CN110564647A

CN110564647A - 一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110564647A
Application number: CN201910898124.9A
Authority: CN
Inventors: 陈鸿飞; 许丽宁; 邵彩虹; 方长旬; 林文雄
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110564647B

Abstract

本发明属于植物微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽胞杆菌ZSY‑3及其作为再生稻根际促生菌株的应用。本发明以再生季稻分蘖数为主要指标，通过筛选得到一株解淀粉芽胞杆菌ZSY‑3，并保存于中国典型培养物保藏中心，实验证明，本发明筛选菌株解淀粉芽胞杆菌ZSY‑3具有一定的固氮、解磷、解钾和产IAA能力，能够有效的作为根际促生菌株，促进再生季稻腋芽萌发生长成穗,有助于提高再生季稻产量。

Description

一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌种及其应用的技术领域，具体涉及一株促生菌及其在再生稻腋芽萌发生长中的促进作用技术领域。

背景技术

水稻是我国的三大主要粮食作物之一，稳定和提高稻谷总产对维护我国的粮食安全至关重要。提高作物总产的途径有3 条：（1）提高单位面积的单季产量，也就是单产；（2）增加耕地面积；（3）提高复种指数。但我国水稻生产依然面临着一些现实问题：人均稻米消费需求刚性增长，水稻的单产虽然仍在增加，但是增产幅度越来越小，难有大的突破；农业生产成本不断上升，种粮比较效益偏低，导致农业劳动力结构发生改变，农村劳动力短缺，水稻播种面积呈现下降趋势，尤其在我国南方部分稻区出现了“双改单”甚至抛荒的现象，水稻种植面积增加的可能性极小；因而通过提高复种指数来增加收获面积成为提高稻谷总产的一条主要途径。

再生稻是采用一定的栽培管理措施，使头季水稻收割后稻桩上的休眠芽萌发生长成穗再收获一季的一种资源节约型稻作模式，具有“七省两增一优”的特点（省种、省工、省时、省水、省肥、省药、省秧田、增产、增收、米质优）的特点，在当前种粮成本持续上涨、“双改单”及抛荒面积不断增加的双重压力下，已成为我国南方光温资源一季有余两季不足和“双改单”稻区提高复种指数、稳定稻谷总产和调优粮食结构、提高稻米质量、实施农业供给侧结构性改革及提高种粮效益的一种重要稻作制度。

再生季稻产量的高低对发挥再生稻这一稻作制度作用至关重要；众多研究表明再生季稻产量与单位面积上再生分蘖数量的相关性最密切，再生芽发苗、成穗的多少，直接影响再生季稻单产的高低(李经勇,1997,凌启鸿,1989,任天举,1993,刘保国,1998,郑景生,2004)。因此，提高单位面积再生分蘖数量成为发挥再生稻稻作制度作用的关键。

当前，提高再生季稻分蘖的数量多依赖于化肥的施用，但长期的施用化肥会加剧环境污染，并对土壤的结构和理化性质造成危害，导致土壤的养分失调、板结等问题。

植物根际促生菌(PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类，植物根际促生菌可通过合成某些对植物生长发育有直接作用的物质(如生长素等) 和(或) 改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于植物吸收(如固氮、解磷等) 从而促进植物生长，也可抑制或减轻某些植物病害对植物生长发育和产量的不良影响。具有低碳、纯天然、无毒、无害、无污染的特点，在农作物上的应用日益广泛，已有研究者从棉花、小麦、烟草、辣椒、番茄、马铃薯等作物中分离到具有良好促生或生防效果的植物根际促生菌，但目前尚未见用于再生稻腋芽萌发生长的根际促生菌研究报道。

发明内容

本发明目的在于提供一株再生稻腋芽萌发生长的根际促生菌解淀粉芽孢杆菌及其应用。

为实现上述目的，本发明提供的一株可促进再生稻腋芽萌发生长的根际促生菌解淀粉芽孢杆菌, 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZSY-3，已于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCCNo.17041。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为中国，北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

进一步地，将该解淀粉芽胞杆菌株应用于促进再生稻腋芽萌发生长中。

进一步地，将该解淀粉芽胞杆菌株应用于制备促进再生稻腋芽萌发生长的微生物菌肥或菌剂中。

该菌可在芽孢杆菌通用培养基中培养发酵。培养基成分：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH=7.0。

在显微镜下观察该菌菌落形态，该菌菌落表面粗糙，中间隆起, 呈白色不透明；菌株呈杆状,革兰氏染色呈阳性，结合形态学和16S rDNA分子生物学鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

该菌可利用木糖、乳糖、棉子糖、麦芽糖、甘露糖和阿拉伯糖，不利用半乳糖，可使淀粉、酪素水解。

本发明的有益效果在于：本发明的解淀粉芽孢杆菌具有产IAA、解磷、解钾和固氮能力，固氮能力为4.71 mg/L，解磷能力为3.18 mg/L，解钾能力为15.17 mg/L，产IAA能力为0.99 mg/L。能够有效的作为根际促生菌株，促进再生季稻腋芽的萌发生长成穗，提高再生季稻分蘖数、有效穗数，进而提高产量。

附图说明

图1为本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZSY-3对再生季稻的促生作用。

图2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZSY-3的菌落形态。

图3为本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZSY-3的革兰氏染色图。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1、解淀粉芽孢杆菌的分离与纯化

土样的采集：2015年从福建农林大学教学基地试验田采集具有强再生力水稻再生季根际土样。采用5点采样法,混合均匀做为样品。采用稀释分离法对土样微生物分离纯化,称取10g土壤加入无菌水90 mL的三角瓶中，120r/min，振荡30min，获得土壤悬液，将获得的土壤悬液依次稀释，制成10^-1~10^-6等不同稀释度的土壤溶液。用胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L配制培养基，用NaOH调节该培养基pH值至7.0~7.4,每升加10~15g琼脂粉，取10^-3~10^-6各稀释梯度的样品0.1 mL涂抹于上述培养基制平板上,每个浓度重复3次, 平板倒置于30°C的培养箱培养一天后，选取菌落数适宜的平板，挑取其中的单菌落,采用平行划线的方法进行纯化，连续3次转接，确认为单一细菌，得到3株菌株。

2、根际促生菌的筛选及促生效果测定

试验采用温室盆栽法，地点设在福建农林大学教学试验场点温室大棚，采用上口径30cm、下口径23cm、高30cm的塑料桶为容器，每盆装土重12kg，每个菌处理和对照各6盆，三次重复，共90盆。收割后3天开始处理，处理时用菌悬液灌根，每株浇灌菌悬液500毫升, 浓度为10⁶-10⁸CFUs/ml，隔3天再浇灌1次，共2次，以强化菌在根际的定殖，对照浇灌相同体积的无菌培养基，处理方法相同。

菌悬液制备：配制LB液体培养基（NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g），用馏水溶解并补充至1000 mL，调pH值为7.0，121℃灭菌20min。将上述分离纯化得到的3株菌株分别接种到LB液体培养基中，34℃、 220 r/min振荡培养48h得到菌悬液。

促生考察：于再生季稻成熟期，每处理取3株考察单株穗数、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量。

表 1 不同菌株处理下再生季产量及其构成因子

可见，筛选得到的菌株ZSY-3能够有效的作为根际促生菌株，显著促进再生季稻腋芽的萌发成穗，有助于提高再生季稻产量。（见图1）

3、菌株的鉴定

革兰氏染色及形态鉴定：形态观察发现菌株呈杆状，菌落表面粗糙，中间隆起, 呈白色不透明（见图2），将上述筛选得到的菌株ZSY-3经革兰氏染色结果为阳性（见图3）。

分子鉴定：为了进一步确定该菌株，提取该菌株的总DNA, 采用通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ; 1492R: 5' – GGTTACCTTGTTACGA CTT-3' )进行PCR扩增，经16S rDNA序列分析，并与CNBI数据库比对，确定为解淀粉芽孢杆菌。

16S rDNA序列：

tgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaa。

实施例2 菌株促生潜力测定

（1）菌株固氮能力测定

制备固氮菌种子液：将阿须贝无氮液体培养基（葡萄糖10.0g，KH₂PO₄ 0.2g，CaCO₃5.0g，MgS0₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g,，CaSO₄0.2g，琼脂15g，蒸馏水1000mL,pH7.0）分装试管(10mL/管)后灭菌，将菌株接种至上述培养基置28℃、150rpm摇床培养2d。将配好的无氮液体培养基以每瓶50mL加入250mL的三角瓶中，灭菌后接进1mL固氮菌种子培养液，设置不接种的空白对照。接种后28℃，150rpm振荡培养7d。将培养好的固氮菌发酵液分别定容至50mL，500rpm离心10min，以除去其中的不溶性物质。取10mL上清液经消煮后采用于凯氏定氮法测定氮含量。如表2所示，测得菌株ZSY-3固氮能力为4.71 mg/L。由此可知,菌株ZSY-3具有固氮能力。

（2）菌株解磷能力测定

制备解磷菌种子液：将解磷液体培养基（葡萄糖10.0g，（NH₄）₂SO₄ 0.5g，KCl 0.3g,，NaCl 0.3g， MgSO₄·7H₂O 0.3g ，MnSO₄·4H₂O 0.03g,，FeSO₄·7H₂O 0.03g ，Ca₃(PO₄)₂8.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g， pH7.0~7.5）分装试管(10mL/管)后灭菌，将菌株接种至上述培养基置28℃、150rpm摇床培养2d。

将配好的解磷液体培养基以每瓶50mL加入250mL的三角瓶中，灭菌后接进1mL解磷种子培养液，设置不接种的空白对照。接种后28℃，150rpm振荡培养7d。用分光光度计采用钼蓝比色法测定磷含量。如表2所示，测得菌株ZSY-3解磷能力为3.18 mg/L。由此可知,菌株ZSY-3具有解磷能力。

（3）菌株解钾能力测定

制备解钾菌种子液：将解钾液体培养基（蔗糖5 g，FeCl₃ 0. 005 g，MgS0₄·7H₂O 0. 5g,，CaCO₃ 0. 1 g ,，Na₂HPO₄ 2 g，钾长石粉 2 g，琼脂 15 g，pH7. 0）分装试管(10mL/管)后灭菌，将菌株接种至上述培养基置28℃、150rpm摇床培养2d。将配好的解钾液体培养基以每瓶50mL加入250mL的三角瓶中，灭菌后接进1mL解磷种子培养液，设置不接种的空白对照。接种后28℃，150rpm振荡培养7d。将在三角瓶中发酵液定容至50mL，取10mL的菌液10000rpm离心10min，取上清液采用火焰分光光度计测定钾含量。如表2所示，测得菌株ZSY-3解钾能力为15.17 mg/L。由此可知,菌株ZSY-3具有解钾能力。

（4）菌株产吲哚乙酸能力测定

挑取新鲜菌苔于MM培养基（KH₂PO₄ 50mM， K₂HPO₄ 50mM，MgSO₄ 5mM，(NH₄)₂SO₄ 25 mM，1% 葡萄糖，添加 0.05w/v%的 L 型色氨酸，蒸馏水1000 mL），25℃,180r/min培养7d。将在三角瓶中发酵液定容至50mL，10000rpm离心10min，取1 mL上清液加入2 mL的Salkowski’s反应液。混匀后，于室温下暗处反应30 min，对照为离心后的空白培养基，测定反应液在530nm处吸光值。如表2所示，测得菌株ZSY-3产IAA能力为0.99 mg/L。由此可知,菌株ZSY-3具有产IAA能力。

表 2菌株固氮、解磷、解钾、产IAA能力测定

可见，本发明筛选得到的解淀粉芽孢杆菌ZSY-3具有良好的固氮、解磷、解钾和产IAA能力。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1190

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420

ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1190

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZSY-3，于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.17041。

2.一株如权利要求1所述解淀粉芽胞杆菌株在促进再生稻腋芽萌发生长中的应用。

3.一株权利要求1所述解淀粉芽胞杆菌株在制备促进再生稻腋芽萌发生长的微生物菌肥或菌剂中的应用。