CN110692647A - 一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液和灭菌方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液和灭菌方法，所述的灭菌液，包括溶菌酶和抗生素。此灭菌液和方法可在不破坏组织工程医疗器械内部活性细胞、相关因子蛋白、基质结构的情况下，有效的对产品进行最终灭菌。最终配合无菌包装，使组织工程医疗器械最终达到无菌状态。

Description

一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的 灭菌液和灭菌方法

技术领域

本发明涉及医疗产品灭菌技术领域，特别是一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液和灭菌方法。

背景技术

Non-Denature液体灭菌法，主要应用于部分同种异体和异种异体组织工程医疗器械的终末灭菌中。作为一次性使用的医疗器械，最终在临床使用时应为无菌状态。目前对于这种一次性使用无菌医疗器械产品，通常有两种制备方式。第一种：终末灭菌，是指产品在完成制备后进行灭菌，然后无菌包装，或包装完成后灭菌(如：辐照灭菌)。第二种：无菌操作法：是指将产品原辅材料、工位器具、设备等先进行灭菌处理，然后全成在无菌环境下进行操作，直至产品包装完成。两种方法最终都可以达到灭菌保证水平10^-6。在临床中，几乎所有的一次性使用无菌医疗器械，均采用第一种方式。而第二种灭菌方式由于成本较高且不易控制，只有少数产品采用(如：培养基等)。而Non-Denature液体灭菌法则属于第一种灭菌方式。

对于同种异体和异种异体组织而言，其是许多组织工程医疗器械的基本原材料。这种材料自身就会携带多种菌类和病毒，同时材料主要由多种细胞、基质组成，其也是一种天然的培养基。如果存放出现问题，短时间内材料上携带的菌类或病毒就会大量滋生。通常做为原材料存在的同种异体或异种异体组织体积较大，且存放要求较高，在使用前无法直接有效的进行灭菌。这样就无法采用无菌操作法来达到产品最终无菌的目的。如果单纯的使用第一种终末灭菌的方式(如：辐照、环氧乙烷、干热、湿热、乙醇等)来对产品进行灭菌处理，则会严重的损坏组织工程产品的结构，同时更重要的是破坏了细胞赖以生长的微环境。组织工程产品植入人体后需要吸引受体的细胞长入，毛细血管爬行覆盖提供赖以生存的营养。如果采用辐照、环氧乙烷、干热、湿热、乙醇等灭菌的方式则在灭菌的同时也破坏了细胞活性和细胞赖以生存的微环境：我们发现在人体和动物体组织上含有大量的利于患处修复、生长、诱导、抗感染等的因子或蛋白质。如：人皮质生长因子(HEGP)、骨诱导生长因子(BMP)、血管内皮质生长因子(VEGF)等。这些物质可诱导或引导患处的细胞，针对损伤部分的修复治疗。同时还有很多这类因子和蛋白，可以控制组织修复后的效果，最终可达到与受损前几乎相同的状态。这一点对于很多损伤的修复极为重要。如：烧伤后植皮术、整形美容等。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液和灭菌方法，此灭菌液和方法可在不破坏组织工程医疗器械内部活性细胞、相关因子蛋白、基质结构的情况下，有效的对产品进行最终灭菌。最终配合无菌包装，使组织工程医疗器械最终达到无菌状态。

本发明目的在于提供一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液，包括溶菌酶和抗生素。

本发明所述的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械是指只是具有生物组织材料的生物结构、细胞间质和部分生长因子的功能，而不保留细胞活性，也不获取细胞功能性的功能产品。包括同种异体和异种异体组织材料。

本发明所述方法适用于大多数常规的组织工程医疗器械，适用范围广，但为了发挥更好的灭菌优势和出于成本考虑，优选的，所述的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械：

(1)不包括可溶于水、脂类或/和醇类的功能产品；如皮下脂肪层、眼玻璃体：

(2)不包括最终产品里不能含有水分的材料；如：甲壳素类材料，具体如：玻尿酸冻干粉、吸附试纸；

(3)不包括一些具有强吸附作用的组织工程材料；如：生物海绵类材料，具体如PVA海绵、聚氨酯海绵；

(4)不包括需要附着细胞生长的基质材料、载药植入性的组织工程医疗器械；如：心血管支架；

(5)不包括用于功能性的植骨材料、用于心脏起搏器的材料；如：人工心脏等。

进一步的，本发明的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的选择，可以为上述不包括的之外的其他同种异体组织或异种异体组织，包括但不限于皮肤，骨，软骨，肌腱，神经组织，血管，心藏瓣膜，心包膜，羊膜，脐带组织等。

进一步的，本发明所述的溶菌酶选自动物源溶菌酶、植物源溶菌酶和微生物源溶菌酶三类中的一种或几种。其中动物源溶菌酶可以包括但不限于鸡蛋清溶菌酶、人或哺乳动物溶菌酶；植物源溶菌酶可以包括但不限于从木瓜、芜菁、无花果、萝卜等植物体内分离得到的溶菌酶；微生物源溶菌酶可以包括但不限于β-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内酰胺酶、内肽酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、壳多糖酶等。

本发明所述的溶菌酶优选微生物溶菌酶，发明人发现选用微生物溶菌酶在作用于产品时更容易渗透入产品同时膜体表面也不易产生絮凝物质的情况，优选的例如包括但不限于β-N-乙酰己糖胺酶、β-内酰胺酶、β-葡聚糖酶、壳多糖酶。

本发明所述的溶菌酶的总质量浓度优选在0.01％～0.5％之间。具体溶菌酶的体积浓度可以根据不同种类溶菌酶的最低作用浓度来进一步优选，在一种实施例中，为保证溶菌酶的有效性，通常会选用该溶菌酶最低作用浓度的2～3倍，如：在灭菌过程中选用N-乙酰胞壁酰胺酶只要保证其总浓度不低于0.05％即可发挥相应的效用，在本发明中则选用N-乙酰胞壁酰胺酶在整个灭菌过程保证其总质量浓度不低于0.1％。每种溶菌酶的最低作用浓度可根据公知材料或现有技术获得。

进一步的，本发明所述的抗生素为β-内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗生素或硝基呋喃类抗生素中的一种或几种。

本发明所述β-内酰胺类抗生素包括但不限于青霉素类、头孢菌素类、粘杆菌素类、杆菌肽锌、万古霉素、维吉尼亚霉素等中的一种或几种。

本发明所述青霉素类包括但不限于青霉素钠、青霉素钾、氨苄西林钠、阿莫西林、哌拉西林、青霉素V钾等。

本发明所述头孢菌素类包括但不限于头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢唑啉钠、头孢拉定、头孢哌酮钠、头孢他啶、头孢曲松钠等。

本发明所述大环内酯类抗生素包括但不限于红霉素、乙酰螺旋霉素、琥乙红霉素、罗红霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素、吉他霉素等中的一种或几种。

本发明所述氨基糖苷类抗生素包括但不限于庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、奈替米星、阿米卡星、妥布霉素、新霉素、大观霉素、小诺霉素等中的一种或几种。

本发明所述四环素类抗生素包括但不限于四环素、土霉素、多西环素、米诺环素等。

本发明所述磺胺类抗生素包括但不限于磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪等中的一种或几种。

本发明所述硝基呋喃类抗生素包括但不限于呋喃唑酮。

在本发明一种优选的实施例中，所述的抗生素优选青霉素类和头孢类，其中青霉素类包括但不限于青霉素、苄星青霉素、青霉素G、青霉素V、普鲁卡因青霉素、甲氧苯青霉素、双氯西林、氟氯西林、氯唑西林、阿莫西林、氨芐青霉素、复方阿莫西林、美洛西林、阿洛西林、哌拉西林、羧苄青霉素、替卡西林、萘夫西林、亚胺培南(泰能)、美罗培南、帕尼培南等；头孢类包括但不限于头孢氰甲、头孢羟氨芐、头孢氨芐、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑林、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢孟多、头孢雷特、头孢替安、碳头孢烯：氯碳头孢、头孢拉宗、头孢美唑、头孢米诺、头孢替坦、头孢西丁、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢匹胺、头孢磺啶、拉氧头孢、Cefclidine、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、氟氧头孢、头孢氯嗪、头孢洛仑、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、Cefmatilen、Cefmepidium、Cefovecin、头孢□唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢噻氧、Ceftobiprole、Ceftobiprole、头孢呋汀。

本发明所述抗生素的总质量优选浓度在0.01％～0.7％之间。具体的优选浓度可以根据不同抗生素作用于人体时的最高血药浓度来进行进一步的优选，通常优选为最高血药浓度的1～2倍。

本发明所述的灭菌液pH优选为4.5～6.0之间。灭菌液的pH调节可以选用本领域常用的试剂，如柠檬酸、稀硫酸、稀盐酸、乙酸、乳酸、果酸中的一种或几种。

本发明所述的灭菌液配制所用试剂为注射用水。

本发明的目的之二在于提供一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌方法，将同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械浸泡于本发明所述的灭菌液中，缓慢加入碱性溶液改变灭菌液的pH值至7.5～8.5之间。

本发明是通过溶菌酶和抗生素混合制备成灭菌液，在保证两种成分有效灭菌浓度的情况下，通过滴定的方式改变灭菌液的pH值，从而改变材料表面的渗透性，使得混合灭菌液可以充分作用于材料，最终达到终末灭菌的效果。

本发明所述方法中用到的碱性溶液优选为氢氧化钠、氢氧化钙、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或几种。

本发明缓慢加入的方法可以选用任意本领域的常规方法，在一种实施方式中，是选用碱性试剂进行滴定。

滴定时间应根据溶菌酶和抗生素的有效作用时间为参考，最终应通过微生物挑战试验来确定滴定时间。

滴定结束后浸泡液的pH值应停留在7.5～8.5之间，优选的，滴定时充分混合浸泡液，使得浓度变化均匀。

本发明所述的灭菌方法，在滴定过程中，需要保证灭菌液中的溶菌酶和抗生素是否在有效浓度之内，即本发明所述的百分含量，可随时调整滴定液和灭菌液的浓度。

进一步的，本发明浸泡的温度为25～38℃。

本发明所述的方法，为了进一步提高最终的灭菌效果，同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械在灭菌之前，优选的初始微生物限度控制在100cfu/g以内。

进一步的，本发明提供一种更为具体的方法，包括以下步骤：

(1)用pH在5.6～7.8的缓冲剂对同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械表面进行冲洗；

(2)冲洗完毕后将同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械完全浸泡在灭菌液中，并将温度恒定在25～38℃，并将灭菌液pH值调整至4.5～6.0之间；

(3)缓慢加入碱性溶液改变灭菌液的pH值至7.5～8.5之间。

本发明冲洗用的缓冲剂可以选自甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-氢氧化钠、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠中的一种或几种，冲洗过程不能使用强压或反复折叠组织材料，避免损坏材料内的生物结构。

本发明消毒完毕后，取出组织材料，可以再使用超声波清洗的方法对材料进行清洗，清洗溶剂可选用注射用水、生理盐水、甘油、二甲基亚砜、棉籽油中的一种。根据实际情况，可反复清洗二到三次。清洗过程中应控制溶液温度，避免应温度过高损伤组织材料。清洗结束后根据不同组织材料特性及需要的保存方进行无菌封装。

本发明相对于现有技术的优势：

(1)本发明的灭菌液是溶菌酶和抗生素联合使用，通过溶菌酶破坏微生物细胞壁，再经过抗生素的渗透性，通过碱性溶液对pH的缓慢调整，容易渗入材料内部，对微生物的抑制和破坏作用明显，且不易破坏其生物结构。

(2)本发明所述的灭菌方式可有效的杀灭目前已知的大部分微生物，同时最大程度的保存组织材料中利于细胞组织生长的因子，可满足最终产品灭菌水平低于10^-6的要求。

(3)本发明灭菌所针对的范围较为广泛，包括：细菌、真菌、衣原体、支原体、寄生虫、病毒等。

(4)传统终末灭菌(如：辐照、环氧乙烷、干热、湿热、乙醇等)对材料进行灭菌处理会严重的损坏材料的生物结构。该方法第一次创造性的改变了传统的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械灭菌。在灭菌的同时，完全保留了同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的基质结构形态和组织间质中的各种生长因子，由于这些基质结构形态和生长因子大量被保存，可诱导同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械植入物受体内自身细胞组织着床再生，形成天然的支架结构，可使受体毛细血管等组织蔓延生长，促进同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械植入物在受体内存活。同时用该方法处理的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械产品也是一种良好的干细胞负载体，可有效的为干细胞的分化和生长提供良好的环境。经过大量实验，使用该方法处理的TEMP产品具有细胞组织生长快、愈合快、低钙化、低感染、低吸收、愈合后微瘢痕等特点。

附图说明

图1为基底层皮片在实施例1灭菌的真皮基质上附着生长的情况；

图2为基底层皮片在对比例1灭菌的真皮基质上附着生长的情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例灭菌过程中应保证在绝对无菌的环境下进行。整个灭菌过程所涉及的设备包括：生物安全柜、精密恒温水域器、滴定仪、超声波清洗机、封装设备等。整个操作过程是基于无菌操作(可参见YY/T0567.1-2005《医疗产品的无菌加工第1部分：通用要求》)的基础上完成的。

关于灭菌液残留的判定

由于组织工程材料灭菌时使用了多种溶菌酶和抗生素，如在材料中有所残留可能会对产品的使用造成一定的影响。同时也无法判定材料是否灭菌彻底。这里可根据《药典》中抑菌剂效力检查法指导原则中的方法，对材料进行检测。结果应为细菌和真菌均能在培养期间内正常生长。如出现生长缓慢或不生长的情况，应重复进行试验。若结果相同可判定为灭菌液残留超出可接受水平。此时应考虑调整超声波清洗时间、清洗次数，以及更换清洗溶剂。

关于灭菌效果的验证

可根据《药典》中无菌检查法对组织材料进行检查，可检测此方法对细菌和真菌的杀灭效果。针对病毒的杀灭效果，可选用四中指示病毒，即有无脂包膜和DNA或RNA遗传组。应选择具有一定耐受性的指示病毒。如：伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、猪细小病毒(PPV)、脑心肌炎病毒(EMCV)等，来进行病毒灭活验证。

对于同种异体和异种异体材料在使用本灭菌方法后，是否对其自身的生长因子或诱导因子产生影响，可通过动物模型进行异位诱导成形实验来证明。

实施例1

实例1同种异体真皮基质的灭菌

步骤1：在无菌的环境下制备混合灭菌液500ml，其中N-乙酰胞壁质聚糖水解酶浓度为0.3mg/ml、青霉素浓度为0.25mg/ml，并使用稀盐酸将灭菌液pH值调节至5.0；

步骤2：取出待灭菌真皮基质(材料厚度应小于0.5mm,总重量应小于25g)，使用生理盐水冲洗材料表面，并平铺于灭菌液内；

步骤3：将灭菌液温度恒温至35℃，并使用浓度为50mg/ml氢氧化钠溶液通过滴定仪对灭菌液进行滴定。滴定时应保证溶液混合均匀。滴定时间为2.5h，最终灭菌液pH值为7.5；

步骤4：取出真皮基质后使用无菌生理盐水清洗，清洗后用甘油浸泡并密封保存，同时取部分样品按《药典》中无菌检查进行检验，符合药典要求。

对比例1采用辐照灭菌同种异体真皮基质

待灭菌真皮基质(材料厚度应小于0.5mm,总重量应小于25g)采用20-25KGy辐照灭菌，取部分样品按《药典》中无菌检查进行检验，符合药典要求。

效果对比：

使用人基底层皮片负载试验对两种方法制备的真皮基质(实施例1和对比例1)进行对比：

步骤1：分别取两种方法制备的真皮基质(实施例1和对比例1)，使用无菌生理盐水进行清洗或复水备用；

步骤2：取健康人皮下基底层皮片约1～3g,并粉碎至物理直径为0.1～2.0mm的小颗粒，并使用生物染色剂进行染色；将粉碎后的皮片分两份，均匀的涂抹至两种真皮基质上；

步骤3：使用DMEM培养基，37℃，培养72h,取出后使用无菌生理盐水洗脱浸泡。并观察小皮片生长情况；

观察方法：在均匀涂抹被染色的粉碎皮片后，使用×4倍物镜观察计数，在视野内统计皮片附着数量，随机5个观察点，平均计数76个。培养洗脱后，采用同样的方法观察，通过图1和图2的结果可知，基底层皮片在实施例1灭菌处理过的真皮基质上附着生长良好(图1)，而在对比例1辐照灭菌处理过的真皮基质上附着生长情况较差，较实施例1有明显差距(图2)。根据计数试验表明，使用实施例1制备的真皮基质平均附着达65处，即使用实施例1制备的真皮基质负载的皮片小颗粒融合分化率达85.5％；对比例1制备的真皮基质平均附着达11处，即使用对比例1制备的真皮基质负载的皮片小颗粒融合分化率仅14.5％。

实施例2同种异体肌腱

1、在无菌的环境下制备混合灭菌液500ml，其中β-内酰胺酶浓度为0.5mg/ml、青霉素浓度为0.25mg/ml，并使用稀盐酸将灭菌液值调节至5.0；

2、取出待灭菌异体肌腱(材料宽度应小于2cm，厚度应小于0.3cm)，使用生理盐水冲洗材料表面，并平铺于灭菌液内；

3、将灭菌液温度恒温至35℃，并使用浓度为50mg/ml氢氧化钠溶液通过滴定仪对灭菌液进行滴定。滴定时应保证溶液混合均匀。滴定时间为2.5h，最终灭菌液pH值为7.5；

4、取出异体肌腱后使用无菌生理盐水清洗，清洗后用甘油浸泡并密封保存，同时取部分样品按《药典》中无菌检查进行检验，符合药典要求，且临床植入效果较好。

Claims (10)

1.一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌液，其特征在于，包括质量浓度在0.01％～0.5％的溶菌酶和质量浓度在0.01％～0.7％的抗生素。

2.根据权利要求1所述的灭菌液，其特征在于，灭菌液pH为4.5～6.0。

3.根据权利要求1所述的灭菌液，其特征在于，所述的同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械：

(1)不包括液体分散的和/或可溶于水、脂类或/和醇类的功能产品；

(2)不包括最终产品里不能含有水分的材料；

(3)不包括一些具有强吸附作用的组织工程材料；

(4)不包括需要附着细胞生长的基质材料、载药植入性的组织工程医疗器械；

(5)不包括用于功能性的植骨材料、用于心脏起搏器的材料。

4.根据权利要求1所述的灭菌液，其特征在于，所述溶菌酶选自动物源溶菌酶、植物源溶菌酶和微生物源溶菌酶三类中的一种或几种；优选以下一种或几种：鸡蛋清溶菌酶、人或哺乳动物溶菌酶、从木瓜、芜菁、无花果、萝卜等植物体内分离得到的溶菌酶、β-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内酰胺酶、内肽酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、壳多糖酶；更优选的，选自以下一种或几种：β-N-乙酰己糖胺酶、β-内酰胺酶、β-葡聚糖酶、壳多糖酶。

5.根据权利要求1所述的灭菌液，其特征在于，所述抗生素选自β-内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗生素或硝基呋喃类抗生素中的一种或几种。

6.一种适用于同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械的灭菌方法，其特征在于，将同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械浸泡于权利要求1所述的灭菌液中，缓慢加入碱性溶液改变灭菌液的pH值至7.5～8.5之间。

7.根据权利要求6所述的灭菌方法，其特征在于，浸泡的温度为25～38℃。

8.根据权利要求6所述的灭菌方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用pH在5.6～7.8的缓冲剂对同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械表面进行冲洗；

(2)冲洗完毕后将同种异体和异种异体组织及组织工程医疗器械完全浸泡在权利要求1所述的灭菌液中，并将温度恒定在25～38℃，并将灭菌液pH值调整至4.5～6.0之间；

(3)缓慢加入碱性溶液改变灭菌液的pH值至7.5～8.5之间。

9.根据权利要求6～8任一项所述的灭菌方法，其特征在于，所述的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钙、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或几种。

10.根据权利要求8所述的灭菌方法，其特征在于，所述的缓冲剂选自甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-氢氧化钠、乙酸-乙酸钠、磷酸氢二钠-磷酸氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠中的一种或几种。

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