CN110849863B

CN110849863B - 一种检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法

Info

Publication number: CN110849863B
Application number: CN201910978373.9A
Authority: CN
Inventors: 陆峰; 崔晓林; 柳艳; 袁一凡; 王梁华; 柴逸峰
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110849863A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，包括以下步骤：首先应用生物膜干涉实验确定所选适配体和小分子之间的亲和力大小；然后通过表面增强拉曼散射光谱技术对适配体结合小分子前后发生的构象改变进行检测；最后通过分子动力学模拟直观阐述适配体与配体的结合过程。本发明以茶碱及其适配体为例，验证上述方法对于研究适配体构象改变的可靠性，为设计、修饰、筛选出具有高亲和力、高选择性的适配体提供新方法、新思路，使其更好地应用到检测、传感、临床诊断和治疗等领域中。

Description

一种检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法。

背景技术

核酸适配体通常是利用SELEX(指数富集性配体系统进化，Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment)技术从基因文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列。它能够与相应的靶分子如：药物、蛋白质、核酸或其他无机、有机分子等进行高亲和力和强特异性的结合。同时，适配体具有的热稳定性、盐耐受性、易合成和成本低等优点，使其逐渐成为检测、传感、临床等领域研究的热点(Negri,P.；Chen,G.；Kage,A.；Nitsche,A.；Naumann,D.；Xu,B.； Dluhy,R.A.,Direct Optical Detection of Viral NucleoproteinBinding to an Anti-Influenza Aptamer.Analytical Chemistry 2012,84,5501-5508.)。因此研究适配体与小分子结合过程中的构象改变对于设计、修饰和筛选高亲和力、高选择性的适配体具有重要意义。

许多研究人员都对适配体构象的改变表现出强烈的兴趣，但大多数的研究都是采用电化学的方法来验证适配体与配体分子的结合，不仅耗时长，样品需求量大而且操作复杂。所以，急需建立一种快速、简便、无损的方法对适配体构象的改变进行确证、检测和机制解释。

BLI(生物膜干涉，biolayer interferometry)技术一种基于光干涉原理的非标记手段，具有操作简单、检测无损、样品耗量少、实时提供分析物的直接信息和相互作用情况等优点，被广泛的应用于研究生物分子的相互作用(Gao,S.； Hu,B.；Zheng,X.；Cao,Y.；Liu,D.；Sun,M.；Jiao,B.；Wang,L.,Gonyautoxin 1/4 aptamers with high-affinity andhigh-specificity:From efficient selection to aptasensorapplication.Biosensors and Bioelectronics 2016,79,938-944.)。BLI技术不仅可以对所提供的配体和适配体的结合情况进行快速分析，同时还能准确地给出两者的亲和力数值。但却无法监测到适配体在与配体分子结合过程中的构象改变情况，所以，需要借助其他的手段才能对适配体构象的改变进行检测。

SERS(表面增强拉曼光谱，surface-enhanced Raman spectroscopy)技术因其灵敏度高、特征信息丰富、检测速度快等优点引起了人们的广泛关注。它能够提供待测物质详细的指纹图谱，是用来检测核酸、蛋白质、细胞、病毒、药物等分子强有力的工具(Morla-Folch,J.；Gisbert-Quilis,P.；Masetti,M.； Garcia-Rico,E.；Alvarez-Puebla,R.A.；Guerrini,L.,Conformational SERS Classification ofK-Ras Point Mutations forCancer Diagnostics.Angewandte Chemie 2017,129,2421-2425)。分子之间的弱相互作用可以体现在SERS图谱上，因此可以直接对适配体与配体分子结合后的构象改变做出判断。可以将 SERS图谱的变化归属到是由适配体上哪种碱基引起的变化。但由于SERS图谱的变化也是一种间接的指标，构象具体是如何变化的，还需要借助其他手段才能进一步说明。

MD(分子动力学，molecular dynamics)模拟是指利用计算机软件，以原子为基本元素，依据牛顿力学原理，在经验势场作用下，求解系统中各粒子在某时刻的位置和速度，来模拟分子体系随时间变化的运动轨迹。MD模拟能够模拟生物学实验中所控制的条件，如温度、压力、离子浓度、pH以及溶剂类型。所有这些因素都可以在MD模拟中调整和控制(Mortier,J.et al.The impact of molecular dynamics on drug design:applicationsfor the characterization of ligand-macromolecule complexes.Drug Discov Today,2015.20(6):p.686-702.)。它可以准确地预测适配体与配体分子的结合模式与结合能力，其结果可以用来指导实验，提供思路和理论依据，弥补光谱等实验手段的限制。

但是关于一种通过生物膜干涉实验和表面增强拉曼光谱技术以及分子动力学模拟这样一种逐级分析的方式来快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法。本发明以茶碱小分子及其适配体为例，通过生物膜干涉实验和表面增强拉曼光谱技术以及分子动力学模拟这样一种逐级分析的方式来研究适配体与茶碱结合前后构象的变化，为设计、筛选、修饰具有高亲和力高选择性的适配体提供一种新的方案，使其能够更好的应用到检测、传感、临床诊断和治疗等领域。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：首先利用BLI(生物膜干涉， biolayerinterferometry)技术对所选适配体与配体分子之间的亲和力进行测定，确定两者可以结合后，再利用SERS(表面增强拉曼光谱，surface-enhanced Raman spectroscopy)手段对适配体结合小分子前后发生的构象改变进行检测，直接采集适配体在与配体小分子结合前后的谱图，根据SERS谱图前后的变化，确定适配体构象的改变，以及归属引起改变的原因。最后利用MD(分子动力学，molecular dynamics)模拟手段，直观阐述适配体与配体的结合过程，深度解析结合过程中适配体的空间变化情况，这样就可以对适配体的构象变化有了一个全面深入的了解，并对引起构象变化的原因进行解释。

本发明以茶碱小分子及其适配体为例，验证上述生物膜干涉-表面增强拉曼光谱-分子动力学模拟(BLI-SERS-MD，原理如图1所示)这样一种逐级分析的方法对于研究结合过程的适配体构象变化的可行性与优越性。

茶碱是一种甲基嘌呤类药物，临床上常用于治疗哮喘、肺气肿、支气管炎等疾病。由于其治疗窗窄(20～100μM)，在临床治疗时需要对其血药浓度进行监测。现常用适配体捕捉的方式测定其血药浓度，特异性好，选择性高，较好地排除了咖啡因、可可碱等类似物的干扰。所以研究适配体与茶碱结合过程中的构象变化，对于设计、修饰一条可以与茶碱亲和度更高、结合特异性更好的适配体具有重要意义。同类技术也可以适用于其他配体与其适配体的构象变化分析。

本发明的第一方面，提供一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，包括以下步骤：

步骤一：利用生物膜干涉(biolayer interferometry，简称BLI)技术对所选适配体与配体分子之间的亲和力进行测定；

步骤二：利用表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS)技术，将适配体弱结合到SERS基底上，采集适配体在与配体小分子结合前后的谱图，根据SERS谱图前后的变化，确定适配体构象的改变，以及归属引起改变的原因；

步骤三：利用分子动力学(molecular dynamics，简称MD)模拟手段，模拟配体与适配体结合的动态过程，计算适配体与配体上主要基团的运动相关系数，解析结合过程中适配体的空间变化情况，并对引起构象变化的原因进行解释。

进一步的，所述的步骤一为：

首先，用缓冲液分别配制配体溶液和适配体溶液，然后将配制好的适配体溶液，配体溶液，缓冲液各200μL分别加入到各反应孔中后(OctetRED 96， ForteBio公司)，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离，然后得到适配体-配体的亲和常数。

进一步的，所述的步骤二中，SERS基底的制备方法中：

首先通过Lee法制备银胶溶液，然后将得到的银胶溶液通过离心、去除上清液的办法浓缩约60倍；向10μL浓缩后的银胶溶液中加入5μL 1mM的KI 溶液；再向溶液中加入4μL10mM MgSO₄溶液。

进一步的，所述的Lee法制备银胶溶液的方法为：将36mg硝酸银粉末溶于200mL去离子水中，加热并不断搅拌至溶液微沸，然后加入4mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热、搅拌约1h，溶液由无色变为灰绿色，停止加热，冷却至室温，避光保存(参考文献Lee,P.C.；Meisel,D.Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and goldsols.The Journal of Physical Chemistry 1982,86, 3391-3395.)。

进一步的，所述的步骤二中，

将适配体弱结合到银胶表面之后，等比加入配体溶液，将混合好的适配体 -配体溶液加入去离子水，稀释到100μL，转移到96孔板中采集SERS信号；待测物质的最终检测浓度均为10μM。

进一步的，所述的步骤三中，模拟配体与适配体结合的动态过程的方法为：

首先建立模拟体系的初始化；将配体、适配体体系置于适当大小水盒子中，水模型选用SPC/E，然后对体系进行离子化处理；配体的力场参数文件由AmberTools生成；然后对体系进行能量最小化和平衡模拟；能量最小化使用最速下降算法，在不加约束条件下运行模拟500steps；平衡模拟分两步：第一步控制体系温度从0K升温至300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps，第二步维持体系温度为300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps；最后用平衡后的体系在NPT系综下模拟95ns(步长为2fs)；控制压强在1.01atm，温度为310K；同时，计算适配体-配体分子复合物体系随时间变化的RMSD值(root-mean-square deviation，均方根偏差)，来估计二者结合前后构象的变化程度；通过截取数个不同帧数的构象态，对构象变化过程进行分析。

进一步的，所述的步骤三中，计算适配体与配体上主要基团的运动相关系数的方法为：

采用gromacs获得每一帧的PDB文件；分别读取每一帧及后一帧质心坐标的PDB文件，采用每一个核苷酸或茶碱的后一帧质心坐标减去前一帧的质心坐标，获得每一帧质心坐标的移动向量；然后采用python中numpy.corrcoef() 命令获得小分子质心坐标移动向量和每一个核苷酸质心坐标移动向量的相关系数(皮尔逊积矩相关系数)，记为运动相关系数；将所有相邻帧中每一个核苷酸与小分子的运动相关系数进行平均，获得平均运动相关系数。

进一步的，所述的配体为茶碱，适配体为如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

更进一步的，所述的步骤一为：用缓冲液(Tris-HCl buffer+10mM MgSO₄, pH7.4)分别配制10μM茶碱溶液以及500nM的适配体RNA(5’端连有生物素) 溶液，其中所有的RNA溶液都要现用现配，冰盒储存，以防降解；然后将配制好的适配体溶液，茶碱各200μL分别加入到各反应孔中后，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时 60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离；然后就可以得到适配体-茶碱的响应值。

本发明选择了一条已经被报道过的与茶碱具有高度亲和力的RNA序列作为适配体(5’-GGCGAUACCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUC-3’，SEQ ID NO.1)，利用BLI技术对两者的亲和力进行验证，并得到具体的亲和力数值 (K_d＝1.29μM)。

更进一步的，所述的步骤二为：首先通过Lee法制备银胶溶液，并将得到的银胶溶液通过离心、去除上清液的办法浓缩约60倍，向10μL浓缩后的银胶溶液中加入5μL 1mM的KI溶液，向溶液中加入4μL 10mM MgSO₄溶液；将适配体弱结合到银胶表面之后，等比加入100μM茶碱溶液；将混合好的适配体-茶碱溶液加入去离子水，稀释到100μL，转移到96孔板中采集SERS信号；待测物质的最终检测浓度均为10μM；SERS检测条件：所有的光谱都是由BWS415 Raman spectrometer(B&W Tek,USA)仪器获得，激发波长为785nm，激光功率为100mW，积分时间为10s。

本发明提供适配体与茶碱结合后，由于茶碱的进入使得适配体构象发生改变所引起的SERS谱图的变化。直接证明了两者之间存在相互作用，并且可以通过SERS谱图中变化的峰位移归属到引起构象改变的碱基种类。

更进一步的，所述的步骤三为：

(A)MD模拟茶碱与适配体结合的动态过程

首先建立模拟体系的初始化；将茶碱、适配体体系置于适当大小水盒子中 (复合物表面到水盒子边界距离为

)，水模型选用SPC/E，然后对体系进行离子化处理；茶碱的力场参数文件由AmberTools生成；然后对体系进行能量最小化和平衡模拟；能量最小化使用最速下降算法，在不加约束条件下运行模拟500steps；平衡模拟分两步：第一步控制体系温度从0K升温至300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps，第二步维持体系温度为300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps；最后用平衡后的体系在NPT系综下模拟95ns(步长为2fs)；控制压强在1.01atm，温度为310K；计算适配体-茶碱分子复合物体系随时间变化的RMSD值(root-mean-square deviation，均方根偏差)，来估计二者结合前后构象的变化程度；截取数个不同帧数的构象态，对构象变化过程进行分析；

(B)计算适配体与茶碱上主要基团的运动相关系数

采用gromacs获得每一帧的PDB文件；分别读取每一帧及后一帧质心坐标的PDB文件，采用每一个核苷酸或茶碱的后一帧质心坐标减去前一帧的质心坐标，获得每一帧质心坐标的移动向量；然后采用python中numpy.corrcoef() 命令获得小分子质心坐标移动向量和每一个核苷酸质心坐标移动向量的相关系数(皮尔逊积矩相关系数)，记为运动相关系数；将所有相邻帧中每一个核苷酸与小分子的运动相关系数进行平均，获得平均运动相关系数；分别计算适配体上33个碱基与茶碱上N-1,N-3,N-7,N-9,C＝O-2,C＝O-6,CH3-1,CH3-3, 嘧啶环,和咪唑环的运动相关系数，运动相关系数越接近1，表明两者的运动相关性约密切，即可能存在某种相互作用。

本发明模拟适配体与茶碱结合的动态过程，对引起适配体变化进行深入解释。通过对适配体和茶碱进行MD模拟，我们可以得到茶碱与适配体的结合模式和结合能力，直观动态的展现适配体构象的一系列改变。结合前述的实验结果，我们就可以对适配体构象变化有一个全面深入的了解。

本发明优点在于：

1、比起传统的只用一种方法对适配体的构象改变进行分析，多种方法逐级分析的方法可以对这种构象改变进行全面的分析、确证和机制解释；

2、本发明选择的BLI-SERS-MD三种技术手段均无需复杂操作，样品需求量少，成本低；

3、三种方法虽然对适配体的构象研究是一个逐渐深入的过程，但仪器之间独立工作，互不干扰，可同时进行，极大地节约时间。

附图说明

图1.原理示意图

图2.适配体RNA和阴性对照NC分别与茶碱的结合解离曲线。

图3.a茶碱的SERS谱图；b适配体RNA的SERS谱图；c茶碱-适配体复合物的SERS谱图；d差谱(c-b)。

图4.a阴性对照NC的SERS谱图；b适配体RNA的SERS谱图；c茶碱的SERS谱图；d NC的SERS谱图；e茶碱-NC混合物的SERS谱图；f差谱 (e-d)。

图5.核酸适配体与茶碱结合的构象变化过程。

图6.适配体RNA上33个碱基与茶碱上主要原子或基团的运动相关系数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，所用试剂如无特殊说明均为市售。

实施例1：BLI测定小分子茶碱及其适配体RNA之间的亲和力

利用BLI技术对茶碱小分子及其适配体之间的亲和力进行测定，同时随机选取一条长为21个碱基的RNA序列(NC：UUGUACUACACAAAAGUACUG， SEQ ID NO.2)作为阴性对照与茶碱反应，并在与适配体相同的条件下测定其亲和常数K_d值。

首先，用缓冲液(Tris-HCl buffer+10mM MgSO₄,pH 7.4)分别配制10μM 茶碱溶液以及500nM的适配体RNA(5’端连有生物素)溶液以及500nM NC (5’端连有生物素)溶液，其中所有的RNA溶液都要现用现配，冰盒储存，以防降解。然后将配制好的适配体溶液，NC溶液，茶碱，缓冲液各200μL分别加入到各反应孔中后，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离。然后就可以得到适配体-茶碱、NC-茶碱的响应值。结果如图2。其中适配体与茶碱的结合-解离曲线，是一个急速上升和急速下降的过程，这是由于茶碱分子量过小，与适配体的亲和力高，无论是结合还是解离过程都可以快速达到平衡。而NC与茶碱的结合-解离曲线几乎为一条直线，表明随机选取的核酸序列与茶碱之间不存在亲和力，即NC不会与茶碱发生相互作用。我们得到茶碱-适配体的亲和常数K_d＝1.29μM，而茶碱-NC亲和常数几乎为零。

实施例2：将适配体RNA弱结合到SERS基底上

首先通过Lee法(Lee,P.C.；Meisel,D.Adsorption and surface-enhanced Ramanof dyes on silver and gold sols.The Journal of Physical Chemistry 1982,86,3391-3395.)制备银胶溶液，并将得到的银胶溶液通过离心、去除上清液的办法浓缩约60倍，以此来增强待测物质的拉曼信号。但银胶浓缩的同时，银纳米粒子(AgNPs)表面的杂质也得到了富集，表现出了强烈的拉曼信号，甚至超过了待测物质的信号。所以，我们向10μL浓缩后的银胶溶液中加入5μL 1mM 的KI溶液，用于清洗银纳米颗粒表面的柠檬酸根离子，并使银纳米颗粒表面带有强烈的负电性(AgNP-I^-)。但待测物质适配体RNA由于链骨架上的存在大量的磷酸根基团，也使得整个分子呈现出负电性。强烈静电斥力导致适配体 RNA无法到达银胶表面。为了消除这种阻碍，我们向溶液中加入4μL 10mM MgSO₄溶液。Mg²⁺不仅起到了连接适配体与银纳米粒子的作用，同时还会促进适配体与茶碱的结合(AgNP-I^--Mg²⁺-PO^2-)。此时，适配体RNA与银纳米粒子通过静电作用弱结合在一起，不仅实现缩短两者之间距离的目的，得到较高的检测信号，同时避免出现通过连接子例如多聚糖或者烷硫醇等分子将适配体直接固定在银胶表面，限制适配体的空间伸展性和灵活性情况。

实施例3：适配体结合茶碱前后的SERS谱图的变化

将适配体弱结合到银胶表面之后，等比加入100μM茶碱溶液。在Mg²⁺的帮助下，茶碱与适配体相互诱导结合，由于茶碱分子相比于比起适配体，质量和体积都很小，所以在两者结合过程中，茶碱分子构象不变，而适配体不断改变构象以适应茶碱的进入，最终达到稳定状态。此时，将混合好的适配体-茶碱溶液加入去离子水，稀释到100μL，转移到96孔板中采集SERS信号。待测物质的最终检测浓度均为10μM，结果如图3所示。茶碱在与适配体进行结合后自身特征峰消失不见，被适配体完全掩盖。复合物图谱与适配体图谱十分相似，仅在510,571,686,1295,and 1577cm^-1五处的峰有明显的差别，可认为是由适配体构象改变引起的。

SERS检测条件：所有的光谱都是由BWS415 Raman spectrometer(B&W Tek,USA)仪器获得，激发波长为785nm，激光功率为100mW，积分时间为 10s。

实施例4：茶碱与阴性对照NC反应前后SERS谱图的变化

将随机选取的RNA序列NC，在与适配体相同的条件下弱结合到银胶表面，然后与茶碱进行充分反应，最后采集SERS光谱。结果如图4所示。由图 4A可知，尽管适配体和NC都是核酸序列，但是SERS技术可以很好地区分不同RNA序列。同时，因为茶碱与NC之间不存在亲和力，所以当茶碱加入到适配体溶液中时，茶碱不会与适配体产生相互作用，这样NC的构象不会发生改变，以至于茶碱-NC混合物的图谱和NC单独的图谱几乎一模一样(如图3d、 3e)。

SERS检测条件同实施例3。

实施例5：MD模拟茶碱与适配体结合的动态过程

首先建立模拟体系的初始化。将茶碱、适配体体系置于适当大小水盒子中 (复合物表面到水盒子边界距离为

)，水模型选用SPC/E，然后对体系进行离子化处理。茶碱的力场参数文件由AmberTools生成。然后对体系进行能量最小化和平衡模拟。能量最小化使用最速下降算法，在不加约束条件下运行模拟500steps。平衡模拟分两步：第一步控制体系温度从0K升温至300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps，第二步维持体系温度为300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps。最后用平衡后的体系在NPT系综下模拟95ns(步长为2fs)。控制压强在1.01atm，温度为310K。同时，我们计算了适配体 -茶碱分子复合物体系随时间变化的RMSD值(root-mean-square deviation，均方根偏差)，来估计二者结合前后构象的变化程度。我们还通过截取数个不同帧数的构象态，对构象变化过程进行分析，结果如图4所示。当茶碱靠近适配体时，适配体通过改变自身空间构象得以让茶碱进入，茶碱进入后与适配体上某些碱基发生作用，适配体的构象不断改变，最终达到能量最低状态，以维持复合物的稳定存在。

实施例6：计算适配体与茶碱上主要基团的运动相关系数

采用gromacs获得每一帧的PDB文件。写下每一帧PDB文件中每一个核苷酸和茶碱的质心坐标，保存为——‘帧数’_C.pdb。分别读取每一帧及后一帧质心坐标的PDB文件，采用每一个核苷酸或茶碱的后一帧质心坐标减去前一帧的质心坐标，获得每一帧质心坐标的移动向量。然后采用python中 numpy.corrcoef()命令获得小分子质心坐标移动向量和每一个核苷酸质心坐标移动向量的相关系数(皮尔逊积矩相关系数)，记为运动相关系数。将所有相邻帧中每一个核苷酸与小分子的运动相关系数进行平均，获得平均运动相关系数。分别计算适配体上33个碱基与茶碱上N-1,N-3,N-7,N-9,C＝O-2,C＝O-6, CH3-1,CH3-3,嘧啶环,和咪唑环的运动相关系数，得到表1数据，并将表1 数据转换为图5。运动相关系数越接近1，表明两者的运动相关性约密切，即可能存在某种相互作用。

由图5可知，茶碱上主要的基团或原子都与适配体上碱基 C9,G11,C20,C21,G25运动相关性较高，表明当茶碱进入适配体内部时，上述适配体上的碱基与茶碱发生作用，致使适配体构象发生改变，以维持茶碱-适配体复合物的稳定性。

表1.适配体RNA上33个碱基与茶碱上主要原子或基团的运动相关系数的具体数值

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法

<130> /

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

ggcgauacca gccgaaaggc ccuuggcagc guc 33

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

uuguacuaca caaaaguacu g 21

Claims

1.一种快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：利用生物膜干涉技术对所选适配体与配体小分子之间的亲和力进行测定，确定两者可以结合后，再进行以下步骤的检测；所述的配体为茶碱，适配体为如SEQ ID NO.1所示的RNA序列；

步骤二：通过表面增强拉曼光谱技术，将适配体弱结合到SERS基底上，采集适配体在与配体小分子结合前后的谱图，根据SERS谱图前后的变化，确定适配体构象的改变，以及归属引起改变的原因；具体为：首先通过Lee法制备银胶溶液，并将得到的银胶溶液通过离心、去除上清液的办法浓缩，向浓缩后的银胶溶液中加入KI溶液，向溶液中加入MgSO₄溶液；将适配体弱结合到银胶表面之后，等比加入茶碱溶液；将混合好的适配体-茶碱溶液加入去离子水稀释，转移到96孔板中采集SERS信号；

步骤三：利用分子动力学模拟手段，模拟配体与适配体结合的动态过程，计算适配体与配体上主要基团的运动相关系数，解析结合过程中适配体的空间变化情况，并对引起构象变化的原因进行解释；所述的步骤三为：

（A）分子动力学模拟茶碱与适配体结合的动态过程

首先建立模拟体系的初始化；将茶碱、适配体体系置于适当大小水盒子中，复合物表面到水盒子边界距离为15Å，水模型选用SPC/E，然后对体系进行离子化处理；茶碱的力场参数文件由AmberTools生成；然后对体系进行能量最小化和平衡模拟；能量最小化使用最速下降算法，在不加约束条件下运行模拟500steps；平衡模拟分两步：第一步控制体系温度从0K升温至300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps，第二步维持体系温度为300K，在有约束条件下，运行模拟10000steps；最后用平衡后的体系在NPT系综下模拟95ns，步长为2fs；控制压强在1.01atm，温度为310K；计算适配体-茶碱分子复合物体系随时间变化的RMSD值，来估计二者结合前后构象的变化程度；截取数个不同帧数的构象态，对构象变化过程进行分析；

（B）计算适配体与茶碱上主要基团的运动相关系数

采用gromacs获得每一帧的PDB文件；分别读取每一帧及后一帧质心坐标的PDB文件，采用每一个茶碱的后一帧质心坐标减去前一帧的质心坐标，获得每一帧质心坐标的移动向量；然后采用python中numpy.corrcoef()命令获得小分子质心坐标移动向量和每一个核苷酸质心坐标移动向量的皮尔逊积矩相关系数，记为运动相关系数；将所有相邻帧中每一个核苷酸与小分子的运动相关系数进行平均，获得平均运动相关系数；分别计算适配体上33个碱基与茶碱上N-1, N-3, N-7, N-9, C=O-2, C=O-6, CH3-1, CH3-3, 嘧啶环, 和咪唑环的运动相关系数，运动相关系数越接近1，表明两者的运动相关性越密切，即可能存在某种相互作用。

2.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤一为：首先用缓冲液分别配制配体溶液和适配体溶液，然后将配制好的适配体溶液，配体溶液，缓冲液各200μL分别加入到各反应孔中后，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离，然后得到适配体-配体的亲和常数。

3.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤二中的银胶溶液浓缩约60倍；所述的KI溶液浓度为1mM；所述的MgSO₄溶液浓度为10mM。

4.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的Lee法制备银胶溶液的方法为：将36mg 硝酸银粉末溶于200mL去离子水中，加热并不断搅拌至溶液微沸，然后加入4mL 1%的柠檬酸钠溶液，继续加热、搅拌约1h，溶液由无色变为灰绿色，停止加热，冷却至室温，避光保存。

5.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤一为：用pH 7.4的缓冲液分别配制10μM茶碱溶液以及500nM的适配体RNA溶液，所述的缓冲液为Tris-HCl buffer+10 mM MgSO₄，其中所有的RNA溶液都要现用现配，冰盒储存，以防降解；然后将配制好的适配体溶液，茶碱各200μL分别加入到各反应孔中后，连有链霉素的芯片按照既定程序依次浸入到各反应孔，一共要经历五个阶段，每个阶段耗时60s，包括：基线平衡，适配体耦合，传感器平衡，结合和解离；然后就可以得到适配体-茶碱的响应值。

6.根据权利要求1所述的快速有效的检测适配体与配体小分子结合过程中构象改变的方法，其特征在于，所述的步骤二中SERS检测条件：所有的光谱都是由BWS415 Ramanspectrometer仪器获得，激发波长为785 nm，激光功率为100 mW，积分时间为10s。