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CN110753703B - 新的cd73抗体、其制备和用途 - Google Patents

新的cd73抗体、其制备和用途 Download PDF

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CN110753703B
CN110753703B CN201880033831.5A CN201880033831A CN110753703B CN 110753703 B CN110753703 B CN 110753703B CN 201880033831 A CN201880033831 A CN 201880033831A CN 110753703 B CN110753703 B CN 110753703B
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Abstract

本发明涉及改进的抗‑CD73抗体，与现有技术的抗‑CD73抗体相比，改进的抗‑CD73抗体结合具有促癌作用的膜结合形式的CD73蛋白并且抑制其酶活性，同时基本上不抑制参与心脏保护的可溶形式的CD73蛋白。本发明还涉及产生这种特异性抗‑CD73抗体的方法，以及其用途，包括作为药物的用途和在用于治疗、减轻、预防和诊断癌症的方法中的用途。

Description

新的CD73抗体、其制备和用途
本申请含有计算机可读形式的序列表，在此通过引用将其并入。
发明领域
本发明涉及改进的抗-CD73抗体，与现有技术的抗-CD73抗体相比，改进的抗-CD73抗体结合具有促癌作用的膜结合形式的CD73蛋白并且特异性抑制其酶活性，同时基本上不抑制参与心脏保护的可溶形式的CD73蛋白。本发明还涉及产生这种特异性抗-CD73抗体的方法，以及其用途，包括作为药物的用途和在用于治疗、减轻、预防和诊断癌症的方法中的用途。因此，本发明的抗-CD73单克隆抗体具有作为用于作为单独的治疗或者与阿霉素组合治疗癌症(例如，AML，ALL)和其他免疫介导疾病的免疫检查点抑制剂的新药潜力。
背景技术
对于引起较少严重不良副反应的有效的癌症疗法存在有重大医疗需求。目前的疗法通常缺乏特异性，而且常常由于针对化疗和放疗的固有或获得性耐受性而失效。
外核苷酸酶CD73是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的膜结合糖蛋白，其将细胞外一磷酸腺苷(AMP)转化成腺苷(ADO)。可溶形式的CD73可以通过GPI锚的溶蛋白性裂解或水解从膜脱落。CD73是ATP衰变为腺苷的限速酶，其发挥不同的促癌作用机制。该分子表达于免疫效应细胞上，在该处其有助于免疫抑制作用和低反应性(hyporesponsiveness)；另外，也跨许多种类型的癌症而得以高水平表达。CD73也见于许多种组织中，包括结肠、脑、肾、肝、肺和心脏，另外还见于白血球上以及内皮上。存在着该酶的表达和功能在缺氧条件下以及通过若干促炎介质的存在而上调的证据。
在肿瘤微环境内，CD73产生的腺苷促进肿瘤的生长和存活，同时抑制抗肿瘤的免疫应答。经发现，CD73在范围广泛的癌细胞中得到过量表达，阻断该酶已经显示改变肿瘤的免疫抑制能力。癌细胞诱导免疫抑制环境促进其自身的生长，并规避免疫识别。因此，CD73(也称作NT5E)是强有力的免疫抑制剂。CD73是胞外酶，通常在内皮细胞和免疫细胞上表达，在该处其有助于免疫平衡。例如，CD73在Treg活性的调节(Deaglio et al.，2007；Wang etal.，2011)和无变应性T细胞的低反应性(Martinez et al.，2012)中发挥中心作用。因此，具有EC 3.1.3.5酶活性的CD73(或胞外-5’-核苷酸酶或5’-NT)是广泛表达的催化一磷酸腺苷去磷酸化为腺苷的胞外酶，其发挥不同的免疫抑制和促癌作用机制(图1)。该分子在免疫效应细胞上组成型表达或诱导，在该处有助于免疫抑制作用和低反应性。
另一方面，CD73跨许多种类型的癌症而过量表达(Stagg et al.，2013)，通常与临床预后差有关(Ren et al.，2016)。免疫抑制肿瘤环境含有高水平ADO，靶向CD73阻断通过减少ADO积累来促进抗肿瘤免疫力。在癌症中，CD73推测发挥双重功能：一是，它在构成肿瘤性微环境的肿瘤浸润间质细胞上表达并发挥酶活性；其次，它在癌细胞上高度表达，并直接刺激其以自分泌的方式生长(Stagg et al.，2010；Stagg et al.，2012)。此外，CD73活性使肿瘤特异性T细胞反应迟钝(Jin et al.，2010)，并干扰细胞凋亡和转移(Antonioli etal.，2013)。事实上，多个临床前模型已经证明了CD73作为癌症治疗的治疗靶点的价值(Zhang，2010)。因此，已经表明抗-CD73 mAb在动物模型中降低肿瘤的生长和转移(Stagget al.，2010)。
CD73过量表达还与癌细胞的耐药性有关，癌细胞包括乳腺癌(Loi et al.，2013)、结直肠癌(Cushman et al.，2015)和成胶质细胞瘤(Quezada et al.，2013)等等。尤其是，CD73还被发现在针对TRAIL-诱导的细胞凋亡有耐受性的白血病细胞中过量表达(Mikhailov et al.，2008)。目前，正朝着单独地或者与其他检查点抑制剂组合用抗体进行抗-CD73疗法的临床转化而努力。CD73-阻断mAb构成有价值的抗癌工具，其可以成为放化疗、分子靶向疗法和其他免疫治疗策略的组成部分。
出于这些原因，CD73被视作是有前景的用于例如用阻断单克隆抗体(mAb)进行免疫疗法(辅助)策略的分子靶标。但是，通过常规的免疫技术，极难获得针对结构上复杂的膜蛋白质(如G-蛋白偶联受体(GPCR))或膜结合(membrane-tethered)酶(如CD73)的功能性且由此具有构象特异性的mAb。
另一方面，可溶形式的CD73可以通过GPI锚的溶蛋白性裂解或水解从膜脱落，已经报道具有心脏保护作用。因此，阻断可溶形式的CD73是不合意的，以避免潜在的心脏相关的副作用。而且，由于细胞中的CD73蛋白大多数以膜结合形式存在，这些膜结合的形式构成癌症治疗中用于CD73失活的主要靶标形式。现有技术中已知有若干抗-CD73 mAb(WO2016081748)，但是，其无一能够特异性地抑制膜结合形式的CD73蛋白、同时基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性。
通过提供基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白、同时抑制膜结合形式的CD73的酶活性的抗体，如本文在以下所述，本申请满足了这一需求，上述抗体在权利要求中说明其特征，并通过所附的实施例和附图说明。
细胞外囊泡(EV)是细胞(包括癌细胞)释放的膜围绕的囊泡，含有其来源细胞的功能性蛋白质。EV很有可能构成囊泡如外来体(exosome)和微囊泡的混合物，上述囊泡在形态发生路径、其组成并可能在其生物功能方面有所不同。EV在膜和膜蛋白质中富含，已经表明发挥多种免疫作用。而且，EV在其生理构象中载有多种膜蛋白质。但是EV还含有多种类别的功能性核酸，其在EV被目标细胞吞没之后可以被翻译成功能性蛋白质(在mRNA的情形中)或者发挥调节功能(在例如微-RNA的情形中)。因此，EV现如今被视作是(复杂)信息从来源细胞到目标细胞的相关且强有力的传送者。
本发明的发明人开发了涉及源自肿瘤的EV的免疫策略，用以产生具有治疗和/或诊断潜力的单克隆抗体(mAb)。使用该策略，发明人生成了称作“22E6”的单克隆抗体，该抗体基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白，使得其可以主要产生参与心脏保护的腺苷，但与膜结合形式的CD73蛋白结合，并特异性地抑制其酶活性。该22E6 mAb在此预计是优越的用于干扰癌症耐受性、并进一步临床用于单一和组合疗法的分子。而且，因可溶形式的CD73得以报道的在心脏保护中的作用，阻断其是不合意的，因此相对于现有的结合并抑制可溶和膜结合两种形式的CD73的CD73单克隆抗体，22E6 mAb是特别有利的。
根据本发明的22E6 mAb的序列清楚地不同于已知抗体的序列。因此，22E6 mAb是首个且唯一的选择性抑制膜结合的CD73、但不抑制可溶形式的CD73的抗体。考虑到这两种形式的分子在结构上类似，不同之处仅在于存在还是不存在GPI-锚，开发出选择性地阻断膜形式的功能性抗体是全新且预料不到的。
发明内容
本发明涉及抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-CD73抗体或其抗原结合部分表现出以下特性中的一种或多种：
i)特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
ii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白，其中抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
iii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。
通过提供本文在下文中所述的抗体，本申请满足了这一需求，上述抗体在权利要求中说明其特征，并通过所附的实施例和附图说明。
序列表概述
SEQ ID NO：1是编码mAb 22E6的VH区的DNA序列。
SEQ ID NO：2是编码mAb 22E6的VH互补决定区1(H-CDR1)的DNA序列。
SEQ ID NO：3是编码mAb 22E6的VH互补决定区2(H-CDR2)的DNA序列。
SEQ ID NO：4是编码mAb 22E6的VH互补决定区3(H-CDR3)的DNA序列。
SEQ ID NO：5是编码mAb 22E6的VL区的DNA序列。
SEQ ID NO：6是编码mAb 22E6的VL互补决定区1(L-CDR1)的DNA序列。
SEQ ID NO：7是编码mAb 22E6的VH互补决定区2(L-CDR2)的DNA序列。
SEQ ID NO：8是编码mAb 22E6的VH互补决定区3(L-CDR3)的DNA序列。
SEQ ID NO：9是mAb 22E6的VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是mAb 22E6的VH互补决定区1(H-CDR1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是mAb 22E6的VH互补决定区2(H-CDR2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是mAb 22E6的VH互补决定区3(H-CDR3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是mAb 22E6的VL区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是mAb 22E6的VL互补决定区1(L-CDR1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是mAb 22E6的VL互补决定区2(L-CDR2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是mAb 22E6的VL互补决定区3(L-CDR3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是智人(Homo sapiens)前原蛋白的5′-核苷酸酶同种型1的氨基酸序列，编号：NP_002517。
SEQ ID NO：18是智人前原蛋白的5′-核苷酸酶同种型2的氨基酸序列，编号：NP_001191742。
附图说明
图1：肿瘤环境中腺苷的许多功能，改编自Antonioli et al.，2013。
图2：用于产生靶向肿瘤细胞表面上的膜蛋白质的功能性mAb的基于EV的免疫策略的原理。GBM20是人成胶质细胞瘤细胞系；SN＝上清液；IP＝免疫沉淀；MS＝质谱。
图3：mAb 22E6识别癌细胞上的CD73。(A)22E6和抗-大鼠-IgG-特异性荧光团标记第二mAb的流式细胞术揭示，被mAb识别的蛋白质存在于人癌细胞的表面上。显示的是共计约30种所测试细胞系中的4个代表性细胞系。U138 MG和GBM20是成胶质细胞瘤细胞系，MDA-MB231和T47D是人乳腺癌细胞系。(B)使用市售CD73 mAb用相同细胞系进行的免疫印迹。(C)用22E6或同种型mAb从U138成胶质细胞瘤细胞的裂解物进行CD73蛋白的免疫沉淀，然后用市售CD73 mAb进行免疫印迹，论证了22E6的特异性。输入＝U138裂解物。
图4：22E6阻断腺苷的产生。将CD73-阳性人A375黑色素瘤细胞与AMP一起孵育60min，测量上清液中AMP(左)和ADO(右)的浓度。APCP是小分子特异性CD73抑制剂。
图5：22E6抑制人CLL细胞产生ADO。APCP是CD73小分子抑制剂。
图6：22E6增加混合淋巴细胞反应中TNFα的释放。5x105个外周血单核细胞各自来源于3个不同供体(A、B、C)中的2个，将上述外周血单核细胞在37℃下在标准细胞培养基中与22E6(50μg/ml)或GSF-mAb(50μg/ml)共孵育，通过市售的ELISA检验测量TNFα的量。
图7：来自CD73+癌细胞的EV将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐(μM Pi)。
图8：自卵巢癌患者的腹水分离的EV携带CD73。
图9：22E6阻断来自恶性腹水的EV产生ADO。将EV在不含磷酸盐的缓冲液中在1mMAMP的存在下与APCP、22E6或同种型mAb一起孵育60min，通过孔雀石绿检验对无机磷酸盐(Pi；在AMP去磷酸化的同时产生)的浓度进行定量。
图10：22E6表现出的抑制优先性。
图11：编码22E6的轻链和重链的免疫球蛋白基因的可变部分的核苷酸序列。CDR以黑体标记。重链：SEQ ID NO：1，轻链：SEQ ID NO：5。
图12：22E6的轻链和重链的可变部分的氨基酸序列。CDR以黑体标记。重链：SEQ IDNO：9，轻链：SEQ ID NO：13。
图13：重链(SEQ ID NO：9)的氨基酸编号和其中不寻常的氨基酸残基。
图14：轻链(SEQ ID NO：13)的氨基酸编号和其中不寻常的氨基酸残基。
图15：与同种型抗体相比，mAB 22E6诱导干扰素-γ(IFN-γ)的大量释放。IFN-γ是细胞毒性T-细胞激活的标志物。来源于2个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)分别如所示在37℃下孵育24h。然后通过标准ELISA检验对上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)进行定量。
具体实施方式
定义
“细胞外囊泡”是由包括癌细胞的细胞释放的膜围绕的囊泡，它含有其来源细胞的功能性蛋白质。
在本文中使用时，“抗体”是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段所编码一个或多个多肽(包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。在本文中术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数种免疫球蛋白可变区基因。具体地，在本文中使用时，“抗体”通常是由两个各自约25kDa的轻(L)链和两个各自约50kDa的重(H)链组成的四聚糖基化蛋白质。抗体中可以发现两种类型的称作λ和κ的轻链。取决于重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分成五个主要类别：A、D、E、G和M，其中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，在本发明的上下文中，优选IgG。另外还预计有本发明的如下抗体：其具有通过Fcε受体I结合的IgE恒定结构域或其部分。IgM抗体由5个基础的异四聚体单元以及额外的称作J链的多肽组成，包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个可以聚合以与J链组合形成多价组件(assemblage)的基础的4-链单元。在IgG的情形中，四链单元通常为约150,000道尔顿。每个轻链包括N-端的可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)。每个重链包括N-端的V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)和铰链区。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，例如参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。如果抗体应发挥ADCC的功能，其优选为IgG1亚型，而IgG4亚型则不具有发挥ADCC的能力。
术语“抗体”还包括，但不限于，但包括单克隆、单特异性、多元-或多-特异性抗体，例如双特异性抗体、人源化、骆驼化(camelized)、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移植性和体外产生的抗体，优选嵌合或人源化抗体。术语“人源化抗体”通常定义为其中编码HC和LC的CDR的特异性已经转化成合适的人可变框架(“CDR移植”)的抗体。术语“抗体”还包括scFv、单链抗体、双价抗体(diabody)或四价抗体(tetrabody)、结构域抗体(dAb)和纳米抗体。就本发明而言，术语“抗体”还应包括具有若干抗原结合位点的双-、三-或多嵌合或者双、三-或多功能性抗体。
而且，本发明中所用的术语“抗体”还涉及本文所述的抗体的衍生物(包括片段)。抗体的“衍生物”包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加而改变的氨基酸序列。另外，衍生物包括已通过任意类型的分子与抗体或蛋白质的共价连接而修饰的抗体。这些分子的例子包括糖、PEG、羟基-、乙氧基-、羧基-或胺基-基团，但并不限于此。实际上抗体的共价修饰导致糖基化、聚乙二醇化、酰基化、磷酸化、酰胺化，但不限于此。
本发明的抗体优选为“分离的”抗体。用于描述本文公开的抗体时，“分离的”是指抗体已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收。优选地，分离的抗体不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分，例如由重组转染细胞产生的污染组分，是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，可以包括酶、激素和其他的蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方式中，抗体将会纯化至(1)通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个N-端或内部氨基酸序列残基的程度，或(2)在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色通过SDS-PAGE的均一性。但是，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指免疫球蛋白(或完整抗体)的片段，并包括任何包含抗原结合片段或抗原结合结构域的多肽。优选地，片段例如Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及其他保持本文所述抗原结合功能的抗体片段。典型地，这些片段可以包括抗原结合结构域，并且具有与本文所述的抗体相同的特性。
因此，所述片段优选地也能够与膜结合形式的CD73蛋白结合。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体或其片段或衍生物特异性地结合CD73蛋白，但并不特异性地结合其他蛋白质。根据本发明的抗体或其片段或衍生物通过抗体的可变结构域结合CD73蛋白。
如本文所用，术语“特异性抑制”是指抗体或其片段或衍生物特异性地抑制膜结合形式的CD73蛋白，但并不特异性地抑制可溶形式的CD73。根据本发明的抗体或其片段或衍生物通过抗体的可变结构域抑制膜结合形式的CD73蛋白。
配对的VH和VL一起形成单一抗原结合位点。与VH最近的CH结构域称作是CH1。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链则取决于H链的同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。VH和VL结构域包含4个称作框架区的相对保守的序列区(FR1、FR2、FR3和FR4)，该框架区形成3个高变序列区(互补决定区，CDR)的支架。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基中的大多数。CDR称作CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组成部分称作H1或H-CDR1、H2或H-CDR2和H3或H-CDR3，而轻链上的CDR组成部分则称作L1或L-CDR1、L2或L-CDR2和L3或L-CDR3。
术语“可变”是指免疫球蛋白结构域的表现出其序列可变性、并且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即，“可变结构域”)。可变性不是平均分布在整个抗体可变结构域上；它集中在每个重链和轻链可变区的亚结构域中。这些亚结构域称作“互补决定区”(CDR)。
术语“CDR”及其复数形式“CDRs”是指互补决定区(CDR)：其中的3个构成轻链可变区的结合特征(L1-CDRL1、L2-CDR和L3-CDR)，3个构成重链可变区的结合特征(H1-CDR、H2-CDR和H3-CDR)。CDR有助于抗体分子的功能活性，被包含支架或框架区的氨基酸序列隔开。精确定义的CDR边界和长度加以不同的分类和编号系统。CDR可以因此被Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)所指。尽管边界不同，这些系统各个在可变序列内什么构成所谓的“CDR”方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以在长度和相对于相邻框架区的边界区方面有所不同。例如，参见Kabat、Chothia和/或MacCallum et al.(Kabat et al.，在上述引文中；Chothia et al.，J.MoI.Biol，1987，196：901；和MacCallum et al，J.MoI.Biol，1996，262：732)。但是，优选根据所谓的Kabat系统的编号。
本发明的优选的抗体可变区示于SEQ ID No.9、10、11、12、13、14、15、16中。
可变结构域的更加保守(即，非高变)的部分称作“框架”区(FRM)。天然发生的重链和轻链的可变结构域均包括4个FRM区，其主要采取β-折叠构象并由3个高变区连接，形成回环连接，而在一些情形中形成β-折叠结构的一部分。每个链中的高变区通过FRM紧靠在一起，并与来自另一链的高变区一起有助于形成抗原结合位点(参见Kabat et al.，在上述引文中)。恒定结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，例如，如抗体-依赖性细胞介导细胞毒性和补体激活。
本发明相关的术语“结合结构域”表征多肽与指定的目标表位特异性结合/相互作用的结构域。“表位”是抗原性的，因此术语“表位”在本文中有时也称作“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用位点”。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义了多肽的基序，其能够特异性地与特定的抗原或抗原(例如不同物种中的相同抗原)的特定基团相互作用。所述结合/相互作用也理解成定义“特异性识别”。
术语“表位”另外还指抗原(在本发明的上下文中，抗原是膜结合形式的CD73蛋白)上与抗体分子结合的位点。优选地，表位是分子上的针对其产生抗体或其抗原结合部分、优选抗体和/或抗体将会与其结合的位点(在本发明的上下文中，抗原是膜结合形式的CD73蛋白)。例如，表位可以被抗体或其抗原结合部分识别。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含所识别表位的表位。线性表位典型地在单一序列中包括至少3个、更通常地至少5个例如约8至约10个氨基酸。
与线性表位相对照，“构象表位”是其中包含表位的氨基酸一级序列不是所识别表位的唯一定义组分的表位(例如，其中氨基酸一级序列不必要被定义表位的抗体识别的表位)。典型地，构象表位相对于线性表位包含数量增加的氨基酸。关于构象表位的识别，抗体或其抗原结合部分识别抗原、优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，抗原是膜结合形式的CD73蛋白)。例如，当蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架变得毗邻，使抗体能够识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于，例如，x-射线晶体学、二维核磁共振光谱学和定点自旋标记(site-directed spinlabelling)和电子顺磁共振波谱学。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体或其片段或衍生物的一重链和一轻链的可变区与其抗原(例如膜结合形式的CD73)之间的结合强度，其在体外测量。亲和力决定了表位和抗体的抗原结合位点之间的相互作用强度。亲和力可以使用以下公式计算：
KA＝[AB-AG]/[AB]*[AG]＝kon/koff
其中：
KA＝亲和力常数
[AB]＝抗体上未占据结合位点的摩尔浓度
[AG]＝抗原上未占据结合位点的摩尔浓度
[AB-AG]＝抗体-抗原复合物的摩尔浓度
如本文所用，术语“抗体亲抗原性(avidity)”是指抗体-抗原复合物的总体强度的度量，其实际上取决于以下参数：(1)抗体对于表位的亲和力；(2)抗体和抗原的价态；和(3)相互作用部分的结构排列。
在本上下文中，术语“特异性”是指抗体或其抗原结合部分抑制膜结合形式的CD73蛋白的酶活性，但基本上不抑制其他蛋白质。术语“其他蛋白质”包括任何蛋白质，其包括与抗体或其抗原结合部分所针对的CD73蛋白密切相关或同源的蛋白质。但是，术语“其他蛋白质”不包括抗体或其抗原结合部分与膜结合形式的CD73蛋白(来自与针对其产生抗体或其抗原结合部分的物种不同的物种)交叉反应。
因此，本发明优选地预期针对膜结合形式的CD73蛋白的跨物种特异性抗体或其抗原结合部分。
术语“基本上不抑制”是指本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分不抑制可溶形式的CD73蛋白，即，表现出小于30％、优选20％、更优选10％、特别优选小于9、8、7、6或5％的可溶形式的CD73蛋白的酶活性抑制。
特异性结合据信通过结合结构域氨基酸序列中的特定基序和抗原实现，该基序和抗原由于它们的一级、二级或三级结构以及由于所述结构的二次修饰而彼此结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可以导致所述位点与抗原的简单结合。而且，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以另外可选地导致信号的引发，例如，由于诱导抗原构象的变化、抗原的低聚等。符合本发明的结合结构域的优选例子是抗体。
典型地，当结合亲和力高于10-6M时，认为结合是特异性的。优选地，当结合亲和力为约10-11至10-8M(KD)、优选地约10-11至10-9M时，认为结合是特异性的。如果必要，通过改变结合条件，可以在基本上不影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。
抗体或其抗原结合部分是否如本文上文所定义特异性地反应可以很容易地测试，尤其是，通过将所述抗体或其抗原结合部分与膜结合形式的CD73蛋白的反应和所述抗体或其抗原结合部分与其他蛋白质(例如可溶形式的CD73蛋白)的反应进行比较。
术语“多肽”在本文中与术语“蛋白质”等同地使用。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段，和肽，其通常小于30个氨基酸)包含一个或多个彼此通过共价肽键偶联的氨基酸(产生氨基酸链)。如本文所用，术语“多肽”描述一类分子，例如，其由大于30个氨基酸组成。多肽还可以形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的低聚体，即，由大于1个多肽分子组成。形成这些二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不同的。相应的这些多聚体更高级的结构因此称作均-或杂二聚体、均-或杂三聚体等。杂多聚体的例子是以其天然发生形式由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成的抗体分子。术语“多肽”和“蛋白质”另外也指天然修饰的多肽/蛋白质，其中修饰例如通过例如糖基化、酰基化、磷酸化等的翻译后修饰实现。这些修饰是本领域熟知的。
当用于本文时，“抗体”是包含一个或多个基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽(包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数种免疫球蛋白可变区基因。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有其领域公认定义的氨基酸，例如选自以下的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；蛋氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，但根据需要可以使用修饰的、合成的或稀有氨基酸。通常，氨基酸可以分类为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；具有带负电荷的侧链(例如，Asp、Glu)；具有带正电荷的侧链(例如，Arg、His、Lys)；具有不带电荷的极性侧链(例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)回环采取的主链构象。从比较结构研究已经发现，6个抗原结合回环中的5个仅有可利用构象的有限部分。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角表征。因此，尽管回环大多数部分中的氨基酸序列具有高度可变性，但抗体之间对应的回环可具有非常类似的三维结构(Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，1987，196：901；Chothia et al，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.MoI.Biol，1996，263：800，在此通过引用将其均全文并入)。而且，采取的回环结构和围绕其的氨基酸序列之间存在关联。具体规范类别的构象由回环的长度和位于回环内以及保守框架内(即回环外部)关键位置处的氨基酸残基所决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来进行具体规范类别的指定。术语“规范结构”还可以包括关于抗体线性序列的考虑，例如，如通过Kabat分类(Kabat et al，在上述引文中)。Kabat编号方案(系统)是广泛采用的用于以一致的方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的标准，是应用于本发明的优选方案，如本文中在别处另外提及。也可以使用额外的结构考虑，以确定抗体的规范结构。例如，那些不能完全通过Kabat编号反映的不同之处可以通过Chothia et al的编号系统描述，和/或通过其他技术例如晶体学和二维或三位计算模拟来揭示。因此，可以将指定的抗体序列置于允许尤其是识别适当的底盘序列(chassis sequence)的规范类别中(例如，基于在文库中包括许多种规范结构的需求)。如上述引用的Chothia et al.所描述的抗体氨基酸序列和结构考虑的Kabat编号以及其对于理解抗体结构的规范方面的含义描述于文献中。
CDR3典型地是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，H3可以短到2个氨基酸残基，或者大于26个氨基酸。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是本领域熟知的。抗体结构的综述参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，eds.Harlow et al.，1988。本领域技术人员将会认识到每个亚基结构，例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构，包括活性片段，例如，VH、VL或CDR亚基与抗原结合的部分，即，抗原结合片段，或者，例如，CH亚基结合和/或激活例如Fc受体和/或补体的部分。CDR典型地是指Kabat CDR，如若以下文献中所述：Sequences of Proteins of immunologicalInterest，US Department of Health and Human Services(1991)，eds.Kabat et al。用于表征抗原结合位点的另一标准是指高变回环，如Chothia所描述。参见，例如，Chothia，etal.(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson et al.(1995)EMBO J.14：4628-4638。再另一标准是Oxford Molecular的AbM抗体模拟软件使用的AbM定义。参见，通常，例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering Lab Manual(Duebel，S.和Kontermann，R.编纂，Springer-Verlag，Heidelberg)。关于Kabat CDR所述的实施方式可以另外可选地使用类似的对于Chothia高变回环或AbM-定义的回环所描述的关系实施。
组装和体细胞突变之后的抗体基因序列是高度变化的，这些变化的基因推测编码1010种不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，2nd ed.，eds.Jonio et al.，AcademicPress，San Diego，CA，1995)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的组集(repertoire)。术语“组集”是指完全或部分地源自至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一种核苷酸序列。上述序列可以通过重链的V、D和J链段和轻链的V和J链段的体内重排产生。另外可选地，上述序列可以由细胞产生，重排响应于上述细胞而发生，例如，体外刺激。另外可选地，部分或全部的序列可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见，例如，美国专利5,565,332。组集可以仅包括一种序列，或者可以包括多种序列，包括遗传多样化集合中的多种序列。
“多克隆抗体”或“多克隆抗血清”是指含有对一种(单价或特异性抗血清)或多种(多价抗血清)抗原具有特异性的抗体的混合物，其可以由经抗原或多种抗原免疫的动物的血液制备。
而且，如本发明所用，术语“抗体”还涉及表现出与所述抗体相同的特异性的本文所述抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的例子包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见，例如，Hawkins et al.J.Mol.Biol.254，889-896(1992)；和Lowman et al.，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和效应子功能改变的抗体突变体(参见，例如，美国专利5,648,260)。
用于本文时，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合部分”、“抗原结合片段”和“抗体结合区”是指抗体分子的包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的部分。抗原被抗体特异性识别并结合的部分称作“表位”，如本文中上文所述。如上所述，抗原结合结构域可以典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；但是，它并不必要二者都包含。例如，Fd片段具有2个VH区，常常保持着完整的抗原结合结构域的一定抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的例子包括(1)Fab片段，这是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，这是具有两个在铰链区通过二硫键桥连接的Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，这是具有两个VH和CH1结构域的片段；(4)Fv片段，其具有抗体单个臂的VL和VH结构域；(5)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH结构域；(6)分离的互补性决定区(CDR)；和(7)单链Fv(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过分别的基因编码，它们可以使用重组方法通过合成的连接子连接，使其能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并使用与完整抗体相同的方式对片段进行功能评价。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由基本上同质的抗体的群落得到的抗体，基本上同质的抗体即构成该群落的单个抗体除可以少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原性位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相对照，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性以外，单克隆抗体的优势还在于：它们通过杂交瘤培养合成，不被其他的免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是获自基本上同质的抗体群落，它不应当理解成要求通过任意方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利No.4,816,567)产生。“单克隆抗体”还可以使用以下文献中所述的技术从噬菌体抗体库中分离：例如，Clackson etal.，Nature，352：624-628(1991)；和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)。
单克隆抗体在此具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在此关注的嵌合抗体包括“原始化(primitized)”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“人源化”形式的非人(例如，鼠科动物)抗体是主要为人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体的高变区(也是CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的高变区(其具有所需的特异性、亲和力和能力)的残基取代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基取代。而且，如本文所用，“人源化抗体”还可以包含在受体抗体和供体抗体中都没有发现的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体的性能。人源化抗体理想地还将会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地，包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。进一步细节参见：Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
术语“人抗体”包括具有与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列基本上对应的可变区和恒定区的抗体，包括，例如，Kabat et al.所述的抗体(参见Kabat，et al.(1991)，在上述引文中)。本发明的人抗体可以例如在CDR、特别是CDR3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少1、2、3、4、5或更多个被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基取代的位置。
如本文所用，“体外产生的抗体”是指其中全部或部分的可变区(例如，至少一个CDR)在非免疫细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或任何其他的其中可以测试候选序列的抗原结合能力的方法)中产生的抗体。该术语因此优选地排除通过免疫细胞中的基因组重排产生的序列。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过许多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny et al.，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。在一实施方式中，双特异性抗体包含第一结合结构域多肽，例如Fab′片段，其经由免疫球蛋白恒定区与第二结合结构域多肽连接。
本文所述的抗体可以用于形成双特异性分子。抗-CD73抗体或其抗原结合片段可以衍生或连接至另一功能性分子例如另一肽或蛋白质(例如用于受体的另一抗体或配体)，以产生与至少两个不同的结合位点或目标分子结合的双特异性分子。本文所述的抗体实际上可以衍生或连接至大于1个的其他功能性分子，以产生与大于2个不同的结合位点和/或目标分子结合的多特异性分子；这些多特异性分子也意在包括在如本文所用的术语“双特异性分子”中。为了产生本文所述的双特异性分子，可以将本文所述的抗体与一个或多个其他结合分子(例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)，使得产生双特异性分子。
免疫缀合物和抗体衍生物。本文所述的抗体可以用于诊断目的，包括样品测试和体内成像，出于该目的，抗体(或其结合片段)可以与适当的可检测试剂缀合，以形成免疫缀合物。出于诊断目的，适当的试剂是可检测标记物，对于全身成像，其包括放射性同位素，对于样品测试，其包括放射性同位素、酶、荧光标记物和其他合适的抗体标签。可检测标记物可以是体外诊断领域目前使用的各种类型中的任意者，包括颗粒标记物、包括金属溶胶例如胶体金，同位素，发色团包括荧光标志物，生物素，发光标志物，荧光标志物等，以及将指定底物转化成可检测标志物的酶标记物，和在例如通过聚合酶链式反应扩增后揭示的多核苷酸标签。生物素化抗体则可以通过亲和素或链霉亲和素结合检测。合适的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如，标记物可以是酶碱性磷酸酶，其通过测量1，2二氧丁环底物(例如金刚烷基甲氧基磷酰基氧基苯基二氧丁环(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1，2-二氧丁环-3，2′-(5′-氯)三环{3.3.1.13，7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)以及CDP和)或本领域技术人员熟知的其他发光底物(例如适当的镧系元素例如铽(III)和铕(III)的螯合物)的转化之后化学发光的存在或形成来检测。检测方式由所选择的标记物决定。标记物或其反应产物的出现可以使用肉眼实现(在标记物是颗粒并以适当水平积累的情况下)，或者使用仪器例如光谱仪、光度计、荧光计等实现，其均根据标准惯例进行。
本领域技术人员已知的许多种方法均可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用重组DNA方法产生抗体(美国专利4,816,567)。通过根据已知方法产生杂交瘤也可以产生单克隆抗体(参见，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)。通过该方式形成的杂交瘤则使用标准方法例如酶联免疫吸附检验(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析进行筛选，以识别出一种或多种产生特异性结合特定抗原的抗体的杂交瘤。可以使用任何形式的特定抗原作为免疫原，例如，重组抗原、天然产生形式、其任意变体或片段以及其抗原性肽。
产生抗体的一个示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。例如，噬菌体展示描述于以下文献中：Ladner et al.；美国专利No.5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson et al.(1991)Nature，352：624-628；Marks etal.(1991)J.MoI.Bio！.，222：581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809。
除展示文库的用途以外，特定的抗原还可以用于对非人动物例如啮齿动物如小鼠、仓鼠或大鼠进行免疫。在一实施方式中，非人动物包括至少一部分人免疫球蛋白基因。例如，有可能将小鼠抗体产生不足的小鼠株系用人Ig基因座的大的片段改造。使用杂交瘤技术，可以产生并选择源自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSETM；Green et al.(1994)Nature Genetics 7：13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096；和WO96/33735。
在另一实施方式中，单克隆抗体获自非人动物，然后进行修饰，例如，人源化、去免疫化(deimmunized)、嵌合，可以使用本领域已知的重组DNA技术产生。已经描述了许多种用于产生嵌合抗体的方法。参见，例如，Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda et al.，Nature 314：452，1985；Cabilly et al.，美国专利No.4,816,567；Boss et al.，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi et al.，EP 171496；EP 173494；GB2177096。例如，人源化抗体还可以使用转基因小鼠产生，该转基因小鼠表达人重链和轻链基因，但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。Winter说明了示例性的CDR-移植方法，其可以用于制备本文所述的人源化抗体(美国专利No.5,225,539)。特定人抗体的全部CDR均可以被至少一部分非人CDR取代，或者仅一些CDR可以被非人CDR取代。仅仅必要的是，取代人源化抗体与预定抗原结合所需数量的CDR。
人源化抗体或其片段可以通过以下产生：将Fv可变结构域的不直接参与抗原结合的序列用来自人Fv可变结构域的等同序列取代。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下文献提供：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi et al.(1986)BioTechniques 4：214；和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；和US 6,407,213。这些方法包括从重链或轻链中的至少一个分离、操纵和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。这些核酸可以获自如上所述产生针对预定目标的抗体的杂交瘤，以及获自其他来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
在某些实施方式中，通过引入保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变，对人源化抗体进行优化。这些改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的若干技术中的任意者产生(例如，Teng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor et al，Immunology Today，4：7279，1983；Olsson et al.，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，并且可以根据WO 92/06193或EP 239400的教导产生。
抗体或其片段还可以通过人T细胞表位的特异性缺失或者通过WO 98/52976和WO00/34317中公开的方法进行“去免疫化”而修饰。简言之，可以对抗体的重链和轻链可变结构域进行结合MHC类别II的肽的分析；这些肽代表着潜在的T-细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。对于潜在的T-细胞表位的检测，可以应用称作“肽穿线(peptidethreading)”的计算机模拟方法，此外，可以在人MHC类别II结合肽的数据库中搜索VH和VL序列中存在的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHC类别II DR同种异型中的任意者结合，从而构成潜在的T细胞表位。通过将可变结构域中的少量氨基酸置换，或者优选地通过单一氨基酸置换，可以消除检测的潜在的T-细胞表位。典型地，进行保守置换。经常地，但并非排他性地，可以使用人种系抗体序列中的位置所共有的氨基酸。例如，人种系序列公开于以下文献中：Tomlinson，et at.(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook，G.P.etai.(1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；Chothia，et al.(1992)J.MoI.Biol.227：799-817；和Tomlinson et al.(1995)EMBO J.14：4628-4638。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(Tomlinson，LA.etal.编纂，MRCCentre for Protein Engineering，Cambridge，UK)。这些序列可以用作例如框架区和CDR的人序列的来源。还可以使用共有的人框架区，例如，如美国专利No.6,300,064中所述。
已知抗体可以发挥效应子功能。因此，预计本发明的抗体可以由于其免疫球蛋白恒定区或Fc区而发挥一种或多种效应子功能。另外可选地，在某些实施方式中，预计抗体可以含有改变的免疫球蛋白恒定区或Fc区。例如，根据本文的教导产生的抗体可以更高的强度或者以更高的特异性与效应分子例如补体和/或Fc受体结合，上述效应分子可以控制抗体的若干免疫功能例如效应细胞的活性、溶解、补体介导的活性、抗体清除(antibodyclearance)和抗体半衰期。典型的与抗体(例如IgG抗体)的Fc区结合的Fc受体包括，但不限于，FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn亚类别的受体，包括等位基因变体和另外可选地剪接形式的这些受体。以下文献对Fc受体进行了综述：Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92，1991；Capel et al.，lmmunomethods 4：25-34，1994；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41，1995。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)、并随抗体同种型变化的生物活性。抗体效应子功能的例子包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。为了发挥效应子功能，抗体可以说募集效应细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指目标细胞在补体的存在下裂解。经典补体路径的激活通过补体系统第一组分(Clq)与结合在其关联抗原上的抗体(适当亚类别的)的结合而引发。为了评价补体激活，可以进行CDC检验，例如，如以下文献中所述：Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞活性”或ADCC是指以下形式的细胞毒性：其中某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的结合在Fc受体(FcR)上的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地与携带抗原的目标细胞结合，随后用细胞毒素杀死目标细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，是通过该机制杀死目标细胞所必须的。主要的用于介导ADCC的细胞NK细胞仅表达FcγRE，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页上的表3中。为了评价所关注分子的ADCC活性，可以进行体外ACDD检验，例如，美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述的检验。这些检验可用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。另外可选地，或者额外地，在体内，例如在动物模型中评价所关注分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.，PNAS USA 95：652-656(1998)中所公开的动物模型中进行评价。
“效应细胞”，优选人效应细胞，是表达一种或多种FcR并发挥效应子功能的白血球。优选地，细胞表达至少FcyRm，并发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白血球的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和MNK细胞。效应细胞可以分离自天然来源，例如，血液。
用于产生抗体(包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性和杂缀合物(heteroconjugate)抗体)的技术是本领域已知的，其中一些例示如下。
1)多克隆抗体
多克隆抗体通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关的抗原和佐剂在动物体内产生。可有用的是，使用双官能性或衍生剂，例如马来酰亚胺苯磺酰琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐，将相关抗原与在要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质缀合，上述蛋白质例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成海藻糖二分支霉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate))。本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下选择免疫方案。
例如，通过将蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积弗氏完全佐剂合并，并将溶液在多个部位皮内注射，可以针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物对动物进行免疫。1个月后，通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5至1/10原始量的肽或缀合物对动物进行加强。7-14天后，对动物进行采血，并检验血清的抗体效价。对动物进行加强，直至达到效价平台。缀合物也可以在重组细胞培养中作为蛋白质融合物产生。另外，聚结剂例如明矾适合用于增强免疫应答。但是，在优选的方面，本发明涉及用于产生(或制备)针对膜结合形式的CD73蛋白的抗体的方法，该方法包括：i)用包含源自癌细胞的膜结合形式的CD73的细胞外囊泡(EV)对非人哺乳动物进行免疫；和ii)分离步骤(i)中获得的抗体。进一步优选地，上述用于制备抗体的方法还包括以下步骤：确定步骤(ii)中获得的抗体是否表现出根据以下第1项的特性中的一种或多种。
术语“免疫”是指以下的步骤或多个步骤：将一种或多种抗原(在本发明的情形中为膜结合形式的CD73蛋白或者其一种或多种免疫原性片段)给予非人动物，使得可以在动物中产生抗体。
术语“抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，是指在用其进行免疫的动物、优选非人动物中诱导免疫应答(优选抗体应答)的分子或物质(即，抗原在动物体内是“免疫原性的”)。在本发明的情形中，当针对膜结合形式的CD73蛋白产生抗体时，抗原优选是膜结合形式的CD73蛋白。优选地，用于对非人动物进行免疫的抗原是纯化的抗原。“纯化”的抗原是已经进行过一个或多个纯化流程的抗原。纯化的抗原可以是“同质”的，其用在本文中是指组合物，基于组合物的总重量，该组合物包含至少约70重量％至约100重量％的所关注的抗原，优选至少约80重量％至约100重量％的所关注的抗原。
通常，免疫包括将抗原或多种抗原注射到非人动物中。免疫可以包括一次或多次给予抗原或多种抗原。
具体地，非人动物优选地用任选地与佐剂混合的所述多肽(抗原)免疫至少2次，更优选3次。“佐剂”是非特异性免疫应答刺激剂。佐剂可以是包含以下组分中任一种或两种的组合物的形式：(a)设计成形成保护(多种)抗原不受迅速代谢的储剂的物质(例如，矿物油、明矾、氢氧化铝、脂质体或表面活性剂(例如普朗尼克多元醇(pluronic polyol)))；和(b)非特异性刺激进行免疫的宿主动物的免疫应答(例如，通过增加其中淋巴因子的水平)的物质。
用于增加淋巴因子水平的分子的例子包括脂多糖(LPS)或其脂质liA部分；百日咳博代氏杆菌(Bordetalla pertussis)；百日咳毒素；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；和胞壁酰二肽(MDP)。佐剂的例子包括弗氏佐剂(任选地包含杀灭的结核分枝杆菌；完全弗氏佐剂)；氢氧化铝佐剂；和单磷酰脂质A-合成海藻糖二分支霉菌酸酯(MPL-TDM)。
本文中要进行免疫的“非人动物”优选是啮齿动物。“啮齿动物”是属于胎盘哺乳动物啮齿目的动物。啮齿动物的例子包括小鼠、大鼠、豚鼠、松鼠、仓鼠、雪貂等，小鼠是优选的根据此处的方法进行免疫的啮齿动物。在此可以进行免疫的其他非人动物包括非人灵长类动物例如旧大陆猴(例如狒狒或猕猴，包括恒河猴和食蟹猴；参见美国专利5,658,570)；鸟(例如鸡)；大鼠；山羊；绵阳；牛；马；猪；驴；犬等。
可以通过优选方法获得的抗体是多克隆抗体或多克隆血清(例如，可获自啮齿动物，更优选获自兔、山羊或绵羊)，或者，如果产生抗体的细胞分离自非人动物，则可以产生如本领域通常知晓并在此说明的单克隆抗体(例如，可获自啮齿动物，更优选获自小鼠、大鼠或绵羊)。优选地，将动物用包含两种或更多种不同抗原的混合物的组合物进行免疫；并且步骤(b)包括将来自经免疫的动物的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，以生成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
术语“免疫细胞”是指能够产生抗体的细胞。在此特别关注的免疫细胞是例如源自脾、外周血淋巴细胞(PBL)、淋巴结、腹股沟结、派尔集合淋巴结(Peyers patch)、扁桃体、骨髓、脐带血、胸腔积液和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴样细胞。
“筛选”是指使一种或多种单克隆抗体(例如，纯化的抗体和/或包含抗体的杂交瘤培养物上清液)进行一种或多种定性和/或定量地确定抗体结合所关注抗原的能力的检验。
“免疫检验”是指确定抗体与抗原结合的检验，其中在检验的某个阶段，将抗体或抗原之一或二者任选地吸附在固相上(即“免疫吸附”检验)。这类检验的例子包括ELISA、放射免疫检验(RIA)、和FACS检验。根据上文所述，本发明因此提供可通过前述用于产生抗体的方法，即如前文所述通过对非人动物进行免疫获得的单克隆或多克隆抗体。因此，当在本文中使用时，术语“抗体”还包括可通过用于产生针对膜结合形式的CD73、优选人的膜结合形式的CD73的抗体的方法获得的抗体(单克隆或多克隆的)。
2)单克隆抗体：
“单克隆抗体”获自基本上同质的抗体的群落，基本上同质的抗体即构成该群落的单个抗体除可以少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外相同。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征并不是分离的抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)产生。
在杂交瘤方法中，如本文上文所述对小鼠或其他合适的宿主动物例如仓鼠进行免疫，以激发产生或能够产生将会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。
另外可选地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
免疫剂典型地包括免疫原性蛋白质或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，如果需要非人哺乳动物来源，使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press(1986)，pp.59-103。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用小鼠或大鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并生长，上述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地包括防止HGPRT-缺陷细胞生长的物质次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。
优选的永生化骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的抗体生成细胞高水平地稳定产生抗体并且对例如HAT培养基的培养基敏感的细胞。其中，优选鼠科动物骨髓瘤细胞系，例如可获自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA的源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系；和可获自American Type Culture Collection，Manassus，Virginia USA的SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。另外还有描述人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系用来产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
对其中生长杂交瘤细胞的培养基进行针对抗原产生单克隆抗体的检验。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或者通过体外结合检验例如放射性免疫检验(RIA)或酶联免疫吸附检验(ELISA)测定。
可以对其中培养杂交瘤细胞的培养基进行针对所需抗原的单克隆抗体的存在的检验。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或者通过体外结合检验例如放射性免疫检验(RIA)或酶联免疫吸附检验(ELISA)测定。这些技术和检验是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson et al.，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析测定。
识别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过限制稀释过程进行亚克隆，并通过标准方法生长(Goding，同上)。用于该目的的合适培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中在体内生长为腹水瘤。
亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规的免疫球蛋白纯化方法(例如，如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析或亲和力色谱)从培养基、腹水或血清中适当地分离。
单克隆抗体还可以通过重组DNA方法产生，例如，美国专利No.4,816,567中所述的方法，如上文所述。编码单克隆抗体的DNA很容易使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠科动物抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这些DNA的优选来源。一经分离，DNA可以置于表达载体中，然后将其转染到否则便不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在这些重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括：Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)；和Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在进一步的实施方式中，抗体可以从使用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体库中分离。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体库分离鼠科动物和人抗体。随后的出版物描述了通过链替换(chain shuffling)产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.，Biotechnology，10：779-783(1992))，以及作为超大噬菌体库构建策略的组合感染和体内重组(Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代技术。
DNA也可以进行修饰，例如，通过人重链和轻链恒定结构域编码序列来置换同源性鼠科动物序列(美国专利No.4,816,567；Morrison，et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或者通过将全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。典型地，这些非免疫球蛋白多肽置换成抗体的恒定结构域，或者将其置换成抗体一个抗原结合位点的可变结构域，以产生二价嵌合抗体，该二价嵌合抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域熟知的。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达的方法。重链通常在Fc区中的任意位点处截短，以防止重链交联。另外可选地，可以将相关的半胱氨酸残基用另一氨基酸残基置换或将其缺失，以防止交联。体外方法也适合于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术进行抗体的消化，以产生其片段，特别是Fab片段。
还可以使用合成蛋白质化学中已知的方法体外制备嵌合或杂合抗体，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或者通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合用于该目的的试剂的例子包括亚胺基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺甲酯。
3)人源化抗体：
本发明的抗体还可以包括人源化或人抗体。人源化形式的非人(例如，鼠科动物)抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合亚序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补性决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR(其具有所需的特异性、亲和力和能力)的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基取代。
人源化抗体还可以包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体将会包含基本上全部的至少1个、典型地2个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体任选地还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地，包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
用于对非人抗体进行人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常叫做“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以遵照Winter及同事；Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988)的方法进行，或者通过将啮齿动物的CDR或CDR序列置换成对应的人抗体序列。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被对应的来自非人物种的序列置换。实际上，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基并可能有一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。
产生人源化抗体要使用的重链和轻链的人可变结构域的选择非常重要，以便降低抗原性。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库进行啮齿动物抗体可变结构域序列的筛选。然后取与啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)。Sims et al.，J.Immunol.)151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987)。
另一方法使用源自重链或轻链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可以用于若干种不同的人源化抗体。Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，151：2623(1993)。
进一步重要的是，抗体在保留对抗原的高亲和力和其他有利生物特性的情况下加以人源化。为实现这一目的，根据优选的方法，使用亲本和人源化序列的三维模型，通过对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是市售的，并且是本领域技术人员熟知的。描绘和显示所选择候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过该方式，可以从受体和输入序列选择并组合FR残基，使得所需的抗体特性例如对目标抗原的亲和力增加得以实现。通常，CDR残基直接并且最显著地参与影响抗原结合。
预计有许多种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是例如Fab的抗体片段，其任选地与一种或多种细胞毒性药剂缀合，以产生免疫缀合物。
另外可选地，人源化抗体可以是完整抗体，例如完整的IgG1抗体。
4)人抗体：
作为人源化的替代选择，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物(例如小鼠)，其能够在经免疫时，在不存在内源性免疫球蛋白生成的情况下产生人抗体的完整组集。例如，已经描述道，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这些种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列(gene array)将会导致在经抗原激发时产生人抗体。参见，例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immun.，7：33(1993)；美国专利No.5,591,669和WO97/17852。
另外可选地，可以使用噬菌体展示技术，从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因组集，在体外产生人抗体和抗体片段。McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)。根据该技术，将抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体例如M13的主要或次要外壳蛋白质基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致选择出编码表现这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了B-细胞的一些特性。噬菌体展示可以通过许多种格式进行，其综述参见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Curr.Opin Struct.Biol.3：564-571(1993)。若干来源的V-基因链段可以用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从源自经免疫小鼠的脾脏的V基因随机组合小型文库中分离出抗噁唑酮抗体的多样化阵列。可以构建来自未经免疫的人供体的V基因的组集，并可以基本上遵循以下文献所述的技术分离出针对抗原(包括自抗原)的多样化阵列的抗体：Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)。另外参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
Cole et al.和Boerner et al.的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole etal.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boerneret al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991))。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中产生，上述动物例如其中内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全失活的小鼠。一经激发，观察到人抗体的产生，该抗体在所有方面密切地类似于人体内发现的抗体，包括基因重排、组装和抗体组集。该方法描述于，例如，美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及如下科学出版物：Marks etal.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。最后，人抗体还可以通过活化的B细胞在体外产生(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
5)抗体片段：
在某些情形中，使用抗体片段、而不是整个抗体具有若干优势。更小的片段大小允许快速的清除，并且可以导致进入实体瘤的改进。
已经开发出多种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化产生(参见，例如，Morimoto et al.，J Biochem Biophys.Method.24：107-117(1992)；和Brennan et al.，Science 229：81(1985))。但是，这些片段现在可以通过重组宿主细胞来直接产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全部都可以在大肠杆菌中表达并由其分泌，从而允许容易地产生大量的这些片段。
抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离。
另外可选地，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌回收，并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter et aL，BiolTechnology 10：163-167(1992))。
根据另一方法，F(ab′)2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。体内半衰期增加的Fab和F(ab′)2描述于美国专利No.5,869,046中。在其他实施方式中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)；参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894和美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述。这些线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
6)双特异性和多特异性抗体：
双特异性抗体(BsAb)是对于至少两种不同表位具有结合特异性的抗体，上述表位包括相同或另一蛋白质上的表位。另外可选地，一臂(arm)可以装备成结合目标抗原，另一臂可以与结合白血球上的触发分子(例如T-细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)(例如FcyR1(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRin(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中并定位于目标抗原表达细胞。这些抗体可以源自全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
双特异性抗体还可以用于将细胞毒性药剂定位于表达目标抗原的细胞。这些抗体具有结合所需抗原的一臂和结合细胞毒性药剂(例如氨甲蝶呤)的另一臂。
用于产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的全长双特异性抗体的产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性。Millstein etal.，Nature，305：537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机种类，这些杂交瘤(四元杂交瘤(quadroma))产生潜在的10种不同抗体分子的混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。纯化正确的分子通常通过亲和力色谱步骤进行，是相当繁重的，并且产物收率很低。类似的方法公开于WO 93/08829和Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选是与包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选地，在至少一个融合物中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果需要的话)的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当构建体中使用的三个多肽链的比率不等提供最优的产率时，这为在实施方式中调节三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，当至少两个多肽链以等比率表达导致高的产率时，或者当比率不是特别重要时，可以将两种或全部三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在该方法的优选实施方式中，双特异性抗体由以下组成：一臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链；和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。经发现，这种不对称结构有利于将所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链仅存在于双特异性分子的一半中，这便提供了易于分离的方式。该方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的进一步的细节参见，例如，Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
根据WO 96/27011或US 5,731,168中所述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可以改造成使从重组细胞培养物回收的杂二聚体的百分比最大。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过将大的氨基酸侧链用较小者(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代，在第二抗体分子的界面上产生大小与大的侧链相同或类似的补偿性“腔”。这提供了用于增加杂二聚体相对于其他不需要的最终产物例如同二聚体的收率的机制。
用于由抗体片段产生双特异性抗体的技术已经描述于文献中。例如，双特异性抗体可以使用化学连接来制备。Brennan et al.，Science 229：81(1985)描述了其中将完整的抗体蛋白水解切割以产生F(ab′)2片段的方法。将这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原，以使邻近的二硫醇稳定化，并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物中的一种恢复成Fab′-TNB衍生物，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用于酶的选择性固定化的试剂。
Fab′片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联，形成双特异性抗体。Shalaby etal.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每个Fab′片段分别从大肠杆菌分泌，并在体外进行定向化学偶联，以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺癌靶标的裂解活性。
另外已经描述了许多种用于直接从重组细胞培养物产生并分离二价抗体片段的技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了二价杂二聚体。Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。
通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体杂二聚体。Hollinger etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双体抗体(diabody)”技术提供了另外可选的用于产生双特异性/二价抗体片段的机制。片段包含通过连接子与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，上述连接子短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一片段上的互补性VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。另外已报道有另一种用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来产生双特异性/二价抗体片段的策略。参见Gruber et al.，J.Imnzunol.，152：5368(1994)。
预计有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
示例性双特异性抗体可以结合指定分子上的两个不同表位。另外可选地，抗-蛋白质臂可以与结合白血球上的触发分子例如T-细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或者IgG的Fc受体(FcyR)(例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中于表达特定蛋白质的细胞。
另一种所关注的双特异性抗体结合所关注的蛋白质，并进一步结合人血清白蛋白。
Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双体抗体”技术提供了另外可选的用于产生双特异性抗体片段的机制。片段包含通过连接子与VL连接的VH，上述连接子短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一片段上的互补性VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。另外已报道有另一种用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来产生双特异性抗体片段的策略。参见Gruber et al.，J.Imnzunol.，152：5368(1994)。
预计有多于两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
比起二价抗体，多价抗体可以被表达抗体所结合的抗原的细胞更快地内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有3个或更多个抗原结合位点的(IgM类别以外的)多价抗体(例如，四价抗体)，其可以容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而产生。多价抗体可以包含二聚结构域和3个或更多个抗原结合位点。优选的二聚结构域包含Fc区或铰链区(或者由其组成)。在该情况下，抗体将会包含Fc区以及Fc区氨基端的3个或更多个抗原结合位点。在此优选的多价抗体包括3至大约8个、但优选4个抗原结合位点(或者由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(优选2个多肽链)，其中多肽链包含2个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1(X1n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一个多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CHI-柔性连接子-VH-CHI-Fc区链；或VH-CHI-VH-CHI-Fc区链。在此多价抗体优选进一步包含至少2个(优选4个)轻链可变结构域多肽。在此多价抗体可以包含，例如，大约2至大约8个轻链可变结构域多肽。在此预计的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并任选地进一步包含CL结构域。
7)杂缀合物抗体：
杂缀合物抗体也在本发明的范围内。
杂缀合物抗体由2个共价连接的抗体组成。例如，杂缀合物中的抗体之一可以与亲和素偶联，另一个与生物素偶联。预计抗体可以使用合成蛋白质化学中已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适用于该目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯以及例如美国专利No.4,676,980中公开的试剂。杂缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法产生。合适的交联剂连同大量交联技术是本领域熟知的，公开于美国专利No.4,676,980中。
对于其他的抗体产生技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，eds.Harlowet al.，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明并无需限定于任何具体来源、产生方法或其他特定性质的抗体。
本发明的抗体优选是“分离”的抗体。当用于描述本文所述的抗体时，“分离”是指抗体已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收。优选地，分离的抗体不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分，例如由重组转染细胞造成的污染组分，是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，其可以包括酶、激素和其他的蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方式中，抗体将会纯化至(1)通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个N-端或内部氨基酸序列残基的程度，或(2)在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色通过SDS-PAGE的均一性。但是，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
预计有本文所述CD73抗体的氨基酸序列修饰。例如，提高抗体的结合亲和力和/或其他生物特性可以是合意的。通过将适当的核苷酸变化引入到CD73抗体核酸中，或者通过肽合成，制备CD73抗体的氨基酸序列变体。
这些修饰包括，例如，CD73抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。进行缺失、插入和置换的任意组合，以达到最终的构建体，只要最终的构建体具备所需的特性即可。氨基酸的变化也可以改变CD73抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
可用于识别CD73抗体的作为优选的诱变位置的某些残基或区域的方法被称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所述。
在此，识别CD73抗体内的残基或目标残基的基团(例如，带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys和glu)，并将其用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与表位的相互作用。
那些对置换表现出功能敏感性的氨基酸位置则通过在置换的位点处引入进一步或其他的变异而完善。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的，突变自身的性质并无需预定。例如，为了分析指定位点处突变的性能，在目标密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，筛选表达的具有所需活性的CD73抗体变体。
氨基酸序列插入包括长度范围从1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基到含有成百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。CD73抗体分子的插入变体包括在抗体的N-或C-端与酶的融合物或者与增加抗体血清半衰期的多肽的融合物。
另一种类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体在CD73抗体分子中具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被不同的残基所取代。对于置换诱变最关注的位点包括重链和/或轻链的CDR，特别是高变区，但是也预计有重链和/或轻链中的FR变化。
例如，如果CDR序列包括6个氨基酸，预计这些氨基酸中有1、2或3个被置换。类似地，如果CDR序列包括15个氨基酸，预计这些氨基酸中有1、2、3、4、5或6个被置换。
通常，如果一个或多个或全部的重链和/或轻链CDR中氨基酸被置换，优选地，随后得到的“置换”序列与“原始”CDR序列的同一性为至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)，更优选65％，再更优选70％，特别优选75％，更特别优选80％。这意味着，与“置换”序列的同一性程度如何取决于CDR的长度。例如，具有5个氨基酸的CDR优选地与其置换序列的同一性为80％，以便具有至少一个氨基酸被置换。因此，CD73抗体的CDR与其置换序列可以具有不同的同一性程度，例如，CDRL1可以具有80％，而CDRL3可以具有90％。
优选的置换(或取代)是保守置换。但是，预计有任意置换(包括非保守置换，或者一个或多个下表1中所列的示例性置换)，只要CD73抗体保留其特异性抑制膜结合形式的CD73蛋白的能力和/或其CDR与随后置换的序列具有同一性(与“原始”CDR序列的同一性为至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)，更优选65％，再更优选70％，特别优选75％，更特别优选80％)即可。
保守置换在表1中显示于表头“优选置换”下。如果这些置换导致生物活性的变化，则可以引入表1中称作“示例性置换”的或者如下文中参考氨基酸类别进一步描述的更加大的变化，并对产物进行所需特性的筛选。
表1.氨基酸置换
抗体生物特性的实质性改变通过选择在其保持以下的作用方面显著不同的置换进行：(a)置换区中多肽骨架的结构，例如，折叠或螺旋构象；(b)目标位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。天然发生的残基基于常见的侧链性质分成以下类别：(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性的：cys、ser、thr；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的：asn、gin、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香性的：trp、tyr、phe。
非保守置换将会引起将这些类别之一的成员交换成另一类别。任何不参与保持CD73抗体适当构象的半胱氨酸残基也可以被置换，通常用丝氨酸置换，以提高分子的氧化稳定性，并防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可以添加到抗体上，以提高其稳定性(特别是抗体为例如Fv片段的抗体片段时)。
置换变体特别优选的类型包括置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体将会相对于亲本抗体(从该亲本抗体产生用于进一步开发的所得变体)具有改善的生物特性。用于产生这些置换变体的方便方式包括使用噬菌体展示进行亲和力成熟。简言之，将若干高变区位点(例如6-7个位点)突变成在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的抗体变体以来自丝状噬菌体颗粒的单价融合物的形式，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物展示。
然后对噬菌体展示的变体进行其生物活性(例如结合亲和力)的筛选，如本文所公开。为了识别用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以识别显著地有助于抗原结合的高变区残基。另外可选地，或者额外地，可有益的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以识别抗体和例如人CD73之间的接触点。这些接触的残基和邻近的残基是用于根据本文详述的技术进行置换的候选物。一经产生这些变体，对系列变体进行如本文所述的筛选，可以选择在一种或多种相关检验中具有优异特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化方式。改变是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸)是碳水化合物部分与天冬氨酸侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，上述羟基氨基酸最常见为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸的序列，使得其含有上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)，从而方便地完成抗体上糖基化位点的添加。通过在原始的抗体序列上加入或者置换成一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)，也可以进行改变。
在此预计有抗体的其他修饰。例如，抗体可以与许多种非蛋白质性聚合物中的一种连接，上述聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体也可以包埋在微胶囊中，例如，通过凝聚技术或者通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊，包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者包埋在微乳液中。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
本文公开的CD73抗体还可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的成分通常以双层的形成排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如，如以下文献中所述：Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的W097/38731。循环时间提高的脂质体公开于美国专利No.5,013,556中。具体可用的脂质体可以通过反相蒸发法以脂质组合物产生，脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。将脂质体通过具有给定孔径的滤器挤出，得到具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以与Martin etal.J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述的脂质体经由二硫化物交换反应缀合。脂质体内任选地含有化疗剂。参见Gabizon et al.J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
当使用重组技术时，抗体可以产生在细胞内，在周质间隙中，或者直接分泌在培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如，通过离心或超滤除去颗粒碎片——宿主细胞或裂解的片段。Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。
由细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析和亲和力色谱来纯化，亲和力色谱是优选的纯化技术。蛋白质A用作亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可以用于纯化抗体(Lindmarket al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对于所有的小鼠同种型以及对于人γ3，推荐蛋白质G(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。
当根据本发明使用时，术语“位置”是指氨基酸在所说明的氨基酸序列中的位置。如本文所使用，术语“对应”还包括不仅仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量决定的位置。
可以被置换的根据本发明的指定氨基酸的位置可能出于CD73多肽中别处的氨基酸的缺失或添加而变。
因此，根据本发明的“对应的位置”应当理解成，氨基酸可以在示出的数字上不同，但仍可以具有类似的相邻氨基酸。术语“对应的位置”还包括可以被交换、缺失或添加的所述氨基酸。
为了确定指定CD73氨基酸序列中的氨基酸残基是否与氨基酸序列SEQ ID NO：9或13中的某一位置对应，本领域技术人员可以使用本领域熟知的方式和方法，例如，人工或通过使用计算机程序的比对，上述计算机程序例如BLAST2.0(代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或者适于生成序列比对的任何其他合适的程序。
如本文所示，术语“％同一性”是指当使用任选的序列比对(如可获自www.clustal.org的ClustalW或X技术或者等同的技术所示例)时序列内对应位置处相同氨基酸序列的百分比。例如，在CDR比对的情形中，SEQ ID NOs.9-16所示的每个CDR(分别来自重链和轻链可变区)分别用作重链或轻链可变区的所关注CDR序列的参考序列，例如，SEQID NO.10的H-CDR1与所关注的H-CDR1比对。因此，比对两个序列(参考序列和所关注的序列)，识别两个序列之间相同的氨基酸残基，将相同氨基酸的总数量分别除以SEQ ID NO.9-16的氨基酸的总数量(氨基酸长度)，其取决于比对的是H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2还是L-CDR3。该除法的结果是百分比数值，即，同一性值/程度百分比。
在进一方面，本发明涉及编码本文所述的抗体或其抗原结合部分的核酸。本发明还提供编码本文所述抗体的核酸序列。如本文所用，术语“核酸”或“核苷酸序列”是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA(mRNA)、其组合或者包含DNA和RNA的杂合分子。核酸可以是双链的或单链的，并且可以同时含有双链的和单链的片段。最优选的是双链DNA分子。根据本发明，编码本发明抗体的核酸序列包括编码抗体的赋予根据本发明的抗体特异性结合特性的至少那些部分的核苷酸。优选地，根据本发明的核酸序列编码可变区，优选至少本文所述的CDR。
所述核酸分子优选地包含在载体中，载体优选地包含在宿主细胞中。所述宿主细胞能够表达抗体或其抗原结合部分。出于该目的，核酸分子与控制序列可操作连接。
如本文所用，术语“宿主细胞”是要指编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸通过转化、转染等的方式引入其中的细胞。应当理解到，该术语不仅指特定的受试细胞，而且指该细胞的子代或潜在的子代。由于在后代中会因突变或环境影响而可能发生某些修饰，这些子代实际上可以与亲本细胞不相同，但是仍包括在如本文所用的术语的范围内。
如本文所用，术语“表达”包括任何涉及产生抗体或其抗原结合部分的步骤，其包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操作子序列和核糖体结合位点。真核细胞已知使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作连接的”。例如，用于前序列或分泌前导序列的DNA与用于多肽的DNA可操作连接，如果其表达成参与多肽分泌的前蛋白质；启动子或增强子与编码序列可操作连接，如果其影响序列的转录；或者核糖体结合位点与编码序列可操作连接，如果其位置有利于翻译。通常，“可操作连接”是指被连接的DNA序列是连续的，在分泌前导序列的情形中，被连接的DNA序列是连续的并且处于读取阶段。但是，增强子不必要是连续的。连接通过在方便的限制位点处连接而实现。如果不存在这些位点，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸接合物或连接子。
合适的宿主细胞包括原核生物和真核生物宿主细胞，其包括酵母、真菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
抗体或其抗原结合部分可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。
表达之后，抗体或其抗原结合部分、优选抗体从可溶部分中的大肠杆菌细胞浆料中分离，并可以取决于同种型将其通过例如蛋白质A或G柱纯化。最终的分离可以类似于用于纯化例如CHO细胞中表达的抗体的方法而进行。除原核生物以外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是适合用于本发明的抗体或其抗原结合部分的克隆或表达宿主。
在低等真核宿主微生物当中，最常用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母。但是，有若干种其他的属、种和株常常是可获得的，并可用于此，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主例如，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、K.wickeramii(ATCC 24178)、K.waltii(ATCC56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗体或其抗原结合部分、优选抗体的合适的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经识别出来自宿主例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的许多种杆状病毒菌株和变体以及相应的容许的昆虫宿主细胞。用于转染的许多种病毒株是公众可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，并且根据本发明，这些病毒可以用作本文的病毒，特别是用于草地夜蛾细胞的转染。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见，例如，Hiatt et al.，Nature(1989)342：76-78；Owen et al.(1992)Bio/Technology 10：790-794；Artsaenko et al.(1995)The Plant J 8：745-750；和Fecker etal.(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。
但是，脊椎动物细胞受到最多的关注，培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的例子有SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293或293细胞，亚克隆用于在悬浮培养中生长，Graham etal.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Matheret al.，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(HepG2)。
当使用重组技术时，抗体或其抗原结合部分可以产生在细胞内，在周质间隙中，或者直接分泌在培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如，通过离心或超滤除去颗粒碎片——宿主细胞或裂解的片段。Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。简言之，将细胞浆料在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)的存在下解冻约30min。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售的蛋白质浓缩滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)对来自这些表达系统的上清液进行浓缩。先前步骤中的任一步可以包括例如PMSF的蛋白酶抑制剂，以抑制蛋白水解，并可以包括抗生素，以防止外来污染物的生长。
由宿主细胞制备的抗体或其抗原结合部分、优选抗体可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析和亲和力色谱来纯化，亲和力色谱是优选的纯化技术。
蛋白质A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark etal.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对于所有的小鼠同种型以及对于人γ3，推荐蛋白质G(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和力色谱要连接的基质最常用琼脂糖，但是其他基质也是可用的。比起用琼脂糖可以实现的，机械上稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，可使用Bakerbond ABXMresin(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)用于纯化。取决于要回收的抗体，也可使用其他用于蛋白质纯化的技术，例如，在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)色谱、聚焦层析(chromato-focusing)、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在另一方面，本发明提供用作诊断组合物的本发明的抗体或其抗原结合部分。因此，抗体或其抗原结合部分可以用于其抗原的诊断检验，例如，检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。
可以使用各种本领域已知的诊断检验技术，例如，竞争性结合检验、直接或间接夹心式检验和免疫沉淀检验，其以异源或同源相进行(Zola，Monoclonal Antibodies：AManual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)pp.147-158)。用于诊断检验的抗体或其抗原结合部分可以用可检测的部分标记。例如，抗体或其抗原结合部分可以用可检测的标志物修饰，上述标志物包括配体基团(例如生物素)、荧光团和发色团、放射性同位素、电子致密(electron-dense)试剂或酶。酶通过其活性检测。例如，辣根过氧化物酶通过其将四甲基联苯胺(TMB)转化成可用分光光度计定量的蓝色颜料的能力而检测。其他合适的结合配偶体包括生物素和亲和素、IgG和蛋白质A以及其他本领域已知的受体-配体对。
可检测的部分应当能够直接或间接地产生可检测的信号。例如，可检测的部分可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I，荧光或化学发光化合物，例如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明或荧光素，或者酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以使用本领域已知的任何用于将抗体与可检测的部分缀合的方法。
当给予受试者时，本发明的抗体或其抗原结合部分优选是组合物的形式。组合物优选地适合于制药用途和给予受试者。
因此，本发明的抗体或其抗原结合部分预计用于治疗。因此，本发明预计包含本文所述的抗体或其抗原结合部分的药物组合物(或药物)。
在再另一实施方式中，本发明提供治疗受试者的方法，该方法包括给予治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分，其中受试者具有癌症，例如，其中涉及CD73的癌症。
如本文所用，“癌症”是指以体内异常细胞不可控生长为特征的一大类疾病。不受调节的细胞分裂会导致形成恶性肿瘤或细胞，其侵入相邻组织，并可以通过淋巴系统或血流转移至身体的远部。
其生长可以使用本发明的抗体抑制的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。治疗的癌症的非限定性例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或肿瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括石棉诱导的癌症、病毒相关癌症(例如人乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)和源自两种主要血细胞谱系中任一种的血液恶性肿瘤(两种主要血细胞谱系即髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))，例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、成骨髓细胞性白血病(M1)、成骨髓细胞性白血病(M2；细胞成熟)、早幼粒细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(M4或M4变体，嗜酸性粒细胞增多[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、成巨核细胞性白血病(M7)、分离的粒细胞肉瘤和绿色癌；淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞性淋巴瘤；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、移植后、淋巴增生性疾病、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴样谱系血液恶性肿瘤、急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样真菌病或塞扎里综合征)和具有Waldenstrom巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、郁积性骨髓瘤(也称为无痛性骨髓瘤)、单发性、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛发细胞淋巴瘤；骨髓系血液恶性肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎瘤、中枢和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤、淋巴样谱系血液恶性肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞疾病，例如T前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑形细胞类型；大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)，优选T细胞类型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形和成免疫细胞性亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文所述方法还可用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，用先前的免疫疗法例如用阻断CTLA-4或PD-1或PD-L1的抗体难治的癌症)和复发性癌症。
在优选的实施方式中，癌症选自：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
在进一步优选的实施方式中，癌症是白血病，并且选自：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
术语“受试者”旨在包括活的生物体。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的优选实施方式中，所述受试者是人。
术语“有效剂量”或“有效量”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为在已经患有疾病的患者中足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的量。有效用于该用途的量将取决于感染的严重程度和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
抗体或其抗原结合部分的适当剂量或治疗有效量将取决于待治疗的病状、病状的严重程度、先前疗法和患者的临床病史和对治疗剂的反应。可以根据主治医师的判断来调整适当的剂量，使得可以一次或在一系列给药中将其给予患者。药物组合物可以作为唯一的治疗剂施用或根据需要与另外的疗法联合施用。可与本发明的药物组合物联合应用的疗法的实例是抗-TNF-抗体、可溶TNF-受体、抗-GM-CSF-抗体、抗-IL-1-抗体、抗-IL-25-抗体、抗-IL-17-抗体和/或氨甲蝶呤。本发明的药物组合物特别适用于肠胃外给药，即皮下、肌内、静脉内、关节内和/或滑膜内给药。肠胃外给药可以通过弹丸式(bolus)注射或连续输注。
在优选的实施方式中，注射是局部或非全身注射，优选地，注射入优选膝盖、肩部、髋部、拇指、颞下颌关节或关节突关节、纤维环、髓核、髓核空间的滑膜、滑液空间、滑液或滑膜关节、软骨下区域、骨软骨缺损、关节内空间，椎间盘内(intradiscally)或椎间盘全盘(transdically)地。更优选地，注射是关节内注射，优选地注射入膝盖、肩部、髋部、拇指、颞下颌关节或关节突关节中。进一步优选地，关节内注射是关节内注射入关节突关节或颞下颌关节的滑液中。进一步优选的注射是注射入软骨下室或区域，或者注射入软骨或骨软骨缺损。还包括在用膜封闭缺损之前或之后注射入软骨或骨软骨缺损中。膜可以是，但不限于，骨膜或胶原。
在另一优选的实施方式中，膜是包含I型胶原、III型胶原、猪或大鼠I型胶原或III型胶原、透明质酸或其衍生物的膜。在注射制剂之前封闭缺陷的优点是减少制剂的稀释，或者增加制剂的活性成分的局部浓度。该膜还可以充当生物粘附剂用于细胞的附着。
如果药物组合物已经被冻干，则在给药之前首先将冻干的材料重构于适当的液体中。冻干的材料可以在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与蛋白质在冻干前所处的制剂相同的制剂中重构。
注射用药物组合物可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，其中加入防腐剂。此外，已经开发了若干种最近的药物递送方法，本发明的药物组合物适于使用这些新方法施用，例如Inject-Ease、Genject、注射器笔如Genen和无针装置如MediJector和BioJector。本发明的药物组合物也可以适用于有待发现的给药方法。另外参见Langer，1990，Science，249：1527-1533。
药物组合物也可以配制成贮存(depot)制剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下、植入韧带或肌腱、滑膜下或肌内)、滑膜下注射或肌内注射来给药。因此，例如，制剂可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂改性，或者改性成难溶衍生物，例如，改性成难溶盐。
药物组合物也可以是许多种用于给药的常规贮存形式，以提供反应性组合物。这些包括，例如，固体、半固体和液体剂型，例如液体溶液或悬液、浆液、凝胶、乳膏、香脂(balm)、乳液剂、洗剂、粉剂、喷雾剂、泡沫、糊剂、油膏、药膏(salve)、香脂和滴剂。
如果需要，药物组合物可以存在于小瓶、包装或分配器装置中，其可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂型。在一实施方式，分配器装置可以包括注射器，该注射器具有单一剂量的注射备用的液体制剂。注射器可以随附给药说明书。
药物组合物可以进一步包括额外的药学可接受的组分。其他药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如，如Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中所述，也可以包括在本文所述的蛋白质制剂中，只要它们不会不利地影响制剂的所需特性即可。如本文所用，“药学可接受的载体”是指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，其包括：额外的缓冲剂；防腐剂；助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；螯合剂，如EDTA；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；成盐的抗衡离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯基丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，例如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；和亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮。
本文所述的制剂在对其有需求的患者中用作药物组合物，用于治疗和/或预防本文所述的病理性医学状况。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。治疗包括将制剂施用于或给予身体、分离的组织或细胞(来自具有疾病/病症、疾病/病症的症状或者易患疾病/病症的倾向的患者)，目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、好转或影响疾病、疾病症状或易患疾病的倾向。
因此，本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含根据本发明的抗体或其片段或衍生物作为活性成分。所述药物组合物可以包含至少一种药学可接受的载体或佐剂或赋形剂。
抗体可以以本领域已知的或在普遍公认的药典中列出的药学可接受的组合物的形式提供，以用于动物，更特别地用于人类。
如果需要，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂，丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。
本发明的组合物可以配制成中性或盐的形式。
药学可接受的盐包括，但不限于，与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等形成的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙基胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
上述药物组合物可以用于治疗或预防或诊断任何疾病或病症，优选自身免疫性疾病，最优选以自身抗体的产生为特征的自身免疫性疾病。
给药的剂量和频率包括在术语“治疗有效”和“预防有效”中。给药的剂量和频率还将典型地根据每个患者的具体因素而不同，其取决于所给药的特定治疗剂或预防剂、疾病类型、给药途径以及患者的年龄、体重、反应和既往病史。合适的方案可以由本领域技术人员选择。如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以治疗或减轻疾病或病症、延缓疾病的发作或者在疾病的治疗或管理中提供任何治疗益处的治疗活性组分或药剂的量。
对于本发明涵盖的抗体，施用于患者的剂量通常为患者体重的0.0001mg/kg至100mg/kg。优选地，给药剂量为约15mg/kg。众所周知，人抗体在人体内的半衰期比来自其他物种的抗体长。因此，与来自其他物种的抗体的常规使用剂量相比，本发明的抗体或其片段或衍生物的给药剂量和频率可以降低。
用治疗或预防有效量的本发明的抗体或其片段或衍生物治疗受试者，可以包括单一治疗，或者优选地，可以包括一系列治疗。在优选的实施方式中，受试者可以用约0.1-30mg/kg体重范围内的本发明的抗体或其片段或衍生物治疗，每周一次，持续约1-10周，优选2-8周，更优选约3-7周。可以选择最有利的施用形式和方式，以最大程度地使待治疗的患者受益。
本发明的抗体或其片段或衍生物的给药方法包括，但不限于，肠胃外给药(例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在具体的实施方式中，将本发明的抗体肌肉内、静脉内或皮下给药。组合物可以通过任何方便的途径给药，例如，通过输注或弹丸式注射、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起给药。给药可以是全身的或局部的。另外，还可以使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及通过具有雾化剂的制剂。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”是指给予受试者治疗有效量的根据本发明的药物组合物。“治疗有效量”是指足以治疗或减轻疾病或病症、延迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗益处的药物组合物或抗体的量。
如本文所用，术语“预防”是指药剂用于预防疾病或病症的发作的用途。“预防有效量”定义了足以预防疾病发作或复发的活性成分或药剂的量。
如本文所用，术语“病症”和“疾病”可互换使用，以指代受试者的病状。特别地，术语“癌症”可以与术语“肿瘤”可互换地使用。
而且，本发明的抗体可以用于诊断目的，以检测、诊断或监测疾病或病症，特别是癌症和癌症相关疾病。使用本文所述或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，根据本发明的抗体或其片段或衍生物可以用于检验生物样品中的CD73水平(例如，参见Jalkanen et al.，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen et al.，1987，J.Cell.Biol.105：3087-3096)。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫检验，例如酶联免疫吸附检验(ELISA)和放射免疫检验(RIA)。
因此，本发明还涉及包含本发明的抗体的诊断组合物。
如本文所用，术语“诊断”是指本发明的抗体用于诊断癌症或相关疾病中膜结合形式的CD73的存在的任何用途。
“对治疗有需求”者包括已经患有疾病者，以及要预防该疾病者。术语“疾病”是将从用本文所述的蛋白质制剂的治疗中受益的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所关注疾病的那些病理状况。本文要治疗的疾病的非限制性实例包括退行性疾病，骨骼和/或软骨和/或关节软骨缺损，免疫疾病，优选关节、骨骼或软骨组织的慢性炎症，例如关节炎(包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎)和脊椎疾病(例如椎间盘退变疾病)。在优选的实施方式中，脊柱疾病是特发性腰痛、椎间盘突出、椎间盘内破裂症或椎间盘裂缝、神经根病、椎管狭窄、髓核突出引起的坐骨神经痛、坐骨神经痛、特发性脊柱侧凸或脊髓病。
另外预计本发明的抗体或其抗原结合部分与适合于治疗癌症的药物一起施用。“一起”是指将抗体或其抗原结合部分在第二药物之前、与第二药物同时或者在第二药物之后给药。适合于治疗癌症的药物是一种或多种化疗剂，优选地所述化疗剂是阿霉素。
在本发明的另一实施方式中，提供含有抗体或其抗原结合部分的制品和试剂盒，其可以用于，例如，上述的治疗或非治疗应用。制品包括带有标签的容器。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶和试管。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器装有组合物，该组合物包含对治疗或非治疗应用有效的活性药剂，例如如上文所述。组合物中的活性药剂是抗体或其抗原结合部分。容器上的标签指示该组合物用于特定的疗法或非治疗性应用，还可以标示用于例如上文所述的体内或体外用途的说明书。
本发明的试剂盒通常将包括上述容器和一个或多个包括从商业和用户角度而言所需的材料的其他容器，上述材料包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，同时抑制膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，同时结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，同时结合膜结合形式的CD73蛋白并特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，同时特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，同时基本上不抑制所述可溶形式的CD73蛋白，同时抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，同时基本上不抑制所述可溶形式的CD73蛋白，同时特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够选择性抑制膜结合形式的CD73的酶活性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够区分膜结合形式的CD73蛋白和可溶形式的CD73蛋白，优选地所述区分是膜结合形式的CD73的酶活性的特异性抑制。
在一些方面，例如，与可溶形式的CD73蛋白的酶活性相比较，抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够表现出对膜结合形式的CD73蛋白的酶活性的抑制优先性。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分抑制CD73蛋白的酶活性EC3.1.3.5。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够增加混合淋巴细胞反应中TNFα(肿瘤坏死因子α)的释放。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分能够增加IFN-γ(干扰素γ)的释放。
在本发明一些方面，膜结合形式的CD73蛋白位于癌细胞上或者源自所述癌细胞的细胞外囊泡(EV)上。
在本发明一些方面，癌细胞是人癌细胞。
在本发明一些方面，本发明的抗体是单克隆抗体。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：9所示的VH区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是VH区多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：10所示的H-CDR1多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是H-CDR1多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：11所示的H-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是H-CDR2多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：12所示的H-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，所述多肽是H-CDR3多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：13所示的VL区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是VL区多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：14所示的L-CDR1区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR1多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：15所示的L-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR2多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：16所示的L-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR3多肽。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H31对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H42对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H52A对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H60对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H82A对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H82B对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H82C对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ IDNO：9中的Kabat位置H86对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100A对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100B对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100C对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100D对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100E对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100F对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H100G对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含在与SEQ ID NO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQID NO：9中的Kabat位置H104对应。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含以下重链可变区多肽：在与SEQ ID NO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQ ID NO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D；在与SEQ ID NO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S；在与SEQ ID NO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L；在与SEQ ID NO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E；在与SEQ ID NO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQID NO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQ ID NO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQID NO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含本文所述的多肽中的一个或多个，其使用SEQ ID NO：9的编号。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含本文所述的多肽中的一个或多个，其使用本文所述的Kabat编号。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分包含本文所述的多肽中的一个或多个和一个或多个或全部本文所述的特定氨基酸(例如，本文所述的不寻常的氨基酸残基)。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：10所示的H-CDR1。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：11所示的H-CDR2。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：12所示的H-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：10和11所示的H-CDR1和H-CDR2。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：10和12所示的H-CDR1和H-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：11和12所示的H-CDR2和H-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：10、11和12所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：14所示的L-CDR1。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：15所示的L-CDR2。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：16所示的L-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：14和15所示的L-CDR1和L-CDR2。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：14和16所示的L-CDR1和L-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：15和16所示的L-CDR2和L-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：14、15和16所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：10、11和12所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，在其轻链可变区中包含SEQ ID NO：14、15和16所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：9所示的VH区序列。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其轻链可变区中包含SEQID NO：13所示的VL区序列。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分在其重链可变区中包含SEQID NO：9所示的VH区序列，在其轻链可变区中包含SEQ ID NO：13所示的VL区序列。
在本发明一些方面，癌细胞选自：化疗耐受性癌细胞；转移性癌细胞；难治性癌细胞；复发性癌细胞。
在本发明一些方面，癌细胞源自选自以下的癌症：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
在本发明一些方面，癌症是选自以下的白血病：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人的。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体或其抗原结合部分与以下中的一种或多种偶联：标记基团；毒素；抗肿瘤药剂或药物；腺苷受体抑制剂，优选地所述腺苷受体抑制剂是A2A受体抑制剂(例如，如WO2016075176中所述)。
在一些方面，本发明的抗-CD73抗体可通过杂交瘤获得。
在一些方面，本发明的杂交瘤产生本发明的抗-CD73抗体。
在一些方面，本发明提供编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸。
在一些方面，核酸选自：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8。
在一些方面，本发明提供包含本发明的核酸分子中的至少一个的表达载体。
在一些方面，本发明提供包含与具有第二连接特异性的分子连接的本发明的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，其中所述第二结合特异性来自于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性。
在一些方面，本发明提供包含与第二药剂连接的前述各项中任一项的本发明的抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物，其中所述第二药剂与所述抗体或其抗原结合部分不同。
在一些方面，本发明提供包含本发明的载体和/或核酸的宿主细胞，优选地所述宿主细胞用所述载体和/或核酸转化，进一步优选地，所述宿主细胞是异源性宿主细胞(例如，与根据本发明的抗体或其抗原结合部分来源的生物体不同的宿主细胞，例如，所述宿主细胞不是褐家鼠(Rattus norvegicus)宿主细胞)，进一步最优选地，所述宿主细胞是非人动物宿主细胞，进一步最优选地，所述宿主细胞是分离的宿主细胞。
在一些方面，本发明提供包含CD73蛋白的细胞外囊泡(EV)。
在本发明一些方面，CD73蛋白是膜结合形式的CD73蛋白。
在一些方面，本发明的EV能够将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐。
在本发明一些方面，本发明的EV具有EC 3.1.3.5酶活性。
在本发明一些方面，本发明的EV源自癌细胞。
在本发明一些方面，膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73。
在本发明一些方面，膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73，其中所述人CD73选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
在一些方面，本发明提供包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞或细胞外囊泡(EV)的组合物。
在本发明一些方面，组合物是药物或诊断组合物。
在一些方面，本发明的药物组合物包含：i)根据本发明的本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞或细胞外囊泡(EV)；ii)一种或多种化疗剂，优选地所述化疗剂是阿霉素；和iii)任选地，药学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
在一些方面，本发明提供用于产生本发明的抗体或其抗原结合部分的方法，该方法包括：在允许所述抗体或其抗原结合部分合成的条件下培养本发明的宿主细胞；和从所述培养物中回收所述抗体或其抗原结合部分。
在一些方面，本发明提供用于对非人动物进行免疫的方法，该方法包括以下步骤：i)提供离体或体外癌细胞，优选地所述癌细胞是培养的人成胶质细胞瘤细胞，进一步优选地所述培养的人成胶质细胞瘤细胞是GBM20人成胶质细胞瘤细胞；ii)从所述癌细胞中分离细胞外囊泡(EV)，优选地所述分离包括离心(例如，超速离心)；和iii)用所述细胞外囊泡(EV)对所述非人动物进行免疫。
在本发明一些方面，根据本发明的用于对非人动物进行免疫的方法是用于针对膜结合形式的CD73对非人动物进行免疫的方法，其中细胞外囊泡(EV)包含所述膜结合形式的CD73。
在一些方面，本发明提供用于制备抗体的方法，该方法包括：i)用源自癌细胞的细胞外囊泡(EV)对所述非人哺乳动物进行免疫；ii)分离步骤(i)中得到的抗体。
在本发明一些方面，细胞外囊泡(EV)包含膜结合形式的CD73。
在一些方面，本发明提供用于制备本发明的抗体的方法，该方法包括：i)用本文所述的源自癌细胞的细胞外囊泡(EV)对非人哺乳动物进行免疫；ii)分离步骤(i)中得到的抗体；和iii)确定步骤(ii)中得到的抗体是否表现出根据本发明的特性中的一种或多种。
在一些方面，本发明提供用于制备杂交瘤的方法，所述方法包括：i)通过前述各项中任一项所定义的免疫方法对所述非人动物进行免疫；ii)从经免疫的非人动物中收集产生抗体的细胞，以将其与骨髓瘤细胞融合，并产生杂交瘤细胞；和iii)任选地，对杂交瘤细胞进行表征，优选地，所述表征包括所述杂交瘤细胞的免疫沉淀和/或质谱分析。
在一些方面，本发明提供降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平的方法，该方法包括使细胞与根据本发明的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物接触，使得腺苷水平得以降低(例如，如WO2016081748中所述)。
在一些方面，本发明提供在对其有需求的受试者中刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答的方法，该方法包括给予有效量的根据本发明的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得针对癌细胞的T细胞应答得以刺激(例如，如WO2016081748中所述)。
在一些方面，本发明提供刺激受试者中免疫应答的方法，该方法包括给予受试者根据本发明的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得受试者中的免疫应答得以刺激(例如，如WO2016081748中所述)。
在本发明一些方面，受试者具有表达CD73的癌细胞，并且针对肿瘤细胞的免疫应答得以刺激(例如，如WO2016081748中所述)。
在一些方面，本发明提供用于抑制受试者中表达CD73的癌细胞的生长的方法，该方法包括给予受试者根据本发明的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得受试者中肿瘤的生长得以抑制(例如，如WO2016081748中所述)。
在一些方面，本发明提供治疗癌症的方法，该方法包括给予对其有需求的受试者治疗有效量的根据本发明的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，以治疗癌症(例如，如WO2016081748中所述)。
在本发明一些方面，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明一些方面，膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73。
在本发明一些方面，本发明的方法是体外、离体或体内的方法或者其组合。
在一些方面，本发明提供试剂盒，该试剂盒包括：根据本发明的本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)；和任选地，使用所述试剂盒的说明书。
在一些方面，本发明提供根据本发明的本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，用于以下方法中的一种或多种：用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的方法；用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的方法，其中所述癌症耐受化疗，和/或是转移性癌症和/或难治性癌症和/或复发性癌症；用于监测癌症的发展和/或用于评价癌症治疗的疗效的方法(例如，如WO2004079013中所述)；用于针对抗癌活性筛选候选化合物的方法(例如，如WO2004079013中所述)；用于改变癌细胞对化疗的耐受性的方法；用于使癌细胞对化疗敏感的方法；用于诱导癌细胞中细胞凋亡的方法；用于改变癌症的免疫抑制能力的方法；用于降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平的方法；用于刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答的方法；用于刺激受试者中免疫应答的方法；用于抑制表达CD73的癌细胞的生长的方法；用于检测样品中人CD73的存在的方法；用于产生或制备抗体的方法；用于对非人动物进行免疫的方法；用于制备杂交瘤的方法；根据本发明的任意方法。
在一些方面，本发明提供根据本发明的本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的方法，其中所述癌症选自：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌，优选地，所述白血病选自：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一些方面，本发明提供根据本发明的本发明的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)用于以下中的一种或多种：用于治疗、减轻、预防或诊断癌症；用于治疗、减轻、预防或诊断癌症，其中所述癌症耐受化疗，和/或是转移性癌症和/或难治性癌症和/或复发性癌症；用于监测癌症的发展和/或用于评价癌症治疗的疗效；用于针对抗癌活性筛选候选化合物；用于改变癌细胞对化疗的耐受性；用于使癌细胞对化疗敏感；用于诱导癌细胞中的细胞凋亡；用于改变癌症的免疫抑制能力；用于降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平；用于刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答；用于刺激受试者中的免疫应答；用于抑制表达CD73的癌细胞的生长；用于检测样品中人CD73的存在；用于产生或制备抗体；用于对非人动物进行免疫；用于制备杂交瘤；用于根据本发明的方法。
在本发明一些方面，根据本发明的用途是体外、离体或体内的用途或者其组合。
本发明另外特征在于以下各项：
1.一种抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗-CD73抗体或其抗原结合部分表现出以下特性中的一种或多种：
i)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
ii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
iii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
iv)结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，其中特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
v)结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，其中基本上不抑制所述可溶形式的CD73蛋白，其中抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
vi)结合膜结合形式和可溶形式的CD73蛋白，其中基本上不抑制所述可溶形式的CD73蛋白，其中特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
vii)特异性抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
viii)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白；
ix)选择性抑制膜结合形式的CD73的酶活性；
x)区分膜结合形式的CD73蛋白和可溶形式的CD73蛋白；
xi)与可溶形式的CD73蛋白的酶活性相比较，具有对膜结合形式的CD73蛋白的酶活性的抑制优先性。
2.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述酶活性是EC3.1.3.5。
3.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分增加混合淋巴细胞反应中TNFα(肿瘤坏死因子α)的释放。
4.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述膜结合形式的CD73蛋白位于癌细胞上或者源自所述癌细胞的细胞外囊泡(EV)上。
5.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌细胞是人癌细胞。
6.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体。
7.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其包含以下多肽中的一个或多个：
i)与SEQ ID NO：9所示的VH区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是VH区多肽；
ii)与SEQ ID NO：10所示的H-CDR1多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是H-CDR1多肽；
iii)与SEQ ID NO：11所示的H-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是H-CDR2多肽；
iv)与SEQ ID NO：12所示的H-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，所述多肽是H-CDR3多肽；
v)与SEQ ID NO：13所示的VL区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是VL区多肽；
vi)与SEQ ID NO：14所示的L-CDR1区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR1多肽；
vii)与SEQ ID NO：15所示的L-CDR2区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR2多肽；
viii)与SEQ ID NO：16所示的L-CDR3区多肽序列的同一性为至少60％或更高(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的多肽，优选地，所述多肽是L-CDR3多肽；
ix)在与SEQ ID NO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H31对应；
x)在与SEQ ID NO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H42对应；
xi)在与SEQ ID NO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H52A对应；
xii)在与SEQ ID NO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H60对应；
xiii)在与SEQ ID NO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82A对应；
xiv)在与SEQ ID NO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82B对应；
xv)在与SEQ ID NO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82C对应；
xvi)在与SEQ ID NO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H86对应；
xvii)在与SEQ ID NO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100A对应；
xviii)在与SEQ ID NO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100B对应；
xix)在与SEQ ID NO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100C对应；
xx)在与SEQ ID NO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100D对应；
xxi)在与SEQ ID NO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100E对应；
xxii)在与SEQ ID NO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100F对应；
xxiii)在与SEQ ID NO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100G对应；
xxiv)在与SEQ ID NO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽，上述位置优选地使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H104对应；
xxv)以下重链可变区多肽：在与SEQ ID NO：9的31位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQ ID NO：9的42位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO：9的53位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO：9的61位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO：9的84位对应的位置处具有氨基酸D；在与SEQ ID NO：9的85位对应的位置处具有氨基酸S；在与SEQ ID NO：9的86位对应的位置处具有氨基酸L；在与SEQ ID NO：9的90位对应的位置处具有氨基酸E；在与SEQ ID NO：9的105位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的106位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQ ID NO：9的107位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO：9的108位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的109位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO：9的110位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQ ID NO：9的111位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQ ID NO：9的115位对应的位置处具有氨基酸D；
xxvi)具有以上xxv)中所定义的氨基酸的重链可变区多肽，其使用SEQ ID NO：9的编号；
xxvii)具有以上xxv)中所定义的氨基酸的重链可变区多肽，其使用以上ix)至xxiv)中所定义的Kabat编号；
xxviii)如i)中所定义的多肽，进一步在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxix)如ii)中所定义的多肽，进一步在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxx)如iii)中所定义的多肽，进一步在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸；
xxxi)如iv)中所定义的多肽，进一步在其重链可变区中包含如xxv)中所定义的氨基酸。
8.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下中的一个或多个：
i)在其重链可变区中，SEQ ID NO：10所示的H-CDR1；
ii)在其重链可变区中，SEQ ID NO：11所示的H-CDR2；
iii)在其重链可变区中，SEQ ID NO：12所示的H-CDR3；
iv)在其重链可变区中，SEQ ID NO：10和11所示的H-CDR1和H-CDR2；
v)在其重链可变区中，SEQ ID NO：10和12所示的H-CDR1和H-CDR3；
vi)在其重链可变区中，SEQ ID NO：11和12所示的H-CDR2和H-CDR3；
vii)在其重链可变区中，SEQ ID NO：10、11和12所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；
viii)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：14所示的L-CDR1；
ix)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：15所示的L-CDR2；
x)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：16所示的L-CDR3；
xi)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：14和15所示的L-CDR1和L-CDR2；
xii)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：14和16所示的L-CDR1和L-CDR3；
xiii)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：15和16所示的L-CDR2和L-CDR3；
xiv)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：14、15和16所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
xv)在其重链可变区中，SEQ ID NO：10、11和12所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；以及在其轻链可变区中，SEQ ID NO：14、15和16所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
xvi)在其重链可变区中，SEQ ID NO：9所示的VH区序列；
xvii)在其轻链可变区中，SEQ ID NO：13所示的VL区序列。
xviii)在其重链可变区中，SEQ ID NO：9所示的VH区序列；以及在其轻链可变区中，SEQ ID NO：13所示的VL区序列。
9.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌细胞选自：
i)化疗耐受性癌细胞；
ii)转移性癌细胞；
iii)难治性癌细胞；
iv)复发性癌细胞。
10.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌细胞源自选自以下的癌症：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠道癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
11.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症是白血病，并且选自：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
12.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人的。
13.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与以下中的一个或多个偶联：
i)标记基团；
ii)毒素；
iii)抗肿瘤药剂或药物；
iv)腺苷受体抑制剂，优选地所述腺苷受体抑制剂是A2A受体抑制剂；
14.根据前述各项中任一项所述的抗体，其中所述抗体可通过杂交瘤获得。
15.一种杂交瘤，其中所述杂交瘤产生根据前述各项中任一项所述的单克隆抗体。
16.一种核酸，其编码根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
17.编码根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核酸，其中所述核酸选自：
i)SEQ ID NO：1；
ii)SEQ ID NO：2；
iii)SEQ ID NO：3；
iv)SEQ ID NO：4；
v)SEQ ID NO：5；
vi)SEQ ID NO：6；
vii)SEQ ID NO：7；
viii)SEQ ID NO：8。
18.一种表达载体，其包含根据前述各项中任一项所述的核酸分子中的至少一个。
19.一种双特异性分子，其包含与具有第二连接特异性的分子连接的前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述第二结合特异性来自于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性。
20.一种免疫缀合物，其包含与第二药剂连接的前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述第二药剂与所述抗体或其抗原结合部分不同。
21.一种宿主细胞，其包含根据前述各项中任一项所述的载体和/或核酸，优选地所述宿主细胞用所述载体和/或核酸转化，进一步优选地，所述宿主细胞是异源性宿主细胞，进一步最优选地，所述宿主细胞是非人动物宿主细胞。
22.一种细胞外囊泡(EV)，其包含CD73蛋白。
23.根据前述各项中任一项所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述CD73蛋白是膜结合形式的CD73蛋白。
24.根据前述各项中任一项所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述EV能够将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐。
25.根据前述各项中任一项所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述EV具有EC 3.1.3.5酶活性。
26.根据前述各项中任一项所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述EV源自癌细胞。
27.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，其中所述膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73。
28.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，其中所述膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73，其中所述人CD73选自：
i)SEQ ID NO：17；和
ii)SEQ ID NO：18。
29.一种组合物，其包含根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞或细胞外囊泡(EV)。
30.根据前述各项中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物或诊断组合物。
31.根据前述各项中任一项所述的组合物，其包含：
i)根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞或细胞外囊泡(EV)；
ii)一种或多种化疗剂，优选地所述化疗剂是阿霉素；
iii)任选地，药学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
32.一种用于产生根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：在允许所述抗体或其抗原结合部分合成的条件下培养根据前述各项中任一项所述的宿主细胞；和从所述培养物中回收所述抗体或其抗原结合部分。
33.一种用于对非人动物进行免疫的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供离体或体外癌细胞，优选地所述癌细胞是培养的人成胶质细胞瘤细胞，进一步优选地所述培养的人成胶质细胞瘤细胞是GBM20人成胶质细胞瘤细胞；
ii)从所述癌细胞中分离细胞外囊泡(EV)，优选地所述分离包括离心；
iii)用所述细胞外囊泡(EV)对所述非人动物进行免疫。
34.根据前述各项中任一项所述的对非人动物进行免疫的方法，用于针对膜结合形式的CD73对非人动物进行免疫，其中细胞外囊泡(EV)包含所述膜结合形式的CD73。
35.一种用于制备抗体的方法，所述方法包括：
i)用源自癌细胞的细胞外囊泡(EV)对非人哺乳动物进行免疫；
ii)分离步骤(i)中得到的抗体。
36.根据前述各项中任一项所述的用于制备抗体的方法，其中所述细胞外囊泡(EV)包含膜结合形式的CD73。
37.根据前述各项中任一项所述的用于制备抗体的方法，所述方法包括：
i)用前述各项中任一项所定义的源自癌细胞的细胞外囊泡(EV)对非人哺乳动物进行免疫；
ii)分离步骤(i)中得到的抗体；和
iii)确定步骤(ii)中得到的抗体是否表现出根据第1项的特性中的一种或多种。
38.一种用于制备杂交瘤的方法，所述方法包括：
i)通过前述各项中任一项所定义的免疫方法对所述非人动物进行免疫；
ii)从经免疫的非人动物中收集产生抗体的细胞，以将其与骨髓瘤细胞融合，并产生杂交瘤细胞；
iii)任选地，对杂交瘤细胞进行表征，优选地，所述表征包括所述杂交瘤细胞的免疫沉淀和/或质谱分析。
39.一种降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平的方法，所述方法包括使细胞与根据前述各项中任一项所述的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物接触，使得腺苷水平得以降低。
40.一种在对其有需求的受试者中刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答的方法，所述方法包括给予有效量的根据前述各项中任一项所述的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得针对癌细胞的T细胞应答得以刺激。
41.一种刺激受试者中免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者根据前述各项中任一项所述的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得受试者中的免疫应答得以刺激。
42.根据前述各项中任一项所述的方法，其中受试者具有表达CD73的癌细胞，并且针对肿瘤细胞的免疫应答得以刺激。
43.一种用于抑制受试者中表达CD73的癌细胞的生长的方法，所述方法包括给予受试者根据前述各项中任一项所述的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，使得受试者中肿瘤的生长得以抑制。
44.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予对其有需求的受试者治疗有效量的根据前述各项中任一项所述的抗体、其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物，以治疗癌症。
45.根据前述各项中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。
46.根据前述各项中任一项所述的方法，其中所述膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73。
47.根据前述各项中任一项所述的方法，其中所述膜结合形式的CD73是人的膜结合形式的CD73，其中所述人CD73选自：
i)SEQ ID NO：17；和
ii)SEQ ID NO：18。
48.根据前述各项中任一项所述的方法，其中所述方法是体外、离体或体内的方法或者其组合。
49.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)；和任选地，用于所述试剂盒的说明书。
50.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，用作药物。
51.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，用于以下方法中的一种或多种：
i)用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的方法；
ii)用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的方法，其中所述癌症耐受化疗，和/或是转移性癌症和/或难治性癌症和/或复发性癌症；
iii)用于监测癌症的发展和/或用于评价癌症治疗的疗效的方法；
iv)用于针对抗癌活性筛选候选化合物的方法；
v)用于改变癌细胞对化疗的耐受性的方法；
vi)用于使癌细胞对化疗敏感的方法；
vii)用于诱导癌细胞中细胞凋亡的方法；
viii)用于改变癌症的免疫抑制能力的方法；
ix)用于降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平的方法；
x)用于刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答的方法；
xi)用于刺激受试者中免疫应答的方法；
xii)用于抑制表达CD73的癌细胞的生长的方法；
xiii)用于检测样品中人CD73的存在的方法；
xiv)用于产生或制备抗体的方法；
xv)用于对非人动物进行免疫的方法；
xvi)用于制备杂交瘤的方法；
xvii)根据前述各项中任一项所述的方法。
52.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)，其中所述癌症选自：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌，优选地，所述白血病选自：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
53.根据前述各项中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、杂交瘤、核酸、表达载体、双特异性分子、免疫缀合物、宿主细胞、组合物或细胞外囊泡(EV)用于以下中的一种或多种：
i)用于治疗、减轻、预防或诊断癌症；
ii)用于治疗、减轻、预防或诊断癌症，其中所述癌症耐受化疗，和/或是转移性癌症和/或难治性癌症和/或复发性癌症；
iii)用于监测癌症的发展和/或用于评价癌症治疗的疗效；
iv)用于针对抗癌活性筛选候选化合物；
v)用于改变癌细胞对化疗的耐受性；
vi)用于使癌细胞对化疗敏感；
vii)用于诱导癌细胞中的细胞凋亡；
viii)用于改变癌症的免疫抑制能力；
ix)用于降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平；
x)用于刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答；
xi)用于刺激受试者中的免疫应答；
xii)用于抑制表达CD73的癌细胞的生长；
xiii)用于检测样品中人CD73的存在；
xiv)用于产生或制备抗体；
xv)用于对非人动物进行免疫；
xvi)用于制备杂交瘤；
xvii)在根据前述各项中任一项所述的方法中。
54.根据前述各项中任一项所述的用途，其中所述癌症选自：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、血液癌症、上皮癌、胰腺癌，优选地，所述白血病选自：急性骨髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
55.根据前述各项中任一项所述的用途，其中所述用途是体外、离体或体内的用途或者其组合。
发明实施例
实施例1：制备靶向癌细胞表面上的膜蛋白质的功能性mAb
在本实施例中，通过用源自成胶质细胞瘤细胞系GBM20的细胞外囊泡(EV)对大鼠进行免疫，制备mAb 22E6(图2)。通过离心从GBM20细胞系得到细胞外囊泡(EV)，从上清液分离，并使用本领域已知的标准免疫技术注射到大鼠体内。产生源自大鼠脾细胞的杂交瘤细胞系，并筛选与膜结合形式的CD73蛋白结合并且特异性抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性的抗体。通过免疫沉淀联合质谱(IP-MS)，进行目标mAb的识别，并因此识别mAb 22E6。
实施例2：表征mAb 22E6的结合亲和力和特异性
在本实施例中，对mAb 22E6结合亲和力进行表征(表3)。已经显示，mAb 22E6识别癌细胞上的CD73蛋白。使用特别的流式细胞术技术，用22E6和抗-大鼠-IgG-特异性荧光团标记的二次mAb进行荧光激活细胞分选(FACS)，已经显示，由本发明的22E6 mAb识别的蛋白质存在于共计约30种所测试细胞系的人癌细胞的表面上。所述30种所测试细胞系中有4种代表性的细胞系在此示于图3A中。U138 MG和GBM20是成胶质细胞瘤细胞系，MDA-MB231和T47D是人乳腺癌细胞系。为了比较mAb 22E6的特异性与市售CD73 mAb的特异性，使用市售的CD73 mAb，用相同的细胞系(U138 MG、GBM20、MDA-MB231和T47D)进行免疫印迹，如图3B所示。用22E6或同种型mAb从U138成胶质细胞瘤细胞裂解物进行CD73蛋白的免疫沉淀，然后用市售的CD73 mAb进行免疫印迹，证明了本发明的22E6的特异性，如图3C所示。
实施例3：表征mAb 22E6的抑制特性
在本实施例中，对mAb 22E6的抑制特性进行表征，已经显示，22E6阻断腺苷的产生(图4)。因此，在此如图4所示，将CD73-阳性的人A375黑色素瘤细胞与AMP(一磷酸腺苷)一起孵育60min，测量上清液中AMP(左)和ADO(腺苷，右)的浓度。此外，已经显示，22E6 mAb抑制人CLL细胞产生ADO(图5)。腺苷5′-(α，β-亚甲基)二磷酸酯(APCP)是小分子特异性CD73抑制剂。
实施例4：表征mAb 22E6的免疫调节特性
在本实施例中，对mAb 22E6的免疫调节特性进行表征，已经显示，22E6增加了混合淋巴细胞反应(MLR)中TNFα的释放(图6)。因此，将分别来自3个不同供体(A、B、C)中的2个的5x105个外周血单核细胞(PBMC)在标准细胞培养基中在37℃下与22E6(50μg/ml)或GSF-mAb(50μg/ml)一起孵育24h，用市售的ELISA检验测量TNFα的量。
实施例5：分离并表征细胞外囊泡(EV)
在本实施例中，分离并表征细胞外囊泡(EV)。已经显示，EV可以将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐(图7)，并且从卵巢癌患者的腹水分离的EV携带CD73(图8)。如在此图7所示，来自CD73+癌细胞的EV将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐(μM Pi)。如在此图8所示，CD73存在于通过密度梯度纯化的EV上(图8A)，EV可以在不损失CD73信号的情况下进一步浓缩(图8B)，EV上的CD73可以通过标准的蛋白质印迹(WB)技术检测(图8C)。
实施例6：表征mAb 22E6对ADO产生的抑制
在本实施例中，表征mAb 22E6对ADO产生的抑制，已经显示，22E6阻断源自恶性腹水的EV产生ADO(图9)。因此，将EV在不含磷酸盐的缓冲液中在1mM AMP的存在下与APCP、22E6或同种型mAb一起孵育60min，用标准孔雀石绿检验对无机磷酸盐的浓度进行定量(Pi；在AMP去磷酸化的同时产生)。基于以上，得出结论22E6抑制源自癌症的EV上的CD73。
实施例7：表征mAb 22E6的抑制优先性
在本实施例中，表征mAb 22E6的抑制优先性，已经显示，相比较于可溶形式的CD73蛋白的酶活性，mAb 22E6对于膜结合形式的CD73蛋白的酶活性具有抑制优先性(图10)。如图10所示，22E6对可溶CD73蛋白的酶活性没有或者基本上没有影响。
实施例8：mAb 22E6的免疫球蛋白序列的测序分析
在本实施例中，成功地扩增并克隆了编码22E6的重链和轻链的免疫球蛋白序列(图11和图12)。因此，已经显示，mAb 22E6的免疫球蛋白序列明显地与已知的CD73抗体不同，该差异在CDR区中尤其显著(图13和图14)。因此，在mAb 22E6内识别出以下独特的序列：SEQ ID NO：1，这是编码VH区的DNA序列：SEQ ID NO：2，这是编码VH互补决定区1(H-CDR1)的DNA序列：SEQ ID NO：3，这是编码VH互补决定区2(H-CDR2)的DNA序列；SEQ ID NO：4，这是编码VH互补决定区3(H-CDR3)的DNA序列；SEQ ID NO：5，这是编码VL区的DNA序列；SEQ ID NO：6：这是编码VL互补决定区1(L-CDR1)的DNA序列；SEQ ID NO：7：这是编码VH互补决定区2(L-CDR2)的DNA序列；SEQ ID NO：8：这是编码VH互补决定区3(L-CDR3)的DNA序列；SEQ ID NO：9：这是VH区的氨基酸序列；SEQ ID NO：10，这是VH互补决定区1(H-CDR1)的氨基酸序列；SEQID NO：11：这是VH互补决定区2(H-CDR2)的氨基酸序列；SEQ ID NO：12：这是VH互补决定区3(H-CDR3)的氨基酸序列；SEQ ID NO：13，这是VL区的氨基酸序列：SEQ ID NO：14：这是VL互补决定区1(L-CDR1)的氨基酸序列；SEQ ID NO：15：这是VL互补决定区2(L-CDR2)的氨基酸序列；SEQ ID NO：16，这是VL互补决定区3(H-CDR3)的氨基酸序列。
而且，序列分析在mAb 22E6内的所述序列中识别出若干不寻常的氨基酸残基(即，在序列的＜1％中存在)(图13和图14)。这些如下：
SEQ ID NO：9的31位上的氨基酸F，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H31对应；
SEQ ID NO：9的42位上的氨基酸T，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H42对应；
SEQ ID NO：9的53位上的氨基酸T，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H52A(插入)对应；
SEQ ID NO：9的61位上的氨基酸R，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H60对应；
SEQ ID NO：9的84位上的氨基酸D，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82A(插入)对应；
SEQ ID NO：9的85位上的氨基酸S，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82B(插入)对应；
SEQ ID NO：9的86位上的氨基酸L，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H82C(插入)对应；
SEQ ID NO：9的90位上的氨基酸E，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H86对应；
SEQ ID NO：9的105位上的氨基酸G，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100A(插入)对应；
SEQ ID NO：9的106位上的氨基酸Y，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100B(插入)对应；
SEQ ID NO：9的107位上的氨基酸R，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100C(插入)对应；
SEQ ID NO：9的108位上的氨基酸G，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100D(插入)对应；
SEQ ID NO：9的109位上的氨基酸G，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100E(插入)对应；
SEQ ID NO：9的110位上的氨基酸Y，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100F(插入)对应；
SEQ ID NO：9的111位上的氨基酸F，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H100G(插入)对应；
SEQ ID NO：9的115位上的氨基酸D，其使用Kabat编号与SEQ ID NO：9中的Kabat位置H104对应。
实施例9：mAB 22E6诱导的IFN-γ释放
在本实施例中，mAb 22E6增加IFN-γ的大量释放(图15)。将来自2个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)分别在标准细胞培养基中在37℃下与22E6(0,5μg/ml和5μg/ml)、APCP(1μM和5μM)、同种型抗体(5μg/ml)、aPD-1(5μg/ml)和对照(5μg/ml)一起孵育24h。然后用市售的ELISA检验测量上清液中干扰素-γ(IFN-γ)的量。
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Claims (21)

1.一种抗-CD73抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体，所述抗-CD73抗体或其抗原结合部分表现出以下特性的全部：
i)基本上不抑制可溶形式的CD73蛋白的酶活性，其中结合膜结合形式的CD73蛋白并抑制所述膜结合形式的CD73的酶活性；
ii)在其重链可变区中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，如SEQ ID NOs:10、11和12所示；
iii)在其轻链可变区中，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，如SEQ ID NOs:14、15和16所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述酶活性是EC 3.1.3.5。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含以下多肽：
与SEQ ID NO:9所示的VH区多肽序列的同一性为至少90％的多肽；与SEQ ID NO:13所示的VL区多肽序列的同一性为至少90％的多肽。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下多肽中的一个或多个：
i)在与SEQ ID NO:9的31位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽；
ii)在与SEQ ID NO:9的42位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽；
iii)在与SEQ ID NO:9的53位对应的位置处具有氨基酸T的重链可变区多肽；
iv)在与SEQ ID NO:9的61位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽；
v)在与SEQ ID NO:9的84位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽；
vi)在与SEQ ID NO:9的85位对应的位置处具有氨基酸S的重链可变区多肽；
vii)在与SEQ ID NO:9的86位对应的位置处具有氨基酸L的重链可变区多肽；
viii)在与SEQ ID NO:9的90位对应的位置处具有氨基酸E的重链可变区多肽；
ix)在与SEQ ID NO:9的105位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
x)在与SEQ ID NO:9的106位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽；
xi)在与SEQ ID NO:9的107位对应的位置处具有氨基酸R的重链可变区多肽；
xii)在与SEQ ID NO:9的108位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
xiii)在与SEQ ID NO:9的109位对应的位置处具有氨基酸G的重链可变区多肽；
xiv)在与SEQ ID NO:9的110位对应的位置处具有氨基酸Y的重链可变区多肽；
xv)在与SEQ ID NO:9的111位对应的位置处具有氨基酸F的重链可变区多肽；
xvi)在与SEQ ID NO:9的115位对应的位置处具有氨基酸D的重链可变区多肽；
xvii)以下重链可变区多肽：使用SEQ ID NO:9的编号，在与SEQ ID NO:9的31位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQ ID NO:9的42位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO:9的53位对应的位置处具有氨基酸T；在与SEQ ID NO:9的61位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO:9的84位对应的位置处具有氨基酸D；在与SEQ ID NO:9的85位对应的位置处具有氨基酸S；在与SEQ ID NO:9的86位对应的位置处具有氨基酸L；在与SEQ ID NO:9的90位对应的位置处具有氨基酸E；在与SEQ ID NO:9的105位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO:9的106位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQ ID NO:9的107位对应的位置处具有氨基酸R；在与SEQ ID NO:9的108位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO:9的109位对应的位置处具有氨基酸G；在与SEQ ID NO:9的110位对应的位置处具有氨基酸Y；在与SEQ ID NO:9的111位对应的位置处具有氨基酸F；在与SEQ ID NO:9的115位对应的位置处具有氨基酸D。
5.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
在其重链可变区中，如SEQ ID NO:9所示的VH区序列；和在其轻链可变区中，如SEQ IDNO:13所示的VL区序列。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是嵌合的、人源化的或人的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与以下中的一个或多个偶联：
i)标记基团；
ii)毒素；
iii)抗肿瘤药剂或药物；或
iv)腺苷受体抑制剂。
8.一种核酸，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，包括：
i)SEQ ID NO:2；
ii)SEQ ID NO:3；
iii)SEQ ID NO:4；
iv)SEQ ID NO:6；
v)SEQ ID NO:7；和
vi)SEQ ID NO:8。
9.一种表达载体，其包含根据权利要求8所述的核酸分子。
10.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的核酸和/或权利要求9所述的表达载体，所述宿主细胞不是植物细胞。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物是药物或诊断组合物。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述药物还包含一种或多种化疗药剂。
14.一种用于制造根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：在允许所述抗体或其抗原结合部分合成的条件下，培养根据权利要求10所述的宿主细胞；和从所述培养物中回收所述抗体或其抗原结合部分。
15.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的表达载体、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11至13中任一项所述的组合物。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的表达载体、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11至13中任一项所述的组合物在制备以下一种或多种药物中的应用：
i)用于治疗、减轻、预防或诊断癌症的药物；所述癌症耐受化疗，和/或是转移性癌症和/或难治性癌症和/或复发性癌症；
ii)用于监测癌症的发展和/或用于评价癌症治疗的疗效的药物；
iii)用于改变癌细胞对化疗的耐受性的药物；
iv)用于使癌细胞对化疗敏感的药物；
v)用于在癌细胞中诱导细胞凋亡的药物；
vi)用于改变癌症的免疫抑制能力的药物；
vii)用于降低表达CD73的癌细胞中的腺苷水平的药物；
viii)用于刺激针对表达CD73的癌细胞的T细胞应答的药物；
ix)用于刺激受试者中的免疫应答的药物；
x)用于抑制表达CD73的癌细胞的生长的药物；
xi)用于对非人动物进行免疫的药物。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的表达载体、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11至13中任一项所述的组合物在以下一种或多种方法中的应用：
i)用于针对抗癌活性筛选候选化合物的方法，所述候选化合物用于制备抗癌的药物；
ii)用于制造或制备抗体的方法，所述抗体用于制备药物。
18.根据权利要求16或17所述的应用，其中所述癌症选自：乳腺癌、血液癌症、膀胱癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、胃肠道癌、肾癌、头颈癌、肺癌、骨癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤和肉瘤。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述血液癌症选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
20.根据权利要求18所述的应用，其中所述胃肠道癌选自食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和胰腺癌。
21.根据权利要求18所述的应用，其中所述中枢神经系统肿瘤为成胶质细胞瘤。
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