CN110804611A - 一种适用于细菌和/或真菌的基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例涉及一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其包括以下步骤：除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液。该方法既适用于细菌又适用于真菌，所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。当化验人员需要对临床样本中的菌株进行基因组DNA提取时，无需区分其是细菌还是真菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法。
背景技术
细菌以及真菌在环境中普遍存在，在特定的条件下(如意外伤口，手术，使用呼吸机等)其可进入人体的血液循环系统、泌尿系统，下呼吸道，中枢神经系统等，从而产生比较严重感染甚至致死。
由于细菌细胞壁的主要组分是肽聚糖，而真菌细胞壁的主要成分是几丁质，二者的细胞壁破碎方式有所不同。因此在现有技术中是用提取细菌基因组DNA的试剂盒来提取细菌基因组DNA，用提取真菌基因组DNA的试剂盒来提取真菌基因组DNA，二者相互独立提取，现有技术中缺乏能同时适用于细菌和真菌的基因组DNA提取方法。
另外，在临床标本中，细菌及真菌的含量并不固定，而是与疾病的发病状态有关系。不同种类和来源的临床标本如：血液、脑脊液、下呼吸道灌洗液和尿液中，细菌及真菌的含量差异较大(101-108CFU/mL)。同时，对于未知标本，由于不知道其中是否含有细菌和/或真菌，也不知道其浓度，因此现有的临床检测技术，所有标本都要先将细菌和/或真菌体外培养至一定浓度后(如：1.5×108CFU/mL)，然后再提取基因组DNA。由于需要体外培养，所需检测时间大大延长；并且，临床标本中的抑制物质(如抗菌药物)干扰常会导致其中细菌的体外培养失败，从而使得检验结果不准确或灵敏度不高，从而使得细菌或真菌的含量无法检测到。
硅胶膜离心柱是指一种离心柱提法经常使用的离心柱，由一个套管及一个吸附柱组成。其中吸附柱底部安装一个圆形的硅胶介质的吸附膜。其中硅胶介质吸附膜表面有硅羟基，可以选择性的吸附DNA，并且具有一定的膜通透性，在离心时可以使液体通过。套管则为吸附柱提供一个离心的支架以及离心时收集废液的作用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，该提取方法结合了酶法、玻璃珠破碎法等相关实用操作技术以释放基因组DNA，并利用硅胶膜离心柱为介质，从不同类型的临床标本中同时提取细菌和/或真菌的基因组DNA。该方法既适用于细菌又适用于真菌，所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。当化验人员需要对临床样本中的菌株进行基因组DNA提取时，无需区分其是细菌还是真菌，都可以采用本发明基因组DNA提取方法，即该方法既方便了化验人员，也降低了其出错的可能性。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其包括以下步骤：
除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；
在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；
使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液。
在另一种可能的实现方式中，所述基因组DNA提取方法还包括从混合液中分离细菌和/或真菌的基因组DNA的步骤。
在另一种可能的实现方式中，所述从混合液中分离细菌和/或真菌的基因组DNA的步骤为：将混合液中加入结合液，混合均匀后加至硅胶膜柱中使细菌和/或真菌的基因组DNA与硅胶膜柱中的吸附膜表面的硅羟基团结合；洗涤硅胶柱膜上的吸附膜以去除杂质；洗脱吸附膜上真菌和/或细菌的基因组DNA。
在另一种可能的实现方式中，所述临床标本中细菌和/或真菌浓度为1.0×102- 7CFU/ml，可选地为1.0×102-6CFU/ml，进一步可选地为1.0×102-5CFU/ml，更进一步可选地为1.0×102-4CFU/ml，再更进一步可选地为1.0×102-3CFU/ml。
在另一种可能的实现方式中，所述临床标本未经过体外的细菌和/或真菌培养。直接进行细菌基因组DNA和/或真菌基因组DNA的提取。
在另一种可能的实现方式中，所述临床标本包括血液，泪液，脑脊液，胸腔积水，腹腔积水，肺泡灌洗液，尿液，鼻咽拭子，脓液，脓液，精液。这些临床标本主要分为两大类别，一种是含有红细胞的标本，如全血标本；另一种是不含有组织细胞的体液标本，如：脑脊液，尿液，胸腹腔积水，肺泡灌洗液等。同时其他的临床标本，如：咽拭子，脓液等也同样适用本方法。
在另一种可能的实现方式中，除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物的操作包括：12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清。
在另一种可能的实现方式中，含有红细胞的临床标本在除去液体部分前还包括在抗凝临床标本中加入红细胞裂解液以裂解红细胞的步骤。
在另一种可能的实现方式中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌，所述真菌包括光滑念珠菌、隐球菌。
在另一种可能的实现方式中，在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶30-50mg、溶壁酶50-150U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠50-150mg。
在另一种可能的实现方式中，在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶40mg、溶壁酶100U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠100mg。
在另一种可能的实现方式中，提取的细菌基因组DNA和/或真菌基因组DNA适用于PCR分析、基因序列直接测定、二代测序、基因芯片检测；所述PCR分析包括荧光定量PCR分析或数字PCR分析。
有益效果
(1)本发明基因组DNA提取方法结合了酶法、玻璃珠破碎法等相关实用操作技术释放基因组DNA，并以硅胶膜离心柱为介质，从临床标本中同时提取细菌和/或真菌的基因组DNA。该方法既适用于细菌又适用于真菌，所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。当化验人员需要对临床样本中的菌株进行基因组DNA提取时，无需区分其是细菌还是真菌，都可以采用本发明基因组DNA提取方法，即该方法既方便了化验人员，也降低了其出错的可能性。
同时该基因组DNA提取方法对于临床标本中的高浓度细菌、真菌以及低浓度细菌、真菌(1.0×102-3CFU/ml)的基因组DNA提取，均适用，可以对浓度为1.0×102-8CFU/ml的细菌和/或真菌进行核酸提取。
(2)本发明基因组DNA提取方法尤其适用于所含细菌和/或真菌浓度低的临床标本，可以对浓度为1.0×102-6CFU/ml、1.0×102-5CFU/ml、1.0×102-4CFU/ml、1.0×102-3CPF/ml的细菌和/或真菌进行核酸提取，使得该方法的适用范围广。
(3)本发明基因组DNA提取方法适用于确诊病人或疑似病人的临床样本，又由于可以适用于所含细菌和/或真菌浓度低的临床标本，因此无需对临床标本进行体外的细菌和/或真菌培养，而是可直接进行细菌和/或真菌基因组DNA的提取，既大大缩短了整个检测过程所需时间，又降低了体外培养失败导致的不准确结果的可能性。
(4)本发明基因组DNA提取方法适用于多种临床标本，如鼻咽拭子悬液、泪液、胸腔积水、腹腔积水、脓液、精液等，并且针对不同标本的类型和特点，建立了从不同临床标本中获得浓缩物的方法，从而能快速获得含有细菌和/或真菌的浓缩物，并且尽可能的减少临床标本中其他物质的含量。
(5)本发明基因组DNA提取方法针对临床标本中特定种类的细菌和/或真菌进行了一系列操作步骤、试剂种类和用量的筛选，以实现最优基因组DNA的提取效果。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1-7的基本流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
临床标本：本发明中是指医疗机构按照国家相关法规及操作规范要求，从患者体内或体表采集的少量标本，用于检测是否含有特定的致病性物质。临床检验用标本包括血液，尿液，粪便，鼻咽拭子，肺泡灌洗液，胸腔腹腔积水等。
细菌、真菌：本发明中的含义具有其通常的含义。在本领域中，尤其会关注正常自然环境和人体中存在的微生物在某些特定的诱发条件下，如手术、使用呼吸机插管、人群间传播等情况下会导致特定的细菌、真菌感染。
细菌基因组DNA、真菌基因组DNA：本发明中的含义具有其通常的含义。基因组DNA是细胞的组成成分，是病原体感染的标志物，一般作为临床细菌、真菌感染基因检测的靶物质。
核酸提取：本发明中的含义具有其通常的含义。尤其是指将细菌或者真菌的基因组DNA从细菌细胞、真菌细胞中分离出来，所获得的基因组DNA具有一定纯度和含量，以满足后续的检测试验的需要。
PCR：本发明中的含义具有其通常的含义，即是指聚合酶链反应，一种基因组DNA的快速扩增富集技术，通过使用一对特异性的寡核苷酸片段，扩增反应用酶及体系，可以将一个DNA分子快速放大，从而满足后续的基因组DNA的检测需要。
硅胶膜离心柱：本发明中是指一种离心柱提法经常使用的离心柱，由一个套管及一个吸附柱组成。其中吸附柱底部安装一个圆形的硅胶介质的吸附膜。其中硅胶介质吸附膜表面有硅羟基，可以选择性的吸附DNA，并且具有一定的膜通透性，在离心时可以使液体通过。套管则为吸附柱提供一个离心的支架以及离心时收集废液的作用。
以下实施例中溶菌酶的来源为：Lysozyeme溶菌酶溶液，货号RT401，厂家：天根生化科技(北京)有限公司；规格50mg/ml。
以下实施例中溶壁酶的来源为：Lyticase溶壁酶，货号RT410-02，厂家：天根生化科技(北京)有限公司；规格10U/ul。
实施例1
1.处理临床标本获得细菌和/或真菌沉淀浓缩物
通过对不同临床标本进行处理，以实现细菌和/或真菌与体细胞、体液组分的有效分离，从而使菌体浓缩以提高细菌和/或真菌的单位有效浓度。以下给出针对不同特点的临床标本的处理方法：
对于全血标本，由于标本中含有大量红细胞，红细胞裂解后释放的血红素对后续DNA分析存在一定的抑制，因此对于全血标本，本发明的操作为：取500μl抗凝血，加入450μl红细胞裂解液(红细胞裂解液的组成为：0.15M NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，水，pH7.2-8.0)颠倒混匀后静置5分钟以裂解红细胞，再以12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清，沉淀物中含有细菌和/或真菌沉淀浓缩物。
对于无细胞的体液标本或者仅有少量细胞的体液标本，如：脑脊液，肺泡灌洗液，胸腹腔积水等，本发明的操作为：取500μl标本12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清，使标本中存在的细菌和/或真菌沉淀浓缩，获得细菌和/或真菌沉淀浓缩物。
对于细菌和/或真菌含量较低的标本，如尿液，本发明的操作为：取1-5mL尿液，12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清，使标本中存在的细菌和/或真菌沉淀浓缩，获得细菌和/或真菌沉淀浓缩物。
本步骤对不同临床标本进行不同的处理，并且最后通过离心法将细菌和/或真菌以沉淀物的形式进行浓缩，提高基因组DNA的回收率；同时去除大部分与细菌和/或真菌无关的人体液体成分以降低来自人体的组分对后续可能产生的干扰作用。
2.裂解细菌和/或真菌以释放基因组DNA
采用酶降解和机械破碎相结合的方法，破碎细菌和/或真菌的细胞壁，释放细菌和/或真菌的基因组DNA。具体操作为：在步骤1获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入200μl溶菌酶(200mg/ml)，10μl溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃旋涡震荡30分钟，破坏细菌及真菌的细胞壁成分。
在被破坏了细菌及真菌细胞壁成分的上述标本中，加入200μl含0.1-5.0％SDS的TE缓冲液、1.0-10mg蛋白酶K，充分混匀，56℃孵育10分钟，以使蛋白组分变性及降解，充分释放细菌和/或真菌的基因组DNA。
本步骤中采用了溶菌酶和溶壁酶，分别对细菌和真菌的细胞壁进行有效地分解破坏，并且还加入玻璃珠，提高了细菌和真菌的细胞壁破坏效率，提高细菌和真菌的基因组DNA回收率。加入变性剂以及蛋白酶K不仅促进细菌和真菌细胞膜的破坏，而且促进细菌和真菌细胞中的大部分蛋白质成分变性及降解为小分子量的可溶性物质，从而使蛋白质与基因组DNA分离，并释放出基因组DNA。
3.细菌和/或真菌基因组DNA结合至吸附膜
在经过步骤2处理后的标本中，加入600μl结合液(结合液中含1.0-5.0M高氯酸钠，0.1-4.0M乙酸钠和水)，混合均匀后转移至硅胶膜柱中使DNA与硅胶膜柱中的吸附膜表面的硅羟基团结合。
本步骤中向标本中加入带有低pH值、高盐的溶液(即结合液)使细菌细胞中的蛋白质、膜类物质进一步裂解，也使基因组DNA更容易从溶液状态被析出并容易和吸附膜表面的硅羟基基团相结合。其他成分如：蛋白质降解物，无机盐等不会和硅羟基基团结合，仍然存在于溶液状态中。而通过使用离心方式，将液体与膜有效分离。
4.洗涤吸附膜，去除无机杂质与有机杂质
在硅胶膜柱中加入400-600μl洗液A(含0.1-5.0M高氯酸钠，0.1-4.0M乙酸钠，以及60-80％乙醇)，通过离心8000-12000转/分钟，以使废液流至套管内。
在硅胶膜柱中加入400-600μl洗液B(含60-80％乙醇)，通过离心步骤使液体通过吸附膜，弃去硅胶膜柱外套管中的废液。
使用洗液B重复操作一次。
通过以上洗涤过程，标本中的残留蛋白杂质及降解产物，干扰性盐离子，可溶性抑制物质，均可以有效去除。本发明采用两种不同的洗液，先后对结合有DNA的硅胶介质的吸附膜表面进行洗涤，以除去非特异粘附在吸附膜表面的变性蛋白降解物，糖类，脂类，盐离子，以及会对DNA检测存在干扰作用的物质如药物，胆红素等，进一步提高DNA-吸附膜的纯度。
5.细菌和/或真菌基因组DNA的洗脱
在上述洗涤过的硅胶膜柱中，加入适量(40-60ul)无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡吸附膜1-5分钟，使基因组DNA从吸附膜表面释放至液体中，通过离心回收即获得含有高纯度的细菌和真菌基因组DNA，可用于后续的核酸分析。
实施例2：血液样本中金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取与检测
金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病细菌。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为金黄色葡萄球菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定细菌含量为1.0×108CFU/ml的菌液，使用正常EDTA抗凝全血将菌液分别稀释为含1.0×106CFU/ml(编号Sau106)、1.0×105CFU/ml(编号Sau105)、1.0×104CFU/ml(编号Sau 104)、1.0×103CFU/ml(编号Sau103)、1.0×102CFU/ml(编号Sau 102)、1.0×101CFU/ml(编号Sau 101)金黄色葡萄球菌的血液样本作为模拟细菌感染样本进行血液细菌基因组DNA提取实验材料。
取500ul以上样本，加入450ul红细胞裂解液(红细胞裂解液的组成为：0.15MNH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，水，pH7.2-8.0)，颠倒混匀，静置5分钟。离心12000rpm5分钟，弃上清。
在沉淀中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的金黄色葡萄球菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测金黄色葡萄球菌DNA定量检测。金黄色葡萄球菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：《荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立》；苏裕心，高姗，康琳等，军事医学科学院院刊，2010年2月第34卷第1期，25-29。主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，金黄色葡萄球菌Nuc基因特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含金黄色葡萄球菌Nuc基因片段的重组质粒制备而成。
采用德国QIAGEN公司的微量病原体提取试剂(QIAamp UCP Pathogen Mini Kit，Cat：50214)以及QIAGEN公司的真菌及革兰氏阳性菌的病原体裂解管L(Pathogen LysisTubes L，Cat：19091)，组合后作为本品方法的对比方法。在病原体裂解管L中加入400ul血液样本和100ul ATL试剂，涡旋10分钟，离心8000g 5秒，吸取400ul上清液，使用微量病原体提取试剂提取金黄色葡萄球菌基因组DNA。
提取的DNA同时进行金黄色葡萄球菌DNA荧光PCR定量检测。
由结果可以看出，对于含有不同浓度金黄色葡萄球菌的血液样本，利用本发明所提供的方法进行细菌基因组DNA提取，其DNA提取效果与同类进口试剂(组合后使用)方法相当，并且溶壁酶的加入并没有对金黄色葡萄球菌这种细菌的基因组DNA提取产生影响。
实施例3：脑脊液样本中脑膜炎奈瑟菌基因组DNA的提取与检测
脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)简称为脑膜炎球菌(meningococcus)，是流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的病原菌。脑膜炎奈瑟菌为革兰染色阴性，常呈双排列，直径约为0.8μm的双球菌。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为脑膜炎奈瑟菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定细菌含量为3.0×108CFU/ml的菌液，分别使用非细菌感染的脑脊液将菌液分别稀释为含5.0×105CFU/ml(编号Nm105)、1.0×104CFU/ml(编号Nm104)、1.0×103CFU/ml(编号Nm 103)、1.0×102CFU/ml(编号Nm 102)脑膜炎奈瑟菌的脑脊液样本，作为模拟细菌感染样本进行基因组DNA提取实验材料。
取500ul以上样本，离心12000rpm 5分钟，弃上清。
在沉淀中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的脑膜炎奈瑟菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测脑膜炎奈瑟菌DNA定量检测。脑膜炎奈瑟菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：《TaqMan荧光定量PCR检测和鉴别不同血清群脑膜炎奈瑟菌方法的建立及应用》。朱兵清,徐丽,李马超等，中华流行病学杂志,2008年第29卷第4期,360-364。主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，脑膜炎奈瑟菌特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含脑膜炎奈瑟菌DNA片段的重组质粒制备而成。
脑膜炎奈瑟菌为革兰氏阴性菌，因此采用德国QIAGEN公司的QIAamp UCPPathogen Mini Kit(Cat：50214)以及病原体裂解管S(Pathogen Lysis Tubes S，Cat：19091)组合后，作为本品方法的对比方法。
提取的DNA同时进行脑膜炎奈瑟菌DNA荧光PCR定量检测。
由结果可以看出，对于不同浓度的脑膜炎奈瑟菌脑脊液样本，利用本发明所提供的方法进行细菌基因组DNA提取，其DNA提取效果与同类进口试剂(组合后使用)相当，并且溶壁酶的加入并没有对脑膜炎奈瑟菌这种细菌的基因组DNA提取产生影响。
实施例4：尿液样本中光滑念珠菌DNA的提取
光滑念珠菌是增长较快的一种条件致病真菌。其与白色念珠菌和热带念珠菌不同，光滑念珠菌感染的患者一般其机体免疫功能损害并不严重。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为光滑念珠菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定真菌浓度为3.0×108CFU/ml的菌液，使用非真菌感染的尿液，将菌液分别稀释至含有5.0×106CFU/ml(编号Cgl 106)、1.0×104CFU/ml(编号Cgl 104)、1.0×103CFU/ml(编号Cgl 103)、1.0×102CFU/ml(编号Cgl 102)、1.0×101CFU/ml(编号Cgl 101)光滑念珠菌的尿液样本，作为模拟光滑念珠菌感染尿液临床样本进行基因组DNA提取。
取1000ul以上样本，离心12000rpm 5分钟，弃上清。
在沉淀中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的光滑念珠菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测光滑念珠菌DNA定量检测。光滑念珠菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：《TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR快速检测光滑念珠菌》。郭毅，杨靖娴，邵东华等。中国实验诊断学2016年2月第20卷第2期，178-182页。)主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，光滑念珠菌特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含光滑念珠菌DNA片段的重组质粒制备而成。
采用德国QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(Cat：50214)以及病原体裂解管L(Pathogen Lysis Tubes L，Qiagen，Cat：19092)组合后，作为本品方法的对比方法。
提取的DNA同时进行光滑念珠菌DNA荧光PCR定量检测。
由结果可以看出，对于不同浓度的光滑念珠菌尿液样本，利用本发明所提供的方法进行真菌基因组DNA提取，其DNA提取效果与同类进口试剂(组合后使用)相当，并且溶菌酶的加入并没有对光滑念珠菌这种真菌的基因组DNA提取产生影响。
实施例5：血液中隐球菌基因组DNA的提取
隐球菌是一种真菌，可导致隐球菌病。媒介一般为干的鸽子粪，鲜有人与人之间传播的报告。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为隐球菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定真菌含量为3.0×108CFU/ml的菌液，使用正常EDTA抗凝血将菌液分别稀释为含1.0×104CFU/ml(编号Cne104)、1.0×103CFU/ml(编号Cne 103)、1.0×102CFU/ml(编号Cne 102)、1.0×101CFU/ml(编号Cne 101)隐球菌的血液样本作为模拟真菌感染样本进行基因组DNA提取实验材料。
取500ul以上样本，加入450ul红细胞裂解液(天根生化(北京)公司的红细胞裂解液Cat：RT122-01)，颠倒混匀，静置5分钟。离心12000rpm 5分钟，弃上清。
在沉淀中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的隐球菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测隐球菌DNA定量检测。隐球菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：《荧光定量PCR检测隐球菌DNA方法的建立》。程鹏飞，蒋晓迪，曹轩，武汉大学学报(理学版)，2010年6月第56卷第3期，343-347。主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，隐球菌特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含隐球菌ITS序列的重组质粒制备而成。
采用天根生化(北京)公司的红细胞裂解液(Cat：RT122-01),Lyticase溶壁酶(Cat:RT 410-02),酵母基因组DNA提取试剂盒(Cat：DP307-02)共同作为组合试剂，分别按照试剂盒操作说明分别进行红细胞裂解，真菌沉淀，真菌细胞壁裂解，及基因组DNA提取过程。最后获得50ul隐球菌基因组DNA。
提取的DNA同时进行隐球菌DNA荧光PCR定量检测。
由结果可知，对于血液中不同含量的隐球菌样本，本发明所提供的核酸提取方法，提取低浓度真菌样本核酸时，比同类的产品组合方法要具有优势。且溶菌酶的加入并没有对隐球菌这种真菌的基因组DNA提取产生影响
实施例6：肺泡灌洗液样本中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取
肺炎克雷伯菌是一种细菌，其是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为肺炎克雷伯菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定细菌含量为1.0×108CFU/ml的菌液，分别使用无细菌感染的肺泡灌洗液作为稀释液，将菌液稀释为含1.0×106CFU/ml(编号Kpn106)、1.0×104CFU/ml(编号Kpn104)、1.0×103CFU/ml(编号Kpn103)、1.0×102CFU/ml(编号Kpn102)肺炎克雷伯菌的肺泡灌洗液样本作为模拟细菌感染样本进行DNA提取试验。
取500ul样本，12000rpm离心5分钟，吸弃上清，使标本中存在的细菌沉淀浓缩。
在沉淀中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的肺炎克雷伯菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测肺炎克雷伯菌DNA定量检测。肺炎克雷伯菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：肺炎克雷伯菌Taqman荧光定量PCR检测方法的建立。李富祥，廖德芳，姚俊，中国兽医科学，2014年，44(12)：1231-1235。主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，肺炎克雷伯菌16S基因特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含肺炎克雷伯菌16S基因片段的重组质粒制备而成。
采用天根生化(北京)公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(Cat：DP302-02)以及Lysozyme溶菌酶溶液(Cat：RT 401)组合使用，按照试剂盒操作说明分别进行细菌浓缩及裂解，以及基因组DNA提取过程。最后获得50ul肺炎克雷伯菌基因组DNA。
提取的DNA同时进行肺炎克雷伯菌DNA荧光PCR定量检测。
结果可见，本发明的核酸提取方法及试剂，对于肺泡灌洗液样本中肺炎克雷伯菌基因组DNA提取，当细菌浓度较高时，结果基本符合，当细菌浓度低时，本发明的细菌基因组DNA提取效率优于对比试剂(组合后使用)。并且溶壁酶的加入并没有对肺炎克雷伯菌这种细菌的基因组DNA提取产生影响。
实施例7：尿液样本中鲍曼不动杆菌和光滑念珠菌基因组DNA的提取与检测
鲍曼不动杆菌属于革兰氏阴性菌，是一种严格需氧、非乳糖发酵的条件致病菌，不具鞭毛，移动性不高，但生命力极强，可广泛地存在于大自然中。光滑念珠菌如前所述为一种真菌。
取一份经全自动生物质谱检测系统Microflex LT/SH测定为光滑念珠菌阳性，DENSICHECK比浊仪测定为3.0×108CFU/ml的培养样本，以及一份经测定为1.0×108CFU/ml的鲍曼不动杆菌培养样本，使用本发明的方法进行核酸提取测试。
将两种菌液按照一定比例混合后，分别使用无细菌、无真菌感染的正常人尿液作为稀释液，将菌液稀释为含1.0×106CFU/ml鲍曼不动杆菌和光滑念珠菌(编号M1206)、1.0×104CFU/ml(编号M1204)、1.0×103CFU/ml(编号M1203)、1.0×102CFU/ml(编号M1202)鲍曼不动杆菌和光滑念珠菌的尿液临床模拟样本，进行DNA提取以及荧光PCR测试。以上浓度是指肺炎克雷伯菌和隐球菌各自的浓度。
取1000ul样本，12000rpm离心5分钟，弃上清，使标本中存在的细菌/真菌细胞沉淀。
在沉淀物中加入200ul溶菌酶(200mg/ml)、10ul溶壁酶(10U/μl)以及100mg玻璃珠(直径分布为0.1-3mm)，37℃涡旋30分钟。加入200ul裂解液(含3.0％SDS的TE缓冲液)，5mg蛋白酶K，混匀后于56℃孵育10分钟。
加入600ul结合液(结合液中含3.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠和水)，混匀后转移至硅胶膜柱中，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液。
在硅胶膜柱内加入600ul洗液A(含2.0M高氯酸钠，2.0M乙酸钠，以及70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；
在硅胶膜柱内加入600ul洗液B(含70％乙醇)，离心8000rpm 1分钟，弃去套管中的废液；重复洗液B操作一次。最后空柱最大转速离心1分钟弃去柱内残留的少量液体。
换一个无核酸酶的离心管，放入离心吸附柱，柱内加入50ul无核酸酶水(pH6.5-8.5)，浸泡2分钟，8000rpm离心1分钟，弃去吸附柱，离心管内液体即为纯化后的鲍曼不动杆菌和光滑念珠菌基因组DNA。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测光滑念珠菌DNA定量检测。光滑念珠菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：《TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR快速检测光滑念珠菌》。郭毅，杨靖娴，邵东华等。中国实验诊断学2016年2月第20卷第2期，178-182页。主要组成成分为：2.5U ExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，光滑念珠菌特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含光滑念珠菌DNA片段的重组质粒制备而成。
取5ul纯化后的DNA产物，进行荧光PCR检测鲍曼不动杆菌DNA定量检测。鲍曼不动杆菌DNA荧光PCR反应试剂由贝尔生物提供，试验方法、尤其特异性引物序列和探针序列参考文献：实时荧光聚合酶链反应检测呼吸道感染鲍曼不动杆菌TEM-1基因。张红河，董晓勤，范建中等。中国微生态学杂志2006年12月第18卷第6期，466-467页。主要组成成分为：2.5UExTaq DNA聚合酶(大连Takara)，dNTPs，10×PCR缓冲液(含Mg离子)，鲍曼不动杆菌TEM基因特异性上游引物、下游引物，以及Taqman探针，无核酸酶水等。DNA定量标准品(S1-S4)由包含鲍曼不动杆菌TEM基因DNA片段的重组质粒制备而成。
采用德国QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(Cat：50214)以及病原体裂解管L(Pathogen Lysis Tubes L，Qiagen，Cat：19092)组合后，作为本品方法的对比方法。提取的DNA同时进行光滑念珠菌DNA荧光PCR定量检测。
采用德国QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(Cat：50214)以及病原体裂解管S(Pathogen Lysis Tubes S，Cat：19091)组合后，作为本品方法的对比方法。提取的DNA进行鲍曼不动杆菌DNA荧光PCR定量检测。
结果可见，本发明的核酸提取方法及试剂，对尿液样本中鲍曼不动杆菌和光滑念珠菌基因组DNA提取，对于不同含量的细菌和真菌样本，均可以有效进行DNA提取。本发明的细菌和真菌基因组DNA提取比需要组合使用的对比试剂要更具有优势。并且，由结果可知，对于尿液样本，溶菌酶的加入并没有对光滑念珠菌这种真菌的基因组DNA提取产生影响，溶壁酶的加入也并没有对鲍曼不动杆菌这种细菌的基因组DNA提取产生影响。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；
在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；
使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述基因组DNA提取方法还包括从混合液中分离细菌和/或真菌的基因组DNA的步骤；可选地，所述从混合液中分离细菌和/或真菌的基因组DNA的步骤为：将混合液中加入结合液，混合均匀后加至硅胶膜柱中使细菌和/或真菌的基因组DNA与硅胶膜柱中的吸附膜表面的硅羟基团结合；洗涤硅胶柱膜上的吸附膜以去除杂质；洗脱吸附膜上真菌和/或细菌的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本中细菌和/或真菌浓度为1.0×102-7CFU/ml，可选地为1.0×102-6CFU/ml，进一步可选地为1.0×102-5CFU/ml，更进一步可选地为1.0×102-4CFU/ml，再更进一步可选地为1.0×102-3CFU/ml。
4.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本未经过体外的细菌和/或真菌培养。
5.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本包括血液，泪液，脑脊液，胸腔积水，腹腔积水，肺泡灌洗液，尿液，鼻咽拭子，脓液，脓液，精液。
6.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物的操作包括：12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清。
7.根据权利要求6所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：含有红细胞的临床标本在除去液体部分前还包括在抗凝临床标本中加入红细胞裂解液以裂解红细胞的步骤。
8.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述细菌包括金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌，所述真菌包括光滑念珠菌、隐球菌。
9.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶30-50mg、溶壁酶50-150U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠50-150mg；可选地，在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶40mg、溶壁酶100U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠100mg。
10.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：提取的细菌基因组DNA和/或真菌基因组DNA适用于PCR分析、基因序列直接测定、二代测序、基因芯片检测；所述PCR分析包括荧光定量PCR分析或数字PCR分析。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200218 |