CN110760504B - 一种磷脂酶a1的共交联固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种磷脂酶A1的共交联固定化方法。使用油溶性的噠嗪双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的磷脂酶A1以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化磷脂酶A1。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在40～75mg酶/g载体范围时具有较高的活性，其中负载量为61mg酶/g载体时，其活性达到最高值。

Description

一种磷脂酶A1的共交联固定化方法

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种磷脂酶A1的共交联固定化方法，该新型固定化酶可用于除去油脂中的非水化磷脂，并生产溶血磷脂。

背景技术

磷脂酶A1(EC 3.1.1.3)是一种羧酸酯水解酶(等电点为5.3)，广泛存在于细菌、霉菌、哺乳动物和植物中，磷脂酶A1能够专一水解磷脂Sn-1位上的脂肪酸得到Sn-2位酰基溶血磷脂，把非水化磷脂转化为水化磷脂，磷脂酶A1催化水解磷脂制备溶血磷脂是界面反应，磷脂在水中较难分散，磷脂酶A1游离到磷脂胶束和水的界面，酶的活性部位和磷脂胶束结合后发生水解，反应中不需要金属离子的参与，反应界面的大小直接影响反应速度和水解程度。植物毛油的精炼过程中需要除去影响脱酸、脱色、脱臭等工序的杂质，磷脂的存在会使油脂在加热过程起泡，影响食用性。脱胶不彻底，将会影响后续的精炼工序，对成品油的品质产生不利影响。酶法脱胶主要是利用磷脂酶可以水解非水化磷脂，产生溶于水的溶血磷脂的特性，将磷脂从油脂中去除。磷脂酶A1水解磷脂的产物为游离脂肪酸和Sn-2位酰基溶血磷脂，同时溶血磷脂也可应用于食品保鲜、调味、化妆品、蛋白质提纯等领域，对乳化稳定性、耐热性、耐酸性、抗盐性等方面都有较大的改善作用。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的磷脂酶A1可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的磷脂酶A1极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的磷脂酶A1其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于磷脂酶A1的固定，利用磷脂酶A1分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种磷脂酶A1的固定化方法，这种方法是基于磷脂酶A1与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为磷脂酶A1及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过磷脂酶A1的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物与酶分子产生强的亲和力，导致交联反应能使磷脂酶A1能以接近100％的利用率被固定化，交联反应发生后，液相中几乎没有残留的磷脂酶A1；

非常有益的是，β-环糊精与胺化环氧树脂的分子复合物具有弯曲的刚性结构，它带来了充足的自由体积，为生物大分子与底物相互作用提供传质通道，同时为生物大分子的构象提供稳定性，从而提高了固定化酶的催化活性。

2、本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述固定化酶的制备方法，其特征步骤为：1)将双酚A环氧树脂(牌号为D-39，环氧值为0.39，数均分子量为513)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.3的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；3)将磷脂酶A1溶解在pH＝8.0的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的磷脂酶A1溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化磷脂酶A1酶的产物。

非常有益的是，交联剂中的一个双键首先与分子复合物上的氨基发生反应，形成具有乳化作用的产物，油相在反应启动后会很快分散直至消失，磷脂酶A1首先通过吸附方式进入聚合物中，然后交联剂上的双键与酶上的氨基进行缓慢的反应，最终变成共交联的固定化酶产物；

非常有益的是，利用β-环糊精与疏水苯环的相互作用引入亲水基团，避免使用化学键，并通过交联反应使β-环糊精无法脱离聚合物，使固定化酶的制备简化；

非常有益的是，整个聚合过程中不加入其它有机溶剂，不需要更高的温度。

本发明的优点在于：1)利用水/油双相反应实现酶的交联，控制了交联程度；2)引入β-环糊精超分子复合物改善了固定化磷脂酶A1的微环境，提高了酶的催化反应活性；3)共交联固定法能使磷脂酶A1以极高的效率被固定化。

具体实施方式

酶的固定化

1)将双酚A环氧树脂(牌号为D-39，环氧值为0.39，数均分子量为513)、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.3的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将磷脂酶A1溶解在pH＝8.0的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)分别将浓度为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL的磷脂酶A1溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合，通过改变酶溶液的浓度来调节固定化酶的负载量；

5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，同时油相消失，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的固定化磷脂酶A1的产物。

固定化酶的负载量测定：

由于共交联法固定磷脂酶A1后，反应残留液中测不到磷脂酶的活性，说明经过交联后磷脂酶A1全部进入到固体颗粒中，所以负载量的计算用以下公式：

其中：C为共交联酶溶液的浓度(mg/mL)；V为共交联酶溶液的体积(mL)；m为固定化酶干态质量(g)。

酶活力测定：

(1)游离酶活的测定：一定量的底物无油磷脂、0.5％PVA溶于预定pH值的缓冲液中，用高速均质机在10000r/min的条件下均质3min，得到底物溶液。取4个100mL高型烧杯，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入磷脂酶A1溶液预定稀释倍数的稀释液1mL(用缓冲液稀释)，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应一定时间，于样品瓶中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出，于自动滴定仪下用NaOH标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。

(2)固定化酶活的测定：使用丙酮去除大豆卵磷脂中的少量的甘油三脂，得到无油大豆磷脂。取5g的聚乙烯醇于烧杯中，加入1000mL的pH为5.0的缓冲液，加热并搅拌，使聚乙烯醇溶解。冷却至室温后，向烧杯中加入40g无油大豆卵磷脂，搅拌均匀后，10000r/min均质10min，获得底物溶液。准确称取30g底物溶液于锥形瓶中，将锥形瓶放入水浴摇床中，50℃预热10min。加入固定化酶，在180r/min、50℃的条件下反应10min后，加入15mL95％乙醇，使酶失活，终止酶解反应。使用自动电位滴定仪，用0.1mol/LNaOH溶液滴定反应后的底物溶液，记录NaOH溶液消耗量。空白对照不添加固定化磷脂酶，其他条件与实验组保持一致。

规定1min水解大豆卵磷脂产生游离脂肪酸所需要的酶量为一个磷脂酶活力单位(U)。每克固定化酶含有的磷脂酶活力单位(U/g)即为固定化磷脂酶的酶活力，按公式计算：

其中：X表示样品的磷脂酶活力(U/g)；V表示滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积(mL)；V₀表示滴定空白时消耗的NaOH标准溶液体积(mL)；c表示NaOH标准溶液的浓度(mol/L)；m表示反应中加入的固定化酶质量(g)；t表示测定酶活时的反应时间(min)。

相对活性：

将固定化酶的活性与游离酶的活性之比定义为相对活性。

实验结果：

实验一共得到7个不同负载量的固定化磷脂酶A1的样品，分别测定它们的活力，计算得到它们的相对活性。图2是相对活性与负载量的关系，当负载量在40～75酶/g载体范围时，固定化酶具有较高的活性，当负载量为61mg酶/g载体时其相对活性达到最大值，其比活力是游离酶的95％，这个结果说明磷脂酶A1在这个范围处于非常适合催化的状态。当负载量大于61mg酶/g载体时，固定化酶的活性逐渐随负载量的增加而变小。一般来说交联固定法都会使酶的构象变得僵硬，从而活性降低，本发明专利的共交联固定法能使酶的微环境得到改善，这与引入环糊精超分子结构单元有关，它使固定化酶的结构变的松散，同时还改善了内部的亲水性，此外共交联还能提高酶的分散性，避免了酶的聚集，从而提高其催化活性。但是当负载量过大时，酶的聚集变得不可避免，所以其活性又迅速下降。

我们以负载量为61mg酶/g载体的样品为研究对象，测定固定化酶与游离酶溶液的储存稳定性，其结果如图3所示，以时间为零的起始状态的活性为100％，在4℃，pH＝5.5的条件下，经过28天的储存，游离酶溶液只残留47％的活性，而固定化酶能残留82％的活性，所以在储存稳定性方面，固定化酶要明显优于游离酶。

附图说明

图1交联剂的化学结构。

图2固定化磷脂酶A1的催化活性与其负载量的依赖关系。

图3固定化与游离磷脂酶A1的储存稳定性比较。

Claims (1)

1.一种磷脂酶A1共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂噠嗪双丙烯酸酯，其结构如下：

水相中的反应物为磷脂酶A1及结构如下的分子复合物：

所述的磷脂酶A1共交联固定化方法，按以下步骤操作：

1)将数均分子量为513的双酚A环氧树脂、甲醇和三乙烯四胺三种组分按照2∶2∶1.3的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物；

2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围；

3)将磷脂酶A1溶解在pH＝8.0的磷酸缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围；

4)将不同浓度的磷脂酶A1溶液与上述分子复合物水溶液按照50mL∶20mL的比例混合；

5)在搅拌下将1.0g噠嗪双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置5～6小时，过滤后即得到不同负载量的磷脂酶A1固定化产物。

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