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CN110606893A - 一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法 - Google Patents

一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法 Download PDF

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CN110606893A CN201810618266.0A CN201810618266A CN110606893A CN 110606893 A CN110606893 A CN 110606893A CN 201810618266 A CN201810618266 A CN 201810618266A CN 110606893 A CN110606893 A CN 110606893A
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Abstract

本发明公开了一种靶向CD19和CD20双抗原的嵌合性抗原受体T细胞治疗肿瘤的方法。本发明提供了本发明提供的嵌合性抗原受体，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中细胞外识别域依次包括信号肽、双抗原识别区、铰链区和跨膜区；所述双抗原识别区包括CD20单链抗体(scfv)和CD19单链抗体，其中，所述CD19单链抗体靠近所述跨膜区。本发明的优点是DCAR‑013‑T细胞可以识别CD19和CD20任意一个抗原，杀伤肿瘤细胞；在B细胞来源的血液肿瘤和淋巴瘤患者中CD19和CD20均为阴性的肿瘤细胞极少，针对CD19和CD20的双靶点CAR显示了良好的体外杀伤和临床治疗效果，体现了这种双靶点设计的优越性。

Description

一种靶向CD19和CD20双抗原的嵌合性抗原受体T细胞治疗肿 瘤的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种靶向CD19和CD20双抗原的嵌合性抗原受体T细胞治疗肿瘤的方法。
背景技术
嵌合性抗原受体Chimeric antigen receptor(CAR)技术是利用基因工程方法，赋予T细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞，没有HLA(人类白细胞抗原)的限制。CAR的结构由细胞外识别域和细胞内信号转导结构域组成：细胞外识别域可以特异性地识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)，细胞内信号转导结构域用来启动T淋巴细胞识别肿瘤细胞(靶细胞)表面蛋白后的免疫应答，发挥细胞毒作用，杀伤靶细胞。
CAR的细胞外识别域由信号肽(Signal peptide,SP)、识别抗原的单链抗体结构域(scFv)的胞外区、连接区(Linker)、铰链区(Hinge)，以及跨膜区(transmembrane,TM)组成；细胞内信号转导结构域由共刺激分子和CD3ζ(CD3z)胞内段组成。无共刺激分子为第一代CAR，含有1个共刺激分子(CD28、4-1BB、OX40、ICOS等)为第二代CAR，含有2个共刺激分子为第三代CAR。
发明内容
本发明一个目的是提供一种嵌合性抗原受体。
本发明提供的嵌合性抗原受体，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中细胞外识别域依次包括信号肽、双抗原识别区、铰链区和跨膜区；
所述双抗原识别区包括CD20单链抗体(scfv)和CD19单链抗体，其中，所述CD19单链抗体靠近所述跨膜区。
上述嵌合性抗原受体中，所述CD20单链抗体包括CD20单链抗体的轻链可变区和CD20单链抗体的重链可变区；
所述CD19单链抗体包括CD19单链抗体的轻链可变区和CD19单链抗体的重链可变区；
其中，所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区它们四个之间的位置顺序关系为(1)或(2)：
(1)所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区；
(2)所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区。
上述嵌合性抗原受体中，所述CD20单链抗体的重链可变区和所述CD19单链抗体的重链可变区通过连接区甲连接；或，所述CD20单链抗体的轻链可变区和所述CD19单链抗体的轻链可变区通过所述连接区甲连接；
和/或，所述CD20单链抗体的轻链可变区和所述CD20单链抗体的重链可变区通过连接区乙连接；
和/或，所述CD19单链抗体的轻链可变区和所述CD19单链抗体的重链可变区通过连接区丙连接。
上述嵌合性抗原受体中，所述CD20单链抗体轻链可变区为如下a或b或c：
a)其由序列表中序列2第22-127位所示的氨基酸残基组成；
b)将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
c)与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD20单链抗体重链可变区为如下d或e或f：
d)其由序列表中序列2第133-252位所示的氨基酸残基组成；
e)将d)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
f)与d)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD19单链抗体轻链可变区为如下g或h或i：
g)其由序列表中序列2第403-509所示的氨基酸残基组成；
h)将g)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
i)与g)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD19单链抗体重链可变区为如下g或k或l：
g)其由序列表中序列2第268-387所示的氨基酸残基组成；
k)将g)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
l)与g)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
和/或，
所述连接区甲的氨基酸序列为序列2第253-267位
所述连接区乙的氨基酸序列为序列2第128-132位
所述连接区丙的氨基酸序列为序列2第388-402位。
上述嵌合性抗原受体中，所述信号肽为CD8A的信号肽或者是CSF1R、CSF2RA、CD4的信号肽；
所述铰链区为IgG1、IgG4、IgD和/或CD8的全部或部分肽段；
所述跨膜区选自CD28、CD3ζ、CD4、CD8和CD2中的一种或多种的跨膜结构；
所述胞内信号结构域包括胞内共刺激分子和信号结构域；
所述胞内共刺激分子选自CD28、4-1BB、ICOS和OX40的一种或多种；
所述信号结构域选自CD3ζ、CD5、CD28和CD124中的一种或多种；
和/或，所述胞内信号结构域包括共刺激分子和CD3ζ(CD3z)胞内段；
所述胞内信号结构域具体包括胞内共刺激分子41-BB和信号结构域CD3ζ；
无共刺激分子为第一代CAR，含有1个共刺激分子(CD28、4-1BB、OX40、ICOS等)为第二代CAR，含有2个共刺激分子为第三代CAR；本发明采用的是胞内共刺激分子4-1BB。
和/或，所述嵌合性抗原受体，依次由信号肽、双抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域组成；
上述嵌合性抗原受体依次由CD8a信号肽、双抗原识别区、铰链区(Hinge)、跨膜区(transmembrane,TM)和胞内信号结构域组成；
其中，双抗原识别区依次由所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述连接区乙、所述CD20单链抗体的重链可变区、所述连接区甲、所述CD19单链抗体的重链可变区、所述连接区丙和所述CD19单链抗体的轻链可变区组成；
或，双抗原识别区依次由所述CD20单链抗体的重链可变区、所述连接区乙、所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述连接区甲、所述CD19单链抗体的轻链可变区、所述连接区丙和所述CD19单链抗体的重链可变区组成。
上述嵌合性抗原受体中，所述嵌合性抗原受体为如下1)或2)或3)：
1)其由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
2)将1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
3)与1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链。
编码上述嵌合性抗原受体的核酸分子也是本发明保护的范围；
或，含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。
上述重组载体为将所述核酸分子导入慢病毒载体中，得到表达上述嵌合性抗原受体的慢病毒载体；
所述重组病毒为将所述重组载体导入宿主细胞，包装得到重组病毒；
或，所述细胞为免疫细胞，
或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞；
和/或，所述细胞为将所述重组载体通过所述慢病毒转染到T细胞中，得到表达所述嵌合性抗原受体的T细胞。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其包括上述嵌合性抗原受体、上述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。
上述嵌合性抗原受体或上述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述嵌合性抗原受体或上述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒在制备肿瘤细胞诱导下IFN-γ和/或IL-2的分泌量提高的T细胞中的应用也是本发明保护的范围。
上述中，所述肿瘤为CD19和CD20双阳性的肿瘤；
和/或，所述肿瘤来源于B淋巴细胞的血液肿瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤等任一种或数种组合；
和/或，所述淋巴瘤为大B细胞淋巴瘤；
和/或，所述肿瘤细胞为CD19和CD20双阳性的肿瘤细胞；
和/或，所述产品为药物或试剂盒或自体回输制剂。
所述T细胞为离体细胞，其为患者自体细胞。
本发明将识别2个肿瘤抗原CD19和CD20的scFv串联在一起，这种双识别CAR(Dual-CAR)经过慢病毒感染肿瘤患者自体的T淋巴细胞，并经过体外扩增，再回输肿瘤患者的细胞治疗制剂。经过慢性病毒载体将识别表面分子CD19和CD20肿瘤细胞的特异性嵌合抗原受体转染到自体的T细胞中，改造后的T细胞称为DCAR-013-T细胞。这种经过修饰的DCAR-013-T细胞可以特异性识别和杀伤表面分子为CD19或CD20的细胞。其特征是CD20的scFv在外侧、CD19的scFv在内侧(靠近细胞膜的一侧)。DCAR-013-T细胞可以识别两种抗原CD19或CD20，肿瘤细胞的CD19或CD20任何一个抗原均可以被均DCAR-013-T细胞识别且直接杀伤。
单个CD19-CAR或CD20-CAR只能识别和杀伤单个抗原的肿瘤细胞，例如CD19-CAR可以杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，可能留下少数CD19阴性CD20阳性的肿瘤细胞，这些细胞可以迅速增殖起来，造成肿瘤的复发或治疗效果不佳。
本发明的优点是DCAR-013-T细胞可以识别CD19和CD20任意一个抗原，杀伤肿瘤细胞；在B细胞来源的血液肿瘤和淋巴瘤患者中CD19和CD20均为阴性的肿瘤细胞极少，针对CD19和CD20的双靶点CAR显示了良好的体外杀伤和临床治疗效果，体现了这种双靶点设计的优越性。
从CD19和CD20的空间结构来看，CD19为单跨膜蛋白，胞外区较长含有270个氨基酸，而CD20为4次跨膜蛋白，2个胞外区的蛋白较短，分别为6和47个氨基酸，针对这种结构，设计了长短结合型的双靶点CAR，CD20-scFV在外侧识别较短的CD20胞外区，而CD19-scFV在内侧识别较长的CD19胞外区，这种设计考虑到肿瘤细胞抗原空间结构，体现了双靶点针对识别两种不同空间结构的靶抗原，可以同时结合两种抗原，也可以只结合任何一个单一抗原，形成互补效应，充分发挥双靶点设计的优势。
CD20和CD19两个单链抗体结构域的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的排列方式的特征是连接区(Linker)两侧分别为20-scFV和19-scFV的重链可变区，或者均为轻链可变区，即按照20-VL-VH和19-VH-VL排列，或者20-VH-VL和19-VL-VH排列；在连接区(Linker)两侧为20和19的重链可变区或轻链可变区，这种排列的特点是避免20的重链可变区(或轻链可变区)和19的轻链可变区(或重链可变区)形成新的单链抗体结构，这种错配的结构有可能造成对自体细胞的非特异性识别和杀伤。
本发明所用慢病毒感染的DCAR-013-T细胞对患者的CD4和CD8-T细胞表型没有影响，可以轻微提高记忆性T细胞(CD45RO+和CD62L+)的百分率(8％)；可以在体外特异性杀伤CD19+或CD20+或双阳性的肿瘤细胞，而对CD19阴性和CD20阴性的细胞没有杀伤作用。通过临床医院对复发难治性大B细胞淋巴瘤18例患者的治疗，患者的完全缓解(CR)率为38.9％(7/18)，部分缓解(PR)率44.44％(8/18)，总有效(CR+PR)率达83.33％，显示了双靶点DCAR-013-T细胞良好的临床治疗效果。
附图说明
图1为DCAR-013分子组成示意图。
图2为流式细胞分析未感染T细胞与慢病毒感染第3天DCAR-013-T细胞的表型CD4和CD8。
图3为流式细胞分析未感染T细胞与病毒感染第3天DCAR-013-T细胞的表型CD62L和CD45RO。
图4为患者未感染慢病毒T细胞的表型鉴定。
图5为人T细胞DCAR-013慢病毒感染的阳性率。
图6为DCAR-013-T细胞体外杀伤实验。
图7为DCAR-013因子释放实验。
图8为DCAR-013识别和杀伤淋巴瘤细胞的作用示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、嵌合性抗原受体DCAR-013的制备
嵌合性抗原受体DCAR-013分子组成示意图如图1所示，其依次由CD8a信号肽、双抗原识别区、铰链区(Hinge)、跨膜区(transmembrane,TM)和胞内信号结构域组成；
其中，双抗原识别区依次由CD20单链抗体的轻链可变区、连接区乙、CD20单链抗体的重链可变区、连接区甲、CD19单链抗体的重链可变区、连接区丙和CD19单链抗体的轻链可变区组成；
或，双抗原识别区依次由CD20单链抗体的重链可变区、连接区乙、CD20单链抗体的轻链可变区、连接区甲、CD19单链抗体的轻链可变区、连接区丙和CD19单链抗体的重链可变区组成。
嵌合性抗原受体DCAR-013的氨基酸序列为序列2，编码嵌合性抗原受体DCAR-013的核酸分子的核苷酸序列为序列1。
1、CD8a信号肽
CD8a信号肽的氨基酸序列为序列表中序列2第1-21位氨基酸；
2、双抗原识别区
双抗原识别区依次由anti-CD20scFv的轻链可变区(VL)、连接区乙linker、anti-CD20scFv的重链可变区(VH)、连接区甲linker、anti-CD19scFv的重链可变区(VH)、连接区丙linker、anti-CD19scFv的轻链可变区(VL)组成；
或双抗原识别区依次由anti-CD20scFv的重链可变区(VH)、连接区乙linker、anti-CD20scFv的轻链可变区(VL)、连接区甲linker、anti-CD19scFv的轻链可变区(VL)、连接区丙linker、anti-CD19scFv的重链可变区(VH)组成。
上述连接区甲、连接区乙和连接区丙不同。
anti-CD20scFv的轻链可变区(VL)的氨基酸序列为序列表中序列2第22-127位，编码anti-CD20scFv轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列为序列1第64-381位；
连接区乙linker的氨基酸序列为序列表中序列2第128-132位，编码连接区乙linker的核酸分子的核苷酸序列为序列1第382-396位；
anti-CD20scFv的重链可变区(VH)的氨基酸序列为序列表中序列2第133-252位，编码anti-CD20scFv重链可变区的核酸分子的核苷酸序列为序列1第397-756位；
连接区甲linker的氨基酸序列为序列表中序列2第253-267位，编码连接区甲的核酸分子的核苷酸序列为序列1第757-801位。
anti-CD19scFv的重链可变区(VH)的氨基酸序列为序列表中序列2第268-387位，编码anti-CD19scFv重链可变区的核酸分子的核苷酸序列为序列1第802-1161位；
连接区丙linker的氨基酸序列为序列表中序列2第388-402位，编码连接区丙linker的核酸分子的核苷酸序列为序列1第1162-1206位；
anti-CD19scFv的轻链可变区(VL)的氨基酸序列为序列表中序列2第403-509位，编码anti-CD19scFv轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列为序列1第1207-1527位；
3、铰链区(Hinge)
铰链区(Hinge)采用Human CD8A的铰链区(Hinge)区，其氨基酸序列为序列2第510-554位。铰链区(Hinge)对应的核酸序列为序列1第1528-1662。
4、跨膜区(TM)
跨膜区(TM)为Human CD8a的跨膜区，其氨基酸序列为序列2第555-578位。
跨膜区对应的核酸序列为序列1第1663-1734。
5、胞内信号结构域
胞内信号结构域依次由胞内共刺激分子41-BB和信号结构域CD3ζ(CD3z)组成。
胞内共刺激分子41-BB的氨基酸序列为序列2第579-620位；其核苷酸序列为序列1第1735-1860位。
信号结构域CD3ζ(CD3z)的氨基酸序列为序列2第621-732位其核苷酸序列为序列1第1861-2196位。
二、表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒载体的制备
慢病毒载体pRRL-SIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE记载在如下文献中：Zhao Y,Stepto H,Schneider CK.Development of the First World Health Organization LentiviralVector Standard:Toward the Production Control and Standardization ofLentivirus-Based Gene Therapy Products.Human Gene Therapy Methods.2017；28(4):205-214.。
将延伸生长因子-1α(Elongation factor-1α,EF1A)启动子替换慢病毒载体pRRL-SIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的BamHⅠ和BstXⅠ双酶切位点间的DNA分子，得到自失活的慢病毒载体(self-inactivating lentivirus vector)，命名为Lenti-EF1A-GFP。
表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒载体DCAR-013为将序列表中序列1所示的编码嵌合性抗原受体DCAR-013的核酸分子替换自失活的慢病毒载体Lenti-EF1A-GFP的XbaⅠ和SalⅠ酶切位点间的编码GFP的核酸序列，得到的载体，延伸生长因子-1α启动子驱动嵌合性抗原受体DCAR-013的表达。
三、包装表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒
1、慢病毒包装
使用三载体系统在HEK293T细胞中包装含有编码DCAR-013蛋白的慢病毒颗粒；
HEK293T在含10％FBS的DMEM培养基中培养；
试剂包括培养基DMEM(ThermoFisher)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰酶(Gibco)，Dulbecco’s PBS(ThermoFisher)，PEI(1mg/mL，Polyplus)，Opti-MEM(Gibco))和10厘米细胞培养皿(Corning)；
包装包含编码DCAR-013蛋白的慢病毒颗粒制备流程如下：
1)直径10厘米细胞培养皿中接种HEK293T细胞，24h后细胞汇合度达到70％-80％。
2)转染前混合液准备：在15mL无菌离心管中准备转染混合液(表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒载体DCAR-013、编码病毒核衣壳蛋白Gag/Pol和Rev的质粒psPAX2和编码病毒包膜蛋白的质粒pMD2.G按照一定比例混合)；
3)转染：每个10cm培养皿中加入1mL转染混合液，需要缓慢、均匀加入；前后左右轻轻摇匀，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
4)换液：转染前2小时更换新鲜DMEM；每个10cm培养皿中加入8mL预热至37℃的新鲜DMEM。转染6小时后换液，转染48h-72小时收集病毒上清，0.22μm滤器过滤，收集滤液，得到表达DCAR-013蛋白的慢病毒颗粒，或者分装后-80度冰箱保存，或者进行慢病毒纯化。
2、慢病毒纯化
1)离心容器的预处理
2)将离心所用的40ml内套管及金属外管用75％酒精浸洗2小时，倒掉酒精，用无菌水润洗三次后，与生物安全柜中照紫外过夜；
3)将上述1得到的不同转染时间点收集病毒上清的滤液混匀，置于50ml离心管中，2000rpm，室温离心10min，离心以去除细胞碎片；
4)用20ml注射器吸取离心后的上清，用0.22μm的滤器过滤收集至新的50ml离心管中；
5)将过滤后的病毒上清转移至40mL的内套管中，天平配平后转移到金属套管中，拧紧瓶盖，放置至Beckman离心机中，28000rpm，4℃离心150min；
6)取出离心管，将内套管中的上清倒掉，用吸水纸尽量吸净管口液体，加入D-PBS200μl，将内套管置于一干净的50mL离心管内，4℃过夜；
7)将4℃过夜的病毒分装于干净的EP管内，取一部分检测病毒滴度，将其余部分病毒液置于-80℃冰箱中保存，得到表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒(以下简称为DCAR-013慢病毒)。
3、慢病毒滴度测定
胰酶消化计数HEK293T细胞，以2×105/孔接种到6孔板中。置于37℃5％C02孵育箱中培养至细胞50％融合。取上述2得到的DCAR-013慢病毒毒液，分别加入0.5μl、1μl、5μl、10μl、20μl于EP管内，加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为8μg/mL，加入新鲜培养液至终体积lmL。弃去HEK293T细胞培养液，将上述各浓度病毒液(包括原液)分别加至6孔板中，置于37℃5％C02培养箱中孵育。48h后用胰酶消化293T，培养基中和后350g离心4分钟，弃掉上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞2次，将细胞溶于50μl的PBS中，加入兔抗小鼠IgG(H+L)F(ab')2-APC的抗体(Jackson公司)1μl，4℃孵育30分钟后，2000rpm离心4分钟，弃掉上清，用PBS清洗细胞，然后，加入350μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测293T细胞CAR阳性率。
病毒滴度(TU/mL)＝CAR阳性细胞率×细胞总数/慢病毒液体积(mL)，为避免误差，只选择阳性率为1～30％的孔进行计算，取各组平均值计算滴度。
细胞数为2×105的293T细胞加入1μl的慢病毒，流式细胞检测F(ab')2抗体检测阳性率为15％，DCAR-013慢病毒感染293T的滴度为0.15×2×105/0.001mL＝3.0×107TU/mL。
四、表达嵌合性抗原受体DCAR-013的CAR-T细胞获得
1、将RetroNectin稀释到工作浓度后，加入六孔板，每孔约2mL，置于37℃5％CO2孵育箱中，2小时后取出，吸出孔中RetroNectin，回收至干净的50mL离心管中；
2、将-80℃保存的三得到的表达嵌合性抗原受体DCAR-013的慢病毒毒液置于冰盒中，待其缓慢融化；
3、取培养激活的T细胞，以5×106/孔接种到6孔板中；
上述激活的T细胞按照如下方法制备：将采集的患者自体外周血与无菌PBS等体积混合，稀释外周血，同时将淋巴细胞分离液加到50mL无菌离心管中，将稀释后的外周血按1:1比例小心加到淋巴细胞分离液的上层，400g，室温，离心20分钟；淋巴细胞分离液将离心管中的外周血分四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层(白细胞层)，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。轻轻吸取白细胞层，用无菌PBS洗2次，分别离心8分钟；倾去上清，白细胞重悬在PBS中，并计数，即得到制备好的外周血单核淋巴细胞(PBMC)；再将PBMC加入6孔板，每孔加入2ml含PBMC细胞的培养基，加入5×106个细胞，每孔加入80μl激活人T细胞的CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，11131D)，放入培养箱中，37℃培养，CD3/CD28抗体刺激24-48小时的细胞，为激活的T细胞。
4、加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为8μg/mL，逐滴加入DCAR-013慢病毒，摇匀后，2000rpm，室温离心60min；
5、置于37℃5％CO2孵育箱中培养24小时；
6、第二次感染慢病毒，重复操作步骤4；
7、置于37℃5％CO2孵育箱中培养24小时后，转移至其他容器中继续培养。
8、第二次感染慢病毒72小时后，得到感染慢病毒的CAR-T细胞(以下简称为DCAR-013-T)。
以未感染慢病毒的T细胞作对照，与上述相同，不同的仅是不加入DCAR-013慢病毒。
收集感染慢病毒的CAR-T细胞，PBS洗涤1次，将体积调为50μl，加入小鼠抗人CD4-APC和CD8-PE流式抗体(BD Biosciences公司)各2μl，以未经感染T细胞为对照。避光4℃孵育60分钟后，2000rpm离心4分钟，弃掉上清，用PBS清洗细胞2次，然后加入350μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测CD4和CD8细胞的阳性率，结果如图2所示。FL4为anti-CD4，FL2为anti-CD8，未感染T细胞CD4和CD8的阳性率分别为36.7％和59.1％；DCAR-013-T细胞CD4和CD8的阳性率分别为35.8％和59.8％，两者无显著的差异。
记忆性T细胞的分子表型鉴定：CD62L、CD45RO双阳性的细胞为记忆性T细胞。收集感染慢病毒的CAR-T细胞和未感染的患者T细胞，PBS洗涤1次，将体积调为50μl，加入小鼠抗人CD45RO-APC和CD62L-PE(BD Biosciences公司)流式抗体各3μl。避光4℃孵育60分钟后，2000rpm离心4分钟，弃掉上清，用PBS清洗细胞2次，然后加入350μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测CD45RO和CD62L细胞的阳性率；结果如图3所示，双阳性的细胞为记忆性T细胞，感染慢病毒的CAR-T细胞的CD62L、CD45RO双阳性细胞的百分率为68.6％，而未感染的患者T细胞的CD62L和CD45RO的双阳性百分率为60.4％，结果表明：DCAR-013-T细胞组记忆性T细胞(Tmem)略高于对照组,两者差值为8.2％。
实施例2、DCAR-013-T细胞的应用
图8为DCAR-013识别和杀伤淋巴瘤细胞的作用示意图；上部为淋巴瘤细胞，下部为DCAR-013-T细胞。
一、感染和未感染嵌合性抗原受体DCAR-013的T细胞表型鉴定
1、表达嵌合性抗原受体DCAR-013的CAR-T细胞
取激活的T细胞进行计数，以5×106/孔接种到6孔板中，将-80℃保存的实施例1的3得到的DCAR-013慢病毒置于冰盒中，待其缓慢融化；在6孔板中加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为8μg/mL，缓慢加入病毒液，摇匀后，2000rpm，室温离心60min，置于37℃5％CO2孵育箱中培养24小时；然后第二次感染病毒，重复以上的操作，12小时后换新鲜培养液，第二次感染病毒48-72小时后，用流式细胞术检测CAR-T的阳性率。
2、检测
将实施例1中的激活后患者自体T细胞的流式分析结果(抗体为小鼠抗人CD3，BDBiosciences公司)，结果如图4所示，可以看出，患者自体T细胞经CD3和CD28抗体激活后体外培养第3天，流式细胞分析的表型：CD3的阳性率为98.5％；CD4和CD8的阳性率分别为36.7％和59.1％。
感染慢病毒的DCAR-013-T的患者自体T细胞5天后，流式细胞分析，抗体为兔抗小鼠IgG(H+L)F(ab')2(Jackson公司)，原理是DCAR-013编码的20-scFV和19-scFV是小鼠来源的，Fab段有种属特异性，患者自体的T细胞没有这种结构，因此可以用Fab段抗体检测DCAR-013的表达；结果如图5所示，图的上半部分是阴性对照(Control)，下半部分是用抗小鼠Fab段抗体检测的病毒感染第7天DCAR-013-T阳性率，减去对照，约为23.9％。
二、DCAR-013-T细胞体外杀伤实验
DCAR-013-T细胞对单表达CD19和单表达CD20肿瘤细胞的杀伤作用，K562为CD19阴性和CD20阴性的血液肿瘤细胞(人慢性髓系白血病细胞；K562：编号3111C0001CCC000039，中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)
体外杀伤实验结果如图6所示，当效靶比(E:T)为2.5和5时，DCAR-013-T细胞对CD19阳性或CD20阳性的肿瘤细胞有杀伤作用，而对阴性的K562细胞无杀伤作用，CD19和CD20与单靶点CAR对靶细胞也有杀伤作用，单个CAR19-T和CAR20-T与未感染的T细胞(Normal T)相比，对靶细胞有更高的杀伤率，而对CD19-CD20-的K562细胞无杀伤作用；DCAR-013-T比单个CAR19-T和CAR20-T对靶细胞有高的杀伤率，可达80％以上。
三、DCAR-013-T细胞受靶细胞诱导分泌细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)实验
T细胞受靶细胞刺激活化后，会分泌的IFN-γ和IL-2等细胞因子，这类细胞因子的分泌量可以间接反映DCAR-013-T或19CAR、20CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的反应性。检测用ELISA检测试剂盒(深圳达科为公司，达优IFN-γ和IL-2)。靶细胞：Raji细胞是CD19和CD20双阳性的淋巴瘤细胞，K562细胞是CD19和CD20阴性的血液肿瘤细胞。按特定比例正常T细胞、19CAR、20CAR和DCAR-013-T效应细胞分别和靶细胞混合，共同孵育6-12小时，1000rpm离心，收集分离细胞的上清约50μl至无菌EP管中，-80℃保存备用。按达科为达优试剂盒所用的方法检测用ELISA法γ-干扰素(IFN-γ)和白介素2(IL-2)，方法首先是用IFN-γ和IL-2的标准品，对立标准曲线。加标准品和样品(标准品配制500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml)；在96孔板加入样品，37℃孵育1小时；每孔用200μl洗液洗板3次；每孔加入稀释的50μl streptavidin-HRP，室温30分钟；每孔用200μl洗液洗板3次；每孔加入50μl TMB，室温20分钟；再加入终止液，终止反应；酶标仪读取吸光度(OD)值，用酶标仪读96孔板，测量450nm的OD值，用OD值对照标准曲线，计算样品中IFN-γ和IL-2的含量。
检测结果如图7所示，表明：19CAR和DCAR-013-T与Raji细胞共孵育，分泌IFN-γ的量达到4000pg/mL以上，IL-2含量1000pg/mL以上，均远高于其他组别；19CAR和DCAR-013-T与K562细胞共孵育，IFN-γ和IL-2几乎没有分泌。体现了DCAR-013-T可以识别靶细胞，大幅度提高IFN-γ和IL-2的分泌量，而对CD19阴性和CD20阴性的K562几乎没有IFN-γ和IL-2的分泌。
三、DCAR-013-T细胞临床治疗大B细胞淋巴瘤的疗效分析
共收治18例大B细胞淋巴瘤患者(来自解放军301医院，且患者知情同意)，均为难治复发类型(用其他的方法都治疗过，没有显著的效果)，完成19例次的DCAR-013-T治疗。
入组前治疗疗程数为6-18个，且有5例患者之前行自体干细胞移植治疗，CART分三个剂量组(见表1)，第一剂量组：4例患者，2例(小负荷患者)获得8-10月的CCR，2例(大负荷患者)PD；第二剂量组6人，2例(小负荷患者)获得6-7月CCR，3例(大负荷2例，超大负荷1例)获得PR，1例(超大负荷患者)PD；第三剂量组:3例获得CR(其中1例大负荷患者通过第二剂量组获得PR后，二次CART治疗获得CR)，其中2例小负荷患者获得6-7月的CCR，5例大负荷患者获得1-2月持续PR中，1例大负荷患者PD。
表1为DCAR-013-T细胞临床治疗大B细胞淋巴瘤的疗效观察
注：CCR或CR为完全缓解，PR为部分缓解，PD为疾病进展，SD为疾病稳定。
上述结果表明，收治的18例难治复发型大B细胞淋巴瘤患者，经过DCAR-013-T细胞治疗，患者的完全缓解(CR)率为38.9％(7/18)，部分缓解(PR)率44.44％(8/18)，总有效(CR+PR)率为83.33％。
序列表
<110> 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司
<120>一种靶向CD19和CD20双抗原的嵌合性抗原受体T细胞治疗肿瘤的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2196
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcg tgctgtcgca gtctccagca atcctgtctg catctccagg ggagaaggtc 120
acaatgactt gcagggccag ctcaagtgta agttacatgc actggtacca gcagaagcca 180
ggatcctccc ccaaaccctg gatttatgcc acatccaacc tggcttctgg agtccctgct 240
cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcagcag agtggaggct 300
gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag tggattagta acccacccac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa gggaggtgga ggaagccagg ttcagctggt ccagtcaggg 420
gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca 480
tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaag cagacacctg gacagggcct ggaatggatt 540
ggagctattt atccaggaaa tggtgatact tcctacaatc agaagttcaa aggcaaggcc 600
acattgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct 660
gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga gcgcaattac gacctaacta ctggtacttc 720
gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc gtgagcgaag ctgccgcaaa agaggcagct 780
gccaaggaag cagccgctaa agaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 840
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 900
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 960
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 1020
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 1080
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggccaagga 1140
acctcagtca ccgtctcctc aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 1200
ggatctgaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 1260
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 1320
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 1380
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 1440
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 1500
ggagggggga ccaagctgga gatcacaacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 1560
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 1620
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1680
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1740
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1800
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1860
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1920
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1980
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 2040
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 2100
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 2160
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 2196
<210> 2
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile
100 105 110
Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
180 185 190
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Glu Ala Ala Ala
245 250 255
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Val Lys Leu Gln
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr
275 280 285
Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile
290 295 300
Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly
305 310 315 320
Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile
325 330 335
Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr
355 360 365
Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
405 410 415
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
420 425 430
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
435 440 445
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
450 455 460
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
465 470 475 480
Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
485 490 495
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Thr
500 505 510
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
515 520 525
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
530 535 540
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
545 550 555 560
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
565 570 575
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
580 585 590
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
595 600 605
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
610 615 620
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
625 630 635 640
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
645 650 655
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
660 665 670
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
675 680 685
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
690 695 700
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
705 710 715 720
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
725 730

Claims (10)

1.一种嵌合性抗原受体，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中细胞外识别域依次包括信号肽、双抗原识别区、铰链区和跨膜区；
所述双抗原识别区包括CD20单链抗体和CD19单链抗体，其中，所述CD19单链抗体靠近所述跨膜区。
2.根据权利要求1所述的抗原受体，其特征在于：
所述CD20单链抗体包括CD20单链抗体的轻链可变区和CD20单链抗体的重链可变区；
所述CD19单链抗体包括CD19单链抗体的轻链可变区和CD19单链抗体的重链可变区；
其中，所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区它们四个之间的位置顺序关系为(1)或(2)：
(1)所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区；
(2)所述CD20单链抗体的重链可变区、所述CD20单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的轻链可变区、所述CD19单链抗体的重链可变区。
3.根据权利要求2所述的抗原受体，其特征在于：
所述CD20单链抗体的重链可变区和所述CD19单链抗体的重链可变区通过连接区甲连接；或，所述CD20单链抗体的轻链可变区和所述CD19单链抗体的轻链可变区通过所述连接区甲连接；
和/或，所述CD20单链抗体的轻链可变区和所述CD20单链抗体的重链可变区通过连接区乙连接；
和/或，所述CD19单链抗体的轻链可变区和所述CD19单链抗体的重链可变区通过连接区丙连接。
4.根据权利要求2或3所述的嵌合性抗原受体，其特征在于：
所述CD20单链抗体轻链可变区为如下a或b或c：
a)其由序列表中序列2第22-127位所示的氨基酸残基组成；
b)将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
c)与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD20单链抗体重链可变区为如下d或e或f：
d)其由序列表中序列2第133-252位所示的氨基酸残基组成；
e)将d)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
f)与d)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD19单链抗体轻链可变区为如下g或h或i：
g)其由序列表中序列2第403-509所示的氨基酸残基组成；
h)将g)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
i)与g)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
所述CD19单链抗体重链可变区为如下g或k或l：
g)其由序列表中序列2第268-387所示的氨基酸残基组成；
k)将g)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
l)与g)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；
和/或，
所述连接区甲的氨基酸序列为序列2第253-267位
所述连接区乙的氨基酸序列为序列2第128-132位
所述连接区丙的氨基酸序列为序列2第388-402位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的嵌合性抗原受体，其特征在于：
所述信号肽为CD8A的信号肽或者是CSF1R、CSF2RA、CD4的信号肽；
所述铰链区为IgG1、IgG4、IgD和/或CD8的全部或部分肽段；
所述跨膜区选自CD28、CD3ζ、CD4、CD8和CD2中的一种或多种的跨膜结构；
所述胞内信号结构域包括胞内共刺激分子和信号结构域；
所述胞内共刺激分子选自CD28、4-1BB、ICOS和OX40的一种或多种；
所述信号结构域选自CD3ζ、CD5、CD28和CD124中的一种或多种；
和/或，所述胞内信号结构域包括共刺激分子和CD3ζ(CD3z)胞内段；
和/或，所述嵌合性抗原受体，依次由信号肽、双抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域组成；
和/或，所述嵌合性抗原受体为如下1)或2)或3)：
1)其由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
2)将1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的肽链；
3)与1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链。
6.编码权利要求1-5中任一所述嵌合性抗原受体的核酸分子；
或，含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。
7.根据权利要求6所述的重组载体或细胞，其特征在于：
所述重组载体为将所述核酸分子导入慢病毒载体中，得到表达权利要求1-5中任一所述嵌合性抗原受体的慢病毒载体；
所述重组病毒为将所述重组载体导入宿主细胞，包装得到重组病毒；
或，所述细胞为免疫细胞，
或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞；
和/或，所述细胞为将所述重组载体通过所述慢病毒转染到T细胞中，得到表达所述嵌合性抗原受体的T细胞。
8.一种产品，其包括权利要求1-5中任一所述嵌合性抗原受体、权利要求6所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。
9.权利要求1-5中任一所述嵌合性抗原受体或权利要求6所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；
或权利要求1-4中任一所述嵌合性抗原受体或权利要求6所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用；
或权利要求1-4中任一所述嵌合性抗原受体或权利要求6所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒在制备肿瘤细胞诱导下IFN-γ和/或IL-2的分泌量提高的T细胞中的应用。
10.根据权利要求8所述的产品或权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述肿瘤为CD19和CD20双阳性的肿瘤；
和/或，所述肿瘤来源于B淋巴细胞的血液肿瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤等任一种或数种组合；
和/或，所述淋巴瘤为大B细胞淋巴瘤；
和/或，所述肿瘤细胞为CD19和CD20双阳性的肿瘤细胞；
和/或，所述产品为药物或试剂盒或自体回输制剂。
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