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CN110699312A - 一种猪种布鲁氏菌bi-1基因缺失菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种猪种布鲁氏菌bi-1基因缺失菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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CN110699312A
CN110699312A CN201911190912.9A CN201911190912A CN110699312A CN 110699312 A CN110699312 A CN 110699312A CN 201911190912 A CN201911190912 A CN 201911190912A CN 110699312 A CN110699312 A CN 110699312A
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Abstract

一株猪种布鲁氏菌BI‑1基因缺失菌株及其构建方法和应用，该菌株是通过卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI‑1基因得到的，其主要步骤为：以猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增得到BI‑1基因上、下游同源臂，与同样PCR扩增得到的卡那霉素抗性基因片段一起克隆入pUC18质粒，获得同源重组缺失质粒pUC18‑BI1‑KanR。将该质粒电转化猪种布鲁氏菌感受态细胞，经PCR鉴定，所得阳性转化子即为猪种布鲁氏菌BI‑1缺失菌株。与野生型菌株相比，该缺失菌株表现出生长速度减缓，菌落减小，细胞膜通透性增加，细胞聚合性增强等特点，提示该缺失菌株具有作为布鲁氏菌减毒活疫苗的潜质。

Description

一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患传染病，主要引起患病动物流产和不育，在人上主要表现为波状热、骨关节炎症、生殖系统炎症等，严重威胁人类的生命健康和畜牧业的健康、可持续发展。疫苗免疫接种是预防布鲁氏菌病最有效的手段，但是目前我国市售布鲁氏菌病疫苗在免疫保护力和区分野毒感染与疫苗接种方面尚存在诸多不足，而且全球范围内尚没有有效的人用布鲁氏菌病疫苗。因此，布鲁氏菌病疫苗的研制及相关研究亟待深入。
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，球杆状，无荚膜，无鞭毛，不形成芽胞，以专业和非专业吞噬细胞为宿主细胞。布鲁氏菌进化出了多种毒力因子和毒力系统，一旦进入宿主细胞即通过各种毒力因子干扰、逃避宿主的免疫杀伤机制，建立胞内增殖，引起慢性感染。目前研究发现，外膜蛋白（Out membrane proteins, OMPs）、磷酸脂多糖(Lipopolysaccharide, L PS)、VirB IV型分泌系统、BvrR/BvrS双组份系统、核蛋白L7/L12、群体感应系统等是参与布鲁氏菌感染的重要毒力因子，大都具有较强的免疫保护活性，且大部分组分是膜相关分子。
Bax inhibitor-1 (BI-1)是在真核生物和原核生物中高度保守的跨膜蛋白，在真核生物中主要起着抑制BAX诱导的细胞凋亡功能，在原核生物中的功能尚不明确。但是，大肠埃希氏菌中的BI-1样蛋白YccA被证明是ATP依赖的金属蛋白酶FtsH的底物和调节因子，对细菌外膜的生物生成具有重要作用。我们的研究发现，BI-1缺失对布鲁氏菌的生长和外膜特性具有显著影响，表明BI-1缺失菌株具有制备减毒活疫苗及其相关检测方法的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪种布鲁氏菌Bax inhibitor-1 (BI-1)基因缺失菌株及其构建方法和应用，所要解决的技术问题是将猪种布鲁氏菌S2疫苗株进行BI-1基因缺失，进一步减弱其毒性，提高其在疫苗研制和相配套检测方法建立方面的可用性、有效性。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一株猪种布鲁氏菌Bax inhibitor-1 (BI-1)基因缺失菌株，其特殊之处在于：用卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI-1基因获得。
一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
(1) 根据猪种布鲁氏菌基因组序列和pEGFP-C1基因序列以及pUC18质粒的酶切位点信息，设计所需PCR引物；
(2) 以布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增获得BI-1上、下游同源臂BI1-UP和BI1-DW； 以pEGFP-C1质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素抗性基因KanR；
(3) 将步骤（2）得到的基因片段分别与pMD19T-simple载体连接，获得相应的重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR；
(4) 将步骤（3）得到的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行培养，提取相应重组质粒，送生物公司测序；
(5) 将步骤（4）测序正确的重组质粒分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，回收纯化BI-1上、下游同源臂基因片段和KanR基因片段；
(6) 将步骤（5）得到的基因片段等体积混合后与pUC18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR；
(7) 制备猪种布鲁氏菌感受态细胞备用；
(8) 将步骤（6）得到的同源重组缺失质粒与步骤（7）所得的感受态细胞混匀，冰置10min，转移到预冷的1 mm电击杯内，以2.5KV、4.5 ms的条件进行电转化，立即加入1 mL无抗TSB液体培养基，37 ℃、180 rpm复苏12 h，然后涂布含25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基，置于37 ℃培养72 h，挑取单克隆菌落进行培养；
(9) 将步骤（8）中得到的菌液置于70 ℃水浴灭活2 h，然后用鉴定引物BI1-F/R进行PCR鉴定，筛选出BI-1基因缺失菌株。
上述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，制备猪种布鲁氏菌感受态细胞包括：将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株于无抗性的TSA固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48h，然后按照体积比1:100接种于50 mL无抗性TSB液体培养基中扩大培养；当OD600=0 .9时，将菌液置于冰上预冷30 min，然后4500 g离心20 min，弃上清；用20 mL 预冷的ddH2O重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；然后用20 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；最后用1 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，以100 μL的体积分装， -80 ℃冻存备用。
上述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，所述引物组包括：
Figure 919291DEST_PATH_IMAGE001
。
一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株在制备布鲁氏菌减毒活疫苗中的应用。
一种猪种布鲁菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用。
上述猪种布鲁菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用，其特殊之处在于：所述试剂盒还包括BI-1抗体检测试剂。
本发明的有益效果是：
本发明通过同源重组的方法，构建了猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株，并证明BI-1基因缺失会显著影响布鲁氏菌的生长速度和细胞外膜特性，使布鲁氏菌表现出生长减慢、聚合度增强、通透性增加。本发明获得的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株为新的布鲁氏菌病减毒活疫苗研发及其相应检测方法的建立提供了理论和物质基础，也为研究BI-1基因在布鲁氏菌中的生理功能提供了理论基础。
附图说明
图1为BI-1基因上、下游同源臂PCR结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为BI-1基因上游同源臂BI1-UP PCR产物，2泳道为BI-1基因下游同源臂BI1-DW PCR产物。
图2为卡那霉素抗性基因PCR结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为卡那霉素抗性基因KanR PCR产物。
图3为pMD19T-BI1-UP酶切鉴定结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pMD19T-BI1-UP经Sph I和Spe I双酶切的结果。
图4为pMD19T-BI1-DW酶切鉴定结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pMD19T-BI1-DW经Sal I和EcoR I双酶切的结果。
图5为pMD19T-BI1-KanR酶切鉴定结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pMD19T-BI1-KanR经Sal I和Spe I双酶切的结果。
图6为同源重组缺失质粒酶切鉴定结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pUC18-BI1-KanR经Sph I和EcoR I双酶切的结果。
图7为猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株鉴定结果；
M为DL5000 DNA Marker，1泳道为猪种布鲁氏菌活疫苗S2菌株的鉴定PCR产物，2泳道为猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的鉴定PCR产物。
图8为猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株聚合度检测结果；
A为猪种布鲁氏菌活疫苗S2株菌液和猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失株菌液静置前，B为猪种布鲁氏菌活疫苗S2株菌液和猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失株菌液室温静置24 h后，C为检测两种菌液静置前后在600 nm处的吸光值计算得到的聚合度。
图9为猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株生长速度检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
一种猪种布鲁氏菌Bax inhibitor-1 (BI-1)基因缺失菌株的构建方法，具体步骤如下：
（1）引物设计：根据猪种布鲁氏菌基因组序列，设计BI-1基因上、下游同源臂PCR引物BI1-UF/BI1-UR（分别含有Sph I和Spe I酶切位点）和BI1-DF/BI1-DR（分别含有Sal I和EcoR I酶切位点）；根据pEGFP-C1基因序列，设计卡那霉素抗性基因PCR引物KanR-F/KanR-R（分别含有Sal I和Spe I酶切位点）；另外，根据猪种布鲁氏菌基因组序列，在BI-1基因序列内部设计缺失菌株鉴定引物BI1-TF/BI1-TR。引物序列如下：
Figure 118191DEST_PATH_IMAGE001
，
（2）目的片段获得：以提取的猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，利用PCR引物BI1-UF/BI1-UR和BI1-DF/BI1-DR PCR扩增获得BI-1基因上、下游同源臂基因片段BI1-UP和BI1-DW；以pEGFP-C1质粒为模板，利用PCR引物KanR-F/KanR-R PCR扩增获得卡那霉素抗性基因片段KanR。将获得的BI1-UP、BI1-DW和KanR与pMD19T-Simple克隆载体进行T-A连接，获得重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR。将上述重组质粒分别热激转化DH5α感受态细胞，37 ℃、 180 rpm复苏1 h后涂布含有60 μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，次日分别挑取阳性转化子，37 ℃、 180 rpm培养16 h，然后提取相应重组质粒。将提取的pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR重组质粒分别进行Sph I/Spe I、Sal I/EcoR I和Sal I/Spe I双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送生物公司进行测序。
（3）同源重组缺失质粒构建：将步骤（2）测序正确的重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR分别进行Sph I/Spe I、Sal I/EcoR I和Sal I/Spe I双酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别回收纯化BI-1上、下游同源臂基因片段BI1-UP、BI1-DW和卡那霉素抗性基因片段KanR。将上述纯化的基因片段等体积混合，与经Sph I/EcoR I双酶切的pUC18于16 ℃连接过夜，获得用于BI-1基因缺失的同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR。上述连接产物热激转化DH5α感受态细胞，37 ℃、 180 rpm复苏1 h后涂布含有25 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，次日分别挑取阳性转化子，37 ℃、 180 rpm培养16 h，然后提取相同源重组缺失质粒。对提取的pUC18-BI1-KanR进行Sph I/EcoR I双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送生物公司进行测序。
（4）猪种布鲁氏菌感受态制备：将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株于无抗性的TSA固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h，然后按照体积比1:100接种于50 mL无抗性TSB液体培养基中扩大培养；当OD600=0 .9时，将菌液置于冰上预冷30 min，然后4 ℃、4500 g离心20 min，弃上清；用20mL 预冷的ddH2O重悬菌体，4 ℃、4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；然后用20 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，4 ℃、4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；最后用1 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，以100 μL的体积分装， -80 ℃冻存备用。
（5）猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的筛选与鉴定：将步骤（4）制备的感受态细胞于冰上融化，取20 μL pUC18-BI1-KanR与之混合，冰置10 min，转移到预冷的1 mm电击杯内，以2.5KV、4.5 ms的条件进行电转化；电转化完成后立即加入1 mL无抗TSB液体培养基，37 ℃、180 rpm复苏12 h，然后涂布含25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基，置于37 ℃培养72 h；挑取单克隆菌落于TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h，无菌吸取1 mL菌液置于70 ℃水浴灭活2 h，然后用鉴定引物BI1-F/R进行PCR鉴定。由于鉴定引物BI1-F/R是设计在BI-1基因内部的，因此只有当BI-1基因被完全替换之后才会出现PCR无条带的现象，也就表明获得了BI-1基因缺失菌株。
实施例
同源重组缺失质粒的构建
1.引物设计
根据NCBI公布的猪种布鲁氏菌基因组序列（登录号：NC_017251.1），设计BI-1基因上、下游同源臂PCR引物BI1-UF/BI1-UR（分别含有Sph I和Spe I酶切位点）和BI1-DF/BI1-DR（分别含有Sal I和EcoR I酶切位点），和在BI-1基因序列内部的缺失菌株鉴定引物BI1-TF/BI1-TR；根据NCBI公布的pEGFP-C1质粒基因序列（登录号：U55763.1），设计卡那霉素抗性基因PCR引物KanR-F/KanR-R（分别含有Sal I和Spe I酶切位点）。引物序列如下：
Figure 787070DEST_PATH_IMAGE001
；
2.目的片段的获得
（1）BI-1基因上、下游同源臂BI1-UP、BI1-DW的PCR
以猪种布鲁氏菌活疫苗S2株基因组为模板，用引物BI1-UF/UR和BI1-DF/DR进行PCR，反应体系如下:
Figure 780434DEST_PATH_IMAGE002
反应条件如下：
上述PCR反应结束后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化PCR产物。
结果如图1所示，分别于1176 bp和1093 bp处出现单一条带，分子量大小与预期相符。
（2）卡那霉素抗性基因KanR的PCR
以pEGFP-C1质粒为模板，用引物KanR-F和KanR-R进行PCR，反应体系如下:
Figure 84824DEST_PATH_IMAGE004
反应条件如下：
上述PCR反应结束后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化PCR产物。
结果如图2所示，于1375 bp处出现单一条带，分子量大小与预期相符。
（3）pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW重组质粒构建
利用TAKARA Ligation Mix将步骤（1）、（2）回收纯化的BI1-UP、BI1-DW和KanR分别与pMD19T-Simple载体进行连接，获得重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR，反应体系如下：
Figure 38054DEST_PATH_IMAGE006
上述反应体系16 ℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂含60 μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，37 ℃培养过夜，次日挑取单克隆菌落，37 ℃、180 rpm培养16 h。
（4）pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR重组质粒鉴定
利用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书，对步骤（3）中的菌液分别进行质粒提取，获得的pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR重组质粒分别进行双酶切鉴定，反应体系如下：
Figure 279679DEST_PATH_IMAGE007
Figure 617120DEST_PATH_IMAGE008
Figure 260591DEST_PATH_IMAGE009
上述反应体系37 ℃反应2 h，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察酶切结果。对于酶切鉴定正确的重组质粒，送生物公司进行测序。
结果如图3、4、5所示，分别于2694 bp和1176 bp，2694 bp和1093 bp，2694 bp和1375 bp处出现特异性条带，表明重组质粒连接正确。
（5）BI1-UP、BI1-DW和KanR片段的获得
对步骤（3）中测序正确的pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR重组质粒分别进行双酶切，反应体系如下：
Figure 595757DEST_PATH_IMAGE010
Figure 324679DEST_PATH_IMAGE011
Figure 403493DEST_PATH_IMAGE012
上述反应体系37 ℃反应过夜，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取特异性目的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照试剂盒说明书，回收纯化目的条带，即得BI-1基因上、下游同源臂BI1-UP、BI1-DW和卡那霉素抗性基因KanR。
3.pUC18-BI1-KanR同源重组缺失质粒的构建
将回收纯化的BI1-UP、BI1-DW和KanR等体积混合，然后利用TAKARA Ligation Mix与pUC18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR，反应体系如下：
Figure 714520DEST_PATH_IMAGE013
上述反应体系16 ℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂含25 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37 ℃培养过夜，次日挑取单克隆菌落，37 ℃、180 rpm培养16 h。
4. 同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR的鉴定
利用天根质粒小提中量试剂盒，按照试剂盒说明书，对步骤3中的菌液进行质粒提取，获得的同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR进行双酶切鉴定，反应体系如下：
Figure 486167DEST_PATH_IMAGE014
上述反应体系37 ℃反应2 h，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察酶切结果。对于酶切鉴定正确的重组质粒，送生物公司进行测序。
结果如图6所示，分别于2645 bp、1479 bp、1308 bp、763 bp和72 bp处出现特异性条带，表明同源重组缺失质粒连接正确。
猪种布鲁氏菌感受态细胞的制备
（1）将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株于无抗性的TSA固体培养基上划线复苏，37 ℃培养72 h；
（2）挑取单克隆菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h；
（3）按照体积比1:100的比例将上述菌液接种于50 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养至菌液的OD600=0 .9；
（4）将上述菌液置于冰上预冷30 min，然后4 ℃、4500 g离心20 min，弃上清；
（5）用20 mL 预冷的ddH2O重悬菌体，4 ℃、4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；
（6）用20 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，4 ℃、4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；
（7）用1 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，以100 μL的体积分装， -80 ℃冻存备用。
猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的筛选与鉴定
1.布鲁氏菌感受态细胞电转化
（1）从-80 ℃取出布鲁氏菌感受态细胞，于冰上融化；
（2）吸取20 μL 同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR与感受态细胞混合，冰置10 min；
（3）将上述混合物转移到预冷的1 mm电击杯内，以2.5KV、4.5 ms的条件进行电转化；
（4）立即加入1 mL无抗TSB液体培养基，37 ℃、180 rpm复苏12 h；
（5）上述转化产物涂布含25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基，置于37 ℃培养72 h；
（6）挑取单克隆菌落于10 mL TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h；
（7）无菌吸取1 mL上述菌液，置于70 ℃水浴灭活2 h，剩余菌液于4 ℃暂存。
2. 猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的PCR鉴定
以步骤1的灭活菌液为模板，利用引物BI1-TF和BI1-TR对菌液样本进行PCR鉴定，反应体系如下：
Figure 436805DEST_PATH_IMAGE015
反应条件如下：
上述PCR反应结束后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统观察PCR结果。对鉴定正确的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株加入终浓度为25%的甘油，于-80 ℃冻存备用。
结果如图7所示，猪种布鲁氏菌活疫苗S2株在453 bp处出现单一、特异性条带，而挑取的转化子则没有任何条带，表明所挑取的转化子即为猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株。
猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株生长速度测定
（1）将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株和猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株ΔBI-1分别于无抗性的TSA固体培养基和含有25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基上划线复苏，37 ℃培养72 h；
（2）分别挑取单克隆菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基和含有25 μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h；
（3）上述菌液4 ℃、5000 g离心10 min，10 mL无菌PBS重悬菌体；
（4）将上述菌液分别用无菌PBS进行10、102、103、104、105、106、107、108倍稀释，涂布无抗性的TSA固体培养基，37 ℃培养72 h，然后进行菌落计数以测定出两种菌液浓度；
（5）分别吸取菌量相同的上述两种菌液，接种于无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180rpm的条件进行培养，分别于接种后0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h测量菌液在600nm处的吸光值，以测定两种菌株的生长速度。
结果如图9所示，相比于猪种布鲁氏菌活疫苗S2株，猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的生长速度显著减慢。
猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株聚合度测定
（1）将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株和猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株ΔBI-1分别于无抗性的TSA固体培养基和含有25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基上划线复苏，37 ℃培养72 h；
（2）分别挑取单克隆菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基和含有25 μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基中，37 ℃、180 rpm培养48 h；
（3）分别上述菌液无菌吸取1 mL，70 ℃水浴灭活2 h，然后分别吸取150 μL灭活菌液测定600 nm处的吸光值；
（4）无菌吸取1 mL后剩余的菌液室温静置24 h，然后分别吸取上清1 mL，70 ℃水浴灭活2 h，同样分别吸取150 μL灭活菌液测定600 nm处的吸光值；
（5）根据以下公式计算两种菌株的聚合度。
聚合度（%）= ([OD全菌 – OD上清]/OD全菌) × 100
结果如图8所示，相比于猪种布鲁氏菌活疫苗S2株，猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的聚合度显著增强，表明缺失菌株的细胞外膜的特性发生了显著改变。
本申请的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株为Brucella suis-△BI-1，Brucellasuis-△BI-1已进行保藏，保藏信息如下：
保藏日期：2019年10月21日；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.18741；
分类命名：猪布鲁氏菌（Brucella suis）。

Claims (7)

1.一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株，其特征在于：用卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI-1基因获得。
2.一种如权利要求1所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 根据猪种布鲁氏菌基因组序列和pEGFP-C1基因序列以及pUC18质粒的酶切位点信息，设计所需PCR引物；
(2) 以布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增获得BI-1上、下游同源臂BI1-UP和BI1-DW； 以pEGFP-C1质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素抗性基因KanR；
(3) 将步骤（2）得到的基因片段分别与pMD19T-simple载体连接，获得相应的重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR；
(4) 将步骤（3）得到的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行培养，提取相应重组质粒，送生物公司测序；
(5) 将步骤（4）测序正确的重组质粒分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，回收纯化BI-1上、下游同源臂基因片段和KanR基因片段；
(6) 将步骤（5）得到的基因片段等体积混合后与pUC18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR；
(7) 制备猪种布鲁氏菌感受态细胞备用；
(8) 将步骤（6）得到的同源重组缺失质粒与步骤（7）所得的感受态细胞混匀，冰置10min，转移到预冷的1 mm电击杯内，以2.5KV、4.5 ms的条件进行电转化，立即加入1 mL无抗TSB液体培养基，37 ℃、180 rpm复苏12 h，然后涂布含25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基，置于37 ℃培养72 h，挑取单克隆菌落进行培养；
(9) 将步骤（8）中得到的菌液置于70 ℃水浴灭活2 h，然后用鉴定引物BI1-F/R进行PCR鉴定，筛选出BI-1基因缺失菌株。
3.根据权利要求2所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，制备猪种布鲁氏菌感受态细胞包括：将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株于无抗性的TSA固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180rpm培养48 h，然后按照体积比1:100接种于50 mL无抗性TSB液体培养基中扩大培养；当OD600=0 .9时，将菌液置于冰上预冷30 min，然后4500 g离心20 min，弃上清；用20 mL 预冷的ddH2O重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；然后用20 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；最后用1 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，以100 μL的体积分装， -80 ℃冻存备用。
4.根据权利要求2或3所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，，其特征在于，所述引物组包括：
Figure 387841DEST_PATH_IMAGE001
。
5.一种如权利要求1所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株在制备布鲁氏菌减毒活疫苗中的应用。
6.一种如权利要求1所述的猪种布鲁菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述猪种布鲁菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括BI-1抗体检测试剂。
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