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CN110527722A - 一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒 - Google Patents

一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒 Download PDF

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张素丽
朱金行
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朱滨
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Abstract

本发明公开了一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒，所述试剂盒包括MassARRAY芯片、检测基因PEAR1(rs2644592,rs11264580)2个SNP位点各三条引物分别称为正向引物，反向引物以及延伸引物，其序列分别如SEQ ID No.1～6，其中引物是用于鉴别氯吡格雷药效和不良反应相关基因的多态性位点。本发明的试剂盒可对上述个位点进行高通量检测，具有灵敏度高、特异性高、检测结果稳定、可靠性高等优点；同时，适用于临床疾病突变检测，药物基因组学分析、法医学鉴定等基因分析领域。

Description

一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒
技术领域
本发明属于基因技术领域，涉及一种用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因多态性(SNP)的检测方法，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对氯吡格雷药物疗效和不良反应相关的PEAR1基因2个基因多态性位点进行检测的方法及相应的试剂盒，更具体为一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒。
背景技术
氯吡格雷(Clopidogrel)化学名为(S)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-C]吡啶-5(4H)-乙酸甲酯，分子式C16H16ClNO2S。氯吡格雷是国内一种新型且广泛使用的治疗心脑血管疾病特别是急性冠状动脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗的首选药物。同时，氯吡格雷作为一种噻吩并吡啶类抗血小板药物在结构特点和功能上有一定特性，且临床不良事件较其他抗凝药有一定优势，因此被认为是心脑血管疾病治疗过程重要考虑的抗血小板药物。近年来，随着深入研究结合临床观察表明，心脑血管疾病患者在接受正规氯吡格雷用药的抗血小板治疗仍然存在不良临床事件的发生，其中最常见的有心肌梗死，脑卒中，支架内血栓甚至死亡等临床事故。
心脑血管疾病是一种相对复杂的慢性疾病，它是由环境因素等非遗传因素(年龄、身高、体重，药物的相互作用，饮食习惯等)与遗传因素等多个因素相互作用的结果，其中遗传因素在该过程发挥核心主导作用从而导致的个体差异，是与氯吡格雷的药动学和药效学有关的蛋白或酶的基因突变，有效蛋白表达和酶的活性，从而增强或降低氯吡格雷的疗效。因此，为达到药物的最佳治疗效果即提高药物有效性或者减少药物不良反应的发生，同时深入挖掘氯吡格雷药效及不良反应相关生物标记已经显得越来越重要，也成为亟需解决的社会健康问题。
氯吡格雷作用途径首先是口服进入肠道吸收，整个过程伴随P-糖蛋白(ABCB1基因编码)转运，利用细胞色素酶CYP450活化作用使最终被激活代谢产物一定程度上定向选择与血小板表面ADP受体P2Y12直接进行不可逆地结合，达到阻断血小板活性增强效应的目的，进而抑制后续ADP介导GPⅡb/Ⅲa复合物的活化，最终使得血小板激活以及聚集作用受到抑制。PEAR1(platelet endothelial aggregation receptor 1，血小板内皮聚集受体1)基因位于人类chr1:156905972位置，是一种新发现跨膜蛋白，参与了诱导血小板接触性激活过程，接着作用于血小板之后，PEAR1胞质内酷氨酸及丝氨酸残基磷酸化，从而使相互接触的血小板形成更稳定的血栓。PEAR1可以同时调节CRP-XL和二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)形成通路，通路与PEAR1基因SNP位点相关，其基因多态性均可能影响抗血小板聚集药物的抗血小板作用。通过对PEAR1基因多态性的检测，可以更好的了解患者对抗血小板聚集药物的治疗效果。对现有文献的检索，在中国人群中对PEAR1 rs2644592和rs11264580作为氯吡格雷药效分子标记的相关报道较少。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种利用rs2644592和rs11264580多态性检测氯吡格雷用药效果的试剂盒，即用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因多态性(SNP)的检测方法。本发明为研究我国人群PEAR1基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为临床个体化用药提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种PEAR1 rs2644592和rs11264580作为氯吡格雷药效分子标记物的应用。
第二方面，本发明涉及一种用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的引物组，包括：检测基因UGT2A1 rs2644592SNP位点的PCR引物序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3所示，特异性延伸引物序列如SEQ ID No:5所示；检测基因UGT2A1rs11264580SNP位点的PCR引物序列如SEQ ID No:2、SEQ ID No:4所示，特异性延伸引物序列如SEQ ID No:6所示。
编号 针对位点 序列(5'-3') 用途
SEQ ID No:1 rs2644592 ACGTTGGATGATCACGAGCCTCTGCAAACA PCR正向引物
SEQ ID No:2 rs11264580 ACGTTGGATGTCCACTGCAACGAGAGCTG PCR正向引物
SEQ ID No:3 rs2644592 ACGTTGGATGAACATGGACACTGTCCAGAG PCR反向引物
SEQ ID No:4 rs11264580 ACGTTGGATGAGACAGTGCTCCTGGCACC PCR反向引物
SEQ ID No:5 rs2644592 CTCGCCAGAGAACCCCGACC 延伸引物
SEQ ID No:6 rs11264580 CTGGCACCCTGGCCC 延伸引物
本发明的引物是在本课题基因分型MassARRAY平台设计,该技术相对以往技术更高效精准，高通量。
第三方面，本发明涉及一种用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，包括前述的引物组。
优选地，所述试剂盒还包括检测试剂、检测芯片以及检测载体。
优选地，所述检测试剂包括PCR混合反应液、SAP酶mix消化反应液和UEP延伸mix反应液。
优选地，所述试剂盒还包括纯化用树脂、点样以及质谱检测用靶片和人基因组DNA提取试剂。
第四方面，本发明涉及一种前述的用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的非诊断目的使用方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用所述引物组进行PCR引物扩增和UEP延伸引物稀释；
S2、PCR反应；
S3、SAP消化反应；
S4、UEP延伸反应；
S5、树脂纯化。
优选地，,步骤S2中，所述PCR反应采用的PCR混合反应液中包含去离子水、PCRBuffer、MgCl2、dNTPs、耐热Taq DNA聚合酶，扩增引物mix；
步骤S3中，所述SAP消化反应采用的SAP酶mix反应液中包含去离子水、SAP Buffer以及SAP酶。
优选地，步骤S4中，所述UEP延伸反应采用的UEP延伸mix反应液中包含去离子水、Gold Buffer、Termination mix、UEP引物mix以及耐高温的延伸酶。
优选地，步骤S5中，将纯化用树脂落入步骤S4制得的装有单碱基延伸产物中。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术，放大检测模板的同时又可检测微量样本，因此检测灵敏度很高。
2、单碱基延伸又称为微测序，使用特异性探针对DNA进行识别，特异性好，假阳性低等优点。
3、高通量测序技术使得速度快，效率高，可在3-4小时完成数百个样本检测。
4、操作比较简单，同时在自动化操作下，降低污染的发生。
5、本发明可对多个患者检测，可以同时得到不同基因位点信息。
6、本研究克服了以往技术一次检测少量SNP位点的高成本缺陷。
7、本发明为研究我国人群PEAR1基因多态性与临床个体化安全用药提供理论基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、引物设计及合成
针对PEAR1基因rs2644592和rs11264580位点2个与氯吡格雷用药相关的基因多态性位点，设计对应特异性PCR引物序列(SEQ ID No:1至SEQ ID No:4)和特异性延伸引物序列(SEQ ID No:5至SEQ ID No:6)，如表1所示。
相关引物在捷瑞生物(上海)有限公司进行合成。
表1
实施例2、样本DNA提取
将抽取的5ml血液收集在含有3.2％柠檬酸三钠和肝素锂的真空采血管中，并静置至少6小时。将采血管倒置3-5次以确保血液与抗凝血剂充分混合。采用DNA MiniKit(250)试剂盒进行DNA抽提；在赛默飞NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计完成DNA浓度的测定；进行样本测定时，需要记录浓度、260/280以及260/230三个数值，以便浓度未达到要求查找可能的污染原因，同时也要求实验人员必须对DNA样品进行分装以至于实验过程减少样本冻融的次数，保证DNA的高质量。然后用去离子水将抽提好的样本浓度稀释为10-20ng/μL即可，以满足后续基因分型样本质控的基本要求。
实施例3、生物学实验
使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对2个与氯吡格雷药效相关的基因多态性进行检测；涉及到的试剂如表2所示：
表2
1、PCR反应条件：95℃，2min；45个循环(95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s)；72℃，5min。
2、SAP消化反应条件：37℃，40min；85℃，5min。
3、UEP延伸反应条件：94℃，30s；40个外部循环(94℃，5s；5个内部循环(52℃，5s；80℃，5s))；72℃，3min。
4、纯化：每管延伸产物中加入16μL去离子水，放入MassARRAY试剂盒树脂至混合均匀，离心。
5、点样：使用微量移液器，1μL纯化产物至靶片点样。
6、上机检测：点样机械臂24个针用NaOH清洗；点样；质谱检测。
经分析发现，PEAR1基因上的rs2644592和rs11264580与HPR(高血小板活性)有显著的个体差异(表3)。
表3
由表3可见，在中国汉族人群中，PEAR1 rs2644592,rs11264580位点在高血小板和正常血小板中有显著差异，并且高血小板活性伴随更高的心血管不良的预后反应。
综上所述，本发明为我国心脑血管人群中PEAR1基因多态性与临床指导用药提供理论和预后基础，为个体化药物基因组学奠定遗传学基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种利用rs2644592和rs11264580检测氯吡格雷药效试剂盒
<130> DAG41294
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg atcacgagcc tctgcaaaca 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg tccactgcaa cgagagctg 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg aacatggaca ctgtccagag 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg agacagtgct cctggcacc 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgccagag aaccccgacc 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggcaccct ggccc 15

Claims (10)

1.一种PEAR1 rs2644592和rs11264580作为氯吡格雷药效分子标记物的应用。
2.一种用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的引物组，包括：检测基因UGT2A1rs2644592SNP位点的PCR引物序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3所示，特异性延伸引物序列如SEQ ID No:5所示；检测基因UGT2A1 rs11264580SNP位点的PCR引物序列如SEQ ID No:2、SEQ ID No:4所示，特异性延伸引物序列如SEQ ID No:6所示。
3.一种用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，包括权利要求2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测试剂、检测芯片以及检测载体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括PCR混合反应液、SAP酶mix消化反应液和UEP延伸mix反应液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括纯化用树脂、点样以及质谱检测用靶片和人基因组DNA提取试剂。
7.一种如权利要求3所述的用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的非诊断目的使用方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、利用所述引物组进行PCR引物稀释和UEP延伸引物稀释；
S2、PCR反应；
S3、SAP消化反应；
S4、UEP延伸反应；
S5、树脂纯化。
8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于,步骤S2中，所述PCR反应采用的PCR混合反应液中包含去离子水、PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、耐热Taq DNA聚合酶，扩增引物mix；
步骤S3中，所述SAP消化反应采用的SAP酶mix反应液中包含去离子水、SAP Buffer以及SAP酶。
9.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤S4中，所述UEP延伸反应采用的UEP延伸mix反应液中包含去离子水、Gold Buffer、Termination mix、UEP引物mix以及耐高温的延伸酶。
10.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤S5中，将纯化用树脂落入步骤S4制得的装有单碱基延伸产物中。
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