到50％聚集的时间作为αS种子添加量的函数。图13B是示出达到50％聚集的时间绘制为αS种子添加量的函数的图。
实施例14：αS-PMCA检测PD患者脑脊髓液中的寡聚αS
通过PD-PMCA检测来自对照和PD患者的人CSF样品中的接种活性。在存在来自确认为PD、AD或非神经退行性神经系统疾病(NND)的人患者的CSF的情况下，在37℃下以500RPM摇动，以使pH7.4的PBS中的纯化无种子α-突触核蛋白质(100μg/mL)聚集。使用平板分光光度计在435nm激发后，通过硫黄素荧光在485nm监测聚集的程度。
CSF的等分试样从PD患者、受非变性神经系统疾病(NND)影响的认知正常个体和受阿尔茨海默氏病(AD)影响的患者中获得。CSF测试样品从可能诊断为用DSM-IV定义的PD的患者中获得，并使用包括常规医学检查、神经学评估、神经心理学评估和磁共振成像的各种测试方法来确定。在一夜禁食后，用无创针头在L4/L5或L3/L4间隙穿刺腰椎后，在聚丙烯管中收集CSF样品。将样品在4℃下以3,000g离心3分钟，等分试样并在-80℃下保存直至分析。CSF细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度被测定。白蛋白质通过速率散射比浊法测定。为了评估血脑屏障的完整性和鞘内IgG的产生，计算了白蛋白质商(CSF白蛋白质/血清白蛋白质)X103和IgG指数(CSF白蛋白质/血清白蛋白质)/(CSF IgG/血清IgG)。该研究是根据《赫尔辛基宣言》的规定进行的，并得到了道德委员会的批准。
实验以及分析的初始部分是盲目进行的。图14是αS寡聚物相对于时间的图，其测量为ThT荧光标记的函数，示出来自PD、AD和NND组的代表性样品的αS聚集的平均动力学。
结果表明，与对照CSF相比，来自PD患者的CSF显著加速了αS聚集(P＜0.001)。通过单向方差分析，然后通过图基(tukey)多重比较后检验，来分析人CSF样品存在下αS聚集动力学差异的重要性。著性水平设定为P<0.05。PD与其他两组样品之间的差异非常显著，P<0.001(***)。
实施例15：免疫捕获的特异性
图15示出表3，表明不同序列或构象抗体捕获αS寡聚物的能力。捕获寡聚物的能力是通过在健康人血浆中掺入合成αS寡聚物并通过αS-PMCA检测来测量的。第一列示出所测试的各种抗体和相应的商业来源。第二列列出了本研究中使用的各种序列抗体的αS蛋白质上的表位识别位点。第三列表示所观察到的特异性抗体捕获αS寡聚物的能力。符号表示使用不同抗体的检出限为：<12fmol(+++)；10-100fmol(++)之间；>1pmol(+)且不显著高于没有捕获试剂(-)的情况。α/β-突触核蛋白质抗体N-19(N端表位)和α-突触核蛋白质抗体C-20-R(C端表位)显示出最佳结果；以及α-突触核蛋白质抗体211(表位：121-125位氨基酸)显示出非常好的结果；α-突触核蛋白质抗体204(表位：1-130片段)显示出良好的结果；以及16ADV小鼠IgG1(构象表位)未显示结果。
实施例16：固相免疫捕获
图16A和16B是用于从复杂样品例如血浆中捕获可溶性错误折叠αS蛋白质的两种固相方法的示意图。策略1使用的ELISA板预先涂有结合至ELISA板上固相的特异性抗体。洗涤板后，在相同板中进行αS-PMCA反应。策略2使用磁珠作为包覆特异性抗体的固相。这种方法提供了样品的浓度。
实施例17：用于检测掺入到人血浆中的α-突触核蛋白质寡聚物的αS-PMCA
来自人血浆的α-突触核蛋白质寡聚物的免疫沉淀使用用作接种底物的α-突触核蛋白质单体和用于检测的硫黄素-T、通过用抗α-突触核蛋白质抗体包覆的珠子(免疫磁珠)和接种聚集测定来进行。在有α-突触核蛋白质种子(+0.2μg种子)和无α-突触核蛋白质种子(-Seed)的情况下，将用抗α-突触核蛋白质包覆的珠子(1x107珠子)与人血浆(500μL)一起温育。免疫沉淀后，将珠子重新悬浮在20μL反应缓冲液(1X PBS)中，并将10μL珠子添加到96孔板的每个孔中。通过添加α-突触核蛋白质单体(200μg/mL)和硫黄素-T(5μM)进行聚集测定。通过荧光计使用435nm的激发和485nm的发射来监测荧光的增加。图17A示出在有和没有种子的血浆中使用N-19抗体的免疫沉淀/聚集结果。图17B示出在有和没有种子的血浆中使用211抗体的免疫沉淀/聚集结果。图17C示出在有和没有种子的血浆中使用C-20抗体的免疫沉淀/聚集结果。
实施例18：αS-PMCA检测具有高灵敏度和特异性的受PD和多系统萎缩症影响的患者的脑脊髓液中的寡聚αS。
为了研究αS-PMCA对PD和相关α-突触核蛋白病如多系统萎缩症(MSA)的生化诊断的效率，对来自许多受这些疾病影响的患者以及受其他疾病影响的对照的CSF进行了测试。图18A、18B和18C示出使用αS-PMCA分别检测来自对照以及受PD和MSA影响的患者的人CSF样品中的接种活性。在存在来自人患者和对照的CSF的情况下，在37℃下以500RPM摇动，以使pH6.0的缓冲液MES中的纯化无种子α-突触核蛋白质(100μg/mL)聚集。使用平板荧光分光光度计在435nm激发后，通过硫黄素T荧光在485nm监测聚集的程度。
CSF测试样品从可能诊断为用DSM-IV定义的PD和MSA的患者中获得，并使用包括常规医学检查、神经学评估、神经心理学评估和磁共振成像的各种测试方法来确定。在一夜禁食后，用无创针头在L4/L5或L3/L4间隙穿刺腰椎后，在聚丙烯管中收集CSF样品。将样品在4℃下以3,000g离心3分钟，等分试样并在-80℃下保存直至分析。CSF细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度被测定。白蛋白质通过速率散射比浊法测定。该研究是根据《赫尔辛基宣言》的规定进行的，并得到了道德委员会的批准。
实验以及分析的开始部分是盲目进行的。图18A、18B和18C是αS聚集随时间的图，其测量为ThT荧光标记的函数，分别示出对照以及来自PD和MSA组的两个代表性样品的αS聚集的平均动力学。
结果表明，与对照CSF相比，来自PD患者的CSF显著加速了αS聚集(P＜0.001)。通过单向方差分析，然后通过图基(tukey)多重比较后检验，来分析人CSF样品存在下αS聚集动力学差异的重要性。显著性水平设定为P<0.05。PD与其他两组样品之间的差异非常显著，P<0.001(***)。
总共29个PD或MSA样品和41个对照的结果是29个PD或MSA样品中有26个阳性，而41个对照样品中有3个阳性，其对应于90％敏感性和93％特异性。
实施例19：全长4R Tau蛋白质和种子的合成
图19是示出重组全长4R tau蛋白质的制备和纯化的流程图。将hTau40的基因转染到大肠杆菌中，并在标准条件下温育以表达hTau40。生长一段时间后，将大肠杆菌细胞进行粉碎、裂解、热处理，并用硫酸铵沉淀以产生粗产物。将粗产物进行阳离子交换色谱、透析，然后浓缩并交换缓冲液。用100kDa质量的截止值的过滤器进一步纯化hTau40。纯化hTau40的产量为20mg/L细菌培养物。然后，使用循环搅拌(在500RPM下摇动1分钟，然后不摇动29分钟)，在37℃下在10mM HEPES pH7.4、100mM NaCl中温育hTau40单体与12.5μM肝素3天而制备全长4R Tau种子。
实施例20A：TAU PMCA
使用循环搅拌(在500RPM下摇动1分钟，然后不摇动29分钟)，使用12.5μM Tau单体、1.25μM肝素、5μM硫黄素T在96孔板上进行Tau-PMCA测定。以12.5pmol、1.25pmol、125fmol、12.5fmol和1.25fmol的量将种子加入孔中。对照在没有种子的情况下进行。使用平板分光荧光计(激发：435；发射：485)，通过ThT荧光随时间追踪聚集。图20A是种子和对照的各种初始量的以％计的聚集图。图20A中的值是两次重复的平均值，误差线表示标准偏差。图20B是T50与fmol中寡聚tau种子量的对数的图，T50是通过ThT荧光测量的达到50％聚集的时间。
实施例20B：TAU PMCA
为了优化tau-PMCA测定，全长人Tau40包括四个不完美的串联微管结合重复序列(4R)。通过在肝素(12.5μM)存在下在37℃下温育全长Tau(50μM)3天来生成Tau寡聚物。种子通过接种tau聚集的能力、与硫黄素T的结合、蛋白质印迹和电子显微镜来表征。预制的聚集体用于成核并诱导Tau聚集。为了进行测定，在不存在或存在不同数量的合成种子的情况下，将含有3μM肝素的10mM HEPES pH7.4、100mM NaCl中的无种子单体tau(15μM)通过在20℃下温育29.5分钟进行tau-PMCA循环，然后以500RPM摇动30秒。在这些条件下，仅观察到Tau在预先形成的种子存在下聚集，并且聚集的动力学取决于所添加种子的数量。重要的是，观察到PMCA信号与添加到反应中的种子数量成正比。该测定对应于0.125pg的寡聚tau的检测阈值。基于tau单体的分子量，该检测阈值对应于-2atto-mol，或者，基于作为平均寡聚物大小的替代物的12-聚体寡聚物的分子量，该检测阈值对应于0.15atto-mol。
实施例20C：TAU PMCA
使用全长Tau种子进行进一步的Tau-PMCA测定，所述全长Tau种子通过将Tau单体与12.5μM肝素在10mM HEPES pH7.4、100mM NaCl中在37℃下温育3天而制备。使用12.5μMTau单体、1.25μM肝素和5μM硫黄素T，在96孔板上通过循环搅拌(在500RPM下摇动1分钟，然后不摇动29分钟)进行测定。图20C是使用平板分光荧光计(激发：435；发射：485)通过ThT荧光随时间追踪聚集的图。图20C示出两次重复的平均值和SD。图20D是tau寡聚物的量与Tau-PMCA信号(达到50％聚集的时间)之间的关系的图。
实施例20D：TAU PMCA是可复制的
进行大规模实验以评估tau-PMCA测定的鲁棒性和可再现性，以分析在有或没有冷冻/解冻的四个不同时间(0、14、28和30天)的性能。使用两组不同的合成种子和五种不同浓度的合成种子(1250、125、12.5、1.25和0.125pg种子)，掺入到缓冲液或对照CSF中。每个样品重复三次。该实验包括几个步骤，包括执行所有实验所需的量的tau的大规模表达和纯化、对生产的材料的质量控制、合成tau寡聚物种子的生成和表征以及tau-PMCA实验以研究测定的准确性和缓冲液和生物基质(CSF)中的重现性。实验总共使用了32种不同的条件(2种不同的种子x 4个时间点x 2种稀释方式(冷冻或不冷冻)x 2种不同的基质(缓冲液或CSF))。由于所有条件均使用五种不同浓度的寡聚种子进行了测试，并且每个条件均一式三份进行，因此整个实验涉及480孔。蛋白质浓度、缓冲液和PMCA条件与实施例20B相同。在测试的32个条件中，只有一个条件的结果与其他条件略有显著不同，表明其准确性和重现性很高。图20E-20L是一系列图，其显示基于8个测试条件的ThT荧光的聚集结果，包括在4个不同的时间点(0、7、14和30天)样品是否经过冷冻和解冻和缓冲液或CSF的存在、以及两种不同的种子制剂(图20E-20H和图20I-20L)。图20E-20L表明，一式三份、不同的时间点和不同的种子之间获得的结果非常相似。数据对应于一式三份样品的平均值±标准误差。在进行实验的时间内，在任何条件下都没有观察到没有种子的tau底物聚集。
为了分析测定的可重复性，在1250pg Tau种子存在下的实验中获得T50值(达到50％聚集的时间)。用两种种子制剂A或B之一使用新鲜种子或冷冻种子在不同天进行的实验的T50值没有显示任何统计学上的显著差异，并且获得的T50的平均值为71.5±1.8h。对于在所有其他种子浓度下进行的研究或在缓冲液中进行的实验，观察到相似的非显著差异。图20M是T50值的表，其示出在16个不同条件下的可重复性。所有值均通过单向方差分析进行分析，然后进行图基(tukey)多重比较测试。
实施例20E：TAU PMCA是特异性的
研究了tau PMCA测定的特异性，特别是检测由其他淀粉样蛋白质组成的聚集体的能力。Aβ和αSyn寡聚物质被制备，并用于单体tau的交叉接种。图20N是tau测定的ThT荧光随时间的图，tau测定中用1pm的tau，Aβ40、AB42、HisαSyn、HuαSyn、以及无种子来接种。图20N示出在存在Aβ或αSyn种子的情况下没有检测到明显的信号，并且即使在这些颗粒的浓度相对较高(相当于2ng tau种子)的情况下，在约100h之前也未检测到信号。这些Aβ是αSyn种子，其在前述实施例中所述的各个Aβ-或αSyn-PMCA测定中，在诱导聚集方面非常有效。这些结果表明，在所使用的条件和浓度下，其他蛋白质聚集体之间没有交叉接种，并且tau-PMCA对检测tau寡聚物具有特异性。
实施例21A：TAU PMCA检测人CSF中的TAU
通过Tau-PMCA分析来自AD患者(7例)、其他5个Tau蛋白病(1FTD，2PSP，2CBD)、受轻度认知障碍(MCI)影响的人和受其他神经系统疾病影响的对照(7个样品)的人CSF样品。图21A是示出在温育447h时的ThT荧光的图，其中大多数样品已经达到最大荧光。阳性对照使用掺有合成Tau寡聚物(12.5fmol)的健康CSF样品。阴性对照对应于不含Tau种子的健康CSF样品。图21A示出患有AD、其他tau蛋白病和MCI的患者表现出Tau聚集明显高于阴性对照并且与阳性对照一致。在其他神经系统疾病的7例对照患者中，有6例与阴性对照一致。其他神经系统疾病组中的一名对照患者显示出最大荧光，与tau蛋白病一致。这可能表明该患者患有未诊断出的tau蛋白病，或者是无意中污染。
实施例21B：TAU PMCA检测人CSF中的TAU
检查来自11名受AD影响的患者、11名来自其他tau蛋白病(4PSP，1FTD，5CBD和1CTE)和7名受无关神经系统疾病影响的对照的人CSF样品。通过向CSF掺入20ng重组tau寡聚物来制备阳性对照。阴性对照是没有tau种子的健康CSF。图21B是用于tau-PMCA的来自患有AD或其他tau蛋白病的患者的样品的荧光信号相比包括重组tau寡聚物的样品中观察到的荧光信号的图。因此，患有AD或其他tau蛋白病的患者的样品能够促进tau聚集。相反，在7个对照组中，有6个在tau-PMCA中产生了一个低信号，其值等于在没有种子的CSF中观察到的值。尽管样品大小小，但对照组和患者之间的差异仍具有统计学意义。这些积极的结果表明，tau-PMCA能够检测患者CSF中的tau聚集体。图21B示出最大ThT荧光，以任意单位表示。差异通过单向方差分析进行分析，然后进行图基(tukey)多重比较后检验。**P＜0.01。
实施例22：TAU PMCA检测人CSF中的TAU
在存在来自对照以及受AD，FTD(额颞叶痴呆)、CBD(皮质基底节变性)和PSP(进行性核上性麻痹)影响的代表性CSF样品的情况下，检查Tau-PMCA测定的性能。Tau-PMCA测定是在96孔板上使用12.5μM Tau单体、1.25μM肝素、5μM硫黄素T并使用循环搅拌(在500RPM下摇动1分钟，然后不摇动29分钟)来进行。使用平板分光荧光计(激发：435；发射：485)，通过ThT荧光随时间追踪聚集。图22是示出基于ThT对时间的聚集％的图。对于各种tau蛋白病，T50、扩增率和扩增程度各不相同。例如，与AD相比，PSP和AD样品的T50在150h时大致相同，而PSP样品似乎具有更短的滞后相、更低的扩增速率和更低的扩增程度。与AD和PSP相比，CBD似乎具有约175h的T50，具有更低的扩增速率和更低的扩增程度。与AD、PSP和CBD相比，FTD的T50约为210h，具有更高的扩增速率和更低的扩增程度。与FTD相比，对照CSF样品具有相似的T50和扩增速率和，低得多的扩增程度。CSF对照样品中的扩增可能是因自发的(无种子)扩增、无意的污染或动力学上与FTD相似的未诊断的tau蛋白病而引起。
讨论
本发明的tau-PMCA可以提供各种优点。例如，与已知的间接措施如非病原性生物标志物相比，本发明的实施方式可以直接检测tau错误折叠蛋白质，测量tau的总库，其中只有一小部分形成突触毒性寡聚聚集体，或者测量tau的各种磷酸化物质。在各种实施方式中，本发明检测出错误折叠的tau寡聚物，其导致tau错误折叠，并且被认为有助于在疾病期间在脑中传播损伤。
在说明书或权利要求书中使用的术语“包括”或“包含”的程度，意在以与术语“包括”相似的方式包括，因为该术语在被用作或被理解为权利要求中的过渡词。此外，就采用术语“或”(例如，A或B)而言，其意图是指“A或B或两者兼而有之”。当申请人意图表示“仅A或B而并非两者都”时，将使用术语“仅A或B而不是两者”。因此，本文中术语“或”的使用是包括性的，而不是排他性的使用。参见布莱恩A.加纳(Bryan A.Garner)，《现代法律用法词典》624(第2版，1995年)。同样，在说明书或权利要求书中使用术语“……内”或“在……内”的程度，意在另外表示“……上”或“向……上”。在说明书或权利要求书中，术语“选择”意图是指组件的状况，其中设备的使用者可以在使用设备时根据需要或期望来激活或解除激活组件的特征或功能。在说明书或权利要求书中使用术语“可操作地连接”的程度，是指所标识的部件以执行指定功能的方式连接。在说明书或权利要求书中使用术语“基本上”的程度，意在表示所标识的部件具有以本领域中可接受的误差程度表示的关系或质量。
如在说明书和权利要求书中所使用的单数形式“一个”、“一种”、“该”、“上述”和“所述”包括复数，除非明确指出单数。例如，提及“化合物”可以包括两种或更多种化合物的混合物、以及单一化合物。
如本文所用，术语“约”与数字结合旨在包括数字的±10％。换句话说，“约10”可能表示9到11。
如本文中所述，术语“可选的”和“可选地”是指随后描述的情况可能发生或可能不发生，从而该描述包括情况发生的情况和情况不发生的情况。
另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也根据马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面说明而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地识别为充分描述，并且可以将同一范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之几等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如上所述，如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”，包括所列举的数字，并且指可随后细分为子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的构件。例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，依此类推。尽管本文已经公开了各个方面和实施例，但是其他方面和实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的。
如上所述，尽管已经通过本发明的实施方式的描述说明了本申请，并且尽管已经相当详细地描述了实施方式，但是申请人的意图不是限制或以任何方式限制所附权利要求书的范围至如此详细。受益于本申请，本领域技术人员将容易想到其他优点和修改。因此，本申请在其更广泛的方面不限于特定细节、所示的说明性示例或所涉及的任何装置。在不脱离本发明总构思的精神或范围内，可以从这些细节、示例和装置中做出变化。
本文公开的各个方面和实施方式是出于说明的目的，而不是意图限制，真实的范围和精神由所附权利要求书指示。
Claims (14)
1.一种用于确定生物样品中是否存在第一错误折叠4R tau蛋白质聚集体的非疾病诊断目的的方法，所述方法包括：
执行第一蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)步骤，所述第一PMCA步骤包括：
通过使所述生物样品的第一部分与第一底物蛋白质接触而形成第一温育混合物，所述第一底物蛋白质包括单体无核4R tau；所述核是指错误折叠蛋白质或短片段的原纤维；
在有效形成第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育，每个温育循环包括：
在存在所述第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下，在15℃到40℃的温度温育有效导致所述第一底物蛋白质的至少一部分的错误折叠和/或聚集的所述第一温育混合物；
破坏有效形成所述第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的所述第一温育混合物；以及
通过分析所述第一温育混合物中是否存在所述第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定所述生物样品中是否存在所述第一错误折叠蛋白质聚集体，
所述第一错误折叠蛋白质聚集体包括所述第一底物蛋白质以及所述第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体包括所述第一底物蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，包括：确定所述生物样品中所述第一错误折叠蛋白质聚集体的存在，所述第一错误折叠蛋白质聚集体是错误折叠的4R tau聚集体。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括：确定所述生物样品中是否存在至少第二错误折叠蛋白质聚集体。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括执行至少第二PMCA步骤以确定至少第二错误折叠蛋白质聚集体在所述生物样品中的存在与否，包括：
通过使所述样品的第二部分与第二底物蛋白质接触而形成第二温育混合物，所述第二底物蛋白质在体内进行病理性错误折叠和/或聚集以形成所述第二错误折叠蛋白质聚集体；
在有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的条件下进行两次或更多次温育，每个温育循环包括：
在存在所述第二错误折叠蛋白质聚集体的情况下，温育有效引起所述第二底物蛋白质的至少一部分的错误折叠和/或聚集的第二温育混合物；
破坏有效形成第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体的所述第二温育混合物；以及
通过分析所述第二温育混合物中是否存在所述第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体来确定所述生物样品中是否存在所述第二错误折叠蛋白质聚集体，
所述第二错误折叠蛋白质聚集体包括所述第二底物蛋白质和所述第二扩增的错误折叠蛋白质聚集体包括所述第二底物蛋白质，所述第二底物蛋白包含β淀粉样蛋白(Aβ)、α突触核蛋白和3R tau之一。
5.根据权利要求4所述的方法，所述第二底物蛋白质包括3R tau，所述方法还包括：确定所述生物样品中所述4R tau与所述3R tau的比率为1:99至99:1。
6.根据权利要求1所述的方法，包括制备用以下的至少一个浓度来表征的所述第一温育混合物：
所述第一底物蛋白质小于20μM；
肝素小于75μM；
NaCl小于190mM；以及
硫黄素T小于9.5μM。
7.根据权利要求1所述的方法，包括制备所述第一温育混合物，所述第一温育混合物包括0.001μM至2000μM之间浓度的所述第一底物蛋白质；
0.001μM至75μM之间浓度的肝素；
一个或多个缓冲液组合物：Tris-HCL，PBS，MES，PIPES，MOPS，BES，TES和HEPES；
总浓度为1μM至1M的缓冲液组合物；
总浓度为1μM至1M的盐组合物；
在5至9的pH；以及
总浓度为1nM至1mM的指示剂。
8.根据权利要求1所述的方法：
还包括使所述第一错误折叠蛋白质聚集体的指示剂与所述第一温育混合物接触，所述第一错误折叠蛋白质聚集体的所述指示剂通过在所述第一错误折叠蛋白质聚集体存在下的指示状态和所述第一错误折叠蛋白质聚集体不存在下的非指示状态来表征；以及
其中确定所述生物样品中所述第一错误折叠蛋白质聚集体的存在包括检测所述第一错误折叠蛋白质聚集体的所述指示剂的所述指示状态。
9.根据权利要求1所述的方法，检测所述第一错误折叠蛋白质聚集体包括以下一项或多项：蛋白质印迹测定，斑点印迹测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光蛋白质/肽结合测定，硫黄素结合测定，刚果红结合测定，沉降测定，电子显微镜，原子力显微镜，表面等离子体共振和光谱学；
使第一温育混合物与蛋白酶接触；以及
使用抗错误折叠蛋白质抗体或对错误折叠tau聚集体具有特异性的抗体在以下一项或多项中检测所述第一错误折叠蛋白质聚集体：Western Blot分析，斑点印迹分析和ELISA。
10.根据权利要求1所述的方法，所述生物样品的特征在于包括以下一个或多个：羊水；胆汁；血液；脑脊髓液；耳垢；皮肤；渗出物；粪便；胃液；淋巴液；milk；黏液；粘膜；腹膜液；血浆；胸膜液；脓水；唾液；皮脂；精液；汗水；滑液；眼泪；以及尿；
来源于以下一个或多个细胞或组织：皮肤，脑，心脏，肝脏，胰腺，肺，肾，胃肠，神经，粘膜，血细胞，腺体和肌肉；以及
所述生物样品的每个部分用1μL至1000μL的体积来表征。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述生物样品和所述第一温育混合物中的一个或多个中选择性地浓缩所述第一错误折叠蛋白质聚集体。
12.根据权利要求1所述的方法，破坏所述第一温育混合物包括以下的一个或多个：超声处理，搅拌，摇动，冷冻/解冻，激光照射，高压釜温育，高压和均质化；以及循环搅拌。
13.根据权利要求1所述的方法，包括：
使所述生物样品与硫黄素和摩尔过量的所述第一底物蛋白质接触以形成所述第一温育混合物，所述摩尔过量大于所述生物样品中所述第一错误折叠蛋白质聚集体中所包含的所述第一底物蛋白质的量；
进行两次或更多次有效形成所述第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的温育周期，每个温育周期包括：
在存在所述第一错误折叠蛋白质聚集体的情况下温育有效引起所述第一底物蛋白质的错误折叠和/或聚集的所述第一温育混合物；
摇动有效形成所述第一扩增的错误折叠蛋白质聚集体的所述第一个温育混合物；以及
通过检测对应于所述第一错误折叠蛋白质聚集体的硫黄素的荧光，确定所述生物样品中所述第一错误折叠蛋白质聚集体的存在。
14.根据权利要求1所述的方法，提供不包括tau原纤维的所述生物样品。
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