CN110607371B - 一种胃癌标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胃癌标志物及其应用，特别是C10orf71基因、C10orf71蛋白、C10orf71基因检测引物试剂盒中的至少一种在制备用于预测GC患者对新辅助化疗的响应的产品中的应用。本发明首次确定了C10orf71基因突变为与肿瘤对新辅助化疗响应的关键分子特征，基于本发明的技术方案，新辅助化学疗法在改善预后以及在治疗开始之前确定响应性患者方面具有优势，因此可以制定更好的治疗方案。本发明的方案针对个别GC患者优化治疗策略的重要一步。

Description

一种胃癌标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种胃癌癌症标志物及其应用。

背景技术

胃癌(GC)是世界上最常见的癌症类型之一，也是癌症相关死亡的第二大常见原因(8.2％)。中国是GC患者最多的国家，根据中国国家中央癌症登记处的数据，新诊断的GC病例超过679,000例，每年约有498,000例与GC相关的死亡发生。这些患者大多数处于晚期，其5年生存率<30％。尽管外科手术治疗是GC的主要治疗方法，但仍采用多式联运策略以提高患者生存率。在尝试进行根治性切除术之前，新辅助(或围手术期)化学疗法可以“缩小肿瘤的大小”。此外，对于有高风险发生远处转移的GC患者，新辅助化疗通过消除潜在的癌细胞并为术后辅助化疗提供敏感的治疗方案，从而帮助降低风险。与单独手术相比，这种方法的好处已通过多项临床试验证明。目前，新辅助化疗常规用于可切除晚期GC患者的治疗。

新辅助化学疗法是GC患者的一种广泛应用的治疗选择，并且一些大型临床试验表明，新辅助化学疗法在改善预后以及在治疗开始之前确定响应性患者方面具有优势，因此可以制定更好的治疗方案。但是，相当一部分的GC患者对新辅助化疗的响应不佳。迄今为止，只有某些临床特征(例如年龄和术前体重减轻)可用于患者选择，但功能非常有限。此外，还不清楚新辅助化学疗法如何改变癌症信号传导并影响肿瘤微环境。对这些问题的透彻理解对于制定优化的多模态治疗计划至关重要。因此，迫切需要表征可预测治疗响应的分子标志物，并解读在新辅助化学疗法的压力下GC如何进化。

发明内容

为了预测GC患者对新辅助化疗的响应，从而针对个别GC患者优化治疗策略，本发明拟采用如下的技术方案。

本发明一方面涉及一种C10orf71基因、C10orf71蛋白、C10orf71基因检测引物试剂盒中的至少一种在制备用于预测GC患者对新辅助化疗的响应的产品中的应用。

C10orf71基因(肌肉特异基因)是现有技术已知的基因，但是，现有技术并未报道过其与GC患者对新辅助化疗的响应有关。出人预料的，本发明的发明人发现C10orf71突变在影响GC肿瘤对于新辅助化疗响应中具有关键作用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的产品中还包括MDM2和/或MYC拷贝数的检测试剂。通过使用C10orf71基因标志物和MDM2与MYC拷贝数检测试剂，其用于预测胃癌患者新辅助化疗应答的生物标志物时具有更高的预测准确性。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的用于新辅助化疗的药物包括采用顺铂作为治疗药物。本发明的发明人首次发现C10orf71突变与胃细胞系对顺铂的耐药性相关。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的用于新辅助化疗的药物包括氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂中的一种、两种或者三种。

在本发明的另一方面，还涉及C10orf71基因、C10orf71蛋白、C10orf71基因检测引物试剂盒中的至少一种在制备用于检测胃癌患者对于顺铂耐药性的试剂盒中的应用。

本发明另一方面还涉及一种用于治疗胃癌的试剂盒，其包括C10orf71基因、C10orf71蛋白、C10orf71基因检测引物试剂中的至少一种；还包括氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂中的一种、两种或者三种。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的C10orf71基因检测引物为用于检测C10orf71基因突变的引物。

有益效果

本发明首次确定了C10orf71基因突变为与肿瘤对新辅助化疗响应的关键分子特征，基于本发明的技术方案，新辅助化学疗法在改善预后以及在治疗开始之前确定响应性患者方面具有优势，因此可以制定更好的治疗方案。本发明的方案针对个别GC患者优化治疗策略的重要一步。

附图说明

图1：样品收集和治疗效果评估：(A)样品收集和多组学数据生成。研究包括35例在手术前接受新辅助化疗的GC患者。收集了治疗前的活检样本和治疗后的手术切除的肿瘤样本。根据严格评估的放射学和病理学证据，将患者分为响应组(n＝17)和无响应组(n＝18)。通过全外显子组测序(WES)、全基因组测序(WGS)和RNA测序(RNAseq)获得了治疗前样品和无响应-治疗后样品的多组学数据。(B)来自响应性和无响应性患者的代表性放射学和病理学图像。箭头指示病变部位。(C)响应和非响应组中的坏死率分布。(D)响应和无响应组中的Mandard肿瘤消退评分。

图2.治疗前GC样品中的突变特征：(A)在不同核苷酸背景下六种可能取代类型的比重。无应答组和应答组之间的COSMIC突变特征17的相对权重(B)和微卫星不稳定性(MSI)得分(C)。P值基于Wilcoxon rank-sum检验。(D)两组之间的肿瘤突变负担分布。P值基于单尾t检验。(B)-(D)方框的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5×四分位范围。

图3.治疗前GC样品中的显著突变的基因：(A)在治疗前的肿瘤样本中通过MuSiC2(FDR<0.05)鉴定出的选定显著突变基因(SMGs)。顶部和右侧的条分别显示了在每个患者观察到的突变率和所选基因中突变的组成。基因按其突变频率排序，不同类型的突变以不同的灰度颜色标记。(B)C10orf71在非响应样品中显示出显著的突变偏倚(p<0.045)。genecartoon中显示了突变位点。(C)C10orf71突变与胃细胞系对顺铂的耐药性相关，t检验，p＝1.1x10^-4。(D)基于反相蛋白质阵列中的8种蛋白质标记的细胞周期功能蛋白质组学分析。(E)C10orf71突变与胃细胞系中较低的细胞周期得分相关，t检验，p＝0.015。(F)一种拟议的机制模型，其中C10orf71突变通过引起较不活跃的细胞周期状态赋予对新辅助化疗的耐药性。

图4.治疗前GC样品中显著的体细胞拷贝数变化及其下游信号传导效应：(A)针对响应与无响应组绘制的体细胞拷贝数变化的扩增信号。在响应组中，两个癌基因MYC和CCNE分别位于8q24.21和19q21的唯一峰中，而TP53负调节剂MDM2在无响应组中的12q15的唯一峰中。无反应和反应组中的MYC(B)和MDM2(D)mRNA表达水平。P值基于单尾Wilcoxon rank-sum检验。方框中的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5×四分位范围。相对于无反应组，反应组中上调基因中MYC靶基因(C)和DNA修复途径(E)的富集。FDR基于基因集富集分析。

图5.新辅助化疗后的突变进化：(A)新辅助化疗前后的癌症基因突变图谱。(B)在治疗之后，顶部子网富含突变变化。圆圈的大小表示网络中发生突变的样本数量。(C)在四名患者的治疗前后C10orf71编码区的突变等位基因频率。P值基于成对的t-检验。不同患者的突变以不同灰度颜色显示。(D-E)两名患者中获得的C10orf71突变的假定进化的示意图。

图6.新辅助化疗后基因表达和肿瘤浸润免疫细胞的变化：(A)火山图显示了匹配的治疗前和治疗后样品之间差异表达的基因。重要的基因显示为深色(FC>2，FDR<0.05)。(B)新辅助化疗后显着下调的途径。在倍数变化＞2、FDR＜0.05时鉴定出显着差异表达的基因。条形颜色表示该途径中差异表达基因的数量。(C)热图，显示了由MYC扩增的肿瘤中的治疗驱动的MYC靶基因的mRNA表达倍数变化(治疗后/治疗前)。具有显着差异表达的基因(配对t检验，p<0.05)以浅色(下调)和深色(上调)标记。(D)在治疗前和治疗后样品中GC治疗靶标的差异表达。基于配对的Wilcoxon rank-sum计算P值。(E)在治疗前和治疗后样品中的中性粒细胞和树突状细胞的分数。基于配对t检验计算P值。(D)和(E)方框的中线是中位数，方框的底部和顶部是第一和第三四分位数，并且whiskers分别延伸到下部和上部四分位数的1.5×四分位范围。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

患者招募和样本队列

本项发明研究的GC患者(>T2N+M0，UICC-AJCC第8版)于2015年至2018年在北京大学肿瘤医院(中国北京)招募。该研究根据赫尔辛基的声明进行，并得到了北京大学癌症医院伦理委员会的批准(IRB批准号，2019KT05)。所有患者在治疗、样本收集和分析之前均提供了书面知情同意书。在新辅助治疗之前，通过活检收集了肿瘤并匹配了相邻的非肿瘤组织。对于没有可用的相邻非肿瘤组织的患者，取血样代替。然后，所有患者均接受以氟尿嘧啶为基础的卡培他滨/S-1+奥沙利铂治疗方案(XELOX[奥沙利铂，130mg/m2，静脉注射，第1天；卡培他滨，1000mg/m2，口服，第1至14天]或SOX[奥沙利铂130mg/m2，第1天静脉滴注；S-1，40-60mg，每天2次，口服，第1至14天]2-4个循环，并在手术前评估对治疗的响应。根据Mandard TRG评分评估病理学特征，该评分由三位独立的盲测病理学家(李忠武、刘以强和张立)根据标准对所有患者进行。如果没有证据表明肿瘤已升级并且Mandard TRG评分为1或2，则可以确定为响应。非响应被归类为已升级且Mandard TRG评分为4或5的肿瘤；排除MandardTRG评分为3的肿瘤(A.M.Mandard et al.,Pathologic assessment of tumorregression after preoperative chemoradiotherapy of esophagealcarcinoma.Clinicopathologic correlations.Cancer 73,2680-2686(1994).)。为了减少分类噪音，仅关注三位病理学家的共识评估患者，最后纳入35例患者(17例响应与18例未响应)作为研究队列。手术后进一步收集了肿瘤样本。对于有响应的患者，未收集治疗后的肿瘤样品。

多组学数据生成

对于35名GC患者，分别使用AllPrep DNA Mini Kit(QIAGEN)和QIAamp DNAbloodMini Kit(QIAGEN)提取组织(或血液)样本中的基因组DNA。对于全外显子组测序，使用Bioruptor(Diagenode)将1μg DNA剪切成短片段(150-250bp)。修复所得的DNA片段。然后将接头片段连接到片段的两端。选择目标大小的DNA片段。之后，进行聚合酶链式响应(PCR)，并将所得混合物纯化。根据制造商的方案，使用SureSelect Human All ExonV6(Agilent)进行外显子组捕捉。然后通过PCR扩增杂交的混合物。然后在IlluminaNovaSeq 6000上对经过验证的DNA文库进行测序。对于全基因组测序，使用Bioruptor(Diagenode)将1μg基因组DNA剪切至150-250bp。然后使用Truseq纳米DNAkit(Illumina)的标准方案生成DNA文库。使用Illumina NovaSeq 6000进行配对末端测序(paired-end runs)，对文库进行测序，至最小深度6×base coverage。对于RNA测序，使用AllPrep RNA mini kit(QIAGEN)从新鲜组织中提取了总RNA。对于每个样品，通过TruSeq RNAv2 kit(Illumina)使用3μg总RNA生成文库。该文库用Illumina NovaSeq 6000进行测序，且每个样品平均3,300万个2×150bp配对末端。

变异数据分析

修剪了全外显子组测序阅读对，且所保留的阅读对具有<3％N碱基和>50％高质量碱基。使用Burrows-WheelerAligner 0.7.17将所得的高质量读段与人类参考基因组(Homo_sapiens_assembly19)进行比对(H.Li,R.Durbin,Fast and accurate short readalignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics 25,1754-1760(2009))。为了提高比比对确性，使用了GenomeAnalysis Toolkit(版本3.8.1)(A.McKenna et al.,The Genome Analysis Toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.Genome Res 20,1297-1303(2010))通过以下步骤处理BAM文件：标记重复项，围绕高置信度插入和删除进行局部重新比对以及对碱基质量进行重新校准。基于约7,000个高频SNP位点，确认了来自同一患者的相匹配的治疗前、治疗后和正常样品。使用了癌症基因组图谱MC3项目开发的variant calling pipeline来识别高可信度的体细胞碱基置换和插入/缺失(K.Ellrott et al.,Scalable Open ScienceApproachfor Mutation Calling of Tumor Exomes Using Multiple Genomic Pipelines.CellSyst 6,271-281e277(2018).)。简而言之，此pipeline使用六个调用者来调用置换突变，并使用三个调用者来标识具有详细注释信息的插入/缺失。仅保留至少两个调用者支持的取代突变和插入/缺失，以进行进一步分析。基于来自相同样品的RNA-seq数据进一步验证了WES体细胞碱基置换。使用TopHat2生成比对(D.Kim et al.,TopHat2:accurate alignmentof transcriptomes in the presence of insertions,deletions and genefusions.Genome Biol 14,R36(2013).)。对于每个置换位点，根据来自同一样品的RNA-seqBAM文件计算覆盖率和突变读取的数量。对于具有足够RNA-seq覆盖率(≥10×)的位点，可认为具有至少两个读段的位点已验证了所关注的碱基取代。使用R packagedeconstructSigs v1.8.0基于COSMIC特征作为突变特征矩阵，确定了治疗前样品中的突变特征(R.Rosenthal,N.McGranahan,J.Herrero,B.S.Taylor,C.Swanton,DeconstructSigs:delineating mutational processes in single tumors distinguishes DNA repairdeficiencies and patterns of carcinoma evolution.Genome Biol 17,31(2016).)。使用MANTIS(E.A.Kautto et al.,Performance evaluation for rapid detection of pan-cancer microsatellite instability with MANTIS.Oncotarget 8,7452-7463(2017).)评估了每个肿瘤的微卫星不稳定性状态，并将从mSINGS包中获得的2539个基因座(S.J.Salipante,S.M.Scroggins,H.L.Hampel,E.H.Turner,C.C.Pritchard,Microsatellite instability detection by next generation sequencing.Clin Chem60,1192-1199(2014).)用于该分析。使用MuSiC2(18.N.D.Dees et al.,MuSiC:identifying mutational significance in cancer genomes.Genome Res 22,1589-1598(2012).)在所有治疗前样品中鉴定出明显突变的基因(FDR<0.05)。根据费舍尔的精确检验，Maftools(A.Mayakonda,D.C.Lin,Y.Assenov,C.Plass,H.P.Koeffler,Maftools:efficient and comprehensive analysis of somatic variants in cancer.Genome Res28,1747-1756(2018))被用于探索SMG，这些SMG在非响应和响应样本之间显示出明显的突变偏向。为了检测处理后富含碱基取代变化的基因群，使用了HotNet2(29.

M.D.Leiserson et al.,Pan-cancer network analysis identifiescombinations of rare somatic mutations across pathways and proteincomplexes.Nat Genet47,106-114(2015).)根据每种蛋白质的热值鉴定出明显突变的subnetworks。只保留了具有改变事件的基因。改变事件定义为治疗前后同一患者的不同非沉默变异。热评分仅限于具有至少两个改变事件的主要驱动因素或基因。使用HINT+HI2012、MultiNet和iRefIndex交互网络并可视化共识子网络。Fisher精确检验用于确定统计显著性。

药物响应测定与分析

从GDSC获得21个具有CCLE突变谱数据的胃癌细胞系的顺铂响应数据(AUC评分)(W.Yang et al.,Genomics of Drug Sensitivity in Cancer(GDSC):a resource fortherapeutic biomarker discovery in cancer cells.NucleicAcids Res 41,D955-961(2013).)。在细胞系中，有3个在C10orf71中包含非沉默的单核苷酸变异，而18个是野生型。Student’s t检验用于评估具有C10orf71突变的细胞系与具有野生型的细胞系之间的差异。

反相蛋白质阵列分析

对于RPPA实验，首先通过短串联重复确认18条胃系，然后进行制备。抗体的验证如先前所述(M.Ghandi et al.,Next-generation characterization of the Cancer CellLine Encyclopedia.Nature 569,503-508(2019)；J.Li et al.,Characterization ofHuman Cancer Cell Lines by Reverse-phase ProteinArrays.Cancer Cell 31,225-239(2017).)。如前所述，RPPA数据是由MD安德森癌症中心的RPPA核心机构生成。首先使用ArrayPro(Meda Cybernetics)量化RPPA切片以产生信号强度，然后由SuperCurve处理以估计相对蛋白表达水平，然后通过中值修饰标准化。RPPA玻片质量由质量控制分类器评估，仅保留高于0.8(范围：0-1)的那些玻片用于进一步分析。蛋白质标记物被分为11种信号通路，并根据蛋白质成员的方向计算了通路得分。Student’s t检验用于评估具有C10orf71突变的细胞系与野生型细胞系之间的差异，FDR用于多次测试校正。

体细胞拷贝数变化分析

使用全基因组测序数据来推断治疗前后样品中的拷贝数值。按照用于WES数据的标准修剪全外显子组测序读取对。使用BWA 0.7.17将读段与人类参考基因组(Homo_sapiens_assambly19)进行比对。然后通过Control-FREEC(版本11.5)基于匹配的正常肿瘤对估计SCNAs，窗口大小为5kb(V.Boeva et al.,Control-FREEC:a tool for assessingcopy number and allelic content using next-generation sequencingdata.Bioinformatics 28,423-425(2012))。基于相应的分割值，使用GISTIC2.0(C.H.Mermel et al.,GISTIC2.0 facilitates sensitive and confident localizationof the targets of focal somatic copy-number alteration in humancancers.Genome Biol 12,R41(2011))来识别具有统计学上显著的拷贝数变化频率的区域。扩增和删除阈值设置为0.1。使用相同的工具，对全外显子组测序数据作为一个独立的数据集进行了并行分析，以验证通过全基因组测序鉴定出的SCNA峰。

样品前处理和后处理的克隆结构分析

为了探索新辅助化疗驱动的克隆进化，使用sciClone推断了克隆结构的动态变化(C.A.Miller et al.,SciClone:inferring clonal architecture and tracking thespatial and temporal patterns of tumor evolution.PLoS Comput Biol 10,e1003665(2014))。基于通过Control-FREEC推断的全外显子组测序数据的拷贝数值用于从拷贝数改变区域中排除SNV，以进行克隆分析。使用另一种工具PyClone(A.Roth et al.,PyClone:statistical inference of clonal population structure in cancer.NatMethods 11,396-398(2014).)进一步验证了推断的亚克隆进化。

基因表达分析

使用alignment-free工具Kallisto(N.L.Bray,H.Pimentel,P.Melsted,L.Pachter,Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.NatBiotechnol 34,525-527(2016))基于RNA测序数据来定量基因表达。使用tximport将Kallisto的输出转换为基因水平的计数和TPM(C.Soneson,M.I.Love,M.D.Robinson,Differential analysesfor RNA-seq:transcript-level estimates improve gene-level inferences.F1000Res4,1521(2015))。为了鉴定响应和非响应组之间差异表达的基因，对每个基因进行了t-test检验，并根据t-statistic对它们进行排名。使用基于前秩的基因集富集分析来确定富集的标志性途径(A.Subramanian et al.,Gene set enrichment analysis:a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.Proc NatlAcad Sci U S A 102,15545-15550(2005))。为了鉴定在非响应者不同治疗阶段的肿瘤样品之间差异表达的基因，以患者ID为阻断因子拟合了多因素模型，然后使用DESeq2对于治疗阶段效果进行了Wald检验(M.I.Love,W.Huber,S.Anders,Moderated estimation offold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15,550(2014))。选择FDR＜0.05且倍数变化＞2.0或＜0.5的基因作为差异表达基因。对由后处理样品中上调和下调的基因分别进行了由clusterProfiler(G.Yu,L.G.Wang,Y.Han,Q.Y.He,clusterProfiler:an R package for comparingbiological themes among geneclusters.OMICS 16,284-287(2012))实现的MSigDB标志性基因集的超表达分析(E.I.Boyle et al.,GO::TermFinder--open source software for accessing GeneOntology information and finding significantly enriched Gene Ontology termsassociated with a list of genes.Bioinformatics 20,3710-3715(2004))。进一步使用Student’s t-test比较了MYC扩增的非响应者治疗前后MYC目标基因的差异基因表达。使用TIMER从mRNA表达数据推断出肿瘤浸润免疫细胞的丰度(B.Li et al.,Comprehensiveanalyses of tumor immunity:implications for cancer immunotherapy.Genomebiology 17,174(2016))。进行了成对的Student’s t-test，以识别匹配的治疗前和治疗后样本之间细胞组成的差异。

对35名新辅助化疗前的GC患者的活检肿瘤样品进行了多组学测序(图1A显示了详细的患者和样品信息)。对于这些情况，对肿瘤样本以及匹配的种系DNA样本进行了全外显子组测序，这主要用于鉴定体细胞碱基取代和小的插入/缺失。在35例病例中的32例(由于DNA量不足而排除了3例)中，还进行了全基因组测序，以及匹配的种系样品，用于鉴定体细胞拷贝数变化(SCNA)。此外，对所有肿瘤样品进行了RNA测序，以表征蛋白质编码基因的mRNA表达谱。活检后，患者接受了基于5-氟尿嘧啶+奥沙利铂的新辅助化疗，持续了2-4个周期。然后，根据三位独立病理学家对放射学和病理学证据的严格评估，将病例分为两类：响应(n＝17)和非响应(n＝18)。图1B显示了代表性的放射学和病理学图像。在响应组中，所有病例的坏死率均高于65％，而在非响应组中，坏死率均低于15％(图1C)。响应组病例的Mandard肿瘤消退等级为<2，而非响应组的情况为4或5(图1D)。通常，响应组的患者比非响应组的患者年轻(Wilcoxon rank-sum检验，非响应与非响应＝17：18，p＝0.047)；非响应组的患者倾向于晚期(Wilcoxon rank-sum检验，非响应与非响应＝17：18，p＝0.023)。

在非响应组的18例患者中接受新辅助化疗后，通过手术从其中的14例中获得了新鲜肿瘤样品，并对这些治疗后样品进行了全外显子组测序(图1A)。对于这些情况，还分别进行了全基因组测序(针对13例)和RNA测序。相反，对于响应组的患者，由于对新辅助化学疗法的良好响应导致肿瘤细胞含量低的病变，因此无法获得肿瘤组织。总之，该实验设计使能够从不同的角度(响应与非响应，治疗前与治疗后)鉴定涉及肿瘤对新辅助化疗响应的多种分子畸变(molecular aberrations)(体碱基置换SCNA和基因表达)。

检查了六个可能的碱基对取代的组成，发现T>G取代在响应和非响应组之间表现出最明显的模式，尤其是当取代位点位于C和T的侧翼时(图2A)。一致地，在将突变谱分解成不同的突变特征时，COSMIC特征17(T>G)(11.L.B.Alexandrov et al.,Clock-likemutational processes in human somatic cells.Nat Genet 47,1402-1407(2015).)是先前在食道和胃癌中观察到的特征，并与氧化损伤的副产物有关(12.M.Tomkova,J.Tomek,S.Kriaucionis,B.Schuster-Bockler,Mutational signature distribution varieswith DNA replication timing and strand asymmetry.Genome Biol 19,129(2018).)。响应组的贡献要比非响应组高得多(Wilcoxon rank-sum检验，p＝0.049，响应vs非响应＝17:18，图2B)。接下来，检查了MANTIS计算出的这些肿瘤中微卫星不稳定性(MSI)分数的分布(13.E.A.Kautto et al.,Performance evaluation for rapid detection ofpan-cancer microsatellite instability with MANTIS.Oncotarget 8,7452-7463(2017).)。出人意料的是，发现非响应组中的MSI得分显著高于响应组(Wilcoxon rank-sum检验，p＝0.022，非响应vs.非响应＝17:18，图2C)。因此，测试了非响应组中是否存在更高的突变负担，并证实了这种模式(Student’s t检验，非响应vs非响应＝17：18，p＝0.04，图2D和图3A)。临床前数据表明，MSI-H状态的大肠肿瘤对基于5-氟尿嘧啶的化学疗法具有抗性(M.Hewish,C.J.Lord,S.A.Martin,D.Cunningham,A.Ashworth,Mismatch repairdeficient colorectal cancer in the era of personalized treatment.Nat Rev ClinOncol 7,197

208(2010)；M.Koopman et al.,Predictive and prognostic markers forthe outcome of chemotherapy in advanced colorectal cancer,a retrospectiveanalysis of the phase III randomised CAIRO study.Eur J Cancer 45,1999-2006(2009).)。临床上，只有MSI阴性结直肠癌患者受益，而MSI-H则不受益(16.C.M.Ribic etal.,Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit fromfluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer.N Engl J Med 349,247-257(2003))，这使得MSI-H状态成为对基于5氟尿嘧啶的化疗非响应的强有力的预测因素(G.Des Guetz et al.,Does microsatellite instability predict the efficacy ofadjuvant chemotherapy in colorectal cancer？A systematic review with meta-analysis.Eur J Cancer 45,1890-1896(2009))。该结果提供了第一个证据，即MSI-H状态也可以作为GC患者新辅助化疗非响应的预测指标。

为了鉴定可能在影响治疗响应中起作用的单个突变基因，接下来使用MuSiC2(18.N.D.Dees et al.,MuSiC:identifying mutational significance in cancergenomes.Genome Res 22,1589-1598(2012).)鉴定了明显突变的基因(SMG)(p＝2.9*10^-4，FDR＝0.05)。突变最高的基因包括TP53、PI3KCA、RNF43、ARIDA1和KRAS，如先前在其他胃癌队列中报道的(19.N.Cancer Genome Atlas Research,Comprehensive molecularcharacterization ofgastric adenocarcinoma.Nature 513,202-209(2014))(图3A)。在本研究和以前的研究中鉴定出的SMG中(19.N.Cancer Genome Atlas Research,Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma.Nature513,202-209(2014))，C10orf71是唯一显示响应和非响应组之间明显模式的基因：在5个非响应样本中均发生了突变，但没有响应样本中发生了突变(Fisher精确检验，p＝0.04，FDR<0.25)，并且未检测到复发突变(图3B)。为了验证这一观察结果，基于使用一组21个胃癌细胞的药物响应数据(20个)，确实观察到，具有C10orf71突变的细胞系对顺铂(新辅助化疗方案中包括的等效铂药物)的耐药性高于这些野生型细胞系(Student’s t检验，n_mut vs.n_WT＝3：18，p＝1.1*10^-4，图3C)。为了获得更多的机理上的见解，使用反相蛋白阵列分析了胃细胞系的功能蛋白质组学数据。发现具有C10orf71突变的细胞系显示出的细胞周期得分(基于8种蛋白质标记)明显低于那些野生型细胞系(Student's t检验，n_mut vs.n_WT＝3：18，p＝0.015，图3D、E)。由于细胞周期停滞是铂类药物的主要作用机制，不愿受理论的约束，发明人推测其中C10orf71突变通过引起较不活跃的细胞周期状态而赋予了对新辅助化疗的耐药性(图3F)。这些结果表明，该基因中的突变是对新辅助化疗耐药的潜在生物标记。

与新辅助化疗响应相关的关键SCNA

使用低通全基因组测序数据(肿瘤，范围：5-9*，中位数，7*；正常，范围：5-9*，中位数7*)，接下来研究了可以区分响应组与非响应组的SCNA。使用GISTIC2.0(C.H.Mermel etal.,GISTIC2.0 facilitates sensitive and confident localization of the targetsof focal somatic copy-number alteration in human cancers.Genome Biol 12,R41(2011))(FDR＝0.1)为这两组确定了明显放大或缺失的峰。尽管响应性和非响应性肿瘤的缺失峰图谱相似，但响应组包含两个独特的扩增峰：一个在8q24.21处，包含一个主要的驱动基因MYC；另一处位于19q12，带有癌症基因CCNE1。同时，非响应组在12q15处包含一个独特的扩增峰，其中包含TP53的负调节剂MDM2(P.Chene,Inhibiting the p53-MDM2interaction:an important target for cancer therapy.Nat Rev Cancer 3,102-109(2003).)(图4A)。使用平行的全外显子组测序数据观察到相似的峰。该分析暗示对最初的SCNA候选者进行进一步分析。

如果这些扩增峰在影响对新辅助化学疗法的响应中起作用，将在其相关的下游途径中观察到相应的信号。因此，使用RNA测序数据，接下来检查了这些治疗前样品的mRNA表达谱。尽管没有观察到两组之间MYC的表达有显著差异(图4B，t检验，p＝0.6)，但相对于非响应组，MYC靶基因在响应组中表现出明显丰富的上调基因(图4B，t检验，p＝0.6)。在图4C中，基因集富集分析，标称p＝0.0，FDR＜10^-3)，表明在响应组中确实激活了MYC信号传导。在包括乳腺癌、小细胞肺癌和结直肠癌在内的多种疾病中，已经报道了MYC扩增与对相似化学疗法更好的响应之间的关系。与非响应组的扩增峰一致，MDM2在该组中显示出显著更高的mRNA表达水平(图4D，Student's t检验，响应vs非响应＝17：18，p＝0.033)。此外，DNA修复途径相对于非响应，在响应组中显示出相应的上调，支持MDM2对DNA修复的负调节作用(图4E，基因集富集分析，标称p＝0.0，FDR<10^-3)。在乳腺癌和胰腺癌中，已经报道了MDM2扩增与较差的临床结局与化疗的相关性。没有观察到CCNE1基因本身或其相关途径的显著变化。总的来说，这些结果表明一些关键SCNA可能有助于对GC新辅助化学疗法的敏感性(例如，MYC扩增)或抗性(例如，MDM2扩增)。

新辅助化疗后主要的体细胞碱基置换变化

使用14个匹配的治疗前和治疗后样品对(平均覆盖率>200*)的平行全外显子组测序数据，检查了新辅助化疗下GC的基因组进化。总体而言，没有发现突变负担或突变特征的显著变化。对于已知的癌症驱动器，一些肿瘤在治疗前后显示出关键的突变变化(突变丢失或增加)，而其他肿瘤则显示出相同的突变特征(图5A)。为了系统地鉴定出表现出最频繁发生的突变变化的基因或途径，采用了HotNet2来搜索富含此类信号的蛋白质相互作用网络(29.M.D.Leiserson et al.,Pan-cancer network analysis identifies combinationsofrare somatic mutations across pathways and protein complexes.Nat Genet 47,106-114(2015))。确定的一个顶级子网由IRS1、IRS2、PIK3CA、JAK1和IL6ST组成(图5B)。特别是，IRS1在将胰岛素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体的信号传递至PI3K/AKT途径中发挥了关键作用，它在五个治疗后样品中不断获得新的突变(Fisher的精确检验，p＝0.041)，表明存在复发耐药机制。对响应性与非响应性治疗前样品的分析表明，C10orf71中的突变有助于提高治疗抵抗力。如果是这样，将期望在治疗后的样本中增加等位基因突变的频率或获得新的突变，因为对化疗敏感的肿瘤细胞(即那些没有这种突变的肿瘤细胞)很可能会在治疗过程中通过选择去除。在接受调查的14对样本中，有4例在治疗前或治疗后样本中显示C10orf71突变，其中两个在新辅助化疗后获得了新的突变。在检测到的八个突变位点上，确实观察到与治疗前样品相比突变等位基因频率显著增加(图5C，Student’st检验，n＝8对，p<0.05；即使在调整了肿瘤纯度后，同样的模式仍然成立)。图5D和5E显示了两种情况的推定进化的示意图，其中获得的C10orf71突变逐渐增加其等位基因频率。尽管真正的进化轨迹很难验证，但这一结果表明C10orf71突变在影响肿瘤响应中具有关键作用。

新辅助化疗后关键基因表达和细胞组成变化

最后，使用14个治疗前和治疗后样品对的平行RNA测序数据(每个样品3,300万个读数)，研究了新辅助治疗后扰动的基因表达谱。鉴定了8 69个差异表达的基因(DESEQ2，n＝14对，倍数变化>2，p<5*10^-3，FDR<0.05，图6A)。这些基因显著富集于几种下调的途径中，包括炎症响应、同种异体移植排斥、KRAS信号传导和IL6/JAK/STAT3信号传导(图6B)。对响应与非响应治疗前样品的分析表明，MYC扩增和随后的MYC信号激活使肿瘤细胞对治疗敏感。如果是这样，希望在具有MYC扩增的肿瘤样品中，通过纯化进化过程中的选择将“失活”MYC信号。实际上，发现，对于7种MYC扩增肿瘤，在非响应的治疗后肿瘤中，将近一半的MYC目标基因(47.2％，93/197)被显著下调(Student’s t检验，n＝7对，p<0.05)，并且与其他基因相比，这一比例要高得多(Fisher精确检验，p<10^-3)。相反，在这些样品中，只有3％的MYC靶基因显著上调(图6C)。这些结果进一步支持了MYC扩增与对新辅助化疗的敏感性之间的联系。还检查了当前用于GC治疗的几种治疗靶标的表达，发现HER2、VEGFR1和VEGFR2显著下调(配对的Wilcoxon rank-sum检验，n＝14对，p<0.05，FDR<0.1；图6D和图5A)。

为了研究新辅助化疗对肿瘤微环境的影响，使用TIMER从mRNA表达数据中推断了肿瘤浸润免疫细胞的丰度(包括B细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)。出人意料的是，发现嗜中性粒细胞和树突状细胞的细胞组成显著降低(图6E，Student's t检验，n＝14对，p<0.05，FDR<0.12)，而CD8 T细胞则略有减少(n＝14，p<0.1，FDR<0.2)后处理。总之，RNA测序分析表明，新辅助化疗不仅可以重塑GC细胞中的免疫信号，还可以改变其免疫微环境。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (4)

1.一种C10orf71基因、C10orf71基因检测引物试剂盒中的至少一种在制备用于预测胃癌患者对新辅助化疗的响应的产品中的应用，其中，用于新辅助化疗的药物包括采用顺铂作为治疗药物。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的产品中还包括MDM2和/或MYC拷贝数的检测试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的用于新辅助化疗的药物包括氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂中的一种、两种或者三种。

4.C10orf71基因、C10orf71基因检测引物试剂盒中的至少一种在制备用于检测胃癌患者对于顺铂耐药性的试剂盒中的应用。

Images