CN110679588A

CN110679588A - 一种嵌合抗原受体t细胞冻存介质及用途

Info

Publication number: CN110679588A
Application number: CN201911008857.7A
Authority: CN
Inventors: 叶国栋; 董康梅; 张丽芳; 许剑雄; 陈茂立; 韩大雄; 郭奇伟; 李汉杰
Original assignee: Xiamen Life Interconnect Technology Co Ltd
Current assignee: Xiamen Life Interconnect Technology Co Ltd
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体T细胞冻存介质及用途。其含有：体积浓度为5‑15％的DMSO，质量浓度为2％‑25％的葡萄糖，质量浓度为5‑40％的人血清白蛋白,质量浓度为2‑35％的葡聚糖40，质量浓度为0.2‑1％的氯化钠，体积浓度为5‑40％的plasmalyte‑A，所有成分均是采用无血清培养基X‑vivo15配置而成。采用所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质冻存的CAR‑T细胞具有更高的活细胞率，同时其嵌合抗原受体T细胞可直接静脉回输。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞冻存介质及用途

技术领域

本发明涉及细胞领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体T细胞冻存介质及用途。

背景技术

免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。尽管免疫治疗历经了多年断断续续的发展，但是其研究正在取得越来越多令人激动的结果，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。

CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是利用基因工程技术手段，特异性改造患者自身的免疫T细胞，使其能够识别肿瘤细胞，从而实现特异性杀伤的作用。

CAR-T免疫细胞治疗一般治疗流程是：(1)先从癌症患者身上分离出免疫T细胞；(2)利用基因工程技术手段对其进行特定基因改造，使T细胞表面表达一种能识别肿瘤细胞的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)，T细胞转变成CAR-T细胞，进而能靶向杀死肿瘤细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞；(4)把扩增好的CAR-T细胞输回患者体内，特异性地杀死癌细胞。

2017年12月22日，国家食药监总局(CFDA)官网发布细胞治疗产品研究与评价技术指导原则的通告，明确CAR-T免疫细胞治疗产品按照药品进行管理。因此，在CAR-T细胞体外大量扩增培养后，在维持CAR-T细胞生物学活性不变的情况下，CAR-T免疫细胞制品的长期保存和长距离运输是必要的，而CAR-T免疫细胞的有效冻存则为其作为药物进行产业化应用提供必要的基础技术保障。

细胞冻存液是直接影响冻存后细胞存活率。目前市面上的免疫细胞冻存液多以胎牛血清、高比例DMSO(达到10％)、患者自体血浆，这些冻存液存在以下问题：(1)冻存效果差；(2)冻存液成分不明确；(3)冻存过程和后续应用程序相对繁琐；(4)成本过高；(5)不适于形成产业化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻存效果更好嵌合抗原受体T细胞冻存介质。

为实现上述目的，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞冻存介质，其特征在于，含有以下各成分：DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为2％-25％，人血清白蛋白的质量浓度为5-40％,葡聚糖40的质量浓度为2-35％，氯化钠的质量浓度为0.2-1％，plasmalyte-A体积浓度为5-40％，所有成分均是采用无血清培养基X-vivo15配置而成。

进一步，DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为2％-25％，人血清白蛋白的质量浓度为5-40％,葡聚糖40的质量浓度为2-35％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为5-40％。

进一步，DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-15％，人血清白蛋白的质量浓度为10-25％,葡聚糖40的质量浓度为15-35％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为30％。

进一步，DMSO的体积浓度为8％，葡萄糖的质量浓度为8％，人血清白蛋白的质量浓度为10％,葡聚糖40的质量浓度为30％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为30％。

本发明还提供一种采用所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质进行体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，使用了所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质。

进一步，用预冷的所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质重悬CAR-T细胞后，转移至冻存管或者冻存袋中；置于-80℃进行冷冻，待冷冻完全后，转移至液氮罐中保存即可。

进一步，所述CAR-T细胞经过以下处理：将收集的CAR-T细胞离心后，再用生理盐水洗涤；优选的，再用生理盐水洗涤1-3遍。

进一步，所述离心的条件为200-400g条件下，离心5-8min。

进一步，所述CAR-T细胞的冻存密度为5x10⁶个/ml-50x10⁶个/ml。

进一步，冻存的CAR-T细胞在之后使用时，从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴锅中解冻后使用。

本发明中，氯化钠溶液和无血清培养基X-vivo15基础培养基作为冻存介质的主要液体基质，plasmalyte-A、葡萄糖、和人血白蛋白、葡聚糖40主要作为细胞在液体状态下的保护剂。二甲基亚砜作为冻存保护剂，保护细胞在冻存的降温过程中，不形成大的液体结晶而损坏细胞，二甲基亚砜浓度过高在病人直接回输过程中会带来副反应。

采用本发明嵌合抗原受体T细胞冻存介质冻存的细胞可直接静脉回输。

本发明所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质用来冻存细胞后复苏的细胞活率均较高，达到86-94％。

附图说明

图1为本发明实施例1-6和对比例的超低温冻存复苏后的活细胞率结果比较图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中：

X-vivo15基础培养基：Thermo

葡聚糖40：购自Baxter AG

二甲基亚砜、氯化钠、葡萄糖：购自Sigma Aldrivh

plasmalyte-A：Thermo

生理盐水：购自武汉福星生物药业有限公司

实施例1-6：嵌合抗原受体T细胞冻存介质的制备

原料：见表1。

制备方法：称取各种原料混匀即制备得到嵌合抗原受体T细胞冻存介质。

表1：实施例1-实施例6嵌合抗原受体T细胞冻存介质的原料配比表

实施例7：使用嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞

材料：CAR-T细胞，按中国专利申请201610014730.6方法制备。(也可以是其他来源的CAR-T细胞)

嵌合抗原受体T细胞冻存介质：实施例1-实施例6所得的嵌合抗原受体T细胞冻存介质。

步骤：

1)CAR-T细胞分离

a)将培养9天后的CAR-T细胞混匀后，转移至50ml离心管中，在300g条件下，离心5min，弃掉上清。

b)将离心后的细胞团用15ml，0.9％氯化钠生理盐水重悬，确认细胞团已被完全被打碎，加0.9％氯化钠生理盐水至30ml，在磁力架上静置3min，通过磁力架的磁性实现磁珠跟细胞的分离。

c)用移液管将细胞悬液转移至新的50ml离心管中，重复去磁珠操作两次。

d)将去除磁珠后的细胞悬液在300g离心条件下，离心5min，弃上清，备用。

2)CAR-T细胞冻存制剂

a)CAR-T细胞的冻存密度为5x10⁶个/ml，根据需冻存的细胞总数，将细胞重悬于嵌合抗原受体T细胞冻存介质中，确认细胞团被完全打碎。

b)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，置于-80℃冰箱中，待细胞冷冻后，转移至液氮中保存。

实施例8：效果验证实验

材料：实施例7得到的CAR-T细胞冻存制剂，

台盼蓝染色试剂；

商业冻存液CryoStor_TMCS10，购自STEMCELL Technologies。

肿瘤细胞株：jurkat细胞株，购自中国典型培养物保藏中心。

2、方法

1)细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，立即放入37℃水浴槽中快速解冻；待完全融化后，将细胞缓和也缓慢加入15ml的T细胞完全培养基的离心管中，轻柔混合均匀，在300g条件下，离心5min，弃上清备用。

2)细胞存活率测定

CAR-T细胞在低温保存液中制剂后，30天后取样，用台盼蓝染色后再显微镜下观察、计数；结果见表2。

表2采用实施例1-6的嵌合抗原受体T细胞冻存介质冻存细胞后复苏的细胞活率(％)

由表2可知，实施例1-6所得到的嵌合抗原受体T细胞冻存介质用来冻存细胞后复苏的细胞活率均较高，达到86-94％。实施例6冻存后复苏的细胞活率最高达到94％。

细胞复苏存活率测定效果见图1(超低温冻存复苏后的活细胞率结果图)从图1可以看出：采用本发明所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质冻存的CAR-T细胞与商业冻存液冻存的CAR-T细胞相比，具有更高的活细胞率。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种嵌合抗原受体T细胞冻存介质，其特征在于，含有以下各成分：DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为2％-25％，人血清白蛋白的质量浓度为5-40％,葡聚糖40的质量浓度为2-35％，氯化钠的质量浓度为0.2-1％，plasmalyte-A体积浓度为5-40％，所有成分均是采用无血清培养基X-vivo15配置而成。

2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质，其特征在于，DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为2％-25％，人血清白蛋白的质量浓度为5-40％,葡聚糖40的质量浓度为2-35％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为5-40％。

3.根据权利要求2所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质，其特征在于，DMSO的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-15％，人血清白蛋白的质量浓度为10-25％,葡聚糖40的质量浓度为15-35％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为30％。

4.根据权利要求3所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质，其特征在于，DMSO的体积浓度为8％，葡萄糖的质量浓度为8％，人血清白蛋白的质量浓度为10％,葡聚糖40的质量浓度为30％，氯化钠的质量浓度为0.9％，plasmalyte-A体积浓度为30％。

5.一种采用权利要求1-4任一项所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质进行体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，使用了权利要求1-4任一项所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质。

6.根据权利要求5所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，用预冷的所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质重悬CAR-T细胞后，转移至冻存管或者冻存袋中；置于-80℃进行冷冻，待冷冻完全后，转移至液氮罐中保存即可。

7.根据权利要求5所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞经过以下处理：将收集的CAR-T细胞离心后，再用生理盐水洗涤；优选的，再用生理盐水洗涤1-3遍。

8.根据权利要求7所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述离心的条件为200-400g条件下，离心5-8min。

9.根据权利要求6所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞的冻存密度为5x10⁶个/ml-50x10⁶个/ml。

10.根据权利要求5所述嵌合抗原受体T细胞冻存介质体外冻存CAR-T细胞的方法，其特征在于，冻存的CAR-T细胞在之后使用时，从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴锅中解冻后使用。