CN110628751B - 一种瑞替普酶的突变体设计及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种瑞替普酶突变体及其应用，该突变体包括在自剪切环区两个氨基酸的全新突变位点，包括丙氨酸和脯氨酸在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。将该突变体命名为：瑞替普酶突变体。本发明突变体，具有显著抵抗其内源性抑制剂（PAI‑1）抑制和增强纤溶酶原激活的能力，可作为血栓性疾病药物，用于治疗包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓在内的多种疾病。

Description

一种瑞替普酶的突变体设计及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及瑞替普酶突变体及其应用。

背景技术

随着我国人民日常生活水平的提高，脑卒中的发病率明显升高。据统计，中国每年新发脑中风病人达200万，发病率高达120/10万。2012年幸存中风病人700万，其中450万病人不同程度丧失劳动力和生活不能自理，致残率高达75%。多年来，脑卒中一直是临床上非常重视的一种疾病，无论是研究还是临床治疗，关注的目光一直集中在降低病死率、减少并发症和促进躯体功能的恢复等方面。在我国，据统计每年有300万人需要溶栓药物治疗。溶栓治疗是血栓性疾病治疗的重要手段，溶栓药物是通过溶解血栓、增加心肌血流、改善供氧使梗死范围缩小、改善缺血区的脑神经细胞损伤，从而使的临床治疗得到很大幅度的提高。国际多个大型临床实验证实，溶栓治疗可以降低急性缺血性脑卒中病死率30%以上。

组织型纤溶酶原激活剂 (tissue type plasminogen activator，tPA) 是血液中纤溶系统的生理性激活剂。天然tPA由527个氨基酸组成，它包含五个结构域分别是：1、指型区（F区，4-49位氨基酸）与纤维蛋白结合相关。2、表皮生长因子区（E区，50-86位氨基酸）与细胞膜受体结合有关。3、kringle 1(K1区, 87-175氨基酸)为肝脏受体结合部位。4、kringle 2(K2区, 176-261氨基酸)含有纤维蛋白结合位点。5、水解酶结构域区（SPD区，262-527氨基酸）催化纤溶酶原转化成纤溶酶，并且是PAI-1的结合位点。阿替普酶是tPA的重组蛋白，它是临床上常用的溶栓药物，但它的临床使用还具有一定的局限性，具体表现在：阿替普酶易被内源性抑制剂PAI-1抑制，使其失去活性，导致溶栓效率降低。临床上为了增加疗效需要使用高剂量溶栓剂（高达90mg/Kg），而这可能会导致严重的出血副作用以及神经毒性。因此从1996年阿替普酶首次应用于临床的这20多年以来，科学家们和医药公司也对该药物进行过多次的探索，试图改进现有的溶栓药或者研发新的溶栓药，但始终没有太大的进展与突破。与阿替普酶比较，另一个已上市的溶栓剂瑞替普酶是删除了E和F区、仅仅含有K2和蛋白酶结构域（SPD）的突变体。瑞替普酶改进的优势是对凝块的渗透性更高，缺点是不能抵抗内源性抑制剂PAI-1的抑制。而替奈普酶的改进具有更长的半衰期，并且对PAI-1的耐药性提高了80倍，对纤维蛋白特异性提高了14倍。但是替奈普酶的抵抗能力还不够,并且没有表现出增强对纤溶酶原激活能力。

因此，在临床上，亟需开发溶栓效率高且出血风险低的新型溶栓药物，并用于治疗急性缺血性脑卒中、急性心肌梗塞、肺栓塞等血栓栓塞性疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瑞替普酶突变体及其应用，该突变体具有显著的抵抗内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和更强的激活纤溶酶原的能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该突变位点位于瑞替普酶的自剪切环区。以瑞替普酶（K₂SPD）为基础，将自剪切环区的丙氨酸突变为酪氨酸，脯氨酸突变为碱性氨基酸，所述碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的任意一种。

优选地，将自剪切环区的丙氨酸突变为酪氨酸，脯氨酸突变为精氨酸，突变体氨基酸序列分别为：

SEQ ID NO.1：

SYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEYLSRFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP

获得的瑞替普酶突变体比瑞替普酶有更高的PAI-1抵抗能力和纤溶酶原激活能力。

以上所述瑞替普酶的自剪切环区的脯氨酸除突变为精氨酸外，还包括赖氨酸和组氨酸中的任何一种。在本发明实例中已经证明将自剪切环区的丙氨酸替代为酪氨酸，脯氨酸替代为精氨酸后，既能提高抵抗内源性抑制剂PAI-1的能力，又能增强激活纤溶酶原的能力。

进一步地，将瑞替普酶突变体应用于制备血栓栓塞性疾病药物中。

本发明的优点在于：

本发明瑞替普酶的突变体，将自剪切环区的丙氨酸和脯氨酸分别突变为酪氨酸和精氨酸后的突变体具有显著抵抗被内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。通过实施实验证明，本发明瑞替普酶突变体在体外溶解栓块中具有更优的溶栓效果。该突变体能够应用于制备治疗血栓栓塞性疾病的药物，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒中等疾病。

附图说明

图1：蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；1为瑞替普酶突变体，2为蛋白marker。

图2：显色底物法检测瑞替普酶突变体酶的活性。

图3：瑞替普酶突变体对纤溶酶原激活能力的评价。

图4：瑞替普酶突变体对PAI-1抵抗能力的检测。

图5：体外血栓溶解实验。在正常血液中，瑞替普酶突变体具有显著性的更强更快的血栓溶解能力。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的方法和其优点作进一步说明，但这些实施例并不构成对本发明权利要求范围的限制。在不脱离本发明主要特征的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

实施例1 瑞替普酶突变体的构建、表达和纯化

（1）pPICZα-K₂SPD质粒的构建

以人肝细胞cDNA为模板（NCBI Reference Sequence: NC_000008.11），用PCR方法扩增出K₂SPD基因片段。用限制性内切酶XhoI 和AgeI切割K₂SPD片段,并且用相同的内切酶XhoI 和AgeI切割pPICZαA质粒（pPICZαA质粒来自Invotrogen公司），用T4链接酶将K₂SPD片段连接到pPICZαA质粒中。将酶连产物经过42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单菌落，进行基因测序，将含有正确K₂SPD序列的DH5α菌种，进行扩大培养，采用EZNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提pPiczαA-K₂SPD质粒，以备下面实验使用。

K₂SPD基因片段序列如下：

tcttaccaagggaattgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacgcacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccagcctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggctgccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactcatcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaatttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacattgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtccgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctctccggctacggcaagcatgagtacttgtctaggttctattcggagcggctgaaggaggctcatgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtacaccaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg

pPICZαA质粒序列如下：

AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAACGCGTACCGGTCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATC。

（2）pPiczαA-瑞替普酶突变体质粒的构建与蛋白表达

所采用的PCR模板是上述（1）中的pPiczαA-K₂SPD质粒。

pPiczαA-瑞替普酶突变体引物设计：

Sense: 5’-aagcatgagtacttgtctaggttctattcggag-3’；

Antisense: 5’- atagaacctagacaagtactcatgcttgcc-3’。

PCR体系及PCR程序如下所示：

PCR体系：ddH₂O 35.5 μL，5×Q5 buffer 10μL，10mM dNTP 1μL，20mM Sense 1μL，20mM Antisense 1μL，Template 0.5μL(20ng)，Q5 1μL。

PCR程序：98℃ 30s，（98℃ 10s，71℃ 30s，72℃ 3min）×5cycle，（98℃ 10s，72℃3min）×30cycle，72℃ 5min，4℃保存。

加入1µL DpnI（Takara）至上述PCR产物中，37℃水浴锅消化3h。采用EZNA胶回收试剂盒（OMEGA）对PCR产物进行胶回收。42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单克隆测序，将含有正确突变的菌种进行25%甘油菌保存于-80℃冰箱待用。

挑取上述保存的甘油菌在LB培养基中进行活化、扩大，采用EZNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提pPiczαA- 瑞替普酶突变体质粒。对抽提的质粒进行线性化。

线性化体系：质粒 44μL，10×cutsmart buffer 5μL，PmeⅠ1μL。37℃，过夜。乙醇沉淀回收。

将回收得到的DNA片段电转到毕赤酵母X-33菌株。涂于YPDS（含终浓度100 µg/mlZeocin）平板，挑单菌落，小量表达进行验证。

将小量表达成功的毕赤酵母X-33接种于YPD（含终浓度100 µg/ml Zeocin），28℃培养至OD₆₀₀2-6，以1：10（v/v）接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4（v/v）接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1 %（v/v）的甲醇。收菌，离心10000rpm，30min，然后将上清液用孔径0.45 μm的滤膜抽滤，得到抽滤液。将抽滤液流过已经用平衡液(20 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM NaCl)平衡好的Ni-NTA柱(GE公司，流速5ml/min, 柱体积25 ml)，此时抽滤液中带有6个His标签的突变体蛋白就会结合在Ni-NTA柱上。再用五个柱体积的平衡液(20 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM NaCl)对Ni-NTA柱继续冲洗去杂蛋白。最后，用洗脱液(20 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM NaCl，500 mM 咪唑)对蛋白进行洗脱，对收集的蛋白用透析液(20 mM Tris-HCl pH 8.5，150 mM 的NaCl)进行透析两次，每次透析至少进行2个小时。透析后离心20分钟(20000rpm，Hitachi Koki CR22N 高速冷冻离心机，R20A2转头)去除沉淀。采用SDS-PAGE电泳对目的蛋白进行鉴定，由于 K₂SPD突变体含有N-糖基化，具有50KDa的分子量，见图1，测序的序列如SEQ ID NO.1所示。分析所得蛋白溶液用Millipore超滤管(10000Da)进行浓缩，然后分装，-80℃保存备用。

实施例2 瑞替普酶突变体的活性检测

用已报道的显色法 (chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行酶活性测定。其反应原理如下，在200 µL体积的反应体系中，加入一定浓度的瑞替普酶突变体。然后加入发光底物S2288(Chromogenix)，瑞替普酶及其突变体能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团- p-硝基苯胺(pNA)切下来。通过酶标仪检测405 nm的吸光度值就可以测定瑞替普酶的活性。

具体测定过程：

(a) 材料

经上述实施例1获得的瑞替普酶、瑞替普酶突变体、tPA底物S2288。

Buffer：20 mM Tris-HCl pH7.4，150 mM NaCl，0.2% BSA. 0.22 μm孔径滤膜过滤。

(b) 步骤

用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将瑞替普酶、瑞替普酶突变体稀释至200 nM，和配制1mM S-2288。根据需要加入到200 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：

164 μl buffer +20 μl 瑞替普酶+16 μl S-2288；

164 μl buffer+20 μl 瑞替普酶突变体+ 16 μl S-2288；

在最后加入发光底物S2288，并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处，30 s/ read进行检测60 min。每个测试至少重复3次。取平均值使用GraphPad Prism 5软件进行反应线性拟合。

酶活性测定结果（图2）显示，瑞替普酶突变体对发光底物S2288的切割反应速度比瑞替普酶高1.9倍，说明自剪切环区丙氨酸和脯氨酸突变后酶活性优于瑞替普酶。

实施例3 瑞替普酶突变体对天然底物纤溶酶原激活能力的检测

用已报道的显色法 (chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行测定。其反应原理如下，在200 µL体积的反应体系中，加入一定浓度的瑞替普酶及其突变体和纤溶酶原（Plasminogen,简称PLG），K₂SPD激活PLG生成纤溶酶（plasmin, 简称Pn），然后加入Pn特异性的发光底物S2403，Pn能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团-p-硝基苯胺(pNA)切下来，而瑞替普酶自身并不会酶切发光底物S2403。最后通过酶标仪检测405 nm的吸光度值就可以测定瑞替普酶及其突变体对PLG的激活能力。

具体测定过程：

(a) 材料

经上述实施例1获得的瑞替普酶、瑞替普酶突变体及PLG，Pn底物S-2403。

Buffer：20 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 0.2% BSA. 0.22 μm孔径滤膜过滤。

(b) 步骤

用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将瑞替普酶、瑞替普酶突变体稀释至200 nM，配制1μM PLG，1mM S-2403。根据需要加入到200 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：

64 μl buffer+60 μl PLG+60 μl 瑞替普酶+16 μl S-2403；

64 μl buffer+60 μl PLG+60 μl 瑞替普酶突变体+ 16 μl S-2403；

在最后加入发光底物S2403(Chromogenix)并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处，30 s/ read进行检测60min。每个测试至少重复3次。使用GraphPad Prism 5软件进行数据处理。

结果见图3，结果显示，瑞替普酶突变体对plasminogen的激活能力是瑞替普酶的8倍，说明自剪切环区丙氨酸和脯氨酸的突变显著增强了瑞替普酶对天然底物PLG的激活能力。

实施例4 瑞替普酶突变体对PAI-1抵抗能力的检测

用已报道的显色法 (chromogenic assay) [Gorlatova NV (2003). Mapping ofa conformational epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis. Implications for serpin function. J Biol Chem. ]进行测定。其反应原理如下，在200µL体积的反应体系中，加入20nM 瑞替普酶突变体与20 nM的PAI-1反应10min，瑞替普酶突变体会被PAI-1抑制，然后加入S-2288，未与PAI-1结合的瑞替普酶突变体会切割S-2288并释放发色基团- p-硝基苯胺(pNA)，最后通过酶标仪检测405 nm的吸光度值就可以测定残留的瑞替普酶突变体的酶活，来间接计算出瑞替普酶突变体对PAI-1的抵抗能力。

具体测定过程：

(a) 材料

经上述实施例1获得的瑞替普酶、瑞替普酶突变体及PAI-1, tPA底物S-2288。

Buffer：20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.2% BSA. 0.22 μm孔径滤膜过滤。

(b) 步骤

用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将瑞替普酶、瑞替普酶突变体稀释至200 nM，和配制1mM S-2288。将PAI-1稀释至 200 nM，根据需要加入到200 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：

144 μl buffer+20 μl瑞替普酶+20 μl PAI-1+16 μl S-2288；

144 μl buffer+20 μl 瑞替普酶突变体+20 μl PAI-1+16 μl S-2288；

其中将瑞替普酶突变体与PAI-1预先孵育10min，然后充分混匀且尽量避免产生气泡，最后加入发光底物S2288(Chromogenix)并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405nm处，30 s/ read进行检测60min。每个测试至少重复3次。数据处理采用GraphPad Prism 5软件。

结果如图4，结果显示，瑞替普酶突变体抵抗PAI-1的抑制能力是瑞替普酶的1.52倍，说明自剪切环区丙氨酸和脯氨酸的突变逃逸PAI-1的抑制能力优于瑞替普酶。

实施例5 瑞替普酶突变体对血块的溶解

用已报道的血块溶解实验方法 (clot lysis assay) [Peng SZ (2017). Along-acting PAI-1 inhibitor reduces thrombus formation. Thromb Haemost. ]进行血栓溶解能力检测。由于Ca²⁺的加入会激活血液凝血反应，形成血栓，从而提高了反应体系的浑浊度，在405 nm的吸光度值具有最大的变化。其反应原理如下，在200 µL体积的反应体系中，加入30%人源血清与一定浓度的瑞替普酶突变体，再加入一定量的PAI-1反应10 min，然后加入Ca²⁺。最后通过酶标仪检测405 nm的吸光度值的变化来评价瑞替普酶突变体的溶解血栓的能力。

具体测定过程：

(a) 材料

经上述实施例1获得的瑞替普酶、瑞替普酶突变体，CaCl₂溶液。

人源血清（简称：PPP），来自健康的自愿者的血液。通过3500 rpm离心10 min 获得。

Buffer：20 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl. 0.22 μm孔径滤膜过滤。

(b) 步骤

用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将瑞替普酶、瑞替普酶突变体稀释至1 μM，和配制100mM CaCl₂溶液。根据需要加入到100 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：

60μl buffer+30μl PPP +10μl 100mM CaCl₂；

50μl buffer+30μl PPP+10μl 瑞替普酶+10μl 100mM CaCl₂；

50μl buffer+30μl PPP+10μl瑞替普酶突变体+10μl 100mM CaCl₂；

将上述瑞替普酶和瑞替普酶突变体与含有30%的PPP充分混匀且尽量避免产生气泡，最后加入Ca²⁺，充分混匀后，放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处，30 s/ read进行检测60 min。每个测试至少重复3次，取平均值。数据处理采用GraphPad Prism 5软件。

结果见图5，结果显示，瑞替普酶突变体比瑞替普酶具有更快更强的溶解血栓的能力。24分钟后瑞替普酶突变体已将血块完全溶解，而瑞替普酶尚未能溶解血块。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种瑞替普酶的突变体设计及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp

20 25 30

Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser

35 40 45

Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

50 55 60

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr

65 70 75 80

Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln

85 90 95

Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile

100 105 110

Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser

115 120 125

Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp

130 135 140

Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His

145 150 155 160

Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu

165 170 175

Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp

180 185 190

Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp

195 200 205

Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu

210 215 220

Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser

225 230 235 240

Gly Tyr Gly Lys His Glu Tyr Leu Ser Arg Phe Tyr Ser Glu Arg Leu

245 250 255

Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln

260 265 270

His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp

275 280 285

Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly

290 295 300

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu

305 310 315 320

Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro

325 330 335

Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn

340 345 350

Met Arg Pro

355

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcttaccaag ggaattgcta ctttgggaat gggtcagcct accgtggcac gcacagcctc 60

accgagtcgg gtgcctcctg cctcccgtgg aattccatga tcctgatagg caaggtttac 120

acagcacaga accccagtgc ccaggcactg ggcctgggca aacataatta ctgccggaat 180

cctgatgggg atgccaagcc ctggtgccac gtgctgaaga accgcaggct gacgtgggag 240

tactgtgatg tgccctcctg ctccacctgc ggcctgagac agtacagcca gcctcagttt 300

cgcatcaaag gagggctctt cgccgacatc gcctcccacc cctggcaggc tgccatcttt 360

gccaagcaca ggaggtcgcc cggagagcgg ttcctgtgcg ggggcatact catcagctcc 420

tgctggattc tctctgccgc ccactgcttc caggagaggt ttccgcccca ccacctgacg 480

gtgatcttgg gcagaacata ccgggtggtc cctggcgagg aggagcagaa atttgaagtc 540

gaaaaataca ttgtccataa ggaattcgat gatgacactt acgacaatga cattgcgctg 600

ctgcagctga aatcggattc gtcccgctgt gcccaggaga gcagcgtggt ccgcactgtg 660

tgccttcccc cggcggacct gcagctgccg gactggacgg agtgtgagct ctccggctac 720

ggcaagcatg agtacttgtc taggttctat tcggagcggc tgaaggaggc tcatgtcaga 780

ctgtacccat ccagccgctg cacatcacaa catttactta acagaacagt caccgacaac 840

atgctgtgtg ctggagacac tcggagcggc gggccccagg caaacttgca cgacgcctgc 900

cagggcgatt cgggaggccc cctggtgtgt ctgaacgatg gccgcatgac tttggtgggc 960

atcatcagct ggggcctggg ctgtggacag aaggatgtcc cgggtgtgta caccaaggtt 1020

accaactacc tagactggat tcgtgacaac atgcgaccg 1059

<210> 3

<211> 3481

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960

tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020

agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080

tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140

tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagaacgcg 1200

taccggtcat catcatcatc atcattgagt ttgtagcctt agacatgact gttcctcagt 1260

tcaagttggg cacttacgag aagaccggtc ttgctagatt ctaatcaaga ggatgtcaga 1320

atgccatttg cctgagagat gcaggcttca tttttgatac ttttttattt gtaacctata 1380

tagtatagga ttttttttgt cattttgttt cttctcgtac gagcttgctc ctgatcagcc 1440

tatctcgcag ctgatgaata tcttgtggta ggggtttggg aaaatcattc gagtttgatg 1500

tttttcttgg tatttcccac tcctcttcag agtacagaag attaagtgag accttcgttt 1560

gtgcggatcc cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag 1620

attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa 1680

attttccctc tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag 1740

aaaaaagaga ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca 1800

cgtttctttt tcttgaaatt ttttttttta gtttttttct ctttcagtga cctccattga 1860

tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 1920

ttacaacttt ttttacttct tgttcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagggg 1980

cggtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag 2040

gaactaaacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc 2100

cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga 2160

cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt 2220

ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga 2280

gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat 2340

cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca 2400

cttcgtggcc gaggagcagg actgacacgt ccgacggcgg cccacgggtc ccaggcctcg 2460

gagatccgtc ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt 2520

cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 2580

aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa 2640

tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc 2700

ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa gctggagacc aacatgtgag 2760

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2820

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2880

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2940

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 3000

tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 3060

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 3120

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 3180

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 3240

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 3300

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 3360

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3420

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3480

c 3481

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagcatgagt acttgtctag gttctattcg gag 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atagaaccta gacaagtact catgcttgcc 30

Claims (3)

1.一种瑞替普酶的突变体，其特征在于，所述突变体的突变位点位于瑞替普酶的自剪切环区，以瑞替普酶为基础，将自剪切环区的丙氨酸突变为酪氨酸，脯氨酸突变为精氨酸，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的瑞替普酶的突变体蛋白在制备提高PAI-1抵抗能力和纤溶酶原激活能力的药物中的应用。

3.一种如权利要求1所述的瑞替普酶的突变体蛋白在制备血栓栓塞性疾病药物中的应用。

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