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CN110613838A - 增强细胞通透性的多肽及其应用 - Google Patents

增强细胞通透性的多肽及其应用 Download PDF

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CN110613838A
CN110613838A CN201810631663.1A CN201810631663A CN110613838A CN 110613838 A CN110613838 A CN 110613838A CN 201810631663 A CN201810631663 A CN 201810631663A CN 110613838 A CN110613838 A CN 110613838A
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CN
China
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polypeptide
seq
tumor
cancer
tnf
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CN201810631663.1A
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姜石松
逯文姝
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Shanghai Jia Wen Yingli Biological Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供衍生自TNF的、能够增强细胞通透性的多肽。所述多肽可以与需要穿过任何血管进入组织(如血脑屏障，血胎屏障、呼吸道及肠道粘膜‑血管屏障、血管与正常或肿瘤组织、淋巴与正常或肿瘤组织等等)的药物联用，从而增强所述药物穿过血管或淋巴管屏障。本发明还提供衍生自TNF的、能够破坏血管淋巴管内皮细胞结构、阻断血管淋巴管输送渠道从而抑制肿瘤转移的多肽。所述多肽可以与其它抗肿瘤药物联用以增强抗肿瘤作用。本发明还提供包含所述多肽的药物组合物。

Description

增强细胞通透性的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域；具体地说，本发明涉及一种能够增强细胞通透性的多肽及其应用。
背景技术
内皮细胞是一薄层的专门上皮细胞，它形成血管及淋巴管的内壁，也是血脑屏障的最主要组成部分。内皮细胞有序排列，形成一个半渗透屏障，在血液和间质的选择性转运中起关键作用。由内皮细胞形成的血脑屏障可以阻挡有害物质进入大脑。
然而，从另一方面看，内皮细胞形成的血脑屏障对绝大多数药物亦具有完全的屏蔽作用。因此，大多数需要穿过血脑屏障的药物无法达到病灶部位(比如脑部肿瘤)，从而不能发挥其治疗作用；或者为实现治疗作用，只能提高给药剂量，从而为接受者带来更大的副作用。
肿瘤坏死因子(TNF)是一种由激活的巨噬细胞产生的重要细胞因子。虽然已知TNF可以通过其受体来增强内皮细胞的通透性，有助于打开血脑屏障。但是TNF的多功能性会引起其它副作用比如炎症反应，从而限制了TNF多临床应用。
另外，如果某类药物能引起血管淋巴管的过度破坏或破坏肿瘤血管新生，则可以利用抑制肿瘤转移。已知TNF在某些情况下具有类似功能。但同样的TNF的多功能性(例如引起炎症反应)限制了其在这方面多应用。
因此，本领域急需能够提高血管淋巴管内皮细胞通透性的、安全有效的增加血管通透性药物输送手段；以及破坏血管新生，抑制肿瘤转移的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高组织细胞，特别是内皮细胞通透性的、安全有效的物质手段；以及破坏血管新生，抑制肿瘤转移的物质手段。
在第一方面，本发明提供多肽在制备增强组织细胞通透性的药物中的应用，其特征在于，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
在优选的实施方式中，所述TNF为TNFα，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在具体的实施方式中，所述细胞是内皮细胞。
在具体的实施方式中，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)、P14(SEQ ID NO:11)、P15(SEQ ID NO:6)、P16(SEQ IDNO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
在具体的实施方式中，所述应用是增强需要穿过血管或淋巴管屏障的药物穿过血管或淋巴管屏障。
在优选的实施方式中，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间障碍的药物穿过血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间的障碍。
在优选的实施方式中，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障、呼吸道及肠道粘膜-血管屏障、血管与正常或肿瘤组织、淋巴与正常或肿瘤组织等等。
在优选的实施方式中，多肽增加血管通透性但不破坏内皮细胞结构。
在优选的实施方式中，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P22(SEQ ID NO:3)、P14(SEQ ID NO:11)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)；更优选P22(SEQ ID NO:3)、P14(SEQ ID NO:11)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)；更优选P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)。
在第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含多肽和需要穿过血管或淋巴管屏障的药物以及任选的药学上可接受的赋形剂，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
在优选的实施方式中，所述TNF为TNFα。
在优选的实施方式中，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间障碍的药物穿过血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间的障碍。
在优选的实施方式中，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障、呼吸道及肠道粘膜-血管屏障、血管与正常或肿瘤组织、淋巴与正常或肿瘤组织等等。
在具体的实施方式中，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P14(SEQ ID NO:11)、P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)、P15(SEQ ID NO:6)、P16(SEQ IDNO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
在优选的实施方式中，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P14(SEQ ID NO:11)、P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)；更优选P22(SEQ ID NO:3)、P14(SEQ ID NO:11)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)；更优选P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)。
在优选的实施方式中，所述需要穿过血脑屏障的药物包括但不限于治疗神经性及脑部疾病的药物，如阿尔兹海默、帕金森、脑部肿瘤等。
在优选的实施方式中，所述需要穿过血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间障碍的药物包括但不限于：大分子的多肽药物、抗体药物、不易通过血脑屏障的造影剂，例如钆等。
在第三方面，本发明提供一种多肽，所述多肽是P1213(SEQ ID NO:4)。
在第四方面，本发明提供多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
在优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物是抑制肿瘤转移的药物。
在优选的实施方式中，所述多肽是P15(SEQ ID NO:6)、P16(SEQ ID NO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
在第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含多肽和其它抗肿瘤药物以及任选的药学上可接受的赋形剂，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
在优选的实施方式中，所述多肽是P15(SEQ ID NO:6)、P16(SEQ ID NO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
在优选的实施方式中，所述其它抗肿瘤药物是针对中晚期肿瘤的药物，包括但不限于针对乳腺癌、神经胶质瘤、口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、结肠癌、肛门癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、壶腹癌、鼻咽癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、骨癌、骨髓癌、T及B细胞淋巴瘤、白血病、何杰金氏瘤、非何杰金氏瘤、卡波氏肉瘤、头颈部肿瘤、脑瘤、甲状腺癌、胸腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、阴道癌的药物。
在第六方面，本发明提供一种多肽，所述多肽是P1516(SEQ ID NO:8)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示本发明的多肽能够显著增强单层内皮细胞通透性；
图2显示本发明的多肽P12、P13、P1213、P22为凋亡类多肽，可以引起细胞凋亡；P15、P16和P1516为坏死类多肽，引起细胞坏死；
图3显示本发明的凋亡类多肽或者坏死类多肽的代表多肽在不同浓度下对单层内皮细胞通透性的影响。凋亡类多肽P13在较低浓度下，具有和TNF相类似的引起细胞通透性增强的作用；而坏死类多肽P15需要较高浓度才能增强细胞通透性；
图4显示本发明的P13、P1213多肽改变细胞骨架构象，增强细胞通透性。多肽P13处理内皮细胞3小时后，F-actin构象发生明显改变，肌动蛋白缩紧，细胞间出现空隙；6小时后，空隙明显变大。多肽P1213处理内皮细胞3小时后，细胞间出现空隙；6小时后，细胞间空隙开始变小，细胞慢慢恢复；
图5显示本发明的多肽P15、P16处理内皮细胞后，造成细胞骨架的混乱和细胞形状的改变；
图6显示了本发明的坏死类多肽，如P15、P16在较低浓度(5μM)可以有效引起内皮细胞坏死；而凋亡类多肽，如P13需要较高浓度才能引起内皮细胞的死亡。
图7显示了本发明的多肽P1516杀死4T1肿瘤细胞的LD50浓度为22.6μM(A)，在4T1小鼠肿瘤模型中，能轻微抑制小鼠肿瘤生长(B)；显著提高接种4T1肿瘤的小鼠存活率(C)；
图8显示了本发明的P1516给药小鼠肿瘤组织中的血管通透性高度增加，血细胞透过血管，浸润到肿瘤细胞间；
图9显示了本发明的P1516给药的4T1接种肿瘤小鼠肺和肝组织中看不到明显的肿瘤转移。同样接种4T1肿瘤细胞的PBS对照给药组，肺和肝组织中明显可见转移的肿瘤(如图中黑色箭头所示)。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现衍生自TNFα的多肽对血管淋巴管内皮细胞的敏感性超过对其它(比如正常或者肿瘤)组织，这些多肽能够提高内皮细胞的通透性，从而增强药物穿过血脑屏障；本发明的多肽还可以破坏血管淋巴管结构，阻断血管淋巴管运输途径，从而抑制肿瘤转移。在此基础上完成了本发明。
肿瘤坏死因子(TNF)是一种由激活的巨噬细胞或淋巴细胞产生的重要细胞因子。TNF可以通过其受体来增强内皮细胞的通透性，从而有助于打开血脑屏障。但是TNF引起炎症反应，具有很强的副作用。本发明的TNF衍生的多肽能大大增强内皮细胞通透性，其增强内皮细胞通透性的效果甚至显著优于TNF本身，并且本发明的多肽具有在体内快速降解，副作用小的优点。
本发明的多肽及其应用
在本发明中，“本发明的多肽”、“多肽”、“衍生自TNF的多肽”均具有相同的含义，即，表示衍生自TNF，能显著增强组织细胞，特别是内皮细胞通透性的多肽。本文所用的术语“组织细胞”是指构成组织的细胞，例如构成内皮组织的内皮细胞或构成上皮组织的上皮细胞。进一步地，本发明的多肽能够显著增强组织细胞的通透性是指，例如本发明的凋亡型多肽通过使得细胞间出现空隙从而增强组织细胞通透性；或者本发明的坏死型多肽通过造成细胞骨架的混乱和细胞形状的改变，从而增强细胞本身的通透性。
本发明的多肽衍生自TNF，例如，TNFα，其长度可以为7-50个氨基酸；优选地，为10-40个氨基酸；最优选为10-30个氨基酸。
在具体的实施方式中，本发明的多肽是P14、P17、P22、P1213、P13、P15、P16、P1516；优选P14、P17、P22、P1213、P13；更优选P14、P22、P1213、P13；最优选P22、P1213、P13。
基于本发明的多肽的作用，即，增强组织细胞，特别是内皮细胞通透性，本领域技术人员应该知晓，本发明的多肽可进一步用于增强需要穿过血管或淋巴管屏障的药物穿过血管或淋巴管屏障。本领域技术人员知晓，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间障碍的药物穿过血脑屏障、血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间的障碍。在具体的实施方式中，所述血管或淋巴管屏障是血脑屏障、血胎屏障、呼吸道及肠道粘膜-血管屏障、血管与正常或肿瘤组织、淋巴与正常或肿瘤组织等等。
本文所述的“血脑屏障”与本领域技术人员常规理解的相同或相似，是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质，特别是是有害物质经由血液进入脑组织。
本文所述的“血胎屏障”与本领域技术人员常规理解的也相同或相似，是指由母体的子宫内膜的基蜕膜和胎儿绒毛膜共同组成的屏障。此屏障不影响母子间的物质交换，但在一般情况下可防止母体内的病原菌进入胎儿体内，使胎儿免受感染。
本领域技术人员知晓这种需要穿过血脑屏障的药物，包括但不限于：治疗神经性及脑部疾病的药物，如阿尔兹海默、帕金森、脑部肿瘤等药物；所述需要穿过血胎屏障或任何血管、毛细血管、淋巴管与组织之间障碍的药物包括但不限于：大分子的多肽药物、抗体药物、不易通过血脑屏障的造影剂，例如钆等。
本发明人进一步发现，本发明的多肽还能够破坏血管淋巴管内皮细胞结构(图5)，从而显著抑制肿瘤转移，从而能够用于制备抗肿瘤药物。在具体的实施方式中，所述抗肿瘤药物是抑制肿瘤转移的药物。在另一具体的实施方式中，本发明的多肽是P15、P16、P1516。
基于本发明的教导，本领域技术人员知晓，本发明的多肽可以与其它抗肿瘤药物联用以便在所述其它抗肿瘤药物发挥杀伤肿瘤细胞作用的同时抑制肿瘤的转移。在具体的实施方式中，所述其它抗肿瘤药物包括但不限于：乳腺癌、神经胶质瘤、口腔癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、结肠癌、肛门癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、壶腹癌、鼻咽癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、骨癌、骨髓癌、T及B细胞淋巴瘤、白血病、何杰金氏瘤、非何杰金氏瘤、卡波氏肉瘤、头颈部肿瘤、脑瘤、甲状腺癌、胸腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、阴道癌的治疗药物。
进一步地，肿瘤转移现象往往出现在肿瘤的中晚期，因此，本发明的多肽尤其可以与用于肿瘤中晚期的药物联用。
基于本领域公知常识，本领域普通技术人员知道，在多肽的非重要区域，例如两端，改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
因此，基于本发明的教导，本领域技术人员对本发明的多肽作突变而得到仍具备所需的功能和活性的突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-6个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。
因此，本发明应包括本发明的多肽的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
药物组合物
在本发明的多肽的基础上，本发明进一步提供增强细胞，特别是内皮细胞通透性的药物组合物；或者抗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明多肽和药学上可接受的载体。
本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的用量。
本文所用的术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明多肽作为活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型可以为固体形式或溶液形式，优选溶液形式，例如注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。根据治疗状况的要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体、活性成分的有效量以及给药方式都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明的主要优点在于：
1.本发明的多肽能显著增强细胞，特别是内皮细胞通透性；
2.本发明的多肽能显著提高药物穿过血脑屏障，从而降低药物的用量以及减轻药物的副作用；
3.本发明的多肽具有体内快速降解，副作用小的优点；和
4.本发明的多肽还能破坏内皮细胞结构，阻断血管淋巴管输送管道，抑制肿瘤细胞转移。
下面结合具体实施例，进一步详述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
材料与方法
细胞系、TNF及TNF衍生多肽
人淋巴细胞Jurkat A3细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)。人淋巴管内皮细胞由牛津大学王颖杰博士提供。TNF购自Immunotools(德国)。多肽委托浙江公司合成。
单层淋巴管内皮细胞通透性实验
使用96孔XCeligEnP SP仪器(罗氏诊断，英国)进行实验。先将原代人真皮淋巴管内皮细胞(HDLCEs)接种于0.1％明胶包被的96孔E-板(剑桥生物科学，英国)中，在MV(LunZa，Sulf，英国)培养液中培养5天，直到单层完全建立。每48小时更换新鲜培养液。细胞先在仪器内停留6小时，而后TNF衍生肽和对照(即PBS和TNF)被添加到细胞中，每隔10-15分钟收集数据，共收集20小时以上。通过软件监视、记录、存储和分析阻抗。该数据被呈现为阻抗与时间的曲线图，并以归一化细胞指数的曲线下面积(AUC)的形式定量分析，因为这能最好地显示细胞通透性随时间变化。
凋亡和坏死实验
在TNF多肽存在下，温育细胞过夜，然后用活/死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Paisley,英国)染色细胞，利用cytofix/cytoperm固定/透化溶液试剂盒(BD Pharmingen,牛津,英国)固定。然后利用FITC-偶联的抗-胱冬酶-3抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,马萨诸塞州,美国)作胞内染色。用CyAn流式细胞仪(Beckman Coulter,Fullerton,加利福尼亚州)获取细胞，利用Flowjo(Tree Star Inc.Ashland,俄勒冈州)分析数据。
细胞免疫荧光染色
人淋巴管内皮细胞在TNF(20ng/ml)、p13(5μM)、p15(5μM)或p16(5μM)存在下，37℃刺激3h或6h，在室温下将细胞用3％多聚甲醛固定10分钟。用0.5％Triton X-100穿孔，然后用1％FCS封闭30分钟，在室温下用Alexa Fulor 488-鬼笔环肽(Envithon，英国)孵育30min。然后洗涤细胞，用DAPI(Sigma，英国)对细胞核进行染色。使用ZeIS780倒置共聚焦激光扫描显微镜(ZeISS，剑桥，英国)对样品进行成像，并使用ZEN软件进行分析。
细胞活力测定
4T1细胞接种于96孔板中，每孔1000个细胞，在含10％胎牛血清的RBMI-1640培养基(Sigma，英国)中生长，5％CO2，37℃。用培养基稀释P1516多肽至不同工作浓度。每个稀释度做3个相同的孔。试验了六个不同浓度。然后将细胞孵育16小时，通过结晶紫染色评估细胞存活率。使用SigmaPlot 10软件计算半数致死量(LD50)。
4T1肿瘤小鼠模型实验
培养的4T1肿瘤细胞经胰蛋白酶消化，在无菌冰冻PBS中洗涤两次。6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，英国)16只，每只皮下注射100μl细胞悬液，共计1x106个细胞。每周用游标卡尺测量肿瘤长度、宽度和高度两到三次，计算体积＝(长度×宽度×高度)/0.52。从第8天，肿瘤体积达到100mm3开始，每周注射三次多肽p1516(1毫克/公斤)或PBS(对照组)，持续14天(共六组注射)。当肿瘤达到内政部许可证允许的最大尺寸(1.44平方厘米表面积)时，处死小鼠，取出肿瘤组织、肺和肝脏进行免疫组织化学研究。所有的小鼠研究都是按照英国内政部批准的协议进行的。
免疫组化实验
将福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织块、肺和肝样品切片、脱蜡至水。肿瘤切片与内皮细胞标记物CD31的抗体(R&D system)孵育1小时，随后与HRP标记的二抗孵育(R&Dsystem)。切片用DAB(棕色)染色，再用苏木精(蓝色)共染色。肺和肝切片用苏木精伊红(H&E)染色。
实施例
实施例1.本发明的多肽对内皮细胞通透性的影响
为了研究多肽对内皮细胞通透性的影响，本发明人采用了一系列的TNF衍生多肽作用于单层原代人淋巴管内皮细胞(hdlecs)。
结果如图1所示，表明TNF衍生多肽在不同程度上具有增强单层内皮细胞通透性的能力。测量分析显示，在给定的时间内，多肽P14、P17、P22、P1213、P13、P15、P16、P1516比TNFα能更有效的提高淋巴管内皮细胞通透性。
进一步地，本发明人对细胞内的肌动蛋白进行染色，结果显示多肽P1213、P13、P15、P16引起内皮细胞骨架结构不同程度的改变(如图4-5所示)。具体地说，多肽孵育3小时开始观察到许多结构变化；其中，多肽P13、P1213引起的变化相似，即，细胞边缘处肌动蛋白增多，细胞间出现缝隙(图4)。6小时后，TNF处理的细胞边缘处肌动蛋白仍然聚集，P13处理的细胞间间隙进一步增大，而P1213处理的细胞间开始重新形成胞间联系，细胞逐渐恢复正常。多肽P15、P16造成细胞骨架结构混乱及细胞形态的改变(图5)。
因此，本发明的多肽P12、P13、P1213和P22为凋亡类多肽，可以引起细胞凋亡；而P15、P16、P1516为坏死类多肽，引起细胞坏死。图3显示本发明的凋亡类多肽或者坏死类多肽的代表多肽在不同浓度下对单层内皮细胞通透性的影响。凋亡类多肽在较低浓度下，具有和TNF相类似的引起细胞通透性增强的作用；而坏死类多肽需要较高浓度才能增强细胞通透性。
实施例2.本发明的多肽对肿瘤转移的影响
越来越多的证据表明淋巴系统是几种癌症的主要转移途径。淋巴管内皮细胞通过粘附分子和细胞外基质降解蛋白酶的上调而在肿瘤血管生成和转移中发挥积极作用。
本发明人在在体外细胞培养实验中证明内皮细胞比肿瘤4T1细胞对P15、P16或P1516更敏感，5μM多肽可以引起大部分内皮细胞死亡(图6)，而对4T1有效杀伤则需要22.6μM以上的浓度(图7A)。4T1乳腺癌小鼠肿瘤转移模型上证明，尽管多肽P1516不能明显抑制小鼠肿瘤的生长，但是可以显著提高小鼠存活率(图7)，并且高度抑制小鼠体内肿瘤转移(图9)。我们给BALB/c小鼠皮下接种4T1肿瘤细胞，当肿瘤体积达到100mm3时，开始在肿瘤部位注射多肽P1516或PBS(对照组)。对肿瘤体积和存活率进行共计24天的检测，随后进行肿瘤、肺和肝的组织学检查。多肽p1516从第17天开始显示轻微的抑制肿瘤生长作用(图7B)。然而，本发明多肽处理的小鼠存活率提高40％(图7C)。组织学分析显示，多肽p1516治疗组小鼠肺和肝转移大量减少(图9)。使用抗-CD31(血管内皮标记物)抗体对小鼠肿瘤切片进行染色，结果表明P1516给药小鼠肿瘤组织中的血管通透性高度增加，引起广泛的血管损伤，血细胞透过血管，浸润到肿瘤细胞间(图8箭头示血细胞)。这些数据表明，多肽p1516导致肿瘤相关的血管功能损害从而抑制肿瘤转移，提高小鼠生存率。
本发明涉及的序列总结于下表：
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 姜, 石松
逯, 文姝
<120> 增强细胞通透性的多肽及其应用
<130> P2018-0771
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Leu Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
1 5 10 15
Cys Gln Arg Glu
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val
1 5 10 15
Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
20
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
20 25 30
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser
1 5 10 15
Gln Val Leu Phe
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
1 5 10 15
Ser Arg Ile Ala
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys
1 5 10 15
Val Asn Leu Leu
20
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
1 5 10 15
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu
20 25 30
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ala
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val
1 5 10 15
Pro Ser Glu Gly
20
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro
1 5 10 15
Ser Thr His Val
20

Claims (10)

1.多肽在制备增强组织细胞通透性的药物中的应用，其特征在于，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞是内皮细胞。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P22(SEQID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)、P14(SEQ ID NO:11)、P15(SEQ ID NO:6)、P16(SEQ ID NO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用是增强需要穿过血管或淋巴管屏障的药物穿过血管或淋巴管屏障。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含多肽和需要穿过血管或淋巴管屏障的药物以及任选的药学上可接受的赋形剂，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽是P17(SEQ ID NO:2)、P14(SEQ ID NO:11)、P22(SEQ ID NO:3)、P1213(SEQ ID NO:4)、P13(SEQ ID NO:5)、P15(SEQID NO:6)、P16(SEQ ID NO:7)、P1516(SEQ ID NO:8)。
7.一种多肽，所述多肽是P1213(SEQ ID NO:4)。
8.多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含多肽和其它抗肿瘤药物以及任选的药学上可接受的赋形剂，所述多肽衍生自TNF，所述多肽的长度为7-50个氨基酸，优选10-40个氨基酸，最优选10-30个氨基酸。
10.一种多肽，所述多肽是P1516(SEQ ID NO:8)。
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