CN110577995B

CN110577995B - 男性骨质疏松症的诊断标志物

Info

Publication number: CN110577995B
Application number: CN201911029752.XA
Authority: CN
Inventors: 刘跃洪; 周宇; 陈曦; 王志聪; 张建军; 杨灵; 汪红; 江伟
Original assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Current assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110184346A; CN110577995A

Abstract

本发明公开了男性骨质疏松症的诊断标志物，同时还公开了用于诊断男性骨质疏松症的试剂、试剂盒及用途。用于诊断男性骨质疏松症的试剂包含针对TES基因特异性的PCR引物对。本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出男性骨质疏松症的发病及风险，对早期男性骨质疏松症的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期男性骨质疏松症患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

Description

男性骨质疏松症的诊断标志物

技术领域

本发明涉及疾病诊断领域，更具体地，本发明涉及男性骨质疏松症的诊断标志物，具体涉及TES在男性骨质疏松症诊断中的应用。

背景技术

男性骨质疏松症(osteoporosis in men)的发病率大大低于绝经后的女性，故以往对男性骨质疏松症远不及对女性的重视。近几年的研究成果表明，青年时期的男性比女性虽能达到更高的峰值骨量，骨量丢失的起始时间也明显晚于女性，但男女两性都有一个与年龄增长相位的骨丢失过程，即老年性骨质疏松症(Ⅱ型)。男性骨质疏松症与女性骨质疏松症有很多相似之处，但在病因学、病理学和澈地病学等方面仍有明显的性别差别。65岁以上的男性普遍存在程度不等的骨质疏松，其严重并发症是骨折。

在美国，大于65岁的男性髋骨骨折的发生率为4‰-5‰，相应年龄的女性发生率为8‰-10‰。在北欧的髋骨骨折发生率为男∶女＝1∶2，在南欧及其他地区，髋骨骨折的发生率在两性中均相对较低。在世界范围内所有髋骨骨折的病人中，约30％为男性，1990年为51万，预计到2025年男性髋骨骨折的人数将增加到116万人，而这一上升趋势在亚洲将更加突出。

Cooper报告50岁以上男性在一生中的髋部、椎体和前臂骨折危险度为13.1％，而女性为39.7％。Neill报道，经欧洲19个国家36个中心15570例50-79岁人群椎体骨折的男性患病率为20％。我国有关男性骨质疏松症的患病率，据上海地区徐尚忠报道，60岁以上男性为13.9％；北京地区吴青报道为13.4％(腰椎)；沈惠良报道为23.8％(腰椎)。

骨质疏松性骨折给患者造成生活能力的丧失及生命危险，Poor报道骨折的死亡率和发病率男性高于女性。

与女性骨质疏松相同，普通x线仍是诊断男性骨质疏松和相关骨折的必要手段。首要表现为脊柱和骨盆的骨质密度减低。椎体骨皮质变薄，横行骨小梁减少或消失，纵行骨小梁相对明显，严重时椎体内结构消失；椎体变扁，其上下缘内凹、椎间隙增宽，椎体呈双凹状，常因轻微外伤而压缩呈楔形。在长骨上可见骨小梁变细、数量减少、骨皮质变薄和出现分层现象。严重时可在弥漫性骨质密度减低的基础上出现散在分布的数毫米大小的点状透亮区，其边界清楚或模糊，易误诊为骨质破坏。但X线平片对诊断骨质疏松的敏感性和准确性低，对骨质疏松的早期诊断帮助不大。因此亟待开发一种在骨质疏松症早期即可诊断骨质疏松症的方法。

发明内容

本发明涉及一种男性骨质疏松症的诊断标志物，本发明通过实验证明在男性骨质疏松症患者的血液中TES基因mRNA含量显著高于正常人群，因此TES基因的差异表达的性质使其成为可以用来诊断受试者是否患有男性骨质疏松症的分子标志物。

具体地，本发明提供了检测TES的产品在制备男性骨质疏松症诊断工具中的应用。

进一步，所述检测TES的产品包括检测样品中TES基因表达量的产品。

更进一步，所述检测TES的产品包括能够定量样品中TES基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中TES蛋白的产品。

本发明的定量样品中TES基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

所述能够定量样品中TES基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的定量样品中TES蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量样品中TES蛋白的产品包括特异性结合TES蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量样品中TES蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的TES蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对TES蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(InvitrogenCorporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来源于血液。

进一步，所述定量TES基因或TES蛋白的产品可以是检测TES基因或TES蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的工具，所述工具能够检测TES。

进一步，所述工具能够检测样品中TES基因表达量。

进一步，所述工具包括能够定量样品中TES基因mRNA的试剂，和/或能够定量样品中TES蛋白的试剂。

更进一步，所述能够定量样品中TES基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述能够定量样品中TES蛋白的试剂包括与TES蛋白特异性结合的抗体。

进一步，所述诊断男性骨质疏松症的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断男性骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知TES基因的异常与男性骨质疏松症相关也属于TES的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗TES抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合TES即可。

本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中TES基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的TES基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，TES基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被判断具有患有男性骨质疏松症的倾向、或者已经患有男性骨质疏松症，或者男性骨质疏松症患者被判断为复发、或者男性骨质疏松症患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物组合物包括抑制TES基因表达的试剂。

进一步，所述试剂不受限制，只要是可以抑制TES表达水平即可。

所述试剂可以包括siRNA、shRNA、抑制型miRNA、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了TES基因在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

进一步，所述药物包括抑制TES基因的试剂。所述试剂不受限制，只要是可以抑制TES表达水平或抑制TES功能活性即可。

本发明还提供了前面所述的抑制TES基因表达的试剂在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

在本发明的上下文中，“诊断男性骨质疏松症”包括判断受试者是否已经患有男性骨质疏松症、判断受试者是否存在患有男性骨质疏松症的风险、判断男性骨质疏松症患者是否已经复发、判断男性骨质疏松症患者的预后。

本发明的TES基因序列(Chromosome 7,NC_000007.14(116210539..116258786))可在NCBI网站上查询到。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断男性骨质疏松症的分子标志物，使用该分子标志物可以在男性骨质疏松症发生的早期即可作出判断。

附图说明

图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测TES基因差异表达情况的统计图；

图2显示干扰TES基因表达的效果统计图；

图3显示干扰TES基因对成骨细胞增殖影响的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR检测差异表达基因

一、样品收集

选取30例男性骨质疏松症患者，入选标准：双能X线测量骨密度的T<-2.5；T<-2.5并伴有既往脆性骨折史；肝、肾功能正常者。排除标准：①既往使用过抗骨质疏松药物者；②有糖尿病、甲状腺或甲状旁腺疾病、肾上腺及性腺等内分泌疾病；③继发性骨质疏松症。平均年龄78岁。提取上述患者的外周血作为实验样品，同时收集30例正常人的外周血作为对照样品。

二、在mRNA水平上进行验证

1、总RNA提取

使用天根公司的RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(货号：DP443)提取血液总RNA，按照说明书操作，大致步骤如下：

(1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH₂O稀释至1×红细胞裂解液H。

(2)向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H(需自备合适的干净管子)。

注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液H的使用体积也要进行相应调整。

(3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。

(4)4℃ 2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。

(5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。

(6)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低。

(7)向白细胞沉淀中加入裂解液RLH(使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表1进行，涡旋或使用移液器混匀。

注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RLH的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。

表1裂解液使用量表

裂解液μL	健康人类全血(ml)	白细胞数量
			350	多至0.5	多至2*10<sup>6</sup>
600	0.5-1.5	210<sup>6</sup>至110<sup>7</sup>

(8)将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液。

注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。

(9)向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

注意：配制70％乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70％乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。

(10)如果不进行DNase I消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μl去蛋白液RW1H(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。

DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(11)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。

(12)向吸附柱CR4中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

(13)向吸附柱CR4中加入350μl去蛋白液RW1H，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(14)向吸附柱CR4中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。

(15)重复步骤14。

(16)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：离心后将吸附柱CR4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。

(17)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50μlRNase-FreeddH2O室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

2、反转录反应

总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA公司)将1000ng纯化的RNA逆转录合成cDNA。

1)去除基因组DNA反应，按表2中的如下成分于冰上配制反应混合液。

表2去除基因组DNA反应体系

试剂	使用量
		5*gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		总RNA	1μL
无RNase水	至10μL

2)PCR仪上进行反应

42℃ 2min；

4℃保存。

3)反转录反应

反应液配制在冰上进行，成分如表3所示。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

表3反转录反应体系

试剂	使用量
		前一步反应液	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μL
		RT Primer Mix	1.0μL
5*PrimeScript Buffer 2(for Real Time)	4.0μL
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	4.0μL
总	20μL

4)PCR仪上进行反应:

37℃ 15min；

85℃ 5sec；

4℃保存。

3、实时定量逆转录-聚合酶链反应(QPCR)

1)采用SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA公司)，配置10μL PCR反应体系(比例如表4所示)，将除cDNA以外的其他试剂预混，每个样品单个基因制作重复三次复孔，依次加入96孔板中，以ddH₂O作为阴性对照。

表4 QPCR反应体系

引物序列如下：

TES

正向引物：5’-TTGAGCAATGAAGAGGAT-3’(SEQ ID NO.1)，

反向引物：5’-ATAGGTAACTGTATTGATGGA-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH

正向引物：5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(SEQ ID NO.4)。

2)程序设置：

预变性Cycle:1

95℃ 35秒；

95℃ 5秒+57℃ 34秒，共40个循环。

3)获得每个样本的Ct值，所有目标基因的相对表达量按(2-△△Ct)计算，以同组内参基因GAPDH分别作为对照。

4、结果

结果如图1所示，与30例正常对照人群平均水平相比，25例男性骨质疏松症患者中全部患者血液中TES基因的mRNA水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2 男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备

根据TES基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测TES基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症，据此本发明提供了一种基于检测TES基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系；扩增TES基因和GAPDH基因的引物对。扩增TES基因的正向引物序列为5’-TTGAGCAATGAAGAGGAT-3’，反向引物序列为5’-ATAGGTAACTGTATTGATGGA-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’，反向引物序列为5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mMKCL，2.5mM MgCL₂、200mM(NH₄)₂SO₄。

实施例3 TES基因表达对成骨细胞增殖与分化的影响

1、所用试剂

hFOB1.19(购于中科院上海细胞库)；DMEM(高糖)/F12(DMEM:F12＝1:1，购自Gibco公司)，新生胎牛血清(FCS，杭州四季青)；MTT(碧云天公司)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成公司)

2、人成骨细胞培养

将hFOB1.19细胞放于5％CO₂，34℃培养箱内培养，细胞培养基为DMEM(高糖)/F12完全培养基(DMEM(高糖)/F12中添加终浓度为10％的胎牛血清及终浓度为0.3％的G418)。

3、细胞转染

siRNA基因序列引自GenBank，由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。转染前24h将hFOB1.19细胞接种于6孔板，加入1.5mL DMEM/F12完全培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80％-90％时进行转染。转染前更换为不含血清不含G418的Opti-MEM培养基。用250μLOpti-MEM培养基稀释siRNA(终浓度为33nmol/L)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250μLOpti-MEM培养基稀释5.0μL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于34℃、体积分数5％CO₂培养箱中培养。转染6h换DMEM/F12完全培养基培养。

针对TES的siRNA序列(TES-siRNA)为：正向序列

5’-AUAGGUAACUGUAUUGAUGGATT-3’(SEQ ID NO.5)，

反向序列5’-CAUCAAUACAGUUACCUAUGATT-3’(SEQ ID NO.6)。通用阴性对照序列(NC-siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司提供。

4、敲除效率检测

4.1细胞总蛋白的提取

1)转染48h后，吸弃旧培养基，每孔加入1ml 4℃的PBS缓冲液清洗6孔板2-3次，保留最后一次PBS放置于冰上；

2)在EP管中配新鲜裂解液，每1ml RIPA裂解液中加入10μl PMSF(100×)，10μlcooktail(100×)，轻轻吹打混匀，置于冰上备用；

3)将2中PBS弃净，每孔加入120μl上述配制的裂解液，轻轻晃动6孔板，置于冰上裂解40min；

4)待裂解完成后，快速收集细胞，用灭菌的枪头将细胞碎片及裂解液移入到1.5ml灭菌EP管中；

5)4℃离心机，12000rpm，20min，将上清移入另一1.5ml无菌EP管中，做好标记；

6)取3μl蛋白裂解液稀释10倍，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度；

7)余下蛋白裂解液按体积加入一定量的SDS上样缓冲液(6x)，混匀后在沸水中煮沸5-10min。-80℃保存备用。

4.2免疫印迹

用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30μg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使用Bio-Rad半干转印系统转膜，封闭过夜，加入Western洗涤液洗涤，加入单克隆抗体摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western羊抗鼠二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次；ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。利用专业软件计算蛋白条带灰度，灰度与蛋白量成正比，以对照组蛋白表达量为基准，设定为1，计算TES干扰组TES蛋白的相对表达量。

4.3结果

如图2所示，TES-siRNA可有效抑制TES蛋白表达，NC-siRNA组TES蛋白量约为TES-siRNA组的5倍，差异具有统计学意义。

5、成骨细胞增殖实验

步骤：96孔板接种hFOB1.19细胞，每孔2000个，每组5孔，按照前面描述的方法进行siRNA转染，转染48h后，加入MTT液(5mg/mL)20μL/孔，37℃孵育4h，吸去孔内液体，加入DMSO液体150μL/孔，振荡10min，用酶标仪选择570nm波长测定各孔吸光度值，其值与细胞数量成正比。

结果：如图3所示，抑制TES基因表达可促进hFOB1.19细胞增殖，与对照组相比差异显著，具有统计学意义。

6、成骨细胞分化实验

碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞分化的特异性标志，其含量可以间接反映成骨细胞的功能，是最常见评价成骨细胞分泌功能的指标之一，因此通过检测培养液中碱性磷酸酶水平来评估抑制TES基因表达对成骨细胞分化的影响。

培养液中碱性磷酸酶活性测定：

步骤：6孔板中每孔接种1×10⁵/mL个hFOB1.19细胞。按照前面描述的方法进行siRNA转染，吸取转染24h的细胞培养液，2500r/min，离心10min，应用碱性磷酸酶检测试剂盒取上清液进行测定。碱性磷酸酶＝[(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)]×酚标准品浓度×100mL×样品测定前稀释倍数。用酶标仪选择520nm波长测定各孔吸光度值(A值)，根据测得A值计算相对的ALP活性。

结果：TES-siRNA组上清磷酸酶活性与对照组相比显著升高，代表TES抑制表达可促进成骨细胞分化。

表5上清磷酸酶活性统计

项目	NC-siRNA	TES-siRNA
			上清碱性磷酸酶	0.777±0.042	1.469±0.064

综上所述，TES-siRNA通过下调TES基因表达，促进hFOB1.19成骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶活性促进成骨细胞的分化，故抑制TES基因表达可作为治疗骨质疏松症的一种新方法。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 男性骨质疏松症的诊断标志物

<150> 201910626067.9

<151> 2019-07-11

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgagcaatg aagaggat 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataggtaact gtattgatgg a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggacctga cctgccgtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggagtgg gtgtcgctgt 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

auagguaacu guauugaugg att 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caucaauaca guuaccuaug att 23

Claims

1.特异性检测TES基因表达量的产品在制备诊断男性骨质疏松症的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够定量样品中TES基因mRNA的产品，和/或能够定量样品中TES蛋白的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中TES基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TES基因的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述能够定量样品中TES蛋白的试剂包括特异性结合TES蛋白的抗体。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述样品来源于血液。