CN110591938A - 一种高抗逆性凝结芽孢杆菌突变株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高抗逆性凝结芽孢杆菌突变株及其应用，属于食品微生物技术领域。本发明利用常压室温等离子诱变（ARTP）结合适应性进化育种得到一株凝结芽孢杆菌突变株Bacillus coagulans CL5‑2，其保藏号为CGMCC No 1.17145。该菌株的耐酸性、抗胆盐以及耐高温等抗逆性明显提高，可在80℃条件下连续处理50min，存活率达92%以上。将该菌株应用于制备豆粕发酵，产品中活菌数>2×10⁷/kg，总蛋白含量>50%，酸性小肽含量>20%，该菌株同时具备开发为微生态饲料添加剂的优良性能。

Description

一种高抗逆性凝结芽孢杆菌突变株及应用

技术领域

本发明涉及一种高抗逆性凝结芽孢杆菌突变株及其应用，属于食品微生物技术领域。

背景技术

豆粕是大豆加工副产品，富含多种营养物质，其中蛋白质含量为40%~50%，脂肪为1%~2%，碳水化合物约为10%~15%，是目前养殖业应用最为广泛的蛋白质饲料原料之一。但饲用豆粕中蛋白溶解性较差，还存在胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、寡糖等多种抗营养因子，导致生产性能和饲料利用率降低。目前消除豆粕中抗营养因子的主要方法包括物理法、化学法、微生物发酵法等。其中，微生物发酵法具有安全、健康和高效等优势，微生物发酵法可有效降低或者去除抗营养因子含量和提高营养物质的生物学利用率，并且富含功能肽和乳酸等，能改善豆粕风味，积累有益动物健康的代谢产物和益生菌。

当前，国内外生产公司均采用固态发酵法生产豆粕系列产品。在此过程中，发酵菌种的选择、发酵过程工艺参数控制、干燥工艺等主要环节是影响发酵豆粕产品的重要参数。已有的生产菌种种类较多，包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌以及霉菌等，但发酵豆粕的营养和功能品质不一，特别是抗营养因子去除程度、肽含量以及挥发性盐基氮含量差异明显；如何通过获得高效降解蛋白和抗营养因子的益生菌来进一步缩短发酵生产周期等是当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服目前豆粕发酵中存在的技术问题之一，通过ARTP诱变技术结合高通量筛选方法对分离纯化得到的一株凝结芽孢杆菌进行选育，从而得到抗逆性良好的菌株，为凝结芽孢杆菌开发为微生态饲料添加剂奠定基础。

本发明首先提供一种具有高抗逆性（耐酸性、耐胆盐性、热稳定性）的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5突变株。该菌株已于2019年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101)，其保藏号为CGMCC No 1.17145。

所述的菌株由从健康成年猪肠道内容物中分离筛选分离并经室温常压等离子体诱变结合适应性进化育种筛选获得，具有耐酸性、抗胆盐以及耐高温等抗逆性高，稳定性好的特性。

所述的菌株在80℃处理50min，存活率为92%以上；在0.2%和0.4%的胆盐浓度下，存活率分别为89%和74%；在pH为3.0和3.5条件下，2h后的存活率为45%以上和80%以上。

所述凝结芽孢杆菌在制备饲料、微生态饲料添加剂和生产抗菌素等方面具有良好应用价值。

所述的菌株具有显著抑制致病性大肠杆菌O9生长的功能，其最大抑菌率为90%以上。

本发明还提供一种产品，所述产品包括饲料、饲料添加剂、高活性菌剂等，所述产品中包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5。

本发明还提供所述凝结芽孢杆菌在制备高消化率的发酵豆粕中的应用，具体的，制备方法如下：

（1）将凝结芽孢杆菌突变菌株CL5斜面菌种接入装有100mL MRS培养基的500mL摇瓶中，培养温度30-35℃，培养时间12-24h获得种子液；

（2）调整凝结芽孢杆菌种子液中活菌数为1.0×10¹⁰个/mL；

（3）取干豆粕，按料液比为1:0.6（w/v）将豆粕与水混合成湿豆粕。根据接种量为2~10%（v/w）接种到灭菌豆粕中37℃恒温发酵24-36 h。

本发明还提供一种凝结芽孢杆菌高活性菌剂的制备方法，将所述的凝结芽孢

杆菌CL5接种发酵，发酵液减压浓缩后喷雾干燥，制备得到所述凝结芽孢杆菌高活性菌剂。

本发明的有益效果：

上述猪源凝结芽孢杆菌菌株，是从健康成年猪肠道内容物中分离筛选分离并经室温常压等离子体诱变结合适应性进化育种筛选获得，经形态观察、生理生化鉴定和分子遗传学鉴定后确定其为凝结芽胞杆菌，利用常压室温等离子诱变（ARTP）结合适应性进化育种得到一株凝结芽孢杆菌突变株，是一种革兰氏阳性菌。该菌株的耐酸性、抗胆盐以及耐高温等抗逆性明显提高，具备开发为微生态饲料添加剂的优良性能。该菌能抑制大肠杆菌、沙门氏菌等常见的致病菌，具有高抗逆性（耐酸性、抗胆盐以及耐高温等），发酵豆粕中活菌数、总蛋白和酸性小肽含量均明显提高，有利于规模化生产和应用。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益生菌，既能产生芽孢，又能产生乳酸，具有耐热性好、耐受胃酸和胆汁等优点，能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体免疫水平，促进营养物质代谢和利用。

附图说明

图1为分离得到的凝结芽孢杆菌CL的菌落形态；

图2为分离得到的凝结芽孢杆菌CL的16S sRNA的PCR扩增产物电泳图；

图3为分离得到的凝结芽孢杆菌CL的系统进化树；

图4为分离得到的凝结芽孢杆菌CL对大肠杆菌O9的拮抗效果；

图5为ARTP诱变凝结芽孢杆菌突变株pH耐受性比较；

图6为适应性进化选育凝结芽孢杆菌突变株pH耐受性比较；

图7为凝结芽孢杆菌CL5的抗逆性和产蛋白酶活结果；其中，A：pH耐受性；B：胆盐耐受性；C：耐高温80℃；D：产蛋白酶活。

具体实施方式

为对本发明有更深入的了解，现结合具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的实施范围不限于此。本发明的实施例中涉及到的生物材料如未有特殊说明，均为常规市售产品。

实施例1：菌株的分离与鉴定

猪肠内容物取自镇江市丹徒区益康屠宰加工厂新鲜屠宰的生猪。称取1g猪肠道内容物溶于无菌生理盐水中，振荡混匀，80℃水浴15min。冷却至室温，进行富集培养。取1mL培养液进行10倍梯度稀释至一定浓度，吸取适当稀释度的菌悬液200µL均匀涂布于已标记的LB琼脂平板上，每个浓度进行3次重复，37℃下倒置培养24h。挑取生长态势良好的单菌落进行划线培养，直至不再出现杂菌为止。将分离纯化得到的菌株接种于斜面培养基上，培养24-48h后，4℃保存备用。

采用牛津杯法进行菌株复筛：将无菌牛津杯放在含大肠杆菌O9的平板中心，用移液枪移取200µL过膜处理的初筛菌株发酵液加入牛津杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小。经过分离纯化、初筛复筛等处理，根据抑菌圈的大小，最终得到一株对大肠杆菌O9有明显拮抗作用的菌株，命名为CL。其抑菌效果见图4。

基于16S rDNA序列的分子鉴定：以提取到的菌体总DNA为模板，采用细菌16SrDNA通用引物(27F：5′-agagtttgatcmtggctcag-3′；1492R：5′−tacggytaccttttacgactt−3′)，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR反应体系(50μL)如表1所示，反应条件:94℃ 5 min， 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 35 s，72 ℃ 90 s，循环35次，72 ℃ 8 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为约1.5 kb的片段（图2）。切胶回收测序确认该片段实际长度为1413bp，其核苷酸序列如下（SEQ. ID.NO. 1）：

gctggctccgtaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgggttgcagcctgcaatccgaactgggaatggttttctgggattggcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactcaatgctggcaactaaggtcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaaggccctgtctccagggaggtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagccgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagcctcccagtttccaatgaccgcttgcggttgagccgcaagatttcacatcagacttaagaagccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggccgggtaccgtcaaggcgccgccctgttcgaacggcacttgttcttccccggcaacagagttttacgacccgaaggccttcttcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgggccgttaccccgccaactagctaatgcgccgcgggcccatctgtaagtggcagccgaagccgcctttcctttttcctccatgcggaggaaaaaactatccggtattagccccggtttcccggcgttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaaccttttaaaagcaagcttttaaaaggtccgcacgac

将序列与GenBank中保存的数据进行相似性比对，发现菌株CL与Bacillus coagulans同源性最高 (homology, 99%/1427bp, based on 16S rDNA)。系统进化树如图3所示。根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于16S rDNA序列的同源性高于95%，本实验分离筛选的菌株CL属于Bacillus coagulans。

表1. PCR扩增反应体系

实施例2：菌株生长特性与抑菌效果测定

将分离筛选的菌株CL活化后接种于种子培养基中培养12h，以2%接种量接种于45瓶装有50mL种子液的摇瓶中，37 ℃恒温摇床振荡培养。每隔2 h取样测定菌体浓度OD_600nm。0-6h为菌株适应期，随后进入对数生长期，15h后进入稳定期。

试管法测定其抑菌效果：分别挑取一环待测菌株和大肠杆菌O9分别到NB培养基中，37℃、180r/min振荡培养12h。将待测菌株发酵液经离心和膜过滤后，稀释成不同的浓度梯度。将1mL大肠杆菌O9+5mL稀释液+4mL NB培养基体系37℃、180 r/min培养12h，分别测0h和12h的OD_600nm值，计算抑菌率。凝结芽胞杆菌CL发酵液随着稀释比例的降低，对大肠杆菌O9抑菌率逐渐升高；在1:1.25比例下，抑菌率达到最大值（92.91%）。该实施例表明，该菌株具备抑菌活性，该性能有望能改善发酵饲料的生产稳定性，降低发酵过程中的染菌可能；同时有可能有利于降低饲用动物的染病。

实施例3 ：常压室温等离子体诱变（ARTP）结合适应性进化选育高抗逆性菌株

常压室温等离子体诱变：将2×10⁶ 个/mL 的对数期菌体悬液经ARTP 诱变20 s（致死率达93%左右）涂布于固体培养基上，挑选出颗粒饱满、表面圆滑且较大的菌落50株，分别记为CL1、CL2、…、CL50。按2%接种量将挑选出的50株菌株悬液转接到装有MRS培养基的24孔板中，分别考察其在pH3.0、3.5和4.0条件下分别培养2h后的存活率。有22 株突变株的pH（3.0，3.5和4.0）耐受性显著高于出发菌株（图5）。其中，突变菌株CL5的存活率最高，具有良好的耐强酸能力。

在细菌基因组中，编码 16S rRNA 的 rDNA 基因具有良好的进化保守性。物理和化学诱变菌株的保守序列16S rRNA一般不变（也就是说和原菌株的16S s RNA序列一致）。本发明均以诱变后的表观理化性质变化为指标，本发明得到的菌株CL5与原菌株的保守序列一致。

将ARTP诱变获得的选择菌株CL5（选择3株，记为包括CL5-01、CL5-02、CL5-03）进行适应性进化实验。第0d：取活化好的CL5菌种种子液按2%接种量接种到pH5.0培养基中，培养2d，计算存活率；第2d：按10%接种量将pH5.0培养的菌液转接到pH4.0的培养基中，培养3d后，计算活菌数和存活率；第5d：按20%接种量将pH4.0培养的菌液转接到pH3.5的培养基中，培养5d，计算活菌数和存活率；第10d：按30%接种量将pH3.5培养的菌液转接到pH3.0的培养基中，培养15d，计算活菌数和存活率；第25d：按40%接种量将pH3.0培养基的菌液转接到pH2.5的培养基中，培养15d，计算活菌数和存活率。

结果发现突变株CL5-02在pH 3.5、3.0和2.5等环境下存活率为均为最大（图6）。相对于出发菌株，突变株CL5-02在pH 3.5，3.0和2.0环境下存活率均显著增加，分别达到51%，27%和21%；胆盐浓度0.2%和0.4%时存活率分别为88%和76%；在80℃条件下连续处理50min存活率仅下降8.72%（图7），表明该菌株具有高抗逆性和耐高温特性，可以耐受饲料加工过程中的高温工序，更易于储存。

本发明选择最优菌株CL5-02作为本发明筛选的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5突变株，该菌株已于2019年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101)，其保藏号为CGMCC No 1.17145。以下实施例以菌株CL5-02为代表说明本发明筛选的最优凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5突变株为基础进行验证。

实施例4：凝结芽孢杆菌CL5抑菌性能

选择凝结芽孢杆菌突变株CL5培养18h，离心收集发酵上清液，膜滤除菌。按上述试管法，分别培养大肠杆菌O9、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌、链球菌、破伤风梭菌（均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）菌液，加NB培养基调节菌体浓度为1.0~2.0×10⁷，分别测定其抑制大肠杆菌O9、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌等致病菌的性能。取1mL的致病菌液，不同体积的突变株CL5发酵液和NB培养基，确定不同稀释比例条件下的抑制率。如表2所示，突变株CL5对大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌有很强的抑杀作用，对金黄色葡萄球菌、链球菌等革兰氏阳性菌也具有良好的抑制作用。

表2凝结芽孢杆菌突变株CL5抑菌性能研究

实施例5 ：喷雾干燥制备凝结芽孢杆菌CL5高活性菌剂

将凝结芽孢杆菌CL5接种至装有125 mL 发酵培养基（葡萄糖35 g/L，酵母膏8 g/L，蛋白胨10 g/L，K₂HPO₄ 5 g/L，MnSO₄ 0. 1 g/L，NaNO₃ 0. 5 g/L。）的500 mL 三角瓶中， 37℃下180 rpm 培养18h后制得发酵种子液，进而接种至150L发酵罐中，按照1%接种量接入凝结芽孢杆菌种子液，发酵条件分别为37 ℃、300r /min，通气量1:0.5 vvm，罐压控制0. 04～0. 06 MPa。发酵15h后，收集发酵液，减压浓缩50%后喷雾干燥，进风温度为160 °C，出风温度为90 °C，压缩空气流量为600 L/h，进料流速为10.0 mL/min，在该条件下，此时菌体收率在90. 07%；凝结芽孢杆菌制剂8×10⁹个/g，活菌数达到90%以上。

实施例6 ：凝结芽孢杆菌CL5菌剂改善生长猪的生长性能

为说明凝结芽孢杆菌CL5菌剂作为饲料添加菌剂的应用，挑选体重相近（25.0 ± 0.5kg）的健康商品公猪15头（由江苏省永康农牧科技有限公司提供），随机分为空白组、出发菌株WT组和突变菌株CL5（在饲料中添加本发明筛选的凝结芽孢杆菌CL5）等3个实验组，添加菌剂的活菌数均为8×10⁹个/g；每个实验组5头。试验饲料参照国家农业部《猪饲养标准NT/T65-2004》，组成主要包括玉米、大豆油、麦麸、油米糠、普通豆粕、玉米蛋白粉（CP60）、DDGS、菜粕、石粉、磷酸氢钙、食盐、赖氨酸盐酸盐、1%预混合饲料等。试验饲料为颗粒饲料，制粒温度75 ℃。每天8: 00、12: 30、18: 00 定时饲喂，自由饮水，免疫、消毒、卫生等饲养管理按常规进行，试验期40 d。如表3所示，饲用凝结芽孢杆菌有利于提高生猪的平均日增重，其中，突变菌株CL5组的平均日增重最高，同时饲料增重比也显著高于其它实验组。说明使用选育的凝结芽孢杆菌能够获得较好的实际养殖效果。

表3. 凝结芽孢杆菌对生长猪生长性能的影响

实施例7：凝结芽孢杆菌CL5-02发酵豆粕生产高消化率发酵豆粕

将凝结芽孢杆菌突变菌株CL5-02斜面菌种接入装有100mL MRS培养基的500mL摇瓶中，培养温度35℃，培养时间18h获得种子液；调整凝结芽孢杆菌种子液中活菌数为1.0×10¹⁰个/mL；取干豆粕100ｇ，按料液比为1:0.6（w/v）将豆粕与水混合成湿豆粕。根据接种量为5%-15%（v/w）接种到灭菌豆粕中37℃恒温发酵36 h。突变菌株CL5-02发酵豆粕产品中活菌数>2×10¹¹/kg，总蛋白含量>50%，酸性小肽含量>20%（表4）。与空白组和出发菌株组相比，发酵豆粕产品质量明显提高。

表4. 凝结芽孢杆菌出发菌株和突变菌株CL5-02对固态发酵豆粕品质性能的影响

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种高抗逆性凝结芽孢杆菌突变株及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

<400> 1

gctggctccg taaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120

gattccggct tcatgcaggc gggttgcagc ctgcaatccg aactgggaat ggttttctgg 180

gattggctta acctcgcggt ctcgcagccc tttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag 240

cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300

ggcagtcacc ttagagtgcc caactcaatg ctggcaacta aggtcaaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420

ctctgtcccc cgaaggggaa ggccctgtct ccagggaggt cagaggatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600

agctgcagca ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagc gtcagttaca 720

gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780

acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagcctccc agtttccaat gaccgcttgc 840

ggttgagccg caagatttca catcagactt aagaagccgc ctgcgcgcgc tttacgccca 900

ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtggctttct ggccgggtac cgtcaaggcg ccgccctgtt cgaacggcac ttgttcttcc 1020

ccggcaacag agttttacga cccgaaggcc ttcttcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080

actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140

tcagtcccaa tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgttgc cttggtgggc 1200

cgttaccccg ccaactagct aatgcgccgc gggcccatct gtaagtggca gccgaagccg 1260

cctttccttt ttcctccatg cggaggaaaa aactatccgg tattagcccc ggtttcccgg 1320

cgttatccca gtcttacagg caggttgccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacct 1380

tttaaaagca agcttttaaa aggtccgcac gac 1413

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggytacc ttttacgact t 21

Claims (10)

1.一种凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5，所述凝结芽孢杆菌具有高抗逆性，其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌利用常压室温等离子诱变结合适应性进化育种所得。

3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述高抗逆性为耐酸性、抗胆盐或/和耐高温。

4.权利要求1所述凝结芽孢杆菌在制备饲料、饲料添加剂或高活性菌剂中的应用。

5.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在提高豆粕发酵消化率中的应用。

6.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CL5。

7.一种制备高消化率发酵豆粕的方法，其特征在于，将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌接种至大豆豆粕中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体操作如下：

将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌进行菌株培养，获得种子液；

调整凝结芽孢杆菌种子液中活菌数为1.0~9.0×10¹⁰个/mL；

取干豆粕，与水混合成湿豆粕；根据接种量为2~10%（v/w）接种到灭菌豆粕中恒温发酵。

9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于，

所述的培养温度30-35℃，培养时间12-24h；所述干豆粕与水的用量为1:0.6（w/v）；所述恒温发酵条件为37℃恒温发酵24-36 h。

10.一种凝结芽孢杆菌高活性菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的凝结芽孢杆菌CL5接种发酵，发酵液减压浓缩后喷雾干燥，制备得到所述凝结芽孢杆菌高活性菌剂。