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CN110506051A - 通过肽核酸衍生物的外显子跳跃 - Google Patents

通过肽核酸衍生物的外显子跳跃 Download PDF

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CN110506051A CN201780087164.4A CN201780087164A CN110506051A CN 110506051 A CN110506051 A CN 110506051A CN 201780087164 A CN201780087164 A CN 201780087164A CN 110506051 A CN110506051 A CN 110506051A
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Abstract

提供式I的肽核酸衍生物以序列特异性方式紧密结合前mRNA内的剪接位点。考虑到优异的细胞膜通透性和对RNA的强亲和力，所述肽核酸衍生物作为“裸”寡核苷酸以亚飞摩尔浓度诱导用肽核酸处理的细胞中的外显子跳跃。所述化合物甚至在以1μg/Kg或更低的剂量全身施用后显示受试者中的治疗活性，并且因此可用于以可负担得起的治疗成本治疗疾病或症状。

Description

通过肽核酸衍生物的外显子跳跃
发明领域
本发明涉及由具有良好细胞穿透性和对核酸的强亲和力的肽核酸衍生物诱导的外显子跳跃，并且要求于2016年12月30日提交的美国临时申请号62/440,929 (其以其整体通过引用并入本文)的优先权的益处。
发明背景
寡核苷酸已用于多种生物学目的，包括基因表达的反义抑制、PCR(聚合酶链式反应)、通过基因芯片的诊断分析等。由于寡核苷酸以序列特异性方式与包括DNA和RNA的核酸相互作用，所以它们可用于可预测地调节涉及细胞内的DNA或RNA的生物学过程。具有良好细胞通透性的寡核苷酸能够以序列可预测的方式调节细胞内的此类生物学过程。
作为药物靶标的蛋白：蛋白介导不同的细胞功能。发现大多数目前市售的药物通过调节蛋白的功能显示治疗活性不是令人惊讶的。例如，非甾体抗炎药物阿司匹林抑制被称为环加氧酶的酶，以得到其抗炎活性。氯沙坦结合称为血管紧张素II受体的跨膜受体，以得到其抗高血压活性。罗格列酮选择性活化称为过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(PPARγ)的细胞内受体，以引发其抗糖尿病活性。依那西普是一种融合蛋白，其结合称为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞因子，并中和TNF-α的生物活性而得到其抗风湿活性。赫赛汀是一种单克隆抗体，其通过选择性结合在某些类型的乳腺癌细胞中过表达的erbB2来治疗乳腺癌。
前mRNA：遗传信息在DNA(2-脱氧核糖核酸)上携带，其被转录以在细胞核中产生前mRNA(前信使核糖核酸)。哺乳动物前mRNA通常由外显子和内含子组成，并且外显子和内含子相互连接。外显子和内含子如图1A中所举例说明进行编号。
前mRNA剪接成mRNA：在细胞核中，通过一系列复杂反应(通称为“剪接”)，在缺失内含子和连接外显子后，前mRNA被加工成mRNA，如图1B中示意性举例说明。[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398(2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]。
通过在前mRNA和剪接衔接子因子之间形成“剪接体E复合物”(即早期剪接体复合物)来引发剪接。在“剪接体E复合物”中，U1结合外显子N和内含子N的连接，且U2AF35结合内含子N和外显子(N+1)的连接。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接对于早期剪接体复合物的形成是至关重要的。“剪接体E复合物”在与U2进行额外复合后演变成“剪接体A复合物”。然后，“剪接体A复合物”经历一系列复杂反应，以缺失或剪切出内含子以邻接邻近的外显子。
可变剪接和剪接变体：在剪接期间，并不总是保留前mRNA的所有外显子以形成“全长”mRNA。某些外显子被缺失或剪接出以形成变体mRNA，即“剪接变体”。因此，前mRNA可以被“可变地剪接”以产生多种剪接变体。
在1981年首次以编码降钙素的基因报道哺乳动物细胞中的可变剪接。[Naturevol 290(5801), 63-65 (1981); Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 79(6), 1717-1721(1982)] 该基因由6个外显子组成，并且降钙素mRNA通过外显子5和外显子6的跳跃产生。同时，外显子4的跳跃产生编码降钙素基因相关肽(CGRP)的mRNA变体。
可变剪接看起来完全取决于细胞和细胞暴露的条件。由于可变剪接，从单一基因产生多种蛋白。可变剪接允许动物对其基因组大小而言产生更多蛋白多样性。在人类中，估计95%的多外显子基因是可变剪接的。[Nature Genetics vol 40(12), 1413-1415(2008)]。
剪接变体和生物学功能：发现剪接变体以依赖于细胞类型或组织的方式自发发生，并且编码具有经常不同于全长蛋白的概况的生物学概况的蛋白。
雄激素受体(AR)将是产生多种剪接变体的基因的良好实例。[Int. J. Biol. Sci. vol 7(6), 815-822 (2011)] AR前mRNA由8个外显子加上4个隐蔽外显子组成(隐蔽外显子在下图中作为阴影提供)。存在至少7种AR mRNA的剪接变体。
AR mRNA变体1由串联连接的外显子1至外显子8组成，并且编码如图2A中所举例说明的全长AR蛋白。在AR mRNA变体3的情况下，外显子4至外显子8剪接掉(即缺失)。因此，ARmRNA变体3编码缺失全长蛋白中存在的配体结合结构域(LBD)的截短的AR蛋白(AR3)。
全长AR蛋白在与雄激素诸如睾酮或二氢睾酮(DHT)形成复合物后变得具有功能活性。同时，甚至在雄激素不存在的情况下，截短的AR3蛋白也具有功能活性。在对雄激素剥夺疗法抗性的前列腺肿瘤中，经常发现AR3蛋白被上调。因此，AR3变体蛋白的内源性形成可以作为前列腺癌细胞逃避雄激素剥夺疗法的自然选择过程。
缺氧诱导因子1α (HIF-1α)是称为缺氧诱导因子1 (HIF-1)的转录因子的亚基，并且由HIF1A基因编码。HIF-1α响应于缺氧(即低氧水平)而上调，并且因此可被视为细胞氧传感器。[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 92, 5510-5514 (1995)] HIF-1α诱导超过60种基因(包括VEGF和EPO)的转录。HIF-1α经由VEGF促进新血管的形成。[Exp. Mol. Med.vol 36, 1-12 (2004)] 实体瘤由于血液供应有限而经历缺氧，并且上调HIF-1α以在缺氧下存活。
HIF-1α蛋白由用于其作为转录活化物的功能活性的各种结构域组成。其含有一个碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和两个PAS结构域。[对于PAS结构域，参考Curr. Biol. vol 7(11), R674-677 (1997); Eur. J. Biochem. vol 271(6), 1198-1208 (2004)] HIF-1α具有氧依赖性降解(ODD)结构域，其充当氧传感器并且众所周知对HIF-1α蛋白的稳定性是关键的。
存在由六种HIF-1α mRNA剪接变体编码的至少六种HIF-1α蛋白变体，如图2B中所举例说明。[Exp. Mol. Med. vol 36, 1-12 (2004)] 全长HIF-1α (HIF-1αFL) mRNA与野生型HIF-1α (HIF-1αWT) mRNA相似，除了由于可变剪接导致的外显子1和外显子2之间的额外三个碱基(UAG)。外显子14在HIF-1α736中被缺失或跳跃。HIF-1α736缺乏C-末端活化结构域(CAD)。已知HIF-1αFL和HIF-1α736两者都在缺氧时活化VEGF启动子。同时，HIF-1α557 (HIF-1αZ)和HIF-1α516作为HIF-1α的显性阴性同种型发挥功能。在乳腺癌中，HIF-1αFL mRNA剪接变体反映癌症进展的阶段并且与不良预后相关。[BMC Medicine vol 8(44), 1-12 (2010)]。
如雄激素受体和HIF-1α蛋白所例举，剪接变体在产生给定哺乳动物基因的生理多样性中发挥重要作用。自然自发地产生剪接变体以维持体内平衡以及响应生理动态。
核糖体蛋白合成：将前mRNA的内含子酶促剪接出以产生mRNA(信使核糖核酸)，然后将其反式定位至胞质溶胶隔室。在胞质溶胶中，称为核糖体的翻译机构的复合物结合mRNA并在其扫描沿mRNA编码的遗传信息时实施蛋白合成。[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)]。
密码子：在核糖体蛋白合成期间，每个氨基酸由mRNA序列的三联体编码。例如，“AUG”、“UUA”、“CCC”和“AGA”分别编码“甲硫氨酸”、“亮氨酸”、“脯氨酸”和“精氨酸”。此类三联体被称为“密码子”。考虑到A、G、U和C的4种mRNA单体，存在64 (4 x 4 x 4 = 64)种可能的密码子。某些密码子对应于核糖体蛋白合成的“终止”信号。“UGA”、“UAA”和“UAG”是“终止”信号的密码子。当核糖体机构在其沿mRNA扫描时识别“终止”密码子时，核糖体蛋白合成终止。
反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)结合mRNA或前mRNA的寡核苷酸称为“反义寡核苷酸”(ASO)。紧密结合mRNA的ASO可以阻断核糖体蛋白的合成。同样，紧密结合前mRNA的ASO可以干扰剪接过程，并且产生mRNA的剪接变体。
剪接的反义抑制：在形成“剪接体E复合物”(即E-复合物)之后，前mRNA剪接开始。如图3中示意性描述，SR蛋白(即富含丝氨酸精氨酸的蛋白)结合“外显子剪接增强子”(ESE)区域并且帮助募集U1和U2AF35用于分别结合“5'剪接位点”和“3'剪接位点”。[Biochem. Cell Biol. vol 77(4), 277-291 (1999); Curr. Opin. Cell Biol. vol 13(3), 302-309 (2001)]。
原则上，ASO可以通过结合对于E-复合物的形成是至关重要的前mRNA的特定区域而在空间上抑制“剪接体E复合物”的形成。如果ASO紧密结合“5'剪接位点”、“3'剪接位点”或ESE区域，则E复合物的形成被抑制或阻断。
由于mRNA根据其序列编码蛋白，所以mRNA剪接变体编码不同于由“原始”或“全长”mRNA编码的蛋白的蛋白。因此，通过编码显示不同于“原始”或“全长”mRNA编码的蛋白的生物学特性的那些的变体蛋白，剪接的反义抑制是有效的治疗选择。
通过剪接的反义抑制诱导的移框：图4A中提供了人HIF-1α mRNA [NCBI mRNA代码：NM_001530]的“编码DNA序列”(CDS)的一部分作为实例以举例说明通过剪接的反义抑制诱导的“移框”(即“不同框的”)。通过密码子和外显子(即，绿色箭头)展现CDS (即，黄色条)。应当注意，CDS中的T(即，胸腺嘧啶)在mRNA或前mRNA中应当用U(即尿嘧啶)替换。
如果通过剪接的反义抑制而缺失外显子3，则外显子2的3'-末端直接与外显子4的5'-末端连接。然后外显子2和外显子4之间的连接读为"...-GAT-GCT--GAA-CTA-..."，如图4B中所提供(参考左图)。全长mRNA的两个相邻密码子之间存在四个核苷酸。外显子3的缺失使从外显子4开始的密码子不同框。因此，外显子3的缺失诱导密码子的“移框”。
如果通过剪接的反义抑制同时缺失外显子3和外显子4，则外显子2的3'-末端与外显子5的5'-末端相邻。然后外显子2和外显子5之间的连接读为"...-GAT-GCT--CTT-GTC-..."，如图4B中所显示(参考右图)。全长mRNA的两个相邻密码子之间存在三个核苷酸。外显子3和外显子4的双重缺失使从外显子5开始的密码子同框(即没有移框)。
移框产生不同于“原始”密码子的密码子，并且经常产生过早终止密码子(PTC)，如图4C中针对HIF-1α mRNA中外显子3缺失的情况所举例说明。由于核糖体蛋白合成的过早终止，外显子跳跃诱导移框注定产生C-末端截短的蛋白片段。这种蛋白片段可以显示不同于“原始”或“全长”蛋白的生理学特性。因此，剪接的反义抑制可能是疾病靶标基因的有效治疗选择。
通过巢式RT-PCR检测外显子跳跃：经常通过PCR(聚合酶链式反应)检测用ASO诱导的剪接变体mRNA。如果如图5A中所举例说明，ASO诱导150 bp长度的外显子4的跳跃，则从ASO的靶标前mRNA产生两种可能的mRNA，即全长mRNA和缺乏外显子4的mRNA剪接变体。在ASO诱导外显子4完全跳跃(即100%)的情况下，用ASO处理的细胞仅产生比全长mRNA的PCR产物小150 bp的PCR产物。将用于外显子跳跃的PCR产物条带取样并进行测序以证实PCR产物条带确实来自mRNA剪接变体。
通过PCR方法估计外显子跳跃产率：在文献中，通常通过比较剪接变体mRNA的PCR产物的凝胶条带强度与全长mRNA的强度来估计外显子跳跃产率或效率。一般来说，只有在全长mRNA和剪接变体mRNA在细胞中以及在对于PCR检测采用的测定程序期间具有相当的稳定性的情况下，这种估计在理论上是有效的。然而，考虑到mRNA的稳定性是十亿年来进化的总结果，mRNA剪接变体不太可能显示与全长mRNA相同的稳定性。
同样，可以公平地假设剪接变体mRNA和全长mRNA的相对富集可以根据PCR引物、PCR条件和PCR检测方法而变化很大。最近应用数字qPCR来估计用吗啉代或2'-OMe PTO (硫代磷酸酯)的肌营养不良蛋白ASO处理的mdx小鼠中的肌营养不良蛋白mRNA的外显子跳跃产率。通过数字qPCR的外显子跳跃产率与通过传统方法诸如巢式qPCR的产率显著不同。[Lab. Investigation, vol 90, 1396-1402 (2010)] 对来自人DMD患者的成肌细胞和成纤维细胞中的外显子跳跃的数字qPCR研究表明，数字qPCR是以高灵敏度可靠地检测外显子跳跃产物的选择。[PLoS One 0162467, September 09 (2016)]。
考虑到表观外显子跳跃产率倾向于根据PCR测定方法和条件而变化，通过PCR测定的外显子跳跃产率可能需要额外通过靶标基因的蛋白表达或功能测定的验证。
EIciRNA对转录的反馈上调：在前mRNA剪接期间，形成内含子套索作为副产物。外显子跳跃不仅产生剪接变体mRNA，而且还产生外显子内含子环状RNA (EIciRNA)，如图5B中所举例说明，其中外显子3和外显子4被剪接出以产生由内含子、外显子3和外显子4组成的套索。最初形成的套索，即EIciRNA ①，可以经历额外的剪接以产生定义为EIciRNA ②的二级套索。
那些EIciRNA套索保留“外显子4”的5'剪接位点的序列，并且能够募集“U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)”。然后U1 snRNP募集RNA聚合酶II，其可以上调前mRNA的转录。如果EIciRNA在细胞核中累积超过阈值水平，则前mRNA的转录可以增加。因此，当外显子跳跃过度发生时，EIciRNA通常可以作为转录的反馈调节剂发挥功能。[Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易于被内源性核酸酶降解，限制了它们的治疗效用。迄今为止，已经开发并集中研究许多非天然(即非天然存在的)寡核苷酸。[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)] 与DNA和RNA相比，它们中的许多显示延长的代谢稳定性。图6A中提供了一些代表性非天然寡核苷酸的化学结构。那些寡核苷酸可预测地与DNA或RNA一样结合互补核酸。
硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)：PTO是DNA类似物，其中每个单体的骨架磷酸酯氧原子之一被硫原子替代。这种小的结构变化使得PTO对核酸酶的降解相当地抗性。[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)]。
反映PTO和DNA之间的骨架的结构相似性，它们两者在大多数哺乳动物细胞类型中都很难穿透细胞膜。然而，对于大量表达DNA的转运体的某些类型的细胞，DNA和PTO显示相当好的细胞通透性。已知全身施用的PTO由于DNA的转运体的丰富表达而易于分布至肝脏和肾脏。[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)]。
为了在体外改善PTO的细胞通透性，已经广泛采用脂质转染。然而，脂质转染物理地改变细胞膜，引起细胞毒性，并且因此对于长期治疗用途不是理想的。
经过去的30年，已经临床评估PTO和PTO的变体用于治疗癌症、免疫病症、代谢疾病等等。[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.vol 33, 533-540 (2006)] 此类反义药物候选物中的许多尚未成功开发，部分是由于PTO的细胞通透性差。为了克服差细胞通透性，需要以高剂量施用PTO，以得到治疗活性。然而，已知PTO引发剂量限制性毒性，包括凝血时间增加，补体活化，肾小管肾病，库普弗细胞活化，和免疫刺激，包括脾肿大，淋巴样增生和单核细胞浸润。[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]。
已发现许多反义PTO显示对具有来自肝脏或肾脏的显著贡献的疾病的临床活性。Mipomersen是一种PTO类似物，其抑制apoB-100(一种参与LDL胆固醇转运的蛋白)的合成。Mipomersen由于其优先分布至肝脏而在某些动脉粥样硬化患者群体中显现临床活性。[Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)] ISIS-113715是抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的合成的PTO类似物，并且发现其在II型糖尿病患者中显示治疗活性。[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)]。
2'-O-烷基RNA：2'-O-烷基-RNA是在核糖环上的2'-羟基基团其被烷氧基基团替代的RNA类似物。2'-O-烷基RNA显示比PTO或DNA更强的RNA亲和力。此外，2'-O-烷基RNA显示用于治疗目的的改善的代谢稳定性。然而，2'-O-烷基-RNA显示差膜通透性，这限制治疗范围。
锁定核酸(LNA)：在LNA中，RNA的骨架核糖环在结构上被约束以增加对RNA或DNA的结合亲和力。因此，LNA可以被认为是高亲和力DNA或RNA类似物。[Biochemistry vol 45,7347-7355 (2006)] 尽管如此，LNA也显示像DNA或RNA那样的差细胞通透性。
DNA或RNA骨架的杂合寡核苷酸：PTO和2'-O-烷基RNA经常融合成单一寡核苷酸。由于2'-O-烷基RNA部分，这种杂合寡核苷酸具有比相同序列的PTO寡核苷酸更强的RNA结合亲和力。类似地，LNA和PTO通常融合成单一寡核苷酸，并且杂合寡核苷酸具有比相同序列的PTO寡核苷酸更强的RNA结合亲和力。然而，此类杂合寡核苷酸也显示差细胞通透性。
磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)：在PMO中，DNA骨架的磷酸酯和2-脱氧核糖模块分别被磷酰二胺和吗啉替代。[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]尽管DNA骨架带负电，但PMO骨架不带电。因此，PMO和mRNA之间的结合没有骨架之间的静电排斥，并且倾向于比DNA和mRNA之间的结合更强。由于PMO与DNA的骨架结构显著不同，所以PMO不会被识别DNA或RNA的肝转运体识别。然而，PMO不容易穿透细胞膜。
肽核酸(PNA)：PNA是具有N-(2-氨基乙基)甘氨酸的单元骨架的多肽，并且由Nielsen博士及其同事发现。[Science vol 254, 1497-1500 (1991)] 图6B举例说明原型(即未修饰的)PNA的化学结构和命名。
与DNA和RNA一样，PNA也选择性结合互补核酸。[Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)] 在与互补核酸的结合中，PNA的N-末端等同于DNA或RNA的5'-末端，并且PNA的C-末端等同于DNA或RNA的3'-末端。
与PMO一样，PNA骨架不带电。因此，PNA和RNA之间的结合倾向于比DNA和RNA之间的结合更强。由于PNA与DNA的化学结构显著不同，所以PNA不会被识别DNA的肝转运体识别，并且会显示与DNA或PTO不同的组织分布概况。然而，PNA也很难穿透哺乳动物细胞膜。[Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280 (2003)]。
杜氏肌营养不良症(DMD)：DMD是一种肌肉萎缩疾病，每约3,500名新生男性儿童中影响一名。[Lancet Neurol. vol 9, 77-93 (2010)] DMD患者逐渐丧失其肌肉功能，并且在达到其30岁之前死于心脏或呼吸衰竭。在许多DMD患者中，肌营养不良蛋白基因被突变以产生具有过早终止密码子(PTC)的肌营养不良蛋白mRNA，并且表达缺乏C-末端部分的截短的非功能性肌营养不良蛋白。[Human Mol. Genetics vol 12(8), 907-914 (2003)；和其中的参考文献]。
治疗DMD的一种流行方法是使用ASO跳跃在肌营养不良蛋白mRNA中具有PTC的外显子，并且编码具有C-末端的剪接变体蛋白，其通常被称为全长肌营养不良蛋白。
MDX小鼠中的肌营养不良蛋白mRNA的外显子23跳跃：Mdx小鼠是在肌营养不良蛋白前mRNA的外显子23中具有PTC的突变体，并且已被广泛用作人DMD的动物模型。[FEBS J.vol 280(17), 4177-4186 (2013)] 已经评估互补地靶向小鼠肌营养不良蛋白前mRNA的ASO诱导外显子23的跳跃的能力。[Artificial DNA: PNA & XNA vol 2(1), 6-15 (2011)]在这方面，mdx小鼠已经充当评估一类寡核苷酸诱导外显子跳跃的能力的良好模型系统。
将与外显子23和内含子23的连接(即外显子23的5'剪接位点)完全互补的20-聚体2'-OMe PTO (2'-O-甲基硫代磷酸酯) ASO以约10 μg/Kg(如用两亲性转染剂F127配制)局部注射至mdx小鼠的肌肉中，并通过全长肌营养不良蛋白的免疫组织化学(IHC)和western印迹，增加全长肌营养不良蛋白在注射的肌肉组织中的表达。通过IHC和western印迹的这些发现表明，通过局部注射ASO跳跃外显子23。ASO具有与内含子23的5'-末端的18-聚体互补重叠和与外显子23的3'-末端的2-聚体互补重叠。[Nature Med. vol 9(8), 1009-1014(2003)]。
评估与外显子23和内含子23的连接(即外显子23的5'剪接位点)完全互补的另一20-聚体2'-OMe PTO ASO诱导外显子23的跳跃的能力。20-聚体ASO互补地靶向外显子23和内含子23的连接，并且具有与内含子23的5'-末端的18-聚体互补重叠和与外显子23的3'-末端的2-聚体互补重叠。小鼠成肌细胞与2或4 μM ASO的96小时孵育诱导外显子23的跳跃，如通过巢式RT-PCR所证实。外显子23的跳跃也通过RT-PCR在mdx小鼠中鉴定，所述mdx小鼠接受2.9 nmol的ASO的两次肌肉内注射。在用50 mg/Kg的2'-OMe PTO ASO皮下施用的mdx小鼠的肌肉组织中检测到外显子23跳跃。具有与上述2'-OMe PTO ASO相同的序列的20-聚体2'-FPS(2'-氟-硫代磷酸酯)ASO如2'-OMe PTO ASO一样也诱导小鼠成肌细胞中的外显子23的跳跃。然而，2'-FPS ASO未能在肌肉内或皮下注射后诱导mdx小鼠中的外显子23的跳跃。[Mol. Ther. Nucl. Acids vol 4, e265 (2015)]。
评估互补地靶向外显子23和内含子23的连接的20-聚体肽核酸(PNA)诱导mdx小鼠中的外显子23的跳跃的能力。20-聚体PNA ASO具有与内含子23的5'-末端的18-聚体互补重叠和与外显子23的3'-末端的2-聚体互补重叠。250 nM的20-聚体PNA诱导H2K mdx细胞中的外显子23的缺失，如通过巢式RT-PCR所分析。在mdx小鼠中以5至20 μg(约0.25至2 mg/Kg)肌肉内注射后，20-聚体PNA诱导注射部位的肌肉组织中的外显子23跳跃。得出结论，在mdx小鼠中，20-聚体PNA的外显子跳跃效率优于上述2'-OMe PTO ASO的外显子跳跃效率。20-聚体PNA与各种细胞穿透肽(CPP)共价缀合以改善细胞通透性。那些PNA-CPP缀合物和未修饰的PNA相当地诱导细胞中以及注射部位的肌肉组织中的外显子23的跳跃。[Mol. Ther. vol16(1), 38-45 (2008)]。
评估与外显子23和内含子23的连接(即外显子23的5'剪接位点)完全互补的25-聚体PMO ASO诱导mdx小鼠中的外显子23的跳跃的能力。25-聚体ASO具有与内含子23的18-聚体互补重叠和与外显子23的7-聚体互补重叠。25-聚体PMO在以每只动物2 mg(约100 mg/Kg)多次静脉内注射后诱导mdx小鼠中的外显子23跳跃。[Nat. Med. vol 12(2), 175-177(2006)] 25-聚体PMO与各种细胞穿透肽(CPP)共价缀合以改善细胞通透性。那些PMO-CPP缀合物在以3 mg/Kg单次静脉内注射后诱导肌肉中的外显子23的跳跃。[Human Mol. Genet.vol 18(22), 4405-4414 (2009)]。
来自人DMD患者的成肌细胞中的肌营养不良蛋白mRNA的外显子46跳跃：设计2'-OMe PTO ASO以互补地靶向人肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子46内的外显子剪接增强子(ESE)区域，并评估其在源自肌营养不良蛋白mRNA中缺乏外显子45的人DMD患者的成肌细胞中的外显子46的跳跃效率。将细胞通过脂质转染用1 μM的ASO转染，并孵育24小时直至RNA提取用于巢式RT-PCR以检测外显子46的跳跃。测试的ASO中的几种诱导外显子46的跳跃。[Human Mol. Genet. vol 10(15), 1547-1554 (2001)]。
DMD患者中的肌营养不良蛋白mRNA的外显子51跳跃：Drisapersen (PRO051或GSK24022968)是经设计用于互补地靶向人肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子51内的ESE区域的20-聚体2'-OMe PTO，并评估其在人DMD患者中的治疗活性。在通过巢式PCR对肌肉组织进行活组织检查评估时，但drisapersen在每周皮下接受2至6 mg/Kg的DMD患者中诱导外显子51的跳跃，尽管外显子跳跃效力不高。[N. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522(2011)]。
Eteplirsen (AVI-4658)是经设计用于互补地靶向人肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子51内的ESE的30-聚体PMO，并评估其在DMD患者中的治疗活性。在通过IHC(免疫组织化学)对肌肉组织针对全长肌营养不良蛋白进行活组织检查评估时，eteplirsen在通过静脉内输注每周接受2至20 mg/Kg的DMD患者中诱导外显子51的跳跃。[Lancet vol 378(9791), 595-605 (2011)]。
HepG2细胞中的APOB mRNA的外显子27跳跃：载脂蛋白B (APOB)构成脂蛋白颗粒的组成部分。APOB mRNA由29个外显子组成。设计2'-OMe RNA APOB ASO以靶向外显子27的3'剪接位点、外显子27的5'剪接位点或3'剪接位点和5'剪接位点两者。3'剪接位点ASO (3'-SS ASO)具有与内含子26的15-聚体重叠和与外显子27的5-聚体重叠。[BMC Mol. Biol.2007, 8:3. 在2007年1月17日发表] 5'剪接位点ASO (5'-SS ASO)具有与外显子27的5-聚体重叠和与内含子27的15-聚体重叠。通过将3'-SS ASO与5'-SS ASO共价融合来设计40-聚体2'-OMe RNA ASO。因此，40-聚体ASO能够与3'剪接位点以及5'剪接位点同时相互作用。
通过脂质转染评估ASO诱导HepG2细胞中的外显子27跳跃的能力。令人感兴趣的是注意到，3'-SS ASO和5'-SS ASO两者均未能以25至250 nM诱导HepG2细胞中的外显子27跳跃。同时，40-聚体ASO在25至250 nM以剂量依赖性方式显示显著水平的外显子27跳跃。2'-OME RNA与单独的剪接位点的内含子部分的15-聚体互补重叠可能不足以有效抑制早期剪接体复合物的形成。通过有效抑制HepG2细胞中的早期剪接体复合物的形成，期望与跨越APOB前mRNA的外显子27的剪接位点的更紧密结合诱导外显子跳跃。
Bcl-x前mRNA的可变剪接：BCL2L1 (Bcl-x)是通过可变剪接的编码Bcl-xL或Bcl-xS的人基因。设计18-聚体2'-OMe PTO ASO以靶向外显子2的5'剪接位点，并且其具有与外显子2的16-聚体互补重叠和与内含子2的2-聚体重叠。通过以80至400 nM脂质转染，ASO通过一组癌细胞(包括MCF7、PC3、Du145、HeLa和MDA MB231)中的可变剪接促进Bcl-xS的细胞产生。[J. Biol. Chem. vol 277(51), 49374-49382 (2002)]。
β-球蛋白前mRNA中的无细胞体外剪接校正：地中海贫血是由血红蛋白的异常形成引起的遗传性血液病症。在地中海地中海贫血患者中发现的罕见的IVS2705的突变在人β-珠蛋白基因的内含子2中的705个核苷酸位置处携带点突变[T → G]。IVS2705突变产生额外的5'剪接位点并活化内含子的位置579处的隐蔽3'剪接位点。IVS2705突变诱导可变剪接以插入127个核苷酸，即外显子2和外显子3之间的内含子的核苷酸579-705。[J. Biol. Chem.vol 260, 16332-16337 (1985)]。
评估与IVS2705突变体的隐蔽5'剪接位点完全互补的17-聚体2'-OMe RNA ASO在无细胞体外剪接系统中校正异常剪接的能力。该ASO具有与内含子的8-聚体重叠和与隐蔽外显子的9-聚体重叠。该ASO以0.12至2 μM有效地校正异常剪接，以产生没有源自内含子2的隐蔽外显子的mRNA。[Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 90, 8673-8677 (1993)] 体外剪接系统是无细胞的，且因此不需要任何递送剂来诱导外显子跳跃。该ASO以120 nM在无细胞剪接系统中诱导外显子跳跃。如果ASO对5'剪接位点具有更强的亲和力，则外显子跳跃活性将更有效。为了改善外显子跳跃效力，期望使用对5'剪接位点具有强亲和力的ASO。
通过2'-OMe RNA对HeLa pLuc/705细胞中的荧光素酶前mRNA的剪接校正：pLuc/705是经修饰以具有插入核苷酸1368和1369之间的人β-珠蛋白的IVS2705突变体的内含子2的荧光素酶基因。HeLa pLuc/705细胞稳定地表达修饰的pLuc/705荧光素酶基因。修饰的HeLa细胞表达在核苷酸1368和1369之间具有隐蔽外显子的荧光素酶mRNA，且因此编码非功能性荧光素酶变体蛋白。
评估互补地靶向IVS2705突变体的隐蔽5'剪接位点(具有与内含子的8-聚体重叠和与隐蔽外显子的9-聚体重叠)的17-聚体2'-OMe RNA寡核苷酸校正HeLa pLuc/705细胞中的修饰的荧光素酶前mRNA的异常剪接的能力。在以20至500 nM脂质转染后，17-聚体ASO以剂量依赖性方式恢复细胞荧光素酶活性。通过RT-PCR分析，通过ASO处理发现隐蔽外显子被剪接掉。在20 nM或更高浓度下观察到外显子跳跃活性。[Biochemistry vol 37, 6235-6239(1998)]。
通过PNA对HeLa pLuc/705细胞中的荧光素酶前mRNA的剪接校正：评估互补地靶向IVS2705突变体的隐蔽5'剪接位点(具有与内含子的8-聚体重叠和与隐蔽外显子的9-聚体重叠)的17-聚体PNA衍生物校正HeLa pLuc/705细胞中的修饰的荧光素酶前mRNA的异常剪接的能力。设计那些PNA衍生物以具有与PNA序列的N-末端共价缀合的不同数量的膦酸酯基团。[Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)] 引入膦酸酯部分与PNA的共价缀合以便于通过脂质转染转染至细胞中。
在以2.5至60 nM脂质转染后，PNA ASO以剂量依赖性方式恢复细胞荧光素酶活性。通过RT-PCR，通过ASO处理发现隐蔽外显子被剪接掉。具有与之连接的更多膦酸酯基团的PNA ASO在剪接掉隐蔽外显子方面显示更高的功效和效力。具有12个膦酸酯基团的PNA ASO以2.5 nM显示81%的外显子跳跃效力。
观察到的通过PNA ASO的外显子跳跃的亚纳摩尔功效远强于17-聚体2'-OMe RNAASO的功效。[Biochemistry vol 37, 6235-6239 (1998)] 如果适当修饰用于递送至细胞中，则PNA对于有效地诱导外显子跳跃非常有用。
用2'-OMe PTO的FOLH1前mRNA的外显子跳跃：前列腺特异性膜抗原(PSMA)是叶酸水解酶(FOLH1)基因的产物，并且在恶性前列腺组织中高度表达。评估靶向FOLH1前mRNA的2'-OMe PTO ASO在通过脂质转染转染后在LNCap前列腺癌细胞中诱导外显子跳跃的能力。[Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)]。
SSO1是靶向外显子1的5'剪接位点的18-聚体ASO，并且具有与外显子1的16-聚体互补重叠和与内含子1的2-聚体重叠。SSO6和SSO18是分别互补地靶向外显子6和外显子18的18-聚体ASO。
SSO1以约400 nM的IC50诱导可变剪接。SSO6以约4 nM的IC50诱导外显子6的跳跃。SSO18以约4 nM的IC50诱导外显子18的跳跃。
令人感兴趣的是注意到，靶向内含子-外显子区域(即外显子剪接增强子位点)的SSO6和SSO18远比靶向5'剪接位点的SSO1更有效地诱导外显子跳跃。发现用2'-OMe PTOASO靶向ESE区域比在该具体实例中靶向剪接位点更有效。
用2'-O-MOE RNA可变剪接IL-5Rα前mRNA：评估互补地靶向鼠IL-5Rα前mRNA的2'-O-MOE RNA (2'-O-甲氧基乙基RNA) ASO诱导在通过电穿孔转染后的BCL1细胞中的可变剪接(即外显子跳跃)的能力。[Mol. Pharmacol. vol 58, 380-387 (2000)]。
通过互补扫描外显子9的各个区域和侧接外显子9的剪接位点来设计ASO。与内含子8具有4-聚体重叠的与外显子9的3'剪接位点(3' SS)完全互补的20-聚体ASO以10 μM显著诱导可变剪接。靶向外显子9的内含子-外显子区域的ASO以10 μM诱导可变剪接，其效力与3' SS ASO相当。所有测试的ASO诱导可变剪接，表明外显子9及其剪接位点对外显子跳跃高度敏感。3'剪接位点比5'剪接位点更易感。
还设计20-聚体ASO以互补地靶向侧接外显子8的剪接位点，并具有与内含子的4-聚体重叠。ASO以10 μM诱导外显子8的跳跃，尽管3' SS ASO比5' SS ASO更有效。
与通过脂质转染的靶向FOLH1前mRNA的2'-OMe PTO ASO的纳摩尔外显子跳跃功效相比，通过电穿孔的2'-O-MOE RNA ASO的微摩尔外显子跳跃功效被认为非常差。[Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)] 对于将具有带负电荷的骨架的寡核苷酸转染至细胞中，脂质转染比电穿孔更有效。
用2'-O-MOE PTO跳跃Tau前mRNA的外显子10：tau前mRNA中的外显子10的5'剪接位点具有适合于形成茎环的18-聚体序列，并且不适合形成剪接体E复合物。因此，tau前mRNA的外显子10高度易于跳跃。
评估靶向tau外显子10的3'剪接位点或5'剪接位点的2'-O-MOE PTO ASO增强外显子10跳跃的能力。[J. Biol. Chem. vol 276(46), 42986-42993 (2001)] E10α是互补地靶向3'剪接位点的18-聚体ASO。E10α具有与内含子9的10-聚体重叠和与外显子10的8-聚体重叠。E10β是互补地靶向5'剪接位点的21-聚体ASO。E10β具有与外显子10的8-聚体重叠和与内含子10的13-聚体重叠。
通过脂质转染转染至COS-1细胞中后，E10α和E10β以2-5 nM的IC50诱导外显子10的跳跃。在通过电穿孔转染的PC12细胞中，ASO以微摩尔IC50诱导外显子10跳跃。
用2'-O-MOE RNA ASO跳跃MyD88前mRNA的外显子2：MyD88是参与IL-1R和TLR诱导的NF-kB的活化的衔接蛋白。设计20-聚体2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE) RNA ASO以互补地靶向人MyD88前mRNA中的外显子2的3'剪接位点或5'剪接位点。设计20-聚体ASO以具有与内含子1的5'-末端(即外显子2的3'剪接位点)或内含子2的3'-末端(即外显子2的5'剪接位点)的0、5、10、15或20-聚体重叠。在通过脂质转染的转染后，评估ASO诱导A549细胞中的外显子2跳跃的能力。[J. Immunol. vol 176, 3652-3661 (2006)]。
在ASO中，在外显子2的3'剪接位点中与内含子1具有20-聚体重叠的ASO最强力和最有效地诱导外显子2跳跃。观察到的外显子2跳跃的IC50为50至100 nM。靶向5'剪接位点的ASO不如针对3'剪接位点的ASO有效。在靶向5'剪接位点的ASO中，最有效的ASO是与外显子2的3'末端具有20-聚体重叠的ASO。
在同样设计用于互补地靶向小鼠MyD88前mRNA中的外显子2的3'剪接位点或5'剪接位点的2'-O-MOE RNA ASO中，与外显子2的5'-末端具有20-聚体重叠的ASO最有效地诱导通过脂质转染转染的RAW 264.7细胞中的外显子2的跳跃。
将在鼠细胞中最有效的ASO每周以50 mg/Kg施用两次，持续2周。在肠、脂肪组织和肝脏中，MyD88 mRNA显著降低60至85%。50 mg/Kg是大剂量，其可以引起具有磷酸核糖骨架的寡核苷酸治疗剂的典型的副作用。如果2'-O-MOE RNA ASO应显示治疗活性而不引起典型的副作用，则强烈需要显著改善外显子跳跃功效。
通过Nusinersen恢复SMN2中的外显子7：脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种危及生命的罕见疾病，其由SMN1 (运动神经元的存活1)基因的缺失或功能丧失引起。人具有旁系同源的SMN2基因，除了11个核苷酸以外，其具有相同的编码序列。SMN2外显子7中C至T的SNP (单核苷酸多态性)诱导外显子7的跳跃，并且所得的剪接变体mRNA编码快速代谢的SMN2变体蛋白。因此，SMN2突变体不能补偿SMN1蛋白的功能缺失，其导致SMA的爆发。[Neurology vol86, 890-897 (2016)]。
Nusinersen (SpiranzaTM)是互补地靶向SMN2内含子7中的剪接沉默区域的18-聚体2'-O-MOE RNA ASO。由于nusinersen在空间上阻断剪接沉默蛋白的结合，外显子7被保留或恢复以产生全长SMN2蛋白。Nusinersen通过结合位于SMN2内含子7中的剪接沉默区域来恢复常规剪接过程。
Nusinersen于2016年被美国FDA批准用于治疗SMA。Nusinersen以12 mg鞘内施用，每季度或两季度一次。Nusinersen停留在脊髓中的脑脊髓液(CSF)中，半衰期为135至177天。[Nusinersen US Label, FDA, December 2016]。
外显子跳跃寡核苷酸治疗剂的治疗功效：如在本文前面引用的示例性情况中，具有磷酸酯骨架的寡核苷酸在通过脂转染转染的细胞中以纳摩尔功效诱导外显子跳跃，但在作为“裸”寡核苷酸处理的细胞中具有微摩尔功效。
在小鼠中作为“裸”寡核苷酸全身施用后，MyD88前mRNA的微摩尔外显子跳跃功效被转换为10 mg/Kg或更高的治疗剂量。[J. Immunol. vol 176, 3652-3661 (2006)] 在这样高的治疗剂量下，具有磷酸酯骨架的寡核苷酸易受免疫学不良事件的影响。因此，非常希望开发方法或制剂以显著改善治疗剂量。
Drisapersen，经设计以诱导人肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子51的跳跃的20-聚体2'-OMe PTO，诱导每周以2至6 mg/Kg皮下接受作为裸寡核苷酸的ASO的DMD患者中的外显子51的跳跃，尽管外显子跳跃效力不高。[N. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522(2011)] 由于剂量限制性毒性，存在增加drisapersen的治疗剂量的担忧。
PNA和PMO具有中性骨架，不被免疫系统(特别是Toll-样受体)识别，并且没有通常用具有磷酸酯骨架的寡核苷酸观察到的免疫应答。
Eteplirsen (AVI-4658)，经开发以诱导人肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子51跳跃的30-聚体PMO，在通过每周2至20mg/Kg的静脉内输注接受ASO的DMD患者中被良好耐受。[Lancet vol 378(9791), 595-605 (2011)] 最近，eteplirsen得到US FDA加速批准用于DMD患者中。
即使nusinersen是具有外显子恢复能力而不是外显子跳跃的ASO，但每季度12 mg的批准治疗剂量是相当有吸引力的。鞘内注射后有效的神经元摄取被认为是造成nusinersen的功效的主要原因。
具有磷酸酯骨架的寡核苷酸治疗剂的临床开发受到剂量限制性毒性的严重阻碍，所述剂量限制性毒性包括通过toll样受体的活化或补体活化的免疫毒性，肝脏或肾脏中的组织特异性毒性。通过改善体内治疗功效，可以克服此类剂量限制性毒性。
寡核苷酸的制造非常昂贵。如果API制造成本被慷慨地假设为每克1,000 USD，则每周100 mg至2 g的人治疗剂量的当前水平被转换为每周100至2,000 USD (美元)的API成本。实际上，寡核苷酸治疗剂的API制造成本远远超过每克1,000 USD。因此，医疗保健利益相关者将强烈要求显著改进治疗功效，以便以负担得起的长期使用的每年治疗成本提供寡核苷酸治疗剂。
寡核苷酸的良好细胞通透性：细胞膜是一种进化超过十亿年的脂质双层屏障。细胞膜确实作为4至10K Da大小的单链反义寡核苷酸的大屏障发挥功能。通过直接穿透细胞膜来细胞递送此类ASO实际上是不可能的。存在细胞摄取单链寡核苷酸的其他途径。举几例，如用靶向ApoB100的mipomersen所见的肝细胞中的运输蛋白介导的内吞作用，如用nusinersen所观察到的神经元摄取(可能是内吞作用)，GalNac (N-乙酰半乳糖胺)介导的细胞摄取，等等。然而，此类细胞摄取途径高度依赖于组织，并且通常几乎不适用于大多数组织类型。[Nature Biotechnol. vol 35(3), 222-229 (2017)]。
有可能适当地配制具有磷酸酯骨架的寡核苷酸以具有良好的细胞通透性，并且预测这种配制的寡核苷酸比“裸”(即没有制剂)寡核苷酸显示更好的体内治疗功效。考虑到具有磷酸酯骨架的寡核苷酸如果通过脂转染转染则在细胞中最多显示纳摩尔外显子跳跃功效，则经配制以具有良好细胞通透性的寡核苷酸的体内治疗功效将显著改善，如纳摩尔体外外显子跳跃功效所决定。因此，良好的细胞通透性对于诱导外显子跳跃的寡核苷酸的体内治疗功效是至关重要的。尽管如此，开发引发良好递送至组织中的制剂仍然是寡核苷酸治疗剂的领域中的巨大技术挑战。
具有良好的细胞通透性和高亲和力的PNA的修饰的核碱基：如前所引用，设计PNA衍生物以具有共价缀合的不同数量的膦酸酯基团，以便于通过脂质转染递送至细胞中。发现此类PNA ASO在脂质转染后在HeLa细胞中显示亚纳摩尔外显子跳跃功效。[Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)] 亚纳摩尔功效比用具有磷酸酯骨架的ASO观察到的外显子跳跃功效有效得多。因此，如果适当地递送至细胞中，则PNA将可用于有效地诱导外显子跳跃。
通过引入具有与其共价连接的阳离子脂质或其等效物的修饰的核碱基，使PNA对哺乳动物细胞膜高度可通透。此类修饰的核碱基的化学结构在图6C中举例说明。发现胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的此类修饰的核碱基分别可预测地与鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶杂交。[PCT申请号PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253]。
将此类修饰的核碱基掺入PNA上模拟脂质转染的情况。通过脂质转染，寡核苷酸分子用阳离子脂质分子诸如lipofectamine包裹或复合，并且与裸寡核苷酸分子相比，此类lipofectamine/寡核苷酸复合物趋于相当容易地穿透细胞膜。
除了良好的膜通透性以外，发现那些PNA衍生物对互补核酸具有超强亲和力。例如，在与互补DNA形成双链体时，将4至5个修饰的核碱基掺入11-至13-聚体PNA衍生物上容易产生20℃或更高的Tm增加。
发现此类PNA衍生物对单碱基错配高度敏感。单碱基错配导致11至22℃的Tm损失，这取决于修饰的碱基的类型以及PNA序列。
考虑到良好的膜渗透性和对核酸的超高亲和力，具有此类修饰的核碱基的PNA衍生物可用于有效诱导外显子跳跃。
附图简述
图1A. 前mRNA中的内含子和外显子的编号的举例说明。
图1B. 剪接过程的简要示意图。
图2A. 编码变体AR蛋白的AR mRNA剪接变体。
图2B. 编码变体HIF-1α蛋白的HIF-1α mRNA剪接变体。
图3. 参与形成剪接体早期复合物的生物过程的示意图。
图4A. 从人HIF-1α mRNA读出的CDS的一部分。
图4B. 分别举例说明移框(不同框)和同框的缺乏外显子3(左侧)和外显子3-4(右侧)的HIF-1α剪接变体的外显子-外显子连接序列。
图4C. 产生PTC的示例性移框。
图5A. 用于检测外显子跳跃的巢式RT-PCR的示意图。
图5B. 外显子跳跃期间的EIciRNA形成的示意图。
图6A. 代表性非天然寡核苷酸的化学结构。
图6B. 原型PNA的化学结构和缩写命名法。
图6C. 经开发以改善PNA的膜通透性的修饰的核碱基。
图7. 可选择用于式I的肽核酸衍生物的天然或非天然(修饰的)核碱基的实例。
图8A. 可选择用于式I的化合物的取代或未取代的烷基基团的实例。
图8B. 可选择用于式I的化合物的取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基基团的实例。
图8C. 可选择用于式I的化合物的取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基基团的实例。
图8D. 可选择用于式I的化合物的取代或未取代的烷基氧基羰基、取代或未取代的芳基氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基基团的实例。
图8E. 可选择用于式I的化合物的取代或未取代的烷基氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基氧基硫代羰基和取代或未取代的芳基氧基硫代羰基的实例。
图9. 具有天然或修饰的核碱基的PNA单体的化学结构。
图10. N-末端或C-末端取代基的缩写的化学结构。
图11. (N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2的14-聚体PNA衍生物的化学结构。
图12. (N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2的15-聚体PNA衍生物的化学结构。
图13. 用于合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。
图14. 固相肽合成中采用的典型单体延伸循环。
图15A. 纯化前“HIF-ASO 1”的C18-反相HPLC色谱图。
图15B. HPLC纯化后“HIF-ASO 1”的C18-反相HPLC色谱图。
图16. 通过C18-RP制备型HPLC纯化的“HIF-ASO 1”的ESI-TOF质谱图。
图17A. 检测HeLa细胞中由“HIF-ASO 2”诱导的外显子跳跃的HIF-1α巢式PCR中采用的外显子特异性引物的靶位置。
图17B. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中的HIF-1α巢式PCR产物的电泳数据。
图17C. 指定至跳跃HIF-1α外显子2的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图18A. 用0 zM(阴性对照)、10 zM、100 zM、1 aM或10 aM的"HIF-ASO 2"处理24小时的HeLa细胞中的HIF-1α western印迹数据。
图18B. 用0 zM(阴性对照)、10 zM、100 zM、1 aM或10 aM的"HIF-ASO 2"处理24小时的HeLa细胞中的针对β-肌动蛋白归一化的相对HIF-1α蛋白表达水平。(通过标准误差的误差条)
图18C. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中的通过SYBR Green的HIF-1α巢式qPCR。(通过标准误差的误差条)
图18D. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中的通过TaqMan探针的HIF-1α巢式qPCR。(通过标准误差的误差条)。
图19A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 6”处理的HeLa细胞中的HIF-1α巢式PCR产物的电泳数据。
图19B. 用0 zM(阴性对照)、10 zM、100 zM或1 aM的"HIF-ASO 6"处理24小时的HeLa细胞中的HIF-1α western印迹数据。
图19C. 用0 zM(阴性对照)、10 zM、100 zM或1 aM的"HIF-ASO 6"处理24小时的HeLa细胞中的针对β-肌动蛋白归一化的HIF-1α表达水平。(通过标准误差的误差条)。
图20A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的"HIF-ASO 6"处理的HeLa细胞中的通过SYBR Green的巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图20B. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的"HIF-ASO 6"处理的HeLa细胞中的通过TaqMan探针的巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图21A. 在用0(阴性对照)、1、3、10、30或100 aM的"HIF-ASO 1"处理的HeLa细胞中的HIF-1α巢式PCR产物的电泳数据(左侧)；和可指定至外显子2-3的跳跃的PCR产物的Sanger测序数据(右侧)。
图21B. 用0 zM(阴性对照)、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM、10 aM、30 aM、100 aM或300 aM的"HIF-ASO 1"处理72小时的HeLa细胞中的HIF-1α western印迹数据。
图21C. 用0 zM(阴性对照)、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM、10 aM、30 aM、100 aM或300 aM的"HIF-ASO 1"处理72小时的HeLa细胞中的针对β-肌动蛋白归一化的HIF-1α表达水平。
图22A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 12”处理的HeLa细胞中的HIF-1α巢式PCR数据(左侧)连同外显子跳跃条带的Sanger测序数据(右侧)。
图22B. 用0(阴性对照)、0.01、0.1、1或10 aM的"HIF-ASO 12"处理的HeLa细胞中的HIF-1α western印迹数据。
图22C. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 12”处理的HeLa细胞中获得的HIF-1α巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图23A. 用0(阴性对照)、3、30、300或3,000 aM的“AR-ASO 1”处理3小时的MCF7细胞中的AR巢式PCR产物的电泳分析。
图23B. 指定至外显子4-5的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图23C. 用0 zM(阴性对照，即N/C)、10 zM、30 zM、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM、10aM或30 aM的"AR-ASO 1"处理48小时的MCF7细胞中的AR western印迹数据。
图24A. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 zM的“AR-ASO 1”处理5小时的MCF7细胞中的AR外显子4-6水平的通过SYBR Green的qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图24B. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 zM的"AR-ASO 5"处理5小时的MCF7细胞中的AR外显子4-6水平的通过SYBR Green的qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图24C. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 zM的"AR-ASO 5"处理24小时的MCF7细胞中的AR mRNA的通过TaqMan测定的qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图25A. 用注射部位的皮肤获得的原始western印迹数据。NC、1p、10p、100p和1,000p分别是指阴性对照组、1、10、100和1,000 pmol/Kg ASO处理组。
图25B. 用未注射部位的皮肤获得的原始western印迹数据。NC、1p、10p、100p和1,000p分别是指阴性对照组、1、10、100和1,000 pmol/Kg ASO处理组。
图26A. 在注射部位(左侧)和未注射部位(右侧)的按组以及按受试者的AR蛋白表达水平。(**代表p < 0.01，且*代表p < 0.05)
图26B. 在注射部位(左侧)和未注射部位(右侧)的按组的平均AR蛋白表达水平。(**代表p < 0.01，且*代表p < 0.05)。
图27A. 用0(阴性对照)、30、100或1,000 aM的“AR-ASO 1”处理3小时的MCF7细胞中的AR巢式PCR产物的电泳分析。
图27B. 指定至外显子5的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图28A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 7”处理24小时的PC3细胞中的SCN9A巢式PCR产物的电泳分析。
图28B. 分别指定至外显子4(顶部)和外显子4-5(底部)的跳跃的巢式PCR产物的Sanger测序数据。
图29A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 7”处理24小时的PC3细胞中的SCN9A巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图29B. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 3”处理24小时的PC3细胞中的SCN9A巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图29C. 用0(阴性对照)、10或100 zM的“SCN-ASO 8”处理24小时的PC3细胞中的SCN9A巢式qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图30A. 用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 7”处理30小时的PC3细胞中的CoroNa测定结果。
图30B. 用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 3”处理30小时的PC3细胞中的CoroNa测定结果。
图30C. 用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 8”处理30小时的PC3细胞中的CoroNa测定结果。
图31A. 用0(阴性对照)、10或100 zM的“ASO 27”处理24小时的PC3细胞中的SCN9A巢式RT-PCR产物的电泳数据。
图31B. 指定至外显子4-5的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图31C. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 aM的“ASO 27”处理的PC3细胞中的SCN9A巢式RT-PCR产物的电泳数据。
图32A. 用0(阴性对照)、0.1、1或10 aM的"SCN-ASO 27"处理24小时的PC3细胞中的通过一步cDNA合成的SCN9A qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图32B. 用0(阴性对照)、0.1、1或10 aM的"SCN-ASO 27"处理24小时的PC3细胞中的通过用随机六聚体的cDNA合成的SCN9A qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图33A. 用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 27”处理的大鼠L5 DRG细胞(用L5/L6结扎刺激)中的细胞荧光强度的平均迹线。
图33B. 用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 27”处理的大鼠L5 DRG细胞(没有L5/L6结扎)中的细胞荧光强度的平均迹线。
图34A. 用0(即阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 30”处理24小时的DRG神经元细胞(用L5/L6结扎刺激)中的Nav1.7蛋白表达的Western印迹数据。
图34B. 用0(阴性对照)和100 zM的“SCN-ASO 30”处理4小时的DRG神经元细胞(用L5/L6结扎刺激)中的通过手动膜片钳测定的钠电流。(通过标准误差的误差条)。
图35A. 用0(阴性对照)、10、30、100或300 zM的“SCN-ASO 30”处理24小时的大鼠L5 DRG神经元细胞中的通过一步cDNA合成的SCN9A qPCR数据。(通过标准误差的误差条)
图35B. 用0(阴性对照)、10、30、100或300 zM的“SCN-ASO 30”处理24小时的大鼠L5DRG神经元细胞中的通过用随机六聚体的cDNA合成的SCN9A qPCR数据。(通过标准误差的误差条)。
图36. 用媒介物(PBS，阴性对照)、"SCN-ASO 7" 100 pmol/Kg、"SCN-ASO 8" 100pmol/Kg、"SCN-ASO 21" 100 pmol/Kg、"SCN-ASO 35" 100 pmol/Kg、"SCN-ASO 36" 100pmol/Kg或"SCN-ASO 37" 100 pmol/Kg皮下施用的大鼠中的由DPNP诱导的异常性疼痛的逆转。(通过标准误差的误差条)。
图37A. 用以仅媒介物(阴性对照)、1,000 pmol/Kg "DMD-ASO 1"或1,000 pmol/Kg "DMD-ASO 4"皮下施用(BID) 3天的mdx小鼠的肌肉组织获得的巢式PCR(方法A)产物的电泳数据。
图37B. 指定至外显子23的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图38A. 用以仅媒介物(阴性对照)、1,000 pmol/Kg "DMD-ASO 1"或1,000 pmol/Kg "DMD-ASO 4"皮下施用(BID) 3天的mdx小鼠的肌肉组织获得的巢式PCR(方法B)产物的电泳数据。
图38B. 指定至外显子21-23的跳跃的PCR产物条带的Sanger测序数据。
图38C. 用以0(阴性对照)或10 pmol/Kg的"DMD-ASO 1"皮下施用(BID) 5天的mdx小鼠中的三头肌样品获得的巢式PCR(方法A)产物的电泳数据。
图39A. 用媒介物(阴性对照)、100 pmol/Kg "DMD-ASO 1"或1,000 pmol/Kg "DMD-ASO 1"处理的mdx小鼠中的转棒评分。(通过标准误差的误差条且*代表p < 0.05)
图39B. 用0(阴性对照)、10、50或200 pmol/Kg的“DMD-ASO 1”长期施用的mdx小鼠中的握力强度评分。(通过标准误差的误差条且*代表p < 0.05)。
图40. 用0(阴性对照)或200 pmol/Kg的"DMD-ASO 1"施用(每周2次)30周的mdx小鼠的肌肉组织中的与DAPI染色合并的全长肌营养不良蛋白IHC图像。
图41. 用0(阴性对照)、10、50或200 pmol/Kg的“DMD-ASO 1”长期施用的mdx小鼠的骨骼肌中的全长肌营养不良蛋白的相对表达水平。表达水平针对WT小鼠中的表达水平归一化。(通过标准误差的误差条，*代表p < 0,05且** p < 0.01)。
图42. 用在第7周从mdx小鼠取样的骨骼肌获得的巢式PCR产物的电泳数据。
图43. 用0(mdx阴性对照)、10、50或200 pmol/Kg的“DMD-ASO 1”长期施用的C57BL/6小鼠(WT阴性对照)和mdx小鼠的三头肌的通过H&E染色的组织病理学变化。
图44A. 长期暴露于0 (mdx阴性对照)、10 pmol/Kg或30 pmol/Kg的"DMD ASO2"的C57BL/6小鼠(WT阴性对照)和mdx小鼠在脚踏轧机上的步行距离。(通过标准误差的误差条，*代表p < 0.05，**代表p < 0.01且***代表p < 0.001)
图44B. 长期暴露于0 (mdx阴性对照)、10 pmol/Kg或30 pmol/Kg的"DMD ASO2"的C57BL/6小鼠(WT阴性对照)和mdx小鼠中的血清肌酸激酶水平。(通过标准误差的误差条，**代表p < 0.01，且****代表p < 0.0001)
图44C. 长期暴露于0 (mdx阴性对照)、10 pmol/Kg或30 pmol/Kg的"DMD ASO2"的C57BL/6小鼠(WT阴性对照)和mdx小鼠中的血清肌红蛋白水平。(通过标准误差的误差条，***代表p < 0.001，且****代表p < 0.0001)。
图45A. 来自长期暴露于0(mdx阴性对照)、10或30 pmol/Kg的“DMD-ASO 2”的野生型小鼠(WT阴性对照)或mdx小鼠的骨骼肌样品中针对全长肌营养不良蛋白探测的Western印迹数据。
图45B. WT小鼠(WT阴性对照)、没有ASO处理的mdx小鼠和用50 pmol/Kg "DMD-ASO1"、10 pmol/Kg "DMD-ASO 2"或10 pmol/Kg "DMD-ASO 6"皮下施用(每周2次)66周的mdx小鼠中的血清肌酸激酶水平。(通过标准误差的误差条且**代表p < 0.01)
图45C. WT小鼠(WT阴性对照)、没有ASO处理的mdx小鼠和用50 pmol/Kg "DMD-ASO 1"、10 pmol/Kg "DMD-ASO 2"或10 pmol/Kg "DMD-ASO 6"皮下施用(每周2次)66周的mdx小鼠中的血清肌红蛋白水平。(通过标准误差的误差条，*代表p < 0.05，且***代表p < 0.001)。
图46A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的"IDO-ASO 1"处理的SKOV3细胞中的IDO-1巢式PCR产物的电泳数据(左图)和外显子跳跃PCR条带的Sanger测序数据(右图)。
图46B. 用0 zM(阴性对照)或10 zM至1 fM的“IDO-ASO 1”处理的SKOV3细胞中的犬尿氨酸分泌测定结果。(通过标准误差的误差条，且*代表p < 0.05)。
图47A. 用0(阴性对照)、1、3、10、30或100 aM的"IDO-ASO 5"处理的SKOV3细胞中的IDO-1巢式PCR产物的电泳数据。
图47B. 指定至外显子2-4和外显子2-6的跳跃的PCR条带的Sanger测序数据。
图47C. 在用0(阴性对照)、1、3、10、30或100 aM的"IDO-ASO 6"处理的SKOV3细胞中的IDO-1巢式PCR产物的电泳数据(左图)，和指定至外显子2-5的跳跃的PCR条带的Sanger测序数据(右图)。
图48A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM "SNAP-ASO 3"处理的PC12细胞中的SNAP25巢式PCR产物的电泳数据(左图)，和外显子5-7的跳跃的PCR条带的Sanger测序数据。
图48B. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SNAP-ASO 3”处理的PC12细胞中的全长大鼠SNAP25 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条)
图48C. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SNAP-ASO 1”处理的PC12细胞中的全长大鼠SNAP25 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条)。
图49A. 用0 zM(阴性对照)、1 zM、10 zM、30 zM、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM或10aM的"SNAP-ASO 3"处理48小时的PC12细胞中的SNAP25 western印迹数据(顶部图)和针对β-肌动蛋白归一化的相对SNAP25表达水平(底部图)。
图49B. 用0(阴性对照)、0.1或1 aM的“SNAP-ASO 1”处理48小时或72小时的PC12细胞中的SNAP25 western印迹数据。
图50A. 用0 zM(阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM、1 aM、10 aM或100 aM的"SNAP-ASO 3"处理48小时的SiMa细胞中的SNAP25 western印迹数据(顶部图)和针对β-肌动蛋白归一化的相对SNAP25表达水平(底部图)。
图50B. 用0 zM(阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM、1 aM、10 aM或100 aM的“SNAP-ASO 3”处理的SiMa细胞中的全长人SNAP25 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条)。
图51. 用0(阴性对照)、1、10或100 fM的"SNAP-ASO 1"经4天的时段局部施用(BID)的小鼠的皮肤样品的SNAP25 IHC图像。
图52A. 用0(阴性对照)、1、10或1,000 aM的"TYR-ASO 4"处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中的巢式PCR产物的电泳分析。
图52B. 指定至外显子2-3的跳跃的PCR产物的Sanger测序。
图52C. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 aM的"TYR-ASO 4"处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中的通过qPCR的全长TYR mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条)。
图53A. 用0(阴性对照)、0.01、0.1、1或10 aM的"TYR-ASO 4"处理24小时的B16F10细胞中的TYR western印迹数据。
图53B. 用0(阴性对照)、1、10、100或1,000 aM的"TYR-ASO 4"或用10 μg/mL或100μg/mL熊果苷处理的B16F10小鼠黑色素瘤细胞中的黑色素含量的变化。(通过标准误差的误差条，*代表p < 0.05，**代表p < 0.01，且***代表p < 0.001)
图53C. 用0 zM(阴性对照)、1 zM、100 zM或10 aM的"TYR-ASO 1"处理的人原代表皮黑色素细胞中通过qPCR的全长TYR mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条)。
图54A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的"PD-ASO 3"处理的Jurkat细胞中的巢式PCR产物的电泳分析。
图54B. 分别指定至外显子2(左侧)和外显子3(右侧)的跳跃的PCR产物的Sanger测序。
图55A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的"PD-ASO 3"处理的Jurkat细胞中的通过巢式qPCR的人PD-1 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条，**代表p < 0.01，且*代表p < 0.05)
图55B. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的"PD-ASO 3"处理的Jurkat细胞中的通过qPCR的人IL-2 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条，**代表p < 0.01，且*代表p <0.05)。
图56A. 用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的"PD-ASO 1"处理的Jurkat细胞中的通过巢式qPCR的人PD-1 mRNA水平的变化。(通过标准误差的误差条，且*代表p < 0.05)
图56B. 用2、10或50 pmol/Kg的"PD-ASO 2"皮下施用(每周2次)的C57BL/6小鼠中的B16F10黑色素瘤生长的抑制。(通过标准误差的误差条，且*代表p < 0.05)。
发明概述
本发明提供了由式I代表的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10和25之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地代表氘[D]，氢[H]，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
X和Y独立地代表氢，甲酰基[H-C(=O)-]，氨基羰基[NH2-C(=O)-]，氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的芳基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，取代或未取代的芳基氨基羰基，取代或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代或未取代的芳基氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基氧基硫代羰基，取代或未取代的芳基氧基硫代羰基，取代或未取代的烷基磺酰基，取代或未取代的芳基磺酰基，取代或未取代的烷基膦酰基，或取代或未取代的芳基膦酰基基团；
Z代表氢，羟基，取代或未取代的烷基氧基，取代或未取代的芳基氧基，未取代的氨基[-NH2]，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的芳基氨基，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；且
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自非天然核碱基，其具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基基团。
在一些实施方案中，式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成，其中所述靶标剪接位点序列不是人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3') UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3')UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU]。
在一些实施方案中，式I的化合物与靶标前mRNA内的靶标剪接位点具有至少10-聚体互补重叠，其中所述靶标剪接位点序列不包含人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3')UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' →3') UGUACAGAUUGUCU]。
式I的化合物有效地诱导靶标前mRNA的靶标外显子的跳跃，产生缺乏靶标外显子的mRNA剪接变体，且因此可用于调节转录靶标前mRNA的基因的功能活性。
发明描述
本发明提供了由式I代表的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10和25之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地代表氘[D]，氢[H]，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
X和Y独立地代表氢，甲酰基[H-C(=O)-]，氨基羰基[NH2-C(=O)-]，氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的芳基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，取代或未取代的芳基氨基羰基，取代或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代或未取代的芳基氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基氧基硫代羰基，取代或未取代的芳基氧基硫代羰基，取代或未取代的烷基磺酰基，取代或未取代的芳基磺酰基，取代或未取代的烷基膦酰基，或取代或未取代的芳基膦酰基基团；
Z代表氢，羟基，取代或未取代的烷基氧基，取代或未取代的芳基氧基，未取代的氨基[-NH2]，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的芳基氨基，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；且
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自非天然核碱基，其具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基基团。
在一些实施方案中，式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成，其中所述靶标剪接位点序列不是人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3') UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3')UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU]。
在一些实施方案中，式I的化合物与靶标前mRNA内的靶标剪接位点具有至少10-聚体互补重叠，其中所述靶标剪接位点序列不包含人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3')UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' →3') UGUACAGAUUGUCU]。
式I的化合物有效地诱导靶标前mRNA的靶标外显子的跳跃，产生缺乏靶标外显子的mRNA剪接变体，且因此可用于调节转录靶标前mRNA的基因的功能活性。
用于描述的式I的化合物的条件“n是10和25之间的整数”字面上表示“n是选自11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的整数”。
据估计，整个人类基因组中存在26,564个基因。[In Silico Biol. vol 4, 387-393 (2004)]
考虑到每个基因平均存在约8.8个外显子和7.8个内含子，在人类基因组中可能存在368,122个剪接位点[{(8.2 x 2) - 2} x 25,564 = 368,122]。由于对于10-聚体前mRNA存在1,048,576(即410)个可能序列，甚至10-聚体PNA衍生物也显示足够水平的对靶标剪接位点的特异性。然而，每个内含子的5'-末端和3'-末端是高度保守的，具有以[(5' → 3')│GU-]开始的序列和以[(5' → 3') -AG│]结束的序列，其中"│"代表内含子-外显子或外显子-内含子的连接。因此，预测具有11-聚体或更长的寡聚体长度(即，n是大于10的整数)的式I的化合物显示足够水平的对靶标剪接位点的特异性。
式I的化合物紧密结合互补核酸，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所例举。例如，在与互补DNA形成双链体时，将4至5个修饰的(即，天然未存在的非天然的)核碱基掺入式I的11-至13-聚体PNA衍生物上容易产生20℃或更高的Tm增加。本发明的化合物对互补RNA具有强亲和力，就像它对互补DNA一样。因此，优选使本发明的化合物尽可能短，以避免由于所述化合物与具有少量错配的其它前mRNA序列的结合而产生的不期望的脱靶效应。因此，所述化合物的寡聚体长度限于短于25-聚体。
式I的化合物对单碱基错配高度敏感，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所例举。例如，单碱基错配导致11至22℃的Tm损失，这取决于修饰的碱基的类型以及PNA序列。然而，由于对RNA的强亲和力，本发明的化合物仍然紧密结合具有一个或两个错配的靶标剪接位点序列，并且有效地诱导靶标外显子的跳跃。
式I的化合物紧密结合靶标前mRNA内的3'剪接位点或5'剪接位点，这取决于其序列。
在化合物结合3'剪接位点的情况下，所述化合物与靶标3'剪接位点中的14-聚体序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体序列由来自靶标内含子的7-聚体和来自靶标外显子的7-聚体组成。因此，3'剪接位点明确地定义为靶标内含子的3'-末端和靶标外显子的5'-末端之间的连接。
在化合物结合5'剪接位点的情况下，所述化合物与靶标5'剪接位点中的14-聚体序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体序列由来自靶标外显子的7-聚体和来自靶标内含子的7-聚体组成。因此，5'剪接位点明确地定义为靶标外显子的3'-末端和靶标内含子的5'-末端之间的连接。
描述靶向3'剪接位点的式I的化合物的14-聚体序列用跨越从人HIF1A基因[NCBI参考序列：NG_029606.1]读出的人HIF-1α(缺氧诱导因子1α)前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点举例说明。由来自内含子1的20-聚体和来自外显子2的20-聚体组成的3'剪接位点的40-聚体序列读为[(5'→3') uucuuguuguuguuaaguag │GAUAAGUUCUGAACGUCGAA]，其中内含子和外显子序列分别通过小写字母和大写字母表示，并且内含子1和外显子2之间的连接用"│"标记。因此，由来自HIF-1α内含子1的7-聚体和来自HIF-1α外显子2的7-聚体组成的3'剪接位点的14-聚体序列读为[(5'→3') uaaguag│GAUAAGU]。在该3'剪接位点中，靶标内含子和外显子分别是HIF-1α内含子1和外显子2。
提供上述40-聚体前mRNA序列以明确鉴定人HIF-1α前mRNA中的外显子2的3'剪接位点，因为外显子数目通常根据mRNA转录物而变化。在整个本发明中，通过同时指定靶标外显子数目和包含靶标剪接位点的前mRNA序列，在适用的任何地方明确鉴定所述PNA化合物的靶标剪接位点。
描述靶向5'剪接位点的式I的化合物的14-聚体序列用跨越人HIF-1α前mRNA中的外显子2和内含子2的连接的5'剪接位点举例说明。由来自外显子2的20-聚体和来自内含子2的20-聚体组成的5'剪接位点的40-聚体序列读为[(5'→3') GAGGAAACUUCUGGAUGCUG │gugaguuauuuuacaagggu]，其中外显子和内含子序列分别通过大写字母和小写字母表示，并且外显子2和内含子2之间的连接用"│"标记。因此，由来自HIF-1α外显子2的7-聚体和来自HIF-1α内含子2的7-聚体组成的5'剪接位点的14-聚体序列读为[(5'→3') GAUGCUG│gugaguu]。在该5'剪接位点中，靶标外显子和内含子分别是HIF-1α外显子2和内含子2。
式I的化合物紧密结合靶标前mRNA内的靶标剪接位点，并且干扰涉及化合物的靶标剪接位点的“剪接体早期复合物”的形成。所述化合物紧密结合靶标前mRNA内的3'剪接位点或5'剪接位点，这取决于所述化合物的核苷酸序列。由于本发明的化合物在空间上抑制“剪接体早期复合物”的形成，所以剪接出靶标外显子以产生缺乏靶标外显子的mRNA剪接变体。因此，本发明的化合物有效地诱导靶标外显子的跳跃。
用于描述式I的PNA衍生物的天然(即，天然存在的)或非天然(即，天然不存在的)核碱基的化学结构在图7中举例说明。本发明的天然或非天然核碱基包括但不限于图7中提供的核碱基。提供此类天然或非天然核碱基是为了举例说明可允许的核碱基的多样性，且因此不应解释为将本发明的范围限制于图7中提供的核碱基。寡核苷酸领域中的技术人员可以容易地找出与图7中例举的每个非天然核碱基互补的天然核碱基。因此，技术人员可以明确地鉴定式I的化合物与靶标前mRNA序列之间的互补性。
用于描述式I的PNA衍生物的取代基在图8A至图8E中例举。图8A提供了取代或未取代的烷基基团的实例。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基在图8B中举例说明。图8C举例说明取代的烷基氨基、取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基和取代或未取代的芳基膦酰基基团的实例。图8D提供了取代或未取代的烷基氧基羰基、取代或未取代的芳基氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基和取代或未取代的芳基氨基羰基基团的实例。在图8E中，提供了取代或未取代的烷基氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基氧基硫代羰基和取代或未取代的芳基氧基硫代羰基的实例。提供此类示例性取代基是为了举例说明可允许的取代基的多样性，且因此不应解释为将本发明的范围限制于图8A至图8E中例举的取代基。由于本领域技术人员可以容易地发现寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶标前mRNA序列(而不是N-末端或C-末端的取代基)的序列特异性结合的最重要因素，因此存在比图8A至图8E中举例说明的那些取代基更多的可允许用于本发明的所述化合物的不同的取代基。
式I的化合物具有良好的细胞通透性并且可以容易地作为“裸”(即，不用助剂配制以增加递送至细胞中)寡核苷酸递送至细胞中，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所例举。因此，本发明的化合物有效地诱导靶标前mRNA中的靶标外显子的跳跃，以产生在用作为“裸”寡核苷酸的式I的化合物处理的细胞中缺乏靶标外显子的mRNA剪接变体。
式I的化合物不需要用于递送至细胞中以有效地诱导细胞中的靶标外显子的跳跃的任何手段或制剂。在这方面，本发明的化合物与其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)区别开。
考虑到对RNA的强亲和力和良好的细胞通透性，式I的化合物以亚飞摩尔反义功效容易诱导细胞中的靶标外显子的跳跃。迄今为止，从未用其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)报道或实现亚飞摩尔反义外显子跳跃功效。甚至亚纳摩尔反义外显子跳跃功效也很少用其他种类的寡核苷酸记录。用PNA ASO报道亚纳摩尔反义外显子跳跃功效，所述PNA ASO经设计以具有与PNA序列的N-末端共价缀合的不同数量的膦酸酯基团，以便于脂质转染用于转染至细胞中。[Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)] 如本文前面所引用，据报道反义外显子跳跃的体外功效为纳摩尔至微摩尔，甚至在强制递送至细胞中、诸如脂质转染、电穿孔等等的条件下。在这方面，式I的化合物与其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)独特区别开。
为了使寡核苷酸分子结合前mRNA内的其互补序列，需要将该分子伸展或展开以与靶标前mRNA序列互补结合。寡核苷酸分子趋于聚集或保持折叠(例如，像发夹一样)，这是由于它们在核碱基之间形成分子间或分子内氢键的高倾向。因此，用普遍研究的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)，将存在针对反义外显子跳跃的展开的额外能量障碍。寡核苷酸通常在>90℃下在水性缓冲液中孵育以尽可能多地展开寡核苷酸分子后通过UV吸光度进行定量。
由于共价连接至其中的修饰的核碱基的几个碱性氨基，式I的PNA衍生物在生理pH下具有分布在整个寡核苷酸链上的多个正电荷。由于相同寡核苷酸链上相邻正电荷之间的静电排斥，多个正电荷允许式I的化合物保持展开或拉伸。式I的衍生物具有与式I的其他分子聚集的低倾向。因此，式I的化合物趋于保持结构上即用(即，拉伸)以与靶标前mRNA内的靶标序列完全结合。当从DNA转录靶标前mRNA时，结构容易性对于式I的寡核苷酸与靶标前mRNA序列快速对齐也是重要的。因此，与强亲和力组合的结构容易性被认为增加强结合亲和力以产生式I的化合物的亚飞摩尔反义外显子跳跃功效。在这些方面，式I的化合物与其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)高度区别开。
由于良好的细胞通透性，式I的PNA衍生物可以作为“裸”寡核苷酸全身施用，以有效地诱导靶标组织中的外显子跳跃。式I的化合物不需要制剂或助剂来增加向靶标组织的递送以引发期望的治疗活性。将式I的化合物简单地溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水)或盐水中，并且全身施用以毫不费力地在靶标组织中引发治疗活性。
考虑到在作为“裸”寡核苷酸处理的细胞中的外显子跳跃的亚飞摩尔功效，本发明的PNA衍生物经常以 1μg/Kg或更低的全身剂量显示体内治疗活性。用其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)从未实现如此强大的治疗功效。由于寡核苷酸的制造成本通常非常高，所以超强功效对于实现特别是对于具有慢性疾病的患者可负担得起的治疗成本是很大的优势。在这方面，式I的化合物与其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)高度区别开。
由于良好的细胞通透性，本发明的PNA衍生物易于局部或经皮递送以在施用部位引发治疗活性。本发明的化合物不需要大量或侵入性配制以引发预期的局部治疗活性。式I的PNA衍生物容易作为“裸”寡核苷酸经皮递送。由于超强外显子跳跃功效，所述化合物在局部或经皮施用亚皮摩尔寡核苷酸溶液后显示治疗活性。用其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)，作为“裸”寡核苷酸的局部或经皮递送极有挑战性。在这方面，式I的化合物与其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)独特区别开。
式I的化合物可以与药学上可接受的酸或碱组合使用，所述药学上可接受的酸或碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等等。
式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的助剂组合施用于受试者，所述助剂包括但不限于柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等等。
本发明的化合物可以以范围为1 fmol/Kg至高于1 nmol/Kg的治疗有效剂量全身施用于受试者，所述治疗有效剂量可以根据给药时间表、受试者的条件或情况等等而变化。本发明的化合物可以以范围为1 aM至高于1 nM的治疗有效浓度局部施用于受试者，所述治疗有效剂量可以根据给药时间表、受试者的条件或情况等等而变化。
优选的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10和25之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地代表氘，氢，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
X和Y独立地代表氢，甲酰基，氨基羰基，氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的芳基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，取代或未取代的芳基氨基羰基，取代或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代或未取代的芳基氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基氧基硫代羰基，取代或未取代的芳基氧基硫代羰基，取代或未取代的烷基磺酰基，取代或未取代的芳基磺酰基，取代或未取代的烷基膦酰基，或取代或未取代的芳基膦酰基基团；
Z代表氢，羟基，取代或未取代的烷基氧基，取代或未取代的芳基氧基，未取代的氨基，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的芳基氨基，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
L1、L2和L3是由式V代表的共价接头，其将碱性氨基基团共价连接至核碱基部分：
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)和取代或未取代的氨基基团[-N(H)-，或–N(取代基)-]；且
m是1和15之间的整数。
式II、式III和式IV的非天然核碱基分别等同于胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，用于与前mRNA的互补碱基配对，如现有技术[PCT/KR2009/001256]所举例说明。
用于描述式V的条件“m是1和15之间的整数”字面上表示"n是选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的整数"。
令人感兴趣的是式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和23之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，氨基羰基，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基，氧和氨基基团；且
m是1和11之间的整数。
特别令人感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和21之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基，氧和氨基基团；且
m是1和11之间的整数。
高度令人感兴趣的是式I的PNA寡聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和19之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢基团，且R2、R4和R6独立地代表氢，或取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；且
m是1和9之间的整数。
更高度令人感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是12和19之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，或取代或未取代的烷基氧基羰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；且
m是1和9之间的整数。
最高度令人感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是12和18之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X是氢基团；
Y代表取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，或取代或未取代的烷基氧基羰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基团；
L1代表-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、-CH2-O-(CH2)5-、-CH2-O-(CH2)6-或-CH2-O-(CH2)7-，其中右末端直接连接至碱性氨基基团；且
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右末端直接连接至碱性氨基基团。
式I的化合物可以如现有技术[PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253]中所述进行缩写。下面提供了用于描述式I的PNA衍生物的此类缩写的实例，所述式I的PNA衍生物靶向跨越从人HIF1A基因(NCBI参考序列：NG_029606.1)读出的人HIF-1α 前mRNA的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点：
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O3)-TA(5)-NH2；
(N → C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) 苯甲酰基-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) 正丙基-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) 苄基-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) 对甲苯磺酰基-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) [N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2；
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA-Lys-NH2；
(N → C) N-苯基-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2；
(N → C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2；
(N → C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2；
(N → C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH2；
(N → C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH2；
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2；
(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2；和
(N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2：
其中，
A、G、T和C分别是具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的天然核碱基的PNA单体；
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)分别是具有由式VI、式VII、式VIII、式IX和式X代表的非天然核碱基的PNA单体：
其中，
p和q是整数；且
N-和C-末端取代基的缩写具体定义如下：“Fmoc-”是“[(9-芴基)甲基氧基]羰基-”的缩写；"Fethoc-"是“[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基”缩写；"Ac-"是“乙酰基”的缩写；“苯甲酰基-”代表“苯甲酰基-”的缩写；“Piv-”是“新戊酰-”的缩写；“正丙基-”是“1-(正丙基)-”的缩写；"H-"是“氢-”基团的缩写；“对甲苯磺酰基”是“(4-甲基苯)-1-磺酰基-”的缩写；“-Lys-”是氨基酸残基“赖氨酸”的缩写；“-Val-”是氨基酸残基“缬氨酸”的缩写；“-Leu-”是氨基酸残基“亮氨酸”的缩写；“-Arg-”是氨基酸残基“精氨酸”的缩写；“-Gly-”是氨基酸残基“甘氨酸”的缩写；“[N-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”是“[N-1-(2-苯基乙基)氨基]羰基-”的缩写；“苄基-”是“1-(苯基)甲基-”的缩写；“苯基-”是“苯基-”的缩写；“Me-”是“甲基-”的缩写；“-HEX-”是“6-氨基-1-己酰基-”的缩写；“FAM-”是“5,或6-荧光素-羰基-(异构体混合物)”的缩写；且"-NH2"是未取代的“-氨基”基团的缩写。
图9共同提供了缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)和G(pOq)的PNA单体的化学结构。如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所讨论，C(pOq)被认为是等同于“胞嘧啶”的修饰的PNA单体，因为其优选与“鸟嘌呤”杂交。A(p)和A(pOq)被认为是充当“腺嘌呤”的修饰的PNA单体，因为它们对“胸腺嘧啶”具有紧密亲和力。同样地，G(p)和G(pOq)被认为是等同于“鸟嘌呤”的修饰的PNA单体，因为它们的生产碱基与“胞嘧啶”配对。
图10明确地提供了用于使本发明中的式I的PNA衍生物的N-末端或C-末端多样化的取代基的各种缩写的化学结构。提供图10中的N-末端或C-末端基团作为实例是为了举例说明式I的PNA衍生物的N-末端或C-末端的可允许的取代基的多样性，并且因此不应解释为限制本发明的化合物的N-末端或C-末端基团的范围。本领域技术人员可以容易地发现寡核苷酸序列是与靶标前mRNA序列的序列特异性相互作用的重要贡献者。
为了举例说明此类PNA衍生物所采用的缩写，缩写为"(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2"的14-聚体PNA衍生物的化学结构提供于图11中。
作为另一举例说明，缩写为"(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2"的15-聚体PNA衍生物的化学结构提供于图12中。
式I的化合物应当满足“与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成”的要求。如果式I的化合物靶向例如跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点，则3'剪接位点由[(5'→3') guuguuguuaaguag│GAUAAGUUCUGAACG]的30-聚体人HIF-1α前mRNA序列明确地定义。然后靶标HIF-1α 3'剪接位点的14-聚体序列读作[(5'→3') uaaguag│GAUAAGU]。
对于与人HIF-1α前mRNA的互补结合，具有"(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)C-NH2"的序列的15-聚体HIF-1α ASO等同于"(5' → 3') CAG-AAC-TTA-TCC-TAC"的DNA序列。15-聚体ASO与跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点具有15-聚体互补重叠(即，完全互补)，如[(5' → 3') │]的30-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。PNA ASO与[(5'→ 3') uaaguag│GAUAAGU]的14-聚体HIF-1α前mRNA序列具有11-聚体互补重叠(即，来自内含子1的4-聚体和来自外显子2的7-聚体)。因此，15-聚体HIF-1α PNA ASO满足式I的化合物所需的互补重叠的条件。
对于与HIF-1α前mRNA的互补结合，具有"(N → C) Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2"的序列的另一种15-聚体HIF-1α ASO等同于"(5' → 3') CTC-ATC-CTA-CTT-AAC"的DNA序列。15-聚体PNA ASO与跨越内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点具有单个错配，如[(5' → 3') │ UUCUGAACG]的30-聚体HIF-1α前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”，其中单个错配用引号(“”)符号标记。15-聚体PNA与用于描述式I的化合物的14-聚体3'剪接位点序列具有12-聚体互补重叠，如[(5'→ 3') │中标记为“粗体”和“下划线”，其中单个错配用引号(“”)符号标记。尽管存在单个错配，但15-聚体HIF-1α ASO满足式I的化合物所需的互补重叠的条件。
在式I的化合物靶向例如跨越人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点的情况下，5'剪接位点由从人SCN9A基因(从NCBI参考序列：NC_000002.12获得)读出的[(5' → 3') CGUCAUUGUUUUUGC│guaaguacuuucagc]的30-聚体人HIF-1α前mRNA序列明确地定义。然后靶标SCN9A 5'剪接位点的14-聚体序列读作[(5'→3') UUUUUGC│guaagua]。
对于与人SCN9A前mRNA的互补结合，具有"(N → C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH2"的序列的16-聚体SCN9A ASO等同于"(5' → 3')ACT-TAC-GCA-AAA-ACA-A"的DNA序列。16-聚体PNA与跨越人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点具有16-聚体互补(即，完全互补)重叠，如[(5' → 3')的30-聚体SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。16-聚体SCN9A ASO与14-聚体5'剪接位点序列具有13-聚体互补重叠，如[(5'→ 3') 中标记为“粗体”和“下划线”。16-聚体SCN9A ASO满足式I的化合物所需的互补重叠的条件。
发明详述
制备PNA寡聚体的一般程序
根据现有技术[US 6,133,444；WO 96/40685]中描述的方法或稍作修改，通过基于Fmoc-化学法的固相肽合成(SPPS)合成PNA寡聚体。本发明中使用的固体支持物是购自PCASBioMatrix Inc. (Quebec, Canada)的H-Rink Amide-ChemMatrix。具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体如现有技术[PCT/KR 2009/001256]中所述或稍作修改进行合成。
本发明中使用的具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体的化学结构提供于图13中。图13中提供的Fmoc-PNA单体应当作为实例，并且因此不应视为限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易地发现，例如，对于用于合成式I的PNA衍生物的此类Fmoc-PNA单体，保护基团的大量变化是可能的。
PNA寡聚体通过C18-反相HPLC(水/乙腈或水/甲醇，其含有0.1% TFA)纯化，并通过质谱法(包括MALDI-TOF/MS和ESI-TOF/MS)表征。
图14提供了本发明的SPPS中采用的典型单体伸长循环，并且合成细节如下提供。然而，对于本领域技术人员而言，在自动化肽合成仪或手动肽合成仪上运行此类SPPS反应显然可能存在许多微小的变化。以下提供SPPS的所涉及的反应步骤作为示例性反应程序。
[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化] 将1.5 mL 20%哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)中的0.01 mmol (约20 mg树脂) ChemMatrix树脂在libra管中涡旋20分钟，并将反应溶液滤出。将树脂用1.5 mL二氯甲烷(MC)、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC依次每次洗涤30秒。将固体支持物上的所得游离胺进行与Fmoc-PNA单体或与Fmoc保护的氨基酸衍生物的偶联。
[DeFmoc] 将树脂在1.5 mL 20%哌啶/DMF中涡旋7分钟，并滤出DeFmoc溶液。将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC依次每次洗涤30秒。将固体支持物上的所得游离胺立即进行与Fmoc-PNA单体的偶联。
[与Fmoc-PNA单体的偶联] 将固体支持物上的游离胺如下与Fmoc-PNA单体偶联。将0.04 mmol Fmoc-PNA单体、0.05 mmol HBTU [2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐]和10 mmol DIEA (N,N-二异丙基乙胺)在1 mL无水DMF中孵育2分钟，并添加至具有游离胺的树脂。将树脂溶液涡旋1小时，并滤出反应介质。然后将树脂用1.5 mL MC、1.5 mL DMF和1.5 mL MC依次每次洗涤30秒。
[加帽] 偶联反应后，将未反应的游离胺通过在1.5 mL加帽溶液(5%乙酸酐和6%2,6-leutidine/DMF)中振荡来加帽5分钟。然后滤出加帽溶液，并将树脂用1.5 mL MC、1.5mL DMF和1.5 mL MC依次每次洗涤30秒。
[在N-末端中引入“Fethoc-”基团] 通过在通常的碱性偶联条件下使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，将“Fethoc-”基团引入N-末端。"Fethoc-OSu" [CAS No.179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36]的化学结构如下提供。
[从树脂裂解] 通过在1.5 mL裂解溶液(2.5%三异丙基甲硅烷和2.5%水/三氟乙酸)中振荡树脂3小时，将与树脂结合的PNA寡聚体从树脂裂解下来。滤出树脂，并在减压下或通过在溶液上吹氮气来浓缩滤液。将所得残余物与二乙醚一起研磨，并通过过滤收集所得沉淀，用于通过反相HPLC纯化。
[HPLC分析和纯化] 在裂解树脂后，通过C18-反相HPLC纯化PNA粗产物，所述C18-反相HPLC洗脱含有0.1% TFA的水/乙腈或水/甲醇(梯度方法)。图15A和图15B分别是HPLC纯化之前和之后的“HIF-ASO 1”的示例性HPLC色谱图。“HIF-ASO 1”的寡聚体序列提供于表1中。
式I的PNA衍生物的合成实施例
根据上述合成程序，在有或没有微小修改的情况下，制备PNA衍生物。设计本发明的PNA衍生物以靶向前mRNA内的剪接位点，所述前mRNA包括但不限于人或小鼠HIF-1α前mRNA、人或小鼠雄激素受体(AR)前mRNA、人或大鼠SCN9A前mRNA、小鼠肌营养不良蛋白前mRNA、人或小鼠酪氨酸酶前mRNA、人或小鼠SNAP25前mRNA、人IDO1前mRNA、人或小鼠PD-1前mRNA等等。提供靶向许多前mRNA的剪接位点的此类PNA衍生物是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于作为实例引用的那些靶标剪接位点。
表1提供了互补地靶向跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表1中的HIF-1α ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表1中指定的PNA衍生物。
表1. 互补地靶向跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量； b) 观察到的精确质量。
图15A是用“HIF-ASO 1”的粗产物获得的HPLC色谱图。粗产物通过C18-RP制备型HPLC纯化。图15B是“HIF-ASO 1”的纯化产物的HPLC色谱图。在制备型HPLC纯化后，“HIF-ASO1”的纯度显著提高。图16提供了用“HIF-ASO 1”的纯化产物获得的ESI-TOF/MS谱。提供“HIF-ASO 1”的分析数据是为了举例说明如何在本发明中纯化和鉴定式I的PNA衍生物，并且不应解释为限制本发明的范围。
表2提供了互补地靶向跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表2中的HIF-1α ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表2中指定的HIF-1α ASO。
表2. 互补地靶向跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量； b) 观察到的精确质量。
表3提供了互补地靶向跨越从人AR基因(从NCBI参考序列：NC_000023.11获得)读出的人雄激素受体(AR)前mRNA中的外显子5和内含子5的连接的5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表3中的AR ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表3中指定的AR ASO。
表3. 互补地靶向跨越人AR前mRNA中的外显子5和内含子5的连接的5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量； b) 观察到的精确质量。
表4提供了互补地靶向跨越从人SCN9A基因(从NCBI参考序列：NC_000002.12获得)读出的人SCN9A(钠通道亚型9A)前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表4中的SCN9A ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表4中指定的ASO。
表4. 互补地靶向跨越人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量； b) 观察到的精确质量。
表5提供了互补地靶向跨越人SCN9A前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表5中的SCN9A ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表5中提供的SCN9A ASO。
表5. 互补地靶向跨越人SCN9A前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量； b) 观察到的精确质量。
表6提供了互补地靶向人或大鼠SCN9A前mRNA中的特定剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表6中的SCN9A ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表6中指定的SCN9A ASO。
表6. 互补地靶向人或大鼠SCN9A前mRNA中的特定剪接位点(SS)的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) SS表示剪接位点；b) 理论精确质量；和c) 观察到的精确质量。
"SCN-ASO 34"是与跨越人SCN9A前mRNA中的外显子2和内含子2的连接的5'剪接位点完全互补的16-聚体ASO。"SCN-ASO 34"具有与外显子2的11-聚体互补重叠和与内含子2的5-聚体互补重叠，如在[(5' → 3') 的25-聚体人SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
"SCN-ASO 35"是互补地靶向跨越“大鼠”SCN9A前mRNA中的外显子2和内含子2的连接的5'剪接位点的16-聚体ASO。"SCN-ASO 35"具有与外显子2的11-聚体互补重叠和与内含子2的5-聚体互补重叠，如在从大鼠基因组DNA中读出[从NCBI参考序列：NC_005102.3获得]的[(5' → 3') 的25-聚体大鼠SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“SCN-ASO 35”与人SCN9A前mRNA具有单个错配，其如在[(5'→ 3') 的25-聚体前mRNA序列中用引号(“ ”)符号标记。
"SCN-ASO 36"是互补地靶向跨越人SCN9A前mRNA中的外显子7和内含子7的连接的5'剪接位点的15-聚体ASO。"SCN-ASO 36"具有与外显子7的11-聚体互补重叠和与内含子7的4-聚体互补重叠，如在[(5' → 3') 的25-聚体人SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“SCN-ASO 43”的靶标序列在大鼠SCN9A前mRNA中是保守的。
"SCN-ASO 37"是互补地靶向跨越人SCN9A前mRNA中的内含子14和外显子15的连接的3'剪接位点的14-聚体ASO。"SCN-ASO 37"具有与内含子14的3-聚体互补重叠和与外显子15的11-聚体互补重叠，如在[(5' → 3') 的25-聚体人SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。ASO的靶标序列在大鼠SCN9A前mRNA中是保守的，并且在[(5' → 3') 的大鼠25-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
表7提供了互补地靶向从小鼠基因组DNA[从NCBI参考序列：NC_000086.7获得]读出的小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子23的3'或5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表7中的肌营养不良蛋白ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表7中指定的肌营养不良蛋白ASO。
表7. 互补地靶向小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子23的3'或5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) SS表示剪接位点；b) 理论精确质量；和c) 观察到的精确质量。
表8提供了互补地靶向人或大鼠吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)前mRNA中的剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。人和小鼠IDO 1前mRNA序列分别从人基因组DNA[从NCBI参考序列：NC_000008.11获得]和小鼠基因组DNA [从NCBI参考序列：NC_000074获得]读出。提供表8中的IDO1 ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表8中指定的IDO1 ASO。
表8. 互补地靶向人或小鼠IDO1前mRNA中的特定剪接位点(SS)的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) SS表示剪接位点；b) 理论精确质量；和c) 观察到的精确质量。
表9提供了互补地靶向从人SNAP25基因[NCBI参考序列：NG_029626.1]读出的人SNAP25前mRNA中的"外显子7"的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。提供表9中的SNAP25 ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表9中指定的SNAP25 ASO。
表9. 互补地靶向跨越人SNAP25前mRNA中的内含子6和外显子7的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量；和b) 观察到的精确质量。
表10提供了互补地靶向跨越从人TYR基因[NCBI参考序列：NG_0008748]读出的人酪氨酸酶(TYR)前mRNA或从小鼠基因组DNA[从NCBI参考序列：NC_000073获得]读出的小鼠TYR前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点的PNA衍生物。提供表10中的TYRASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表10中指定的TYRASO。
表10. 互补地靶向跨越人或小鼠TYR前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) 理论精确质量；和b) 观察到的精确质量。
表11提供了互补地靶向从人PDCD1基因[NCBI参考序列：NG_012110]读出的人PD-1前mRNA或从小鼠基因组DNA[从NCBI参考序列：NC_000067获得]读出的小鼠PD-1前mRNA中的外显子2的3'或5'剪接位点的PNA衍生物。提供表11中的PD-1 ASO是为了例举式I的PNA衍生物，并且不应解释为将本发明的范围限制于表11中指定的PD-1 ASO。
表11. 互补地靶向人或小鼠PD-1前mRNA中的外显子2的3'剪接位点或5'剪接位点的PNA衍生物连同通过质谱法的结构表征数据。
a) SS表示剪接位点；b) 理论精确质量；和c) 观察到的精确质量。
模型PNA衍生物对于互补RNA或DNA的结合亲和力
制备具有修饰的核碱基的10-聚体PNA衍生物作为模型化合物，以举例说明式I的PNA化合物对于RNA以及DNA的强亲和力。根据本发明中提供的合成程序或在微小修改的情况下制备这些模型PNA化合物。表12中提供了10-聚体PNA衍生物连同通过质谱法的结构鉴定数据。
表12. 举例说明式I的PNA化合物的强RNA或DNA亲和力的作为模型化合物的10-聚体PNA衍生物。
a) 理论精确质量；和b) 观察到的精确质量。
通过如下所述测量Tm值，评估表12中的10-聚体PNA寡聚体对于互补10-聚体RNA或DNA的结合亲和力。
将15 mL聚丙烯falcon管中的4 μM 10-聚体PNA寡聚体和4 μM互补10-聚体DNA或RNA于4 mL水性缓冲液(pH 7.16, 10 mM磷酸钠, 100 mM NaCl)中的混合溶液在90℃下孵育一分钟，并且缓慢冷却至环境温度。然后将溶液转移至4 mL石英UV比色皿中，并且在UV /可见光分光光度计上在260 nm处进行Tm测量，如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所述或作微小修改。用于Tm测量的DNA和RNA购自Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Republicof Korea)，并且不经进一步纯化即使用。
表13提供了在模型PNA寡聚体和互补DNA或RNA之间测量的Tm值(未校正的)。"PNA10-1"，没有修饰的核碱基的参考PNA寡聚体，分别产生针对互补DNA和RNA的51和55℃的Tm值。具有修饰的核碱基的模型PNA寡聚体倾向于随着更多并入修饰的核碱基而显示更高的Tm值。"PNA 10-7"同样显示针对互补DNA和RNA的69℃的Tm，表明模型PNA寡聚体以相当的结合亲和力结合其互补DNA和RNA。
表13. 10-聚体PNA和互补DNA或RNA之间的Tm值。
a) Tm值 - “PNA 10-1”的Tm值。
PNA衍生物对于10-聚体互补DNA的结合亲和力
评估式I的PNA衍生物对于互补地靶向N-末端或C-末端的10-聚体DNA的结合亲和力。通过PNA和10-聚体互补DNA之间的双链体的Tm值评价结合亲和力。PNA衍生物和完全互补的DNA之间的双链体通常显示Tm值太高而不能在水性缓冲溶液中可靠地测定。在Tm测量期间，水性缓冲溶液倾向于沸腾。
对于与10-聚体DNA的互补结合，观察到的式I的PNA衍生物的Tm值(未校正的)非常高，并且提供于表14中。例如，“AR-ASO 1”显示对于具有靶向PNA内的N-末端10-聚体的10-聚体互补DNA的双链体的86.1℃的Tm值，所述PNA内的N-末端10-聚体如[(N → C)中标记为“粗体”和“下划线”。同时，“AR-ASO 1”显示对于具有靶向PNA内的C-末端10-聚体的10-聚体互补DNA的双链体的81.3℃的Tm值，所述PNA内的C-末端10-聚体如[(N → C) Fethoc-C(1O2)TT-中标记为“粗体”和“下划线”。
表14. PNA和靶向PNA的N-末端或C-末端的10-聚体互补DNA之间的Tm值。
HIF-1α ASO的体外活性的实施例
评估互补地靶向人HIF-1α(缺氧诱导因子1α)前mRNA中的外显子2或外显子4的3'剪接位点的式I的PNA衍生物在HeLa细胞中的HIF-1α反义外显子跳跃活性。提供这些HIF-1α ASO的生物学实施例作为实施例以举例说明外显子跳跃由靶向靶标前mRNA中的剪接位点的式I的化合物有效诱导，并且因此不应被解释为将本发明的范围限制于HIF-1α ASO。
HIF-1α实施例1. “HIF-ASO 2”诱导的外显子跳跃。
表1中指定的“HIF-ASO 2”是与人HIF-1α前mRNA中的外显子2的3'剪接位点中的区域完全互补的14-聚体ASO，所述区域如[(5' →3') │(其中符号"│"代表内含子-外显子连接)的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“HIF-ASO 2”具有与内含子1的5-聚体互补重叠和与外显子2的9-聚体互补重叠。
通过HIF-1α巢式PCR评估“HIF-ASO 2”在HeLa细胞中诱导人HIF-1α mRNA的外显子2的跳跃的能力。采用的程序提供如下。
[细胞培养和ASO处理] 使HeLa细胞(目录号CCL-2, ATCC)在含有5 mL EMEM培养基的60 mm培养皿中在5% CO2气氛下在37℃下生长，所述EMEM培养基补充有10% FBS(胎牛血清)、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠。将细胞用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理。将ASO在DDW中系列稀释至适当浓度并等分至培养皿中。
[RNA提取] 5小时后，根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，将200 ng RNA模板针对一组外显子特异性引物[HIF-外显子1_正向：(5' → 3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT；HIF-外显子8_反向：(5' → 3') AACCCAGACATATCCACC]进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 将1 μL cDNA根据以下循环条件针对一组外显子-引物[HIF-外显子1n_正向：(5' → 3') TGAAGACATCGCGGGGAC; HIF-外显子5n_反向：(5' → 3')TTTTTCACAAGG-CCATTTCT]进行20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)：95℃持续5分钟，随后39个循环的在95℃下30秒、在50℃下40秒和在72℃下50秒。
用于一步RT-PCR和巢式PCR扩增的外显子特异性引物组示意性地概述于图17A中。
["外显子2跳跃产物"的鉴定] 将PCR产物连同大小标记混合物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。观察到的PCR条带对应于全长mRNA(即没有外显子跳跃)，并且缺乏外显子2的剪接变体如图17B中所指定。用ASO处理的细胞产生大小可指定为外显子2的跳跃的强PCR条带。没有ASO处理的细胞(即，阴性对照)也产生对应于外显子2的跳跃的PCR产物，表明外显子2在特定程度上自发缺失。然而，在用ASO处理的细胞中的外显子跳跃条带的强度比在没有ASO处理的细胞中强得多。因此，“HIF-ASO 2”促进HeLa细胞中的外显子2的跳跃。外显子跳跃条带的测序数据提供于图17C中，其显现外显子1和外显子3的连接的mRNA序列。
[受单个ASO分子影响的细胞数] “HIF-ASO 2”甚至在10 zM也诱导外显子2跳跃。在60 mm培养皿中的5 mL培养基中存在10 zM (即，10-21M)浓度的约30个ASO分子。鉴于约30个ASO分子诱导60 mm培养皿中的约100,000个HeLa细胞中的跳跃，估计每个ASO分子影响或控制平均约3,000个HeLa细胞中的外显子跳跃。因此，认为每个ASO分子快速穿梭在大量细胞周围以执行其用于外显子跳跃的预定角色。
HIF-1α实施例2. “HIF-ASO 2”对HeLa细胞中的HIF-1α蛋白表达的抑制。
如下所述评估“HIF-ASO 2”抑制HeLa细胞中的HIF-1α蛋白的表达的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的HeLa细胞用0zM(阴性对照)、10 zM、100 zM、1 aM或10 aM的“HIF-ASO 2”处理。
[CoCl2处理和细胞裂解] ASO处理后24小时，除了没有ASO处理的培养皿以外的培养皿用200 μM CoCl2再处理3小时，以通过抑制脯氨酰羟化酶(PHD)的活性来上调HIF-1α蛋白水平。然后将细胞用1 mL冷PBS洗涤2次，并在冰上用补充有1% SDS和1X蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete Mini, Roche)的200 μL 1X RIPA缓冲液(目录号9806, Cell SignalingTech)进行裂解。将每种裂解物收集于1.5 mL e-管中，与100 μL 5X样品缓冲液混合，并在100℃下煮沸5分钟。将裂解物在8% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移至0.45 μm PVDF膜上。将膜用抗HIF-1α抗体(目录号610958, BD Biosciences)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号sc4778, Santa Cruz)探测。
[HIF-1α蛋白表达的抑制] 图18A提供了在用“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中获得的HIF-1α western印迹数据。尽管用没有用CoCl2处理的细胞的裂解物没有检测到HIF-1α条带，但用CoCl2处理的细胞的裂解物产生HIF-1α的强条带。图18B提供了通过密度测定法针对每种个别β-肌动蛋白条带强度归一化的个别HIF-1α条带强度。随着“HIF-ASO 2”浓度增加，HIF-1α表达逐渐降低。在10 aM "HIF-ASO 2"下，观察到的降低为约75%。
HIF-1α实施例3. 用“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
如下通过巢式qPCR评估“HIF-ASO 2”抑制HeLa细胞中的全长HIF-1α mRNA的表达的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的HeLa细胞用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“ASO 2”处理(每个各ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取] ASO处理后3小时，根据制造商的说明，用“MiniBEST通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，将200 ng RNA模板针对一组外显子特异性引物[HIF-外显子1_正向：(5' → 3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT；HIF-外显子8_反向：(5' → 3') AACCCAGACATATCCACC]进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式qPCR] 将1 μL稀释100倍的cDNA针对以下组外显子特异性引物进行20 μL实时PCR反应：[HIF-外显子2n_正向(5' → 3') CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC; HIF-外显子2n_反向(5' → 3') AAGTTTCCT-CACACGCAAATAG; HIF-外显子3n_正向(5' → 3')GAAAGCACAGATGAATTGC; HIF-外显子3n_反向(5' → 3') TCATGTCACCATCATCTGT; HIF-外显子4n_正向(5' → 3') CTAACTGGACACAGTGTGTTTG; HIF-外显子4n_反向(5' → 3')TCTGTGTGTAAGC-ATTTCTCTC; HIF-外显子5n_正向(5' → 3') GCCTTGTGAAAAAGGGTAAAG;HIF-外显子5n_反向(5' → 3') CCATGTTGCAGACTTTATGT]。根据以下循环条件用SYBRGreen (Takara, Japan)探测PCR反应：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。
[HIF-1α mRNA外显子水平的变化] 将ASO处理的样品的个别外显子水平针对没有ASO处理的每种个别外显子水平进行归一化。观察到的相对个别外显子水平提供于图18C中。在用10 zM和100 zM的“HIF-ASO 2”处理的细胞中，所有个别外显子水平分别显著降低60%至80%和50%至70%。然而，用1,000 zM (即，1 aM)的“HIF-ASO 2”处理的细胞获得的个别外显子水平与没有ASO处理的细胞中的外显子水平没有差异。尽管仍然有待阐明为什么外显子水平增加回至阴性对照的水平，因为ASO浓度增加至1,000 zM。然而，图18C中的倒置剂量响应模式与“HIF-1α实施例1”中外显子跳跃的倒置剂量响应模式相当。(参考图17A)。
HIF-1α实施例4. 用“HIF-ASO 2”处理的HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的通过TaqMan探针的qPCR。
除非另有说明，否则如“HIF-1α实施例3”中所述通过巢式qPCR评估“HIF-ASO 2”抑制HeLa细胞中的全长HIF-1α mRNA的表达的能力。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，将200 ng RNA模板针对一组外显子特异性引物[HIF-外显子1_正向(2):(5' → 3') CGCGAACGACAAGAAAAA;HIF-外显子8_反向(2):(5' → 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT]进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为20个循环的在94℃下30秒、在51℃下40秒和在72℃下50秒。
[巢式qPCR] 将1 μL稀释100倍的cDNA根据以下循环条件使用经设计以检测人HIF-1α外显子1和外显子2的连接的TaqMan探针(Hs00936371_m1, Thermo Fisher)进行20μL实时PCR反应：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下10秒和在60℃下30秒。
[HIF-1α mRNA水平的变化] 将ASO处理的样品的全长mRNA水平针对没有ASO处理的mRNA水平进行归一化。观察到的归一化mRNA水平提供于图18D中。在用100 zM和1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理的细胞中，全长HIF-1α mRNA水平分别显著(通过student氏t检验)降低65%和55%。在用10 zM的“ASO 2”处理的细胞中，全长mRNA水平保持不变。
HIF-1α实施例5. “HIF-ASO 6”诱导的外显子跳跃。
表1中指定的“HIF-ASO 6”是与跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点完全互补的17-聚体ASO，所述3'剪接位点如[(5' →3') │的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“HIF-ASO 6”具有与内含子1的7-聚体互补重叠和与外显子2的10-聚体互补重叠。
除非另有说明，否则根据"HIF-1α实施例1"中所述的程序通过HIF-1α巢式PCR评估“HIF-ASO 6”在HeLa细胞中诱导人HIF-1α mRNA的外显子2的跳跃的能力。
将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并且电泳结果提供于图19A中。在所有处理浓度的“HIF-ASO 6”下，外显子2的跳跃是稳健的。“HIF-ASO 6”比“HIF-ASO 2”更有效地诱导外显子2的跳跃。在所有浓度的“HIF-ASO 6”下，全长HIF-1α mRNA的PCR条带几乎完全消失。同时，在用10至1,000 zM的“HIF-ASO 2”处理的细胞中剩余显著水平的全长HIF-1α mRNA。[参考图17A]。
“HIF-ASO 6”与外显子2的3'剪接位点具有比“HIF-ASO 2”更多的互补重叠，这将导致用“HIF-ASO 6”观察到的更高的外显子跳跃效力。ASO与靶标剪接位点的更紧密结合似乎更有效地诱导靶标外显子的跳跃。
HIF-1α实施例6. “HIF-ASO 6”对HeLa细胞中的HIF-1α蛋白表达的抑制。
除非另有说明，否则根据“HIF-1α实施例2”中所述的程序评估“HIF-ASO 6”下调HeLa细胞中的HIF-1α表达的能力。图19B是用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“HIF-ASO6”处理24小时的HeLa细胞获得的western印迹数据。图19C提供了通过密度测定法针对每种个别β-肌动蛋白条带强度归一化的个别HIF-1α条带强度。在用“HIF-ASO 6”处理的细胞中，HIF-1α蛋白的表达降低约45 ~ 55%。
HIF-1α实施例7. 用“HIF-ASO 6”处理的HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
除非另有说明，否则根据“HIF-1α实施例4”中的程序通过巢式qPCR评估“HIF-ASO6”诱导HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的变化的能力。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，将200 ng RNA模板针对一组外显子特异性引物[HIF-外显子1_正向(2):(5' → 3') CGCGAACGACAAGAAAAA;HIF-外显子8(2)_反向:(5' → 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT]进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在51℃下40秒和在72℃下50秒。
[HIF-1α mRNA外显子水平的变化] 针对没有ASO处理的个别外显子水平归一化的个别外显子水平提供于图20(A)中。在用10、100和1,000 zM的“HIF-ASO 6”处理的细胞中，外显子水平分别显著(student氏t检验)降低35%、约30%和约45%。
HIF-1α实施例8. 用"ASO 6"处理的HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的通过TaqMan探针的qPCR。
除非另有说明，否则如“HIF-1α实施例4”中所述通过巢式qPCR评估"HIF ASO 6"抑制HeLa细胞中的全长HIF-1α mRNA的表达的能力。
[全长HIF-1α mRNA水平的变化] 将ASO处理的样品的全长mRNA水平针对没有ASO处理的mRNA水平进行归一化。观察到的相对mRNA水平提供于图20(B)中。在用100 zM和1,000 zM (1 aM)的“HIF-ASO 6”处理的细胞中，全长HIF-1α mRNA水平分别显著(通过student氏t检验)降低约60%和80%。然而，在用10 zM的"HIF-ASO 6"处理的细胞中，全长mRNA水平保持不变。
HIF-1α实施例9. “HIF-ASO 1”诱导的外显子跳跃。
"HIF-ASO 1"是与跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的17-聚体ASO，所述区域如[(5' →3') │的23-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“HIF-ASO 1”具有与内含子1的3-聚体重叠和与外显子2的11-聚体重叠。
除非另有说明，否则如“HIF-1α实施例1”中所述评估“HIF-ASO 1”诱导HIF-1αmRNA中的外显子跳跃的能力。将HeLa细胞用0(阴性对照)、1、3、10、30或100 aM的“HIF-ASO1”处理。24小时后，提取总RNA并进行HIF-1α巢式PCR以检测外显子跳跃。
[外显子跳跃数据] 图21A提供了用巢式PCR产物获得的电泳数据连同可指定至外显子2-3的跳跃的PCR产物的Sanger测序数据。随着ASO浓度从1 aM增加至100 aM，全长mRNA水平倾向于降低。用3 aM 和10 aM的“HIF-ASO 1”的外显子2的跳跃是主要的。然而，随着ASO浓度增加至100 aM时，外显子2-3的跳跃变得过度。通过Sanger测序明确地证实外显子2-3的跳跃产物的PCR产物。[参考图21A右图]。
HIF-1α实施例10. “HIF-ASO 1”对HeLa细胞中的HIF-1α蛋白表达的抑制。
除非另有说明，否则根据“HIF-1α实施例2”中所述的程序评估“HIF-ASO 1”抑制HeLa细胞中的HIF-1α蛋白表达的能力。在该实施例中，将HeLa细胞用0 zM(阴性对照)、100zM、300 zM、1 aM、3 aM、10 aM、30 aM、100 aM或300 aM的“HIF-ASO 1”处理72小时，然后通过与200 μM CoCl2孵育3小时来抑制PHD的活性。存在4个阴性对照(即，0 zM "HIF-ASO 1")的培养皿。
图21B提供了用HeLa细胞裂解物获得的HIF-1α western印迹数据。在阴性对照的裂解物中的HIF-1α蛋白水平相当地高于所有用“HIF-ASO 1”处理的细胞的裂解物。图21C提供了通过密度测定法针对β-肌动蛋白条带强度归一化的个别HIF-1α条带强度。通过与0.1至300 aM的“HIF-ASO 1”孵育72小时，HeLa细胞中的HIF-1α表达降低40至80%。
HIF-1α实施例11. “HIF-ASO 12”诱导的外显子跳跃。
表2中指定的“HIF-ASO 12”是与跨越人HIF-1α前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的15-聚体ASO，所述区域如[(5' → 3')的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“HIF-ASO 12”具有与内含子3的6-聚体重叠和与外显子4的9-聚体重叠。
通过HIF-1α巢式PCR评估“HIF-ASO 12”在HeLa中诱导人HIF-1α mRNA的外显子4的跳跃的能力。除非另有说明，否则根据“HIF-1α实施例1”中描述的方案将HeLa细胞与“HIF-ASO 12”孵育6小时，且然后进行总RNA提取。
图22A提供了在用“HIF-ASO 12”处理的HeLa细胞中的HIF-1α巢式PCR数据。在ASO处理的细胞的所有PCR产物中检测到可指定至外显子2-4的跳跃的外显子跳跃条带，而未处理细胞的PCR产物中未检测到。(参考左图) 外显子跳跃条带的强度在100 zM "HIF-ASO12"下强度最大。全长mRNA条带的强度在100 zM "HIF-ASO 12"下降低最多。外显子2-4的跳跃通过Sanger测序证实，如右图中所提供。
HIF-1α实施例12. “HIF-ASO 12”对HeLa细胞中的HIF-1α蛋白表达的抑制。
除非另有说明，否则如“HIF-1α实施例2”中所述评估“HIF-ASO 12”抑制HeLa细胞中的HIF-1α的表达的能力。
[ASO处理] 将HeLa细胞用0(阴性对照)、10 zM、100 zM或1 aM的“HIF-ASO 12”处理。3个培养皿用于阴性对照。21小时后，除了一个阴性对照的培养皿以外，细胞用200 μMCoCl2处理。3小时后，将所有细胞如下在冰上进行裂解。将细胞用1 mL冷PBS洗涤2次，且然后用200 μL 2X Lammeli样品缓冲液(24 mM Tris-HCl, 20 %甘油, 0.8 % SDS, 0.04 %溴酚蓝, 2 % β-巯基乙醇)进行裂解，以使HIF-1α的降解最小化。将每种裂解物收集在1.5 mLe-管中，并煮沸5分钟。然后将裂解物在8% SDS-PAGE凝胶上进行western印迹。
图22B提供了western印迹数据，其显示在用1和10 aM的“HIF-ASO 12”处理的细胞中的HIF-1α条带强度明显降低。
HIF-1α实施例13. 用“HIF-ASO 12”处理的HeLa细胞中的HIF-1α mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
除非另有说明，否则如"HIF-1α实施例3"中所述通过HIF-1α巢式qPCR评估“HIF-ASO 12”在HeLa细胞中诱导HIF-1α mRNA的变化的能力。将HeLa细胞用“HIF-ASO 12”处理6小时，且然后进行总RNA提取。
图22C提供了qPCR数据，其中在用ASO处理的细胞中的外显子2和3的mRNA水平显著降低(student氏t-检验) 70 ~ 80%。qPCR发现与“HIF-ASO 12”诱导的外显子2-4的跳跃一致(参考“HIF-1α实施例11”)。
AR ASO的体外和体内活性的实施例
评估互补地靶向跨越人雄激素受体(AR)前mRNA中的外显子5和内含子5的连接的5'剪接位点的式I的PNA衍生物在细胞和小鼠中的AR反义外显子跳跃活性。提供这些AR ASO的生物学实施例作为实施例以举例说明外显子跳跃由靶向靶标前mRNA中的剪接位点的式I的化合物有效诱导，并且因此不应被解释为将本发明的范围限制于AR ASO。
AR实施例1. “AR-ASO 1”诱导的外显子跳跃。
表3中指定的“AR-ASO 1”是与跨越人雄激素受体(AR)前mRNA中的外显子5和内含子5的连接的5'剪接位点中的区域完全互补的13-聚体ASO。“AR-ASO 1”互补地结合13-聚体序列，如[(5' → 3') │的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“AR-ASO 1”具有与外显子5的8-聚体重叠和与内含子5的5-聚体重叠。
如下通过AR巢式PCR评估“AR-ASO 1”在MCF7细胞中诱导人AR mRNA的外显子5的跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将MCF7细胞(目录号：HTB-22, ATCC)在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素和0.01 mg/mL牛胰岛素的EMEM培养基中在5% CO2气氛下在37℃下维持。将在60 mm培养皿中生长的细胞用0 (阴性对照)、3、30、300或3,000 aM (即，3 fM)的“AR-ASO1”处理3小时。
[RNA提取] 根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767,Takara)提取总RNA。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)和一组外显子特异性引物[AR-外显子3_正向：(5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 和AR-外显子9_反向：(5' → 3') GGGT-GTGGAAATAGATGGG]，将100 ng RNA模板用于根据以下循环条件的25 μL逆转录反应中：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为39个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 在整个扩增过程中，使用独特的扩增技术(每个循环随着退火温度增加而修饰(touch up))，其在一个温度范围内有效且特异性地起作用，而不是在一个特定退火温度下起作用(即常规PCR方法)。使用一组外显子特异性引物[AR-外显子3_正向：(5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 和AR-外显子7n_反向：(5' → 3') GGGGTGATTTGGAGC-CAT]，根据以下循环条件，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR反应中进一步扩增：初始10个循环[94℃持续30秒，47℃持续40秒(每个循环+0.5℃)，72℃持续40秒]，随后20个循环[94℃持续30秒，50℃持续30秒，和72℃持续40秒]。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。在图23A中，存在可分配至缺乏外显子5的AR mRNA剪接变体的三个处理相关的PCR产物条带。发现"AR-ASO 1"诱导外显子5、外显子4-5和外显子4-6的跳跃，尽管跳跃产物的比率看起来取决于ASO浓度。图23B提供了图23A中的外显子4-5的跳跃条带的实际测序数据。
AR实施例2. "AR-ASO 1"对MCF7细胞中的AR蛋白表达的抑制。
在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中的MCF7细胞用0 zM(阴性对照)或10 zM至30aM的"AR-ASO 1"处理。4个培养皿用于阴性对照。48小时后，细胞用冷PBS洗涤2次，且然后用补充有1X蛋白酶抑制剂(目录号P8340, Sigma)的200 μL 1X细胞裂解缓冲液(目录号9803,Cell Signaling Tech)进行裂解。将裂解物收集于1.5 mL e-管中。将200 μL每种裂解物与100 μL 3X样品缓冲液混合，并煮沸5分钟。将20 μL每种裂解物(4个阴性对照和8个ASO处理样品)在8% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移至PVDF膜上。将膜用抗AR抗体(目录号5153, Cell Signaling Tech)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号sc4778, Santa Cruz)探测。图23C提供了用0 zM (4个阴性对照)至30 aM的“AR-ASO 1”处理的MCF7细胞中获得的ARwestern印迹数据。用ASO处理的裂解物的AR条带(120K大小)强度弱于其相邻裂解物(阴性对照)的强度。
AR实施例3. 用"AR-ASO 1"处理的MCF7细胞中的AR mRNA的通过SYBR Green的qPCR。
[ASO处理和RNA提取] 将5 mL培养基中的MCF7细胞用0 zM(阴性对照)或1 zM至1aM的"AR-ASO 1"处理。(每个浓度2个培养皿) 5小时后，根据制造商的说明(目录号9767，Takara)，使用“MiniBEST通用RNA提取试剂盒”提取总RNA。
[用寡聚dT合成cDNA] 根据制造商的说明(目录号6110A, Takara)，将500 ng RNA模板进行针对“寡聚-dT”的cDNA合成。
[第一次PCR] 然后将cDNA根据以下循环条件针对一组外显子特异性引物[AR-外显子3_正向：(5' → 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; 和AR-外显子9_反向：(5' → 3')GGGTGTGGAAATAGATGGG]进行第一次PCR：94℃持续2分钟，随后15个循环的在94℃下15秒、在55℃下30秒和在72℃下2分钟。
[巢式PCR] 将第1次PCR产物稀释2,000倍，并将1 μL各稀释的PCR产物针对数组外显子特异性引物[AR-外显子4_正向(q)：(5' → 3') GACCATGTTTTGCCCATTG; AR-外显子4_反向(q)：(5' → 3') GGCTCTTTTGAAGAAGACC; AR-外显子5_正向(q)：(5' → 3')GAAACAGAAGTACCTGTGC; AR-外显子5_反向(q)：(5' → 3') GTCATCCCTGCTTC-ATAAC; AR-外显子6_正向(q)：(5' → 3') CGGAAGCTGAAGAAACTTG; AR-外显子6_反向(q)：(5' → 3')CACTTGACCACGTGTACAAG]进行20 μL实时PCR反应。通过SYBR Green (Takara, Japan)探测PCR反应。循环条件：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。随着剂量从1 zM增加至100 zM，外显子水平逐渐、但显著降低。在用100 zM的“AR-ASO 1”处理的细胞中，降低为40 ~ 50%。[参考图24A] 然而，在用1 aM的“AR-ASO 1”处理的细胞中，外显子水平反弹接近阴性对照水平。
AR实施例4. 用"AR-ASO 5"处理的MCF7细胞中的AR mRNA的通过SYBR Green的qPCR。
表3中指定的“AR-ASO 5”是与跨越人AR前mRNA中的外显子5和内含子5的连接的5'剪接位点中的区域完全互补的12-聚体ASO。“AR-ASO 5”互补地结合12-聚体序列，如[(5'→ 3') 的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“AR-ASO 5”具有与外显子5的7-聚体重叠和与内含子5的5-聚体重叠。
根据“AR实施例3”中描述的方法，通过qPCR评估“AR-ASO 5”诱导AR mRNA外显子水平的变化的能力。如图24B中所提供，在用1至1,000 zM的“AR-ASO 5”处理的细胞中，AR外显子水平显著(student氏t-检验)降低约60 ~ 80%。
与“AR-ASO 1”的情况(参见“AR实施例3”)不同，在1,000 zM "AR-ASO 5"下，外显子信使水平没有反弹。
AR实施例5. 用"AR-ASO 5"处理的MCF7细胞中的AR mRNA的通过TaqMan探针的qPCR。
通过采用TaqMan探针的qPCR评估“AR-ASO 5”下调人AR mRNA的能力。
将MCF7细胞用0 zM (阴性对照)至1 aM的"AR-ASO 5"处理。(每个浓度2个皿) 24小时后，根据制造商的说明(目录号9767，Takara)，通过“MiniBEST通用RNA提取试剂盒”提取总RNA。
用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，根据以下循环条件，将400 ng RNA模板针对一组外显子特异性引物[AR-外显子3_正向：(5' → 3') TGGGT-GTCACTATGGAGC; 和AR-外显子9_反向：(5' → 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG]进行cDNA合成：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
将1 μL稀释50倍的每种cDNA溶液根据以下循环条件针对[AR-外显子4_正向(q2)：(5' → 3') TTGTCCATCTTGTCGTCTT; 和AR-外显子5_反向(q2)：(5' → 3')CCTCTCCTTCCTC-CTGTA]的一组外显子特异性引物进行20 μL实时PCR反应：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下15秒和在60℃下30秒。用[(5' → 3') TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ]的TaqMan探针监测qPCR反应。设计TaqMan探针以探测全长AR mRNA中的外显子4和外显子5的连接。
图24C提供了通过TaqMan探针的qPCR数据。在用1 zM至1 aM的“AR-ASO 5”处理的细胞中，全长AR mRNA的相对表达显著(student氏t-检验)降低约50至70%。
AR实施例6. 用“AR-ASO-5”皮下处理的小鼠的皮肤中的AR蛋白表达的抑制。
“AR-ASO 5”靶向人和小鼠中保守的AR前mRNA序列。如下评估“AR-ASO 5”在单次皮下施用后抑制小鼠的皮肤中的AR蛋白表达的能力。
[脱毛和分组] 在第0天，用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉7周龄雄性C57BL/6小鼠，并用剪毛器切下背部的毛发并通过碳蜡去除。在第5天，选择具有无瑕疵(即无斑点)脱毛的小鼠并随机分成0 pmol/Kg(仅媒介物，阴性对照)、1 pmol/Kg、10 pmol/Kg、100pmol/Kg和1,000 pmol/Kg “AR-ASO 5”的5组。(每组6只动物)。
[ASO注射溶液和施用] 将“AR-ASO 5”的水性母液储备溶液在补充有0.1% Tween80的PBS中系列稀释，以制备0 nM(仅媒介物，阴性对照)、0.5 nM、5 nM、50 nM或500 nM的“AR-ASO 5”溶液。在第5天，每个剂量组中的个别小鼠在颈背(即，颈部附近)皮下施用2 mL/Kg的测试物品的单次注射。
[皮肤样品的提取] 在第10天，将动物处死以从注射部位和臀部获得皮肤样品作为非注射部位。在取样之后立即将皮肤样品在液氮中冷冻。将每个皮肤样品微粉化，同时维持样品用液氮冷冻。将微粉化的样品用补充有1% SDS的RIPA缓冲液进行裂解。将裂解物与5X样品缓冲液混合并煮沸5分钟。
[AR western印迹] 将裂解物在PVDF膜上进行AR western印迹。在每个10% PAGE凝胶上上样总共10种裂解物，其中两种个别裂解物来自每组。用多克隆AR抗体(N-20, sc-816, Santa Cruz)探测AR蛋白(120K道尔顿)。
[AR蛋白表达的定量] 将单个PVDF膜上的每个AR条带针对个别β-肌动蛋白条带进行归一化。使用阴性对照组(即，无ASO处理)的两种样品的平均AR条带强度(针对β-肌动蛋白归一化)来将相同PVDF膜上的其他8种样品的AR条带强度。将这种双重归一化应用于另外两个PVDF膜，以通过密度测定法定量个别样品的AR蛋白表达。合并在个别样品的双重归一化后的所有AR表达水平用于通过student氏t-检验针对没有ASO处理的表达水平进行统计学分析。
[AR蛋白表达的抑制] 图25A和25B分别是用来自注射部位和非注射部位的皮肤样品获得的AR western印迹数据。
图26A提供了按组和按受试者的AR蛋白表达的水平。注射部位和非注射部位的AR蛋白表达存在很大程度的受试者间变异性。然而，随着ASO剂量的增加，AR表达倾向于降低。
图26B提供了如针对阴性对照组归一化的按组的平均AR表达水平。在注射部位，在1,000 pmole/Kg "AR-ASO 5"组中，AR蛋白表达显著降低约35%。在非注射部位，在100和1,000 pmole/Kg的处理组中，AR蛋白表达显著降低约40%。
在注射部位远端的皮肤中观察到的AR蛋白表达的抑制表明，ASO可以在皮下注射后通过全身循环容易地分布至施用部位远端的组织。提供离体发现以举例说明皮下注射式I的PNA衍生物之后的全身靶标接合，并且因此不应被解释为限制本发明的范围。
AR实施例7. “AR-ASO 1” (2)诱导的外显子跳跃。
取决于世代、细胞密度和培养条件，MCF7细胞的形态不同。早期世代的MCF细胞倾向于相对快速生长并显示积云形状的集落。后来世代的MCF7细胞可能缓慢生长并形成扁平的表皮细胞集落。然而，维持MCF7细胞以显示积云形状的形态是有挑战性的。
除非另有说明，否则如“AR实施例1”中所述评估“AR-ASO 1”在粗略地显示积云形状的形态的MCF7细胞中的外显子跳跃能力。
[ASO处理] 将MCF7细胞用0 (阴性对照)、30、100或1,000 aM (即，1 fM)的“AR-ASO 1”处理3小时。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取] 根据制造商的说明，使用RNeasy微量制备试剂盒(目录号74104,Qiagen)提取总RNA。将500 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应。
[外显子跳跃结果] 图27A提供了用巢式RT-PCR产物获得的电泳数据。外显子5的跳跃(通过Sanger测序证实：参见图27B)在用ASO处理的细胞中是明显主要的，这与“AR实施例1”的情况(参见图23A)形成对比。
SCN9A ASO的体外和体内活性的实施例
同样评估互补地靶向人SCN9A(钠通道亚型9A)前mRNA中的多个剪接位点的式I的PNA衍生物在细胞和动物中的SCN9A反义和外显子跳跃活性。提供这些SCN9A ASO的生物学实施例作为实施例以举例说明外显子跳跃由靶向靶标前mRNA中的剪接位点的式I的化合物有效诱导，并且因此不应被解释为将本发明的范围限制于SCN9A ASO。
SCN9A实施例1. "SCN-ASO 7"诱导的外显子跳跃。
表4中指定的"SCN-ASO 7"是与跨越从人SCN9A基因(从NCBI参考序列：NC_000002.12获得)读出的人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点中的区域完全互补的16-聚体ASO。"SCN-ASO 7"互补地结合16-聚体序列，如[(5' → 3')│的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"SCN-ASO 7"具有与外显子4的10-聚体重叠和与内含子4的6-聚体重叠。
鉴于已知PC3细胞大量表达人SCN9A前mRNA [Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)]，如下通过SCN9A巢式PCR评估"SCN-ASO 7"诱导PC3细胞中的人SCN9A前mRNA中的外显子4的跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将PC3细胞(目录号CRL-1435, ATCC)在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的Ham氏F-12K培养基中在5% CO2气氛下在37℃下维持。
在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的PC3细胞用0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM的"SCN-ASO 7"处理。
[RNA提取] 孵育18小时后，将PC3细胞用100 μg/mL环己酰亚胺再处理6小时，以冻结核糖体翻译。然后根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)从细胞提取总RNA。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)和一组外显子特异性引物[SCN-外显子2_正向：(5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT, 和SCN-外显子9_反向：(5' → 3')CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT] ，将200 ng RNA模板用于根据以下循环条件的25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为40个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下2分钟。
[巢式PCR扩增] 将1 μL cDNA溶液(稀释100倍)根据以下循环条件针对一组外显子特异性引物[SCN-外显子3n_正向：(5' → 3') GGACCA-AAAATGTCGAGTATTT; 和SCN-外显子8_反向：(5' → 3') GCTAAGAAGGCCCAGC-TGAA]通过巢式PCR(目录号K2612，Bioneer)进行20 μL PCR扩增：95℃持续5分钟，随后35个循环的在95℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
值得注意的是，“SCN-外显子3n_正向”的引物靶向外显子3和外显子5的连接以有效地探测外显子4的缺失，尽管22-聚体引物仍然与外显子3和外显子4的连接具有18-聚体互补重叠。因此，与在全长SCN9A mRNA中发现的“外显子3和外显子4的连接”相比，“SCN-外显子3n_正向”更选择性地识别“外显子3和外显子5的连接”。设计引物序列以比全长SCN9AmRNA更灵敏地检测缺乏外显子4的SCN9A剪接变体。这种外显子跳跃引物可用于检测具有差的代谢稳定性的mRNA剪接变体，因为全长mRNA倾向于显示通过经数十亿年的进化获得的良好代谢稳定性。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将巢式PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。在用1 aM "SCN ASO 7"处理的PC3细胞中的外显子4的跳跃明显强烈，尽管外显子4的跳跃在10和100 zM也是可见的，如图28A中所示。外显子跳跃条带通过Sanger测序明确地证实，如图28B中所提供。
SCN9A实施例2. 用“SCN-ASO 7”处理的PC3细胞中的SCN9A mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
如下通过针对一组外显子特异性引物的qPCR评估“SCN-ASO 7”抑制PC3细胞中的人SCN9A mRNA的表达的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中的PC3细胞与0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM的"SCN-ASO 7"孵育24小时。(每个浓度2个培养皿)。
[RNA提取] 根据制造商的说明，使用“MiniBEST通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)且针对一组外显子特异性引物[SCN-外显子2_正向：(5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 和SCN-外显子9_反向：(5' → 3')TTGCCTGGTTCTGTTCTT]，对200 ng RNA模板进行20 μL逆转录反应。循环条件：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下15秒、在55℃下30秒和在72℃下2分钟。
[巢式qPCR扩增] 将1 μL稀释50倍的每种cDNA溶液针对数组外显子特异性引物组[SCN-外显子4_正向：(5' → 3') GTACACTTTTACTGGAATATATAC; SCN-外显子4_反向：(5'→ 3') AATGACGACAAAATCCAGC; SCN-外显子5_正向：(5' → 3') GTATTTAACAGAAT-TTGTAAACCT; SCN-外显子5_反向：(5' → 3') CTGGGATTA-CAGAAATAGTTTTCA; SCN-外显子6_正向：(5' → 3') GAAGACAATTGTAGGGGC; SCN-外显子6_反向：(5' → 3')GTCTTCTTCACTCTCTAGGG]进行20 μL实时PCR反应。用SYBR Green (Takara, Japan)探测PCR反应。循环条件：95℃持续30秒，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。
[qPCR结果] 将ASO处理的细胞的个别外显子水平针对阴性对照细胞(即，没有ASO处理)的外显子水平归一化。图29(A)概述了qPCR结果。外显子4-6的表达水平在10、100和1,000zM分别显著降低约70%、40%和20 ~ 30%。
SCN9A实施例3. 用“SCN-ASO 3”处理的PC3细胞中的SCN9A mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
表4中指定的"SCN-ASO 3"是靶向跨越人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点的14-聚体ASO。"SCN-ASO 3"互补地结合12-聚体序列，其在[(5' → 3') (其中两个错配用引号(" ")符号标记)的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"SCN-ASO 3"具有与外显子4的7-聚体互补重叠和与内含子4的5-聚体互补重叠。
除非另有说明，否则根据“SCN9A实施例2”中所述的方案评估"SCN-ASO 3"抑制PC3细胞中的全长SCN9A mRNA的表达的能力。
如图29B中所概述提供qPCR结果。外显子4-6的表达水平在10、100和1,000 zM分别显著降低> 90%、约70%和约80%。与“SCN-ASO 7”的情况一样，10 zM显现全长SCN9A mRNA的最强抑制。
SCN9A实施例4. 用"SCN-ASO 8"处理的PC3细胞中的SCN9A mRNA的通过SYBRGreen的qPCR。
表4中指定的"SCN-ASO 8"是靶向跨越人SCN9A前mRNA中的外显子4和内含子4的连接的5'剪接位点中的区域的17-聚体ASO。"SCN-ASO 8"互补地结合15-聚体序列，其在[(5'→ 3') (其中错配用引号符号(" ")标记)的20-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"SCN-ASO 8"具有与人SCN9A前mRNA中的外显子4的10-聚体互补重叠和与人SCN9A前mRNA中的内含子4的5-聚体互补重叠。
除非另有说明，否则根据“SCN9A实施例2”中所述的方案评估"SCN-ASO 8"抑制PC3细胞中的全长SCN9A mRNA的表达的能力。
如图29C中所概述提供qPCR结果。外显子4-6的表达水平在10和100zM分别显著降低50 ~ 70%和70 ~ 80%。
SCN9A实施例5. 用"SCN-ASO 7"处理的PC3细胞中通过CoroNa测定的钠电流的抑制。
通过膜片钳测量细胞钠电流。随着钠离子进入细胞，细胞内钠离子水平增加。可以使用钠离子敏感染料探测细胞内钠水平。“CoroNa Green”是具有冠醚型的钠离子螯合剂的染料。与钠离子螯合后，“CoroNa Green”发射绿色荧光。“CoroNa Green”已用于间接测量细胞内钠水平。发现通过“CoroNa Green”测量的钠水平与通过钠离子膜片钳测量的钠离子电流很好地相关。[Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145-16150 (2009)]。
已知PC3细胞大量表达人SCN9A mRNA，尽管存在其他同时表达的SCN亚型。[Br. J. Pharmacol. vol 156, 420-431 (2009)] 因此，如果通过Nav1.7钠通道亚型的钠离子电流占据PC3细胞中的总钠离子电流的显著部分，则SCN9A mRNA表达的抑制可导致PC3细胞中的钠电流的显著降低。值得注意的是，SCN9A mRNA编码Nav1.7钠通道亚型。
如下使用“CoroNa Green”评估“SCN-ASO 7”抑制PC3细胞中的钠离子电流的能力。
[ASO处理] 在含有2 mL F-12K培养基的35 mm培养皿中生长的PC3细胞用0 zM(阴性对照)、100 zM或1 aM的"SCN-ASO 7"处理。
[CoroNa测定] 30小时后，将细胞用2 mL HBSS (Hank氏平衡盐溶液，目录号14025-092，Life Technologies)洗涤，且然后装入2 mL新鲜HBSS。然后将细胞在37℃下用5μM "CoroNa Green" (目录号C36676, Life Technologies)处理。30分钟后，将细胞用2 mLHBSS洗涤2次，且装入2 mL新鲜HBSS。将培养皿安装在配备有数字摄像机的Olympus荧光显微镜上，以连续捕获细胞的绿色荧光图像。将细胞用100 mM NaCl快速处理，且然后经3分钟的时段数字记录荧光细胞图像的变化。平均每帧存在约4个细胞。以一秒的分辨率追踪来自每个个别细胞的荧光强度。在每个时间点将来自个别细胞的细胞内荧光强度的迹线重叠并取平均值。使用ImageJ程序(版本1.50i, NIH)绘制来自每个ASO浓度的个别细胞的迹线的平均值，如图30A中所提供。对于用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 7”处理的细胞，将平均荧光强度迹线作为个别细胞内钠浓度迹线。
[CoroNa测定结果] 观察到的细胞内荧光强度的迹线概述于图29B中。用1,000 zM"SCN-ASO 7"处理的细胞的荧光强度迹线低于没有ASO处理的细胞的迹线运行。没有ASO处理的细胞的平均荧光强度在100秒时为81.86(任意单位)。同时，用1,000 zM "SCN-ASO 7"处理的细胞的平均荧光强度在100秒时为51.47(任意单位)。因此，与1,000 zM "SCN-ASO7"孵育30小时诱导PC3细胞中的钠通道活性显著降低37%(通过student氏t-检验，p <0.05)。考虑到PC3细胞表达各种亚型的电压门控钠通道(VGSC)，37%降低被认为是“SCN-ASO7”抑制Nav1.7表达的标志。用100 zM "SCN-ASO 7"处理的细胞中钠电流没有显著降低。
SCN9A实施例6. 用"SCN-ASO 3"处理的PC3细胞中通过CoroNa测定的钠电流的抑制。
除非另有说明，否则根据“SCN9A实施例5”中所述的方案使用"CoroNa Green"评估"SCN-ASO 3"抑制PC3细胞中的钠通道的能力。
观察到的细胞荧光强度的迹线提供于图30B中。用“SCN-ASO 3”处理的细胞中的荧光强度的平均迹线低于没有ASO处理的细胞中运行。没有ASO处理的细胞的平均细胞荧光强度在100秒时为89.32(任意单位)。同时，用1,000 zM "SCN-ASO 3"处理的细胞的平均细胞荧光强度在100秒时为61.36(任意单位)。因此，1,000 zM "SCN-ASO 3"使PC3细胞中的钠电流显著(p <0.01)降低31%。100 zM "SCN-ASO 3"诱导的降低为18%，尽管没有显著性。
SCN9A实施例7. 用"SCN-ASO 8"处理的PC3细胞中的钠电流的抑制。
除非另有说明，否则根据“SCN9A实施例3”中所述的方案，使用"CoroNa Green"评估"SCN-ASO 8"抑制PC3细胞中的钠通道的能力。
观察到的细胞荧光强度的迹线提供于图30C中。用“SCN-ASO 8”处理的细胞中的荧光强度的平均迹线低于没有ASO处理的细胞中运行。没有ASO处理的细胞的平均细胞荧光强度在100秒时为130.32(任意单位)。同时，用1,000 zM "SCN-ASO 8"处理的细胞的平均细胞荧光强度在100秒时为89.7(任意单位)。因此，1,000 zM "SCN-ASO 8"使PC3细胞中的钠电流显著(p <0.001)降低31%。100 zM "SCN-ASO 8"诱导的降低为30% (p < 0.001)。
SCN9A实施例8. PC3细胞中的"SCN-ASO 27"诱导的外显子跳跃(A)。
表5中指定的"SCN-ASO 27"是与跨越人SCN9A前mRNA中的"内含子3"和"外显子4"的连接的3'剪接位点完全互补的14-聚体ASO。3'剪接位点内的14-聚体靶标序列在[(5' →3') 的20-聚体SCN9A前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"SCN-ASO 27"具有与"内含子3"的6-聚体重叠和与"外显子4"的8-聚体重叠。
除非另有说明，否则如“SCN9A实施例1”中所述评估"SCN-ASO 27"诱导PC3细胞中的"外显子4"的跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的PC3细胞用0(阴性对照)、1、10或100 zM的"SCN-ASO 27"处理。
[巢式PCR扩增]针对[SCN-外显子2n_正向：(5' → 3') CCACCGGACTGGACCAAAAA;和SCN-外显子9n_反向：(5' → 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]的一组外显子特异性引物，根据以下循环条件，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)中进一步扩增：95℃持续2分钟，随后34个循环的在95℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[外显子跳跃产物的鉴定] 图31A提供了巢式PCR产物的电泳数据，其中用"SCN-ASO 27"处理的细胞产生可指定至外显子4-5的跳跃的强PCR条带。然而，全长SCN9A mRNA的PCR条带强度在10 zM和100 zM ASO的处理样品中比在阴性对照的样品中更强。巢式PCR中的奇怪剂量响应模式可能是由于由“SCN-ASO 27”在外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”诱导的转录上调。[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264(2015)] 外显子跳跃PCR产物通过Sanger测序证实为对应于外显子4-5的跳跃。(参考图31B)。
SCN9A实施例9. PC3细胞中的"SCN-ASO 27"诱导的外显子跳跃(B)。
除非另有说明，否则如“SCN9A实施例8”中所述评估"SCN-ASO 27"诱导PC3细胞中的"外显子4"的跳跃的能力。在该实验中，将PC3细胞用0(阴性对照)、1、10、100和1,000 aM的"SCN-ASO 27"处理24小时。
[巢式PCR扩增] 针对[SCN-外显子3/6_正向：(5' → 3')GGACCAAAAATGTCGAGCCT; 和SCN-外显子9n_反向：(5' → 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]的一组引物实施巢式PCR反应，所述引物经设计以选择性扩增具有外显子3和外显子6的连接序列的产物。
值得注意的是，“SCN-外显子3/6_正向”的引物序列靶向外显子3和外显子6的连接以探测外显子4-5的跳跃，尽管20-聚体引物仍然保留与外显子3和外显子4的连接的17-聚体互补重叠。因此，与在全长SCN9A mRNA中发现的“外显子3和外显子4的连接”相比，“SCN-外显子3/6_正向”的引物序列更选择性地识别“外显子3和外显子6的连接”。设计引物序列以比全长SCN9A mRNA更灵敏地检测缺乏外显子4-5的SCN9A剪接变体。这种外显子跳跃引物可用于检测具有差的代谢稳定性的mRNA剪接变体，因为全长mRNA倾向于显示通过经数十亿年的进化获得的良好代谢稳定性。
图31C提供了巢式PCR产物的电泳数据，其中用"SCN-ASO 27"处理的细胞产生可指定至外显子4-5的跳跃的强PCR条带，其通过Sanger测序证实。
SCN9A实施例10. 用"SCN-ASO 27"处理的PC3细胞中的SCN9A mRNA的通过一步cDNA合成的qPCR。
除非另有说明，否则如“SCN9A实施例2”中所述通过SCN9A巢式qPCR评估"SCN-ASO27"诱导PC3细胞中的人SCN9A mRNA水平的变化的能力。
[ASO处理] 将PC3细胞用0(阴性对照)、0.1、1或10 aM的"SCN-ASO 27"处理24小时。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[通过一步PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对[SCN-外显子2_正向：(5' → 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; 和SCN-外显子8/9_反向：(5' → 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]的一组外显子特异性引物，对200 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下2分钟。
[巢式qPCR扩增] 将1 μL稀释100倍的每种cDNA溶液根据以下循环条件针对[SCN-外显子3_正向：(5' → 3') TGACCATGAATAACCCAC; 和SCN-外显子4_反向(2)：(5' → 3')GCAAGGATTTTTACAAGT]的一组外显子特异性引物进行20 μL实时PCR反应：95℃持续30秒，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。用靶向全长SCN9A mRNA中的外显子3和外显子4的连接的[(5' → 3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]的TaqMan探针监测qPCR反应。
在用“SCN-ASO 27”处理的细胞中的全长SCN9A mRNA水平显著降低(通过student氏t-检验)约35至45%，如图32A中所提供。
SCN9A实施例11. 用"SCN-ASO 27"处理的PC3细胞中的SCN9A mRNA的通过用随机六聚体的cDNA合成的qPCR。
除非另有说明，否则如“SCN9A实施例10”中所述通过SCN9A qPCR评估"SCN-ASO27"诱导PC3细胞中的人SCN9A mRNA水平的变化的能力。使用随机六聚体合成cDNA，并使用TaqMan探针进行SCN9A qPCR反应。
在用“SCN-ASO 27”处理的细胞中的全长SCN9A mRNA水平显著降低(student氏t-检验)约50至60%，如图32B中所提供。
SCN9A实施例12. "SCN-ASO 27"对SNL活化的大鼠L5 DRG细胞中通过CoroNa测定的钠电流的抑制。
“SCN-ASO 27”是与人SCN9A前mRNA完全互补的14-聚体SCN9A ASO，但与从大鼠基因组DNA [NCBI参考序列：NC_000002.12]读出的大鼠SCN9A前mRNA具有单个错配。“SCN-ASO27”与大鼠SCN9A前mRNA具有13-聚体互补重叠和单个错配，其在[(5' → 3') (其中单个错配用引号(" ")符号标记)的20-聚体大鼠前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
如下使用"CoroNa Green”评估"SCN-ASO 27”抑制大鼠DRG(背根神经节)细胞中的钠离子电流的能力。
[脊神经结扎] 脊神经结扎(SNL)在背根神经节(DRG)和脊髓中诱发神经病变，并且已被广泛用作神经性疼痛的模型。[Pain vol 50(3), 355-363 (1992)] 然而，根据如何结扎脊神经，可能存在SNL的几种变型。DRG中神经病变的程度和持续时间似乎根据如何结扎脊神经而不同。[Pain vol 43(2), 205-218 (1990)] L5和L6脊神经的双重结扎(即“L5/L6结扎”)诱发比单独的L5脊神经的结扎(即，“L5结扎”)更严重和持续更长时间的神经病变。
[通过L5/L6结扎的SNL手术] 在第0天，用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉6周龄雄性SD大鼠。然后暴露L5和L6脊神经(左侧)并紧紧结扎。通过适当的无菌操作将肌肉和皮肤闭合并夹住。将大鼠经4周的时段通过von Frey评分零星致敏。
[DRG神经元细胞的制备] 在第31天，将显示低von Frey评分的大鼠处死以提取左侧(结扎侧)和右侧(未结扎侧)DRG。在提取之后立即将DRG浸入0.5 mL PBS中。如下根据文献中公开的方法制备DRG细胞。[Methods Mol Biol. vol 846, 179-187 (2012); PLOS One vol 8(4); e60558 (2013)]。
① 将DRG浸入含有0.2 mL HBSS (Hank氏平衡盐溶液，目录号14025-092，LifeTechnologies)中的0.125%胶原酶(IV型胶原酶，目录号C5138-100MG，Sigma)的1.5 mL e-管中，用剪刀切成小块，并在CO2培养箱中在37℃下在5% CO2和95% RH下孵育20 min；② 将50 μL 0.25%胰蛋白酶/EDTA添加至e-管中，其在培养箱中再保持10 min；③ 向e-管中装入1 mL完全DMEM培养基，并进行以600 g离心沉降5 min；④ 将所得沉淀悬浮于4 mL补充有2XB-27 (B-27®无血清补充剂，目录号17504-044，Gibco)、1X青霉素-链霉素、1X L-谷氨酰胺的Neurobasal-A培养基(Neurobasal®培养基，目录号21103-049，Gibco)中，并将1 mL细胞悬浮液小心地接种至置于35 mm培养皿中的层粘连蛋白包被的盖玻片(目录号GG-25-1.5-层粘连蛋白，Neuvitro)上；⑤ 接种后一天，向皿中小心地装入另外1 mL新鲜的Neurobasal-A培养基；⑥ 接种后两天，用2 mL补充有1 µM Ara-C (目录号C1768-100MG，Sigma)的新鲜Neurobasal-A培养基替换培养基，以选择性抑制除了DRG神经元细胞以外的细胞的生长；⑦ 接种后4天，再次用2 mL补充有1 µM Ara-C的新鲜Neurobasal-A培养基替换培养基；和⑧ 接种后5或6天，DRG神经细胞用“SCN-ASO 27”处理。
[ASO处理和CoroNa测定] 用L5/L6结扎或不用L5/L6结扎的L5 DRG神经元细胞用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 27”处理。30小时后，将细胞用2 mL HBSS洗涤，且然后装入2 mL新鲜HBSS。然后将细胞用5 μM “CoroNa Green”在37℃下处理。30分钟后，将细胞用2 mL HBSS洗涤2次，且装入2 mL新鲜HBSS。将培养皿安装在配备有CCD相机的荧光显微镜上，以连续捕获细胞的绿色荧光图像。将细胞用10 mM NaCl快速处理，且然后经300sec的时段数字记录细胞荧光图像的变化。每帧存在4至5个细胞用于图像捕获。以一秒的分辨率追踪来自每个个别细胞的荧光强度。将来自个别细胞的细胞内荧光强度的迹线使用ImageJ程序(版本1.50i, NIH)取平均值，并且对于用“L5/L6结扎”和不用“L5/L6”的细胞，平均迹线分别提供于图33A和33B中。对于用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SCN-ASO 27”处理的细胞，将平均荧光强度迹线作为个别细胞内钠浓度迹线。
[CoroNa测定结果] 在用L5/L6结扎刺激的细胞中(参考图33A)，用100 zM或1 aM的“SCN-ASO 27”处理30小时产生在150秒的时间点平均细胞荧光强度显著降低(通过student氏t-检验)80-85%。
在没有L5/L6结扎的细胞中(参考图33B)，用1 aM的“SCN-ASO 27”处理30小时产生荧光强度降低约50%。在用100 zM的“SCN-ASO 27”处理的未刺激细胞的情况下，荧光强度没有降低。没有L5/L6结扎的细胞的荧光强度显著小于用L5/L6结扎刺激的细胞的荧光强度，这表明L5/L6诱导Nav1.7钠通道活性的显著上调。
已知没有神经性刺激的DRG神经元细胞表达VGSC的各种亚型，包括Nav1.7、Nav1.8、Nav1.2等等。Nav1.7亚型显示对没有刺激的DRG神经元细胞中的全钠电流的贡献有限。[Nature Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)] 没有L5/L6结扎的DRG神经元细胞可显示来自Nav1.7亚型的钠电流的贡献有限。
同时，已知神经元细胞响应于持续的神经病变而上调Nav1.7表达。[J Biol Chem.vol 279(28), 29341-29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652-6658 (2008)]100 zM和1 aM的“SCN-ASO 27”在由“L5/L6结扎”刺激的神经元细胞中使钠电流抑制80-85%。具有“L5/L6结扎”的DRG细胞中“SCN-ASO 27”对钠电流的更高抑制与由于慢性神经病变导致的神经元细胞中的Nav1.7的上调一致。
SCN9A实施例13. “SCN-ASO 30”对L5 DRG神经元细胞中的Nav1.7蛋白表达的抑制。
“SCN-ASO 30”是与大鼠SCN9A前mRNA完全互补的14-聚体ASO，而“SCN-ASO 27”是与人SCN9A前mRNA完全互补的14-聚体ASO。“SCN-ASO 30”在C-末端具有与“SCN-ASO 27”的单个错配。针对大鼠SCN9A前mRNA的“SCN-ASO 30”可以充当针对人SCN9A前mRNA的“SCN-ASO27”的良好模型ASO。
如下所述评估“SCN-ASO 30”抑制大鼠DRG神经元细胞中的Nav1.7蛋白表达的能力。
[DRG神经元细胞的制备] 对雄性SD大鼠(7周龄)进行紧密的“L5/L6结扎”。7天后，将4只大鼠用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉，以采样结扎侧的L5 DRG。合并DRG并处理以制备DRG神经元细胞，如“SCN9A实施例12”中所述。
[ASO处理] 将DRG神经元细胞用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 30”处理24小时，且然后进行裂解以针对Nav1.7抗体(目录号ab85015, Abcam)进行western印迹，所述Nav1.7抗体探测Nav1.7蛋白的C-末端。β探测-肌动蛋白，用于参考。
[Nav1.7表达的抑制] 图34A提供了用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的“SCN-ASO 30”处理的DRG神经元细胞中获得的western印迹数据。所有裂解物都产生170K的强条带，这可归因于全长Nav1.7蛋白的片段或代谢物。仅用阴性对照和10 zM "SCN-ASO 30"的裂解物检测到220 ~ 240K处的全长Nav1.7蛋白条带。因此，在与100和1,000 zM的“SCN-ASO30”孵育24小时后，大鼠DRG神经元细胞中的Nav1.7表达被显著抑制。
SCN9A实施例14. “SCN-ASO 30”对大鼠L5 DRG神经元细胞中的钠电流的抑制。
评估“SCN-ASO 30”抑制用L5/L6结扎刺激的大鼠L5 DRG神经元细胞中的钠电流的能力，如下所提供。
[DRG神经元细胞的制备] 对雄性SD大鼠(6周龄)进行紧密的“L5/L6结扎”。7天后，将大鼠用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉，用于提取结扎侧的L5 DRG。L5 DRG神经元细胞如下制备：① 将DRG浸入含有0.2 mL HBSS中的0.125%胶原酶的1.5 mL e-管中，用剪刀切成小块，并在CO2培养箱中在37℃下在5% CO2和95% RH下孵育20 min；② 将50 μL 0.25%胰蛋白酶/EDTA添加至e-管中，并将e-管在培养箱中再保持10 min；③ 向e-管中装入1 mL完全DMEM培养基，并进行以600 g离心沉降5 min；④ 然后将所得沉淀悬浮于4 mL补充有2XB-27 (B-27®无血清补充剂，目录号17504-044，Gibco)、1X青霉素-链霉素、1X L-谷氨酰胺的Neurobasal-A培养基(Neurobasal®培养基，目录号21103-049，Gibco)中；⑤ 将DRG细胞的悬浮液运输约1小时，其密封在含有约15 mL Neurobasal-A培养基的15 mL falcon管中；⑥ 将0.5 mL细胞悬浮液小心地接种至置于24-孔板培养皿的孔中的层粘连蛋白包被的盖玻片上；⑦ 将培养板中接种的细胞在CO2培养箱中在37℃下孵育2小时，将细胞附着至盖玻片上，且然后在培养箱中用0(阴性对照)或100 zM的“SCN-ASO 30”处理4小时；⑧ 将DRG神经元细胞在钠膜片钳设备(Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments)上通过手动膜片钳测定法进行钠电流测量。
[膜片钳测定结果] 图34B提供了针对细胞大小归一化的钠电流数据。与100 zM "SCN-ASO 30"孵育4小时后，在表达河豚毒素敏感性钠通道的DRG神经细胞(即小尺寸的神经元细胞)中的钠电流显著(通过student氏t-检验p <0.01)减少约90%。(每组N = 4个细胞)。
SCN9A实施例15. 用"SCN-ASO 30"处理的大鼠DRG细胞中的SCN9A mRNA的通过一步cDNA合成的qPCR。
如下通过SCN9A巢式qPCR评估“SCN-ASO 30”抑制大鼠DRG细胞中的SCN9A mRNA的表达的能力。
[L5 DRG细胞的制备] 将4周龄雄性SD大鼠用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉以提取L5 DRG。合并DRG样品并处理以制备L5 DRG细胞，如“SCN9A实施例12”中所述。
[ASO处理] 将大鼠DRG细胞用0(阴性对照)、10、30、100、300或1,000 zM的“SCN-ASO 30”处理。(每个ASO浓度1个培养皿)。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成] 24小时后，根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)从细胞提取总RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对一组外显子特异性引物[SCN-外显子2(3)_正向：(5' → 3')CAATCTTCCGTTTCAACGCC; 和SCN-外显子10_反向：(5' → 3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT]，将200 ng RNA模板用于根据以下循环条件的25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下2分钟。
[巢式qPCR扩增] 将1 μL稀释100倍的每种cDNA溶液(每个浓度一式两份)根据以下循环条件用靶向SCN9A外显子3和外显子4的连接的TaqMan探针(目录号Rn01514993_mH,ThermoFisher)进行20μL实时PCR反应：95℃持续30秒，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。
图35A提供了qPCR数据。在用“SCN-ASO 30”处理的细胞中的全长SCN9A mRNA表达水平显著降低(通过student氏t-检验)约45 ~ 60%，尽管每个ASO浓度存在单个培养皿。
SCN9A实施例16. 用"SCN-ASO 30"处理的大鼠DRG细胞中的SCN9A mRNA的通过cDNA合成随机六聚体的qPCR。
通过SCN9A qPCR评估“SCN-ASO 30”抑制大鼠L5 DRG细胞中的SCN9A mRNA的表达的能力。总RNA如“SCN9A实施例15”中所述制备，并使用随机六聚体进行cDNA合成。将cDNA溶液(每个ASO浓度一式两份)稀释100倍，并将1 μL每种稀释的PCR产物根据以下循环条件用靶向SCN9A外显子3和外显子4的连接的TaqMan探针进行20 μL实时PCR反应：95℃持续30秒，随后为40个循环的在95℃下5秒和在60℃下30秒。
cDNA溶液还进行针对GAPDH mRNA的qPCR扩增。将SCN9A mRNA的Ct值针对GAPDHmRNA的Ct值归一化。
图35B提供了针对GAPDH归一化的SCN9A qPCR数据。在用“SCN-ASO 30”处理的细胞中的全长SCN9A mRNA表达水平显著降低(student氏t-检验)约45 ~ 75%。
SCN9A实施例17. 在具有糖尿病诱导的周围神经性疼痛的大鼠中SCN9A ASO逆转异常性疼痛。
SCN9A基因编码VGSC亚型Nav1.7的α-亚基。有极少数个体没有感到严重疼痛，但在其他感觉功能方面是正常的。发现此类个体具有经突变以编码非功能性Nav1.7亚型的SCN9A基因。[Nature vol 444, 894-898 (2006)] 这已被称为“SCN9A通道病”。在SCN9A敲除小鼠中，人SCN9A通道病的行为表型被相当多地复制。[PLOS One 9(9): e105895(2014)] 因此，式I的SCN9A ASO可以显示伴随Nav1.7上调的动物疼痛模型中的镇痛活性。
评估“SCN-ASO 7”、“SCN-ASO 8”、“SCN-ASO 21”、“SCN-ASO 35”、“SCN-ASO 36”和“SCN-ASO 37”在具有糖尿病诱导的周围神经性疼痛(DPNP)的大鼠中逆转异常性疼痛的能力。在本实施例中，评估靶向总共五个剪接位点的六种SCN9A ASO在大鼠中逆转由糖尿病性神经病诱导的异常性疼痛的能力。
[DPNP的诱导和分组] 在第0天通过腹膜内注射60 mg/Kg的链脲霉素在大鼠中诱导糖尿病。在第10天，将具有DPNP的大鼠随机分配至以下6组：阴性对照(仅媒介物)，"SCN-ASO 7" 100 pmol/Kg，"SCN-ASO 8" 100 pmol/Kg，"SCN-ASO 21" 100 pmol/Kg，"SCN-ASO35" 100 pmol/Kg，"SCN-ASO 36" 100 pmol/Kg，和"SCN-ASO 37" 100 pmol/Kg。在第10天将动物基于个体动物的von Frey评分分组。(每组N = 8 ~ 9)。根据“Up & Down”方法使用一组微丝(Touch Test®)将异常性疼痛评分。[J Neurosci. Methods vol 53(1), 55-63(1994)]。
[ASO处理和von Frey评分] 通过将SCN9A ASO的水性母液储备溶液在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中系列稀释至100 nM来制备ASO注射用溶液。在第11、13、15、17和19天，动物用1mL/Kg的ASO皮下施用。在第11、13、15、17和19天，在剂量后2小时实施Von Frey评分。另外在第21天和第23天进行Von Frey评分，以评价最终给药后治疗活性的持续时间。通过针对阴性对照组(仅媒介物，即PBS)的student氏t-检验评估每日von Frey评分的统计学显著性。
[治疗活性] 观察到的von Frey评分概述于图36中。除了“SCN-ASO 36”和“SCN-ASO 37”以外的所有ASO都显著逆转异常性疼痛，尽管“SCN-ASO 37”显示治疗活性的明显趋势(在第19天，p值=0.057)。随着重复给药，治疗活性倾向于逐渐增加。对于"SCN-ASO 7"、"SCN-ASO 8"、"SCN-ASO 21"、"SCN-ASO 35"、"SCN-ASO 36"和"SCN-ASO 37"，基于第19天的von Frey评分的最大治疗效力分别为约76%(显著的)，61%(显著的)，93%(显著的)，52%(显著的)，0%和22%(非显著的，p-值= 0.05X)。
“SCN-ASO 7”、“SCN-ASO 8”、“SCN-ASO 21”和“SCN-ASO 35”与其靶内含子具有5-聚体互补重叠。同时，“SCN-ASO 36”和“SCN-ASO 37”分别与它们的靶内含子具有4-聚体和3-聚体互补重叠。尽管存在许多影响治疗效力的因素，但与靶内含子互补重叠的数目看起来影响治疗效力。
在本实施例中，用靶向5个剪接位点中的4个的SCN9A ASO观察到体内反义活性。考虑到体内治疗活性取决于各种因素，包括细胞反义活性、靶组织中药物分子的富集、药代动力学半衰期等，80%的命中率被认为是非常高的。因此，式I的化合物可预测地调节其靶基因的表达。
考虑到“SCN-ASO 7”的分子量(参见表4)，将100 pmol/Kg翻译成约0.53 μg/Kg的治疗剂量。“SCN-ASO 7”的亚-阿托摩尔体外外显子跳跃功效被认为是具有糖尿病性神经病变的大鼠中的约0.53 μg/Kg的超强体内治疗效力的主要原因。甚至更令人惊讶地，ASO作为“裸”寡核苷酸施用。用其他类型的寡核苷酸(包括DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNA等等)从未实现如此强大的体内治疗功效。
DMD ASO的体内和离体活性的实施例
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种危及生命的单基因罕见疾病，其伴有肌肉退化。由于由外显子的点突变或缺失导致的PTC(过早终止密码子)，DMD患者不编码全长肌营养不良蛋白。
Mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J, Jackson Lab)是在肌营养不良蛋白基因的外显子23中具有点突变(其产生PTC)的突变小鼠。Mdx小鼠编码缺乏C-末端部分的肌营养不良蛋白的截短形式。由于C-末端部分结合细胞外基质(ECM)，截短形式丧失其将肌纤维紧密连接至ECM的预定作用。因此，mdx小鼠随着年龄逐渐丧失肌肉完整性和强度。
Mdx小鼠已被广泛用作人DMD的动物模型。已经研究靶向小鼠肌营养不良蛋白外显子23的肌营养不良蛋白ASO通过外显子23的跳跃来消除PTC。
评估互补地靶向小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子23的3'或5'剪接位点的式I的PNA衍生物诱导mdx小鼠中的肌营养不良蛋白外显子23的跳跃的能力。本文提供的生物学实施例用于说明作为式I的化合物的实例的肌营养不良蛋白ASO的外显子跳跃能力，并且因此不应解释为将本发明的范围限制为肌营养不良蛋白ASO。
DMD实施例1. Mdx小鼠中由“DMD-ASO 1”和“DMD-ASO 4”诱导的外显子跳跃(巢式PCR方法A)。
表7中指定的“DMD-ASO 1”是与跨越小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的内含子22和外显子23的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的13-聚体ASO。“DMD-ASO 1”互补地结合13-聚体序列，如[(5' → 3') 的25-聚体序列中标记为“粗体”和“下划线”。“DMD-ASO 1”具有与内含子22的8-聚体重叠和与外显子23的5-聚体重叠。
表7中指定的“DMD-ASO 4”是与跨越小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的内含子22和外显子23的连接的3'剪接中的区域完全互补的17-聚体ASO。“DMD-ASO 4”互补地结合17-聚体序列，如[(5' → 3') 的25-聚体序列中标记为“粗体”和“下划线”。“DMD-ASO 4”具有与内含子22的5-聚体重叠和与外显子23的12-聚体重叠。
评估“DMD-ASO 1”和“DMD-ASO 4”通过如下皮下施用诱导mdx小鼠的肌肉中的外显子跳跃的能力。
[ASO处理和取样肌肉组织] 通过将“DMD-ASO 1”或“DMD-ASO 4”的水性母液储备溶液在PBS中稀释至500 nM来制备注射溶液。雄性mdx小鼠用仅媒介物(阴性对照)、2 mL/Kg的“DMD-ASO 1”或“DMD-ASO 4”皮下施用3天，每天2次(BID)。最后一次剂量后一天，将动物用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉，并处死以取样肌肉组织，包括心脏、膈肌、腓肠肌、四头肌和三头肌。
[RNA提取] 将肌肉样品通过在保持在冰上的管中研磨来均质化，并且每约100 mg肌肉组织用1 mL trizol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。
[通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据以下循环条件，使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)和一组外显子特异性引物[DMD-外显子21_正向：(5' → 3') CAAAGAGAAAGAGCTACAGACA; 和DMD-外显子25_反向：(5' → 3') CTGGGCTGAATTGTTTGAAT]，将500 ng RNA模板用于25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为40个循环的在94℃下30秒、在58℃下1分钟和在72℃下2分钟。
[巢式PCR扩增] 针对一组引物[DMD-外显子22n_正向：(5' → 3')ATCCAGCAGTCAGAAAGCAAA; 和DMD-外显子25n_反向：(5' → 3') ACTAAAAGTCTGCATTGT]，根据以下循环条件，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR(目录号K2612, Bioneer)中进一步扩增：95℃持续5分钟，随后39个循环的在95℃下30秒、在50℃下40秒和在72℃下50秒。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，如图37A中所提供。仅在用“DMD-ASO 1”和“DMD-ASO 4”治疗的动物中检测到外显子23的跳跃。尽管仅在四头肌和腓肠肌中检测到外显子23的跳跃，但“DMD-ASO 1”看起来比“DMD-ASO 4”更有效。
阴性对照的受试者(即，没有ASO处理)产生指定至四头肌中外显子22-23的跳跃的PCR条带。外显子22-23的跳跃产生移框，并且缺乏外显子22-23的肌营养不良蛋白mRNA剪接变体注定编码C-末端部分丢失的截短的肌营养不良蛋白。
收集靶标大小的条带并通过Sanger测序分析，并证实由“DMD-ASO 1”和“DMD-ASO4”诱导的外显子23的跳跃。(参考图37B) 通过测序证实全长(即，没有跳跃)和外显子22-23的跳跃的PCR条带，尽管没有提供外显子22-23的跳跃的测序数据。
DMD实施例2. Mdx小鼠中由“DMD-ASO 1”和“DMD-ASO 4”诱导的外显子跳跃(巢式PCR方法B)。
“DMD实施例1”中获得的RNA样品使用[DMD-外显子20_正向：(5' → 3')CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG; 和DMD-外显子26_反向：(5' → 3') TTCTTCAGCTT-GTGTCATCC]的一组外显子特异性引物进行一步cDNA合成。然后cDNA样品通过巢式PCR针对[DMD-外显子20n_正向：(5' → 3') CCCAGTCTACCACCCTAT-CAGAGC; 和DMD-外显子26n_反向：(5' →3') CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT]的另一组外显子特异性引物进行分析。
提供巢式RT-PCR结果，如图38A和图38B中所概述。在ASO处理的动物中(每组N =2)，检测到外显子21-23和外显子22-25的跳跃。尽管外显子21-23的跳跃是同框的(即，没有移框)，但外显子22-25的跳跃不是同框的。指定至外显子21-23的跳跃的PCR条带通过Sanger测序明确证实。(参考图38B)。
外显子跳跃概况取决于如上所提供的PCR方法。因此，应当谨慎解释外显子跳跃概况。
DMD实施例3. Mdx小鼠中由“DMD-ASO 1”诱导的外显子跳跃(巢式PCR方法A)。
Mdx小鼠皮下接受0(阴性对照)或10 pmol/Kg的“DMD-ASO 1”，每天2次，持续5天。(每组2只动物) 最后一个剂量后一天，将动物处死用于组织取样。根据“DMD实施例1”中描述的巢式RT-PCR方法评估三头肌样品的外显子23的跳跃。
巢式RT-PCR结果概述于图38C中。尽管阴性对照组中的一只动物产生外显子22-23的跳跃的PCR条带，但缺乏外显子22-23的mRNA剪接变体不是同框的。仅在ASO处理组中的一只动物中检测到外显子23的跳跃的PCR条带。因此，DMD-ASO 1诱导外显子23的跳跃，如其所设计的那样。
DMD实施例4. 用“DMD-ASO 1”皮下施用的Mdx小鼠中的通过转棒测试的肌肉功能的改善。
mdx小鼠中的外显子23跳跃除去外显子23中的PTC，并且缺乏外显子23的mRNA剪接变体是同框的，且因此编码结合ECM的具有C-末端部分的变体蛋白。因此，全长变体肌营养不良蛋白部分恢复原始或野生型全长肌营养不良蛋白的生理功能。
鉴于外显子跳跃潜能，在mdx小鼠中通过如下所述的转棒测试评估“DMD-ASO 1”改善肌肉功能的能力。
[分组] 将6周龄雄性mdx小鼠经2周的时段针对转棒进行训练，且然后在第0天，即分组日，基于通过转棒测试的个体评分随机分配至3组：0(阴性对照)、100和1,000 pmol/Kg“DMD-ASO 1”。(每组N = 10)。
[ASO处理] 通过将ASO在PBS中系列稀释至20 nM和200 nM来制备注射溶液。经在第0天至第21天的时段向动物以5 mL/Kg皮下施用媒介物(PBS，阴性对照)、20 nM "DMD-ASO1" (100 pmol/Kg)或200 nM "DMD-ASO 1" (1,000 pmol/Kg)，每周3次。
[转棒测试和统计学分析] 将小鼠在转棒设备(型号#47650, Ugo Basile)上以经60秒4 rpm至45 rpm的加速时间表进行转棒测试。对于每只个别动物，将至落下的潜伏期(即，动物保持在转棒上的持续时间)评分。通过student氏t-检验评估针对阴性对照组的统计学显著性。
[肌肉功能的改善] 图39A概述了按组的转棒评分。在阴性对照组中，转棒评分(即，至落下的潜伏期)平均在约70至120秒时保持停滞。同时，1,000 pmol/Kg组的肌肉功能逐渐显著改善，直至第12天，且然后在其后保持稳定在平均210至230秒的转棒评分。在第12天、第14天和第19天，通过以1,000 pmol/Kg的ASO处理显著改善肌肉功能。100 pmol/Kg组的肌肉功能显示强烈的改善倾向，但并不显著。
DMD实施例5. 用“DMD-ASO 1”长期施用的Mdx小鼠中的通过握力测试和肌肉完整性的肌肉功能的改善。
通过长期施用于mdx小鼠评估“DMD-ASO 1”改善肌肉功能(通过握力测试)、诱导外显子跳跃、上调全长肌营养不良蛋白(即具有编码的C-末端的肌营养不良蛋白)的表达(通过IHC)和改善肌肉完整性(通过用H&E染色的组织病理学)的能力，如下所述。
[分组和ASO处理] 基于个体握力强度评分(通过握力测试)将雄性mdx小鼠(7周龄)随机分配至0(mdx阴性对照)、10、50和200 pmol/Kg “DMD-ASO 1”的4组。(每组N = 12)。本研究中包括12只雄性C57BL/6小鼠(7周龄)的卫星组作为全长肌营养不良蛋白表达水平的野生型阴性对照组。
50和200 pmol/Kg组皮下接受溶解在PBS中的“DMD-ASO 1”，每周2次，直至在第43周最后一次处死。同时，10 pmol/Kg组皮下接受“DMD-ASO 1”，最初在第0周至第8周期间每周2次，其后每周3次以增加ASO暴露。
[通过握力测试的肌肉功能] 根据文献[J. Appl. Physiol. vol 106(4), 1311-1324 (2009)]，通过握力计(目录号47,200, Ugo Basile)上的握力强度每周评估肌肉功能。通过针对mdx阴性对照组的student氏t-检验评估按组的握力强度评分的统计学显著性。
图39B概述在第0周至第30周期间观察到的按组的握力强度评分。在第一剂量后的前11周期间，ASO处理组和阴性对照组之间的握力强度没有显著变化。mdx阴性对照组的握力强度在第3周内达到约107 g的最大值，经数周逐渐衰减，且然后保持相对稳定在约75至95 g。从第10周左右开始，ASO处理组的握力强度开始逐渐改善。在处理组中，与mdx阴性对照组相比，握力强度倾向于增加30~50%。
注意，随机选择每组2至3只动物，并在第7、13、21和30周处死，用于IHC或巢式PCR评估。(参见下文)。
[针对全长肌营养不良蛋白的骨骼肌的IHC评估] 在第7、13和21周，随机选择每组两只动物并处死以提取肌肉组织。在第30周，每组处死3只动物。
在第7周取样的肌肉组织通过冷冻切片针对全长肌营养不良蛋白进行IHC。在第13、21和30周取样的肌肉组织通过石蜡块进行免疫染色。通过石蜡块的IHC通过冷冻切片产生比IHC更好质量的图像。
将肌肉样品连续用1:100稀释的靶向小鼠肌营养不良蛋白的C-末端的一抗(目录号sc-816, Santa Cruz)、用1:200稀释的第二抗IgG抗体(目录号BA-1100, Vector)且然后用1:200稀释的用于红色荧光标记的Dylight 594-链霉抗生物素蛋白(目录号SA-5594,Vector, CA, USA)进行免疫染色。在Zeiss载片扫描仪(在13、21和30周)或Olympus荧光显微镜(在第7周)上捕获IHC图像。另外实施DAPI染色。
图40是在第30周提取的肌肉样品的按组的全长肌营养不良蛋白IHC图像的代表性集合。野生型(WT)阴性对照组产生反映肌纤维束的天然结构的肌营养不良蛋白表达的独特和有角的模式。在mdx小鼠阴性对照组中，没有太多的全长肌营养不良蛋白染色。同时，在200 pmol/Kg处理组的骨骼肌中观察到肌营养不良蛋白染色的强烈和有角的模式。尽管与WT小鼠相比，mdx小鼠中的肌纤维束结构是模糊的，但在用ASO处理的动物中的全长肌营养不良蛋白表达显著增加。
通过使用“ImageJ”程序(NIH)对每个个别IHC图像中的红色荧光的强度进行数字评分，对肌营养不良蛋白IHC图像进行全长肌营养不良蛋白表达的定量。按组和肌肉类型组合个别荧光评分，用于针对野生型阴性对照组的统计学评估。
图41概述mdx小鼠中的全长肌营养不良蛋白的相对表达水平的变化。在较高的ASO剂量和较长的治疗持续时间下，全长肌营养不良蛋白的表达倾向于增加更多。在第30周，200 pmol/Kg组中的全长肌营养不良蛋白表达达到WT阴性对照组的> 80%，而mdx阴性对照中的表达低于野生型阴性对照组的20%。
[外显子跳跃的巢式PCR(方法B)] 将肌肉样品通过在保持在冰上的管中研磨来均质化，并且每约100 mg肌肉组织用1 mL trizol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。如“DMD实施例2”中所述，通过巢式PCR评估总RNA的外显子跳跃。
图42提供了用在第7周取样的骨骼肌获得的巢式PCR产物的电泳数据。在ASO处理组的肌肉样品中检测到△外显子21-23和△外显子21-24的同框PCR产物，但在mdx阴性对照组的那些中根本没有。
[通过H&E染色的组织病理学] 肌肉炎症和变性是DMD症状的标志。通过H&E染色对骨骼肌样品进行组织病理学评估。图43提供了按组和取样时间点的三头肌的H&E染色图像的代表性集合。
在WT阴性对照组中，肌肉结构在取样的所有时间点都是致密的。在所有时间点，野生型小鼠的肌肉中没有肌肉炎症的迹象。
在mdx阴性对照中，肌肉结构显示随着年龄逐渐变性的清晰模式。最值得注意的是，在第30周，肌肉束没有相互连接，并且倾向于退化为圆形。还存在炎性细胞的大量浸润，如蓝斑染色所表明，最显著的是在第13周和第21周。
在200 pmol/Kg组中，在第7周的松弛肌肉结构逐渐恢复至致密结构。在第7周的炎性细胞的显著浸润逐渐随着年龄消失。因此，在以200 pmol/Kg长期施用ASO后，mdx小鼠的肌肉变性和炎症被逆转，这与200 pmol/Kg组中的全长肌营养不良蛋白的上调一致。
10和50 pmol/Kg组中的组织病理学发现的严重程度弱于mdx阴性对照组中的严重程度，但强于200 pmol/Kg组中的严重程度。因此，由ASO暴露诱导的全长肌营养不良蛋白的上调在很大程度上与组织病理学发现一致。
[其他发现] mdx阴性对照组中存在三例未安排的处死或死亡(第26周、第39周和第43周)，这是由于大部分肌肉淋巴瘤最可能通过慢性肌肉炎症发展。在所有ASO处理组中都没有淋巴瘤的病例。
[与其他肌营养不良蛋白ASO的比较] Eteplirsen (exondys 51)是PMO反义寡核苷酸，其经设计以诱导人肌营养不良蛋白前mRNA中外显子51的跳跃。最近，美国FDA发布了eteplirsen用于需要外显子51的跳跃的DMD患者的群体中的加速批准。推荐的eteplirsen的剂量是每周静脉内注射30 mg/Kg。
200 pmol/Kg “DMD-ASO 1”的皮下剂量对应于约1 μg/Kg。式I的肌营养不良蛋白ASO比PMO ASO更有效约30,000倍，尽管在两种类型的ASO之间存在物种和外显子的差异。式I的PNA衍生物的前所未有超强外显子跳跃功效再次转化为这种难以治疗的罕见疾病的超强体内治疗功效。
DMD实施例6. 用“DMD-ASO 2”长期施用的MDX小鼠中的通过步行距离的肌肉功能的改善。
表7中指定的“DMD ASO 2”是与跨越小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的内含子22和外显子23的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的17-聚体ASO。“DMD-ASO 2”互补地结合17-聚体序列，如[(5' → 3') 的20-聚体小鼠肌营养不良蛋白前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“DMD-ASO 2”具有与内含子22的8-聚体重叠和与外显子23的9-聚体互补重叠。
将“DMD-ASO 2”长期施用于mdx小鼠，以评估其通过脚踏轧机上的步行距离改善肌肉功能和通过肌酸激酶(CK)和肌红蛋白的血清水平抑制肌肉降解的能力。
[动物和分组] 基于体重将雄性mdx小鼠(6周龄)随机分配至mdx阴性对照(无ASO处理)、“DMD-ASO 2” 10 pmol/Kg和“DMD-ASO 2”30 mg/Kg的三组。(每组N = 16)。采用12只雄性C57BL/6小鼠(6周龄)作为野生型(WT)阴性对照组。
[注射溶液和ASO处理] 将“DMD-ASO 2”的水性母液储备溶液稀释于PBS或补充有0.1% Tween 80的PBS中，以分别制备10 pmol/Kg和30 pmol/Kg "DMD-ASO 2"的20和60 nM"DMD-ASO 2"的注射溶液。用0.1% Tween 80补充PBS注射溶液被认为是防止ASO分子粘附至注射塑料小瓶、移液管吸头和注射器所必需的。
[脚踏轧机上的行走距离] 在分组后的前30周期间，以2 mL/Kg向动物施用不含Tween 80的注射溶液，每周2次。从第7周开始，每周使动物在脚踏轧机(型号#LE8710,PanLab)上行走。然而，在前30周期间，与mdx阴性对照组相比，ASO处理组未能显示步行距离的任何显著改善。
为了有效地增加ASO剂量，从第36周起向动物施用补充有Tween 80的注射溶液，每周2次。之间存在5周的冲洗(即，没有ASO给药)时段。
图44A概述在第43周至第48周期间按组的脚踏轧机上的步行距离。mdx阴性对照组的平均步行距离逐渐但迅速地从第43周的约250米减少至第48周的130米。ASO处理组的平均步行距离显著长于mdx阴性对照组的距离。
在第46周至第48周期间，10 pmol/Kg组显示240至280米的平均步行距离，这显著长于mdx阴性对照组的距离。同时，30 pmol/Kg组在第46周至第48周期间显示约180至230米的步行距离。存在10 pmol/Kg组的步行距离比30 pmol/Kg组更长的趋势。步行距离的倒置剂量响应表明在较高ASO剂量下自然选择不同的外显子，如在“HIF-1α实施例9”中所观察到。有趣的是，WT阴性对照组和30 pmol/Kg组在第44周至第47周期间显示相当的步行距离。
[终末处死] 在第48周，对动物进行终末处死用于血液取样。分析血液样品的CK(肌酸激酶活性测定试剂盒，目录号ab155901，Abcam)和肌红蛋白(肌红蛋白ELISA试剂盒，目录号ab210965，Abcam)的血清水平，以根据制造商的说明书评价肌肉降解的程度。通过western印迹分析肌肉组织的全长肌营养不良蛋白。
[CK和肌红蛋白的血清水平] 图44B提供了观察到的按组的血清CK水平。反映mdx小鼠的肌肉脆弱性，所有mdx小鼠组产生显著远高于WT阴性对照组的血清CK活性。例如，mdx阴性对照组的血清CK水平是WT阴性对照组的水平的约54倍。10和30 pmol/Kg组的血清CK水平分别比mdx阴性对照组的水平小58%和38%。10 pmol/Kg和mdx阴性对照组之间血清CK水平的差异是显著的。
图44C提供了观察到的按组的血清肌红蛋白水平。反映mdx小鼠的肌肉脆弱性，所有mdx小鼠组产生远高于WT阴性对照组的水平的血清肌红蛋白水平。例如，mdx阴性对照组的血清肌红蛋白水平是WT阴性对照组的水平的约22倍。10和30 pmol/Kg组的血清肌红蛋白水平分别比mdx阴性对照组的水平显著小67%和58%。
观察到的肌肉降解的血清生物标志物的数据与图44A中提供的步行距离的剂量依赖性非常一致。
[通过Western印迹的三头肌中的全长肌营养不良蛋白表达] 在液氮温度下均质化后，将肌肉(三头肌)样品在补充有1% SDS的RIPA缓冲液中裂解。针对BSA标准品通过BCA测定来定量每种裂解物中的蛋白浓度。将每种裂解物的50 mg蛋白在8% PAGE凝胶上进行电泳分离。然后将PVDF膜用靶向C-末端的肌营养不良蛋白抗体(目录号ab154168，Abcam)探测。
图45A提供了观察到的western印迹数据。在所有样品中未检测到427K大小的全长肌营养不良蛋白。相反，WT肌肉样品产生较小的170K、130K和117K大小的肌营养不良蛋白，其中130K大小条带是最富集的。
在mdx组的情况下，检测到三种肌营养不良蛋白条带。10和30 pmol/Kg处理组产生显著强于mdx阴性对照组以及WT对照组的117K条带。10 pmol/Kg组中的130K带强度也明显强于mdx阴性对照组中。
DMD实施例7. 用“DMD-ASO 1”、“DMD-ASO 2”或“DMD-ASO 6”施用的MDX小鼠的长期评估。
表7中指定的“DMD ASO 6”是与跨越小鼠肌营养不良蛋白前mRNA中的外显子23和内含子23的连接的5'剪接位点中的区域完全互补的18-聚体ASO。“DMD-ASO 6”与18-聚体序列互补地重叠，所述18-聚体序列如[(5' → 3') 的25-聚体小鼠肌营养不良蛋白前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“DMD-ASO 6”具有与外显子23的8-聚体重叠和与内含子23的10-聚体重叠。
通过长期皮下施用评估“DMD-ASO 1”、“DMD-ASO 2”和“DMD-ASO 6”的在雄性mdx小鼠中的生理作用。在该评估中，动物未进行需要肌肉压力的物理测试，以保持肌营养不良蛋白基因的转录不被过度肌肉刺激干扰。
[动物和分组] 基于体重将雄性mdx小鼠(6周龄)随机分配至mdx阴性对照(无ASO处理)、“DMD-ASO 1” 50 pmol/Kg，“DMD-ASO 2” 10 mg/Kg和“DMD-ASO 6” 10 mg/Kg的4组。(每组N = 12 ~ 13)。采用12只雄性C57BL/6小鼠(6周龄)作为野生型(WT)阴性对照组。
[注射溶液和ASO处理] 将ASO的水性母液储备溶液系列稀释于PBS中以制备50pmol/Kg "DMD-ASO 1"的25 nM "DMD-ASO 1"的注射溶液，"DMD-ASO 2" 10 pmol/Kg的5 nM"DMD-ASO 2"的注射溶液，和"DMD-ASO 6" 10 pmol/Kg的5 nM "DMD-ASO 6"的注射溶液。向动物用注射溶液以2 mL/Kg皮下施用，每周2次。
[未安排的死亡或处死] 用ASO处理的mdx小鼠倾向于显示比mdx阴性对照组更长的寿命，表明ASO的治疗活性。
在mdx阴性对照组中，存在3例未安排的死亡或处死：第42周、第58周和第61周一次一例。“DMD-ASO 1”处理组显示两例过早死亡，一例在第38周，且另一例在第61周。在“DMD-ASO 2”处理组的情况下，一例死亡在第56周，且另一例死亡在第62周。在“DMD-ASO 6”处理组中存在3例过早死亡：第55周、第65周和第66周一次一例。
[终末处死] 所有存活的动物在分组后第66周处死用于血液取样。血液样品进行针对血清肌酸激酶(CK)和血清肌红蛋白的ELISA测定，如“DMD实施例6”中所述。
[CK和肌红蛋白的血清水平] 图45B提供了观察到的按组的血清CK水平。反映mdx小鼠的肌肉脆弱性，所有mdx小鼠组产生显著远高于WT阴性对照组的血清CK活性。例如，MDX阴性对照组的血清CK水平是WT阴性对照组的水平的约17倍。ASO处理组的血清CK水平倾向于小于MDX阴性对照组的水平，表明ASO的治疗活性。然而，差异并不显著。
图45C提供了观察到的按组的血清肌红蛋白水平。反映mdx小鼠的肌肉脆弱性，所有mdx小鼠组产生显著远高于WT阴性对照组的血清肌红蛋白活性。例如，mdx阴性对照组的血清肌红蛋白水平是WT阴性对照组的水平的约26倍。“DMD-ASO 1”、“DMD-ASO 2”和“DMD-ASO 6”的处理组的血清肌红蛋白水平分别比mdx阴性对照组的水平低43%、49%和68%。MDX阴性对照和“DMD-ASO 6”组之间的差异是显著的。肌肉完整性的血清生物标志物间接支持“DMD-ASO 6”诱导肌营养不良蛋白外显子23的跳跃并且在mdx小鼠中产生功能活性的全长肌营养不良蛋白。
IDO1 ASO的体外活性的实施例
设计表8中的式I的PNA衍生物以互补地靶向人IDO1前mRNA中的各个剪接位点。评估了IDO1 ASO在SKOV3细胞中的外显子跳跃活性。考虑到IDO1催化L-色氨酸降解为N-甲酰基犬尿氨酸，评估IDO1 ASO抑制犬尿氨酸产生的功能活性。本文提供的生物学实施例用于说明作为式I的化合物的实例的IDO1 ASO的外显子跳跃活性，并且因此不应解释为将本发明的范围限制为IDO1 ASO。
IDO1实施例1. “IDO-ASO 1”诱导的外显子跳跃。
表8中指定的“IDO-ASO 1”是与跨越人IDO1前mRNA中的内含子6和外显子7的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的13-聚体ASO。“IDO-ASO 1”互补地靶向13-聚体序列，如[(5' →3') │的20-聚体人IDO1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“IDO-ASO 1”具有与内含子6的5-聚体重叠和与外显子7的8-聚体重叠。
通过IDO1巢式PCR如下评估“IDO-ASO 1”在SKOV3细胞(目录号HTB-77，ATCC)中诱导外显子跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将SKOV3(人卵巢腺癌)细胞在含有5mL补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的McCoy氏5A改良培养基的60 mm培养皿中在5% CO2、37℃下亚培养，并用0 zM(阴性对照)、10 zM、100 zM或1 aM的“IDO-ASO 1”处理48小时。
[RNA提取和通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)从细胞提取总RNA。将200 ng RNA模板根据以下循环条件使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042,Invitrogen)针对一组外显子特异性引物[IDO-外显子2_正向：(5' → 3')TTCATTGCTAAACATCTGCC; 和IDO-外显子10_反向：(5' → 3') TGAAAGGACAAACTCACGGA]进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为40个循环的在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 针对一组外显子特异性引物[IDO-外显子4_正向：(5' → 3')CCTTACTGCCAACTCTCC; 和IDO-外显子9_反向：(5' → 3') CTGCTTTGGCCTGCACTG]，根据以下循环条件，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)中进一步扩增：95℃持续5分钟，随后30个循环的在95℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图46A提供了巢式PCR产物的电泳数据(左图)和指定至外显子6-7的跳跃的PCR条带的Sanger测序数据(右图)。在用100 zM "IDO-ASO 1"处理的细胞的RNA提取物中检测到外显子6-7的跳跃。在用10 zM或1 aM的ASO处理的细胞的RNA提取物中未检测到外显子跳跃条带，这很可能是由于缺乏外显子6-7的IDO1 mRNA剪接变体的稳定性差。尽管在用10或100zM的ASO处理的细胞中的全长IDO-1 mRNA的强度降低，但在用1 aM的ASO处理的细胞中的全长mRNA PCR的强度增加。观察到的在1 aM的全长mRNA水平的增加尚未阐明。它可能是PCR反应期间的伪像，或者可能是由于由“IDO-ASO 1”在外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的(瞬时)转录上调。[Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)] Sanger测序数据(右图)明确地表明在SKOV3细胞中由“IDO-ASO 1”诱导的外显子6-7的跳跃。
IDO1实施例2. “IDO-ASO 1”的反义功能活性。
如下评估“IDO-ASO 1”的功能活性的抑制SKOV3细胞中的犬尿氨酸的分泌的能力。
[犬尿氨酸分泌测定] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的SKOV3细胞用0zM(阴性对照)或10 zM至1 fM的"IDO-ASO 1"处理。(每个浓度3个皿) 将细胞用ASO连同10ng/mL γ-干扰素处理以增加犬尿氨酸的分泌。24小时后，从每个培养皿取样200 μL培养基，并与100 μL 30%三氯乙酸混合。将混合物涡旋并以8,000g离心5分钟。将75 μL所得上清液与75 μL Ehrlich试剂(0.8%对二甲基氨基-苯甲醛/乙酸)混合，并将混合物在ELISA阅读仪上在490nm处针对犬尿氨酸定量。[PLOS One 5(8): e63301 (2013)]。
图46B提供了犬尿氨酸测定结果。除了用1 aM "IDO-ASO 1"处理的细胞，用10 zM至1 fM的ASO处理的细胞中的犬尿氨酸的分泌显著减少(student氏t-检验)。用1 fM "IDO-ASO 1"处理的细胞中的犬尿氨酸分泌减少约40%。
IDO1实施例3. “IDO-ASO 5”诱导的外显子跳跃。
表8中指定的“IDO-ASO 5”是与跨越人IDO1前mRNA中的外显子3和内含子3的连接的5'剪接位点中的区域完全互补的13-聚体ASO。“IDO-ASO 5”与13-聚体序列互补重叠，所述13-聚体序列如[(5' →3') │的20-聚体人IDO1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"IDO-ASO 5"具有与外显子3的8-聚体互补重叠和与内含子3的5-聚体互补重叠。
除非另有说明，否则如“IDO实施例1”中所述通过IDO1巢式RT-PCR评估"IDO-ASO5"诱导SKOV3细胞中的外显子跳跃的能力。
[ASO处理] 将在60 mm培养皿中生长的SKOV3细胞用0 (阴性对照)、1、3、10、30或100 aM的“IDO-ASO 5”处理48小时。
[通过一步PCR的cDNA合成] 使用具有platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，针对一组外显子特异性引物[IDO-外显子1_正向：(5' → 3') AAAACTCCTGGACAATCAGT; 和IDO-外显子8_反向：(5' → 3')ACTTGAAGGGCTTTCTCC]，对200 ng RNA模板进行根据以下循环条件的25 μl逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为40个循环的在94℃下30秒、在52℃下30秒和在72℃下40秒。
[巢式PCR扩增] 使用一组外显子特异性引物[IDO-外显子1n_正向：(5' → 3')TATTGATGAAGAAGTGGG; 和IDO-外显子8n_反向：(5' → 3') GTTCACATGATCGTGGATTTG]，根据以下循环条件，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR(目录号K2612, Bioneer)反应中进一步扩增：95℃持续5分钟，随后30个循环的在95℃下30秒、在52℃下40秒和在72℃下40秒。
[巢式PCR产物数据] 图47A提供了巢式PCR产物的电泳数据。用30和100 aM的“IDO-ASO 5”处理的细胞明显产生缺乏外显子2-4和外显子2-6的mRNA剪接变体。ASO处理的细胞中的全长mRNA的强度降低，尽管用10 aM的ASO处理的细胞中的强度略微上升。图47B提供了缺乏外显子2-4和外显子2-6的mRNA剪接变体的Sanger测序数据。
IDO1实施例4. “IDO-ASO 6”诱导的外显子跳跃。
表8中指定的“IDO-ASO 6”是与跨越人IDO1前mRNA中的内含子3和外显子4的连接的3'剪接位点中的区域完全互补的13-聚体ASO。“IDO-ASO 6”互补地靶向13-聚体序列，如[(5' →3') │的20-聚体人IDO1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“IDO-ASO 6”具有与内含子3的5-聚体互补重叠和与外显子4的8-聚体互补重叠。
除非另有说明，否则如“IDO实施例3”中所述通过IDO1巢式PCR评估"IDO-ASO 6"诱导SKOV3细胞中的外显子跳跃的能力。
[巢式PCR产物数据] 图47C提供了巢式PCR产物的电泳数据(左图)连同可指定至外显子跳跃的PCR条带的Sanger测序数据(右图)。用1至30 aM的“IDO-ASO 6”处理的细胞明显产生缺乏外显子2-5的单一mRNA剪接变体，尽管在用100 aM的ASO处理的细胞中未检测到外显子跳跃条带。ASO处理的细胞中的全长mRNA强度比没有ASO处理的细胞更强，这可能是由于通过“IDO-ASO 1”在外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的转录上调。[Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)]。
SNAP25 ASO的体外和离体活性的实施例
SNAP25 (25kDa的突触体相关蛋白)是参与运动神经元细胞中的神经递质的胞吐作用的SNARE蛋白。肉毒菌毒素A(BotoxTM)切割SNAP25，而得到其著名的抗皱活性。设计表9中的式I的PNA衍生物以互补地靶向人SNAP25前mRNA中的外显子7的3'剪接位点。评估SNAP25ASO在SiMa(人神经母细胞瘤)细胞和大鼠来源的PC12细胞中的SNAP25反义活性，以及它们在局部施用后抑制小鼠皮肤中的SNAP25表达的能力。本文提供的生物学实施例用于说明作为式I的化合物的实例的SNAP25 ASO的外显子跳跃能力，并且因此不应解释为将本发明的范围限制为SNAP25 ASO。
SNAP25实施例1. 用“SNAP-ASO 3”处理的PC12细胞中的外显子跳跃。
表9中指定的"SNAP-ASO 3"是与跨越人SNAP25前mRNA中的"内含子6"和"外显子7"的连接的3'剪接位点中的14-聚体序列完全互补的14-聚体ASO。“SNAP-ASO 3”与14-聚体前mRNA序列互补重叠，所述14-聚体前mRNA序列如[(5' → 3') │的30-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。"SNAP-ASO3"具有与"内含子6"的7-聚体重叠和与"外显子7"的另一7-聚体重叠。
评估“SNAP-ASO 3”在PC12细胞(目录号CRL-1721，ATCC)中诱导外显子跳跃的能力，尽管“SNAP-ASO 3”与从大鼠基因组DNA[从NCBI参考序列:NC_005012获得]读出的大鼠SNAP25前mRNA中的“外显子7”的3'剪接位点具有单个错配。14-聚体ASO与大鼠SCN9A前mRNA具有13-聚体互补重叠，其在[(5' → 3') │ (其中单个错配用引号(" ")符号标记)的25-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
[细胞培养和ASO处理] 将PC12细胞在补充有5% FBS、10%马血清、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中在5% CO2气氛下在37℃下维持。在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的细胞用0 (阴性对照)、10、100或1,000 zM的"SNAP-ASO 3"处理。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成] 与"SNAP-ASO 3"孵育42小时后，将细胞用100 μg/mL环己酰亚胺再处理6小时，以冻结核糖体翻译。然后根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，根据以下循环条件将200 ng RNA模板针对[SNAP-外显子1_正向：(5' → 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 和SNAP-外显子14_反向：(5' → 3') AGCATCTTT-GTTGCACGTTG]的一组外显子特异性引物进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为40个循环的在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 针对[SNAP-外显子1_正向：(5' → 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA;SNAP-外显子14n_反向：(5' → 3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT]的一组外显子特异性引物，对1μL cDNA进行根据以下循环条件的20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)：95℃持续2分钟，随后34个循环的在95℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图48A提供了PCR产物的电泳数据，其中10zM ASO处理样品产生可指定至外显子5-7的跳跃的微弱PCR条带(参考左图)。即使用环己酰亚胺处理细胞以通过冻结核糖体翻译来使全长mRNA不稳定，也仅微弱地检测到外显子跳跃条带。因此，与全长mRNA相比，可指定至外显子5-7的跳跃的SNAP25 mRNA剪接变体可能在细胞中显示差代谢稳定性。将外显子跳跃PCR产物测序为外显子(5-7)的跳跃，如图48A中所示。(参考右图) 考虑到无论ASO浓度如何都观察到可指定至外显子6的跳跃的PCR产物，外显子6的跳跃被认为是自发发生的。
用10 zM "SNAP-ASO 3"处理的细胞中的全长SNAP25 mRNA的强度降低最多。随着ASO浓度从10增加至1,000μM，全长mRNA强度逐渐增加至阴性对照(即，没有ASO处理)的强度。巢式PCR数据中的倒置剂量响应模式可能是由于通过用“SNAP-ASO 3”的外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的转录上调。[Nature Struc. Mol. Biol.vol 22(3), 256-264 (2015)]。
SNAP25实施例2. 用“SNAP-ASO 3”处理的PC12细胞中的SNAP25 mRNA的qPCR。
如下通过SNAP25巢式qPCR评估“SNAP-ASO 3”诱导PC12细胞中的大鼠SNAP25 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的PC12细胞用0(阴性对照)、10、100或1,000 zM的"SNAP-ASO 3"处理。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取和通过一步RT-PCR的cDNA合成] 与"SNAP-ASO 3"孵育42小时后，将细胞用100 μg/mL环己酰亚胺再处理6小时，以冻结核糖体翻译。然后根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)从细胞提取总RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对[SNAP-外显子1_正向：(5' → 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 和SNAP-外显子14_反向：(5' → 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]的一组外显子特异性引物，根据以下循环条件，对200 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为20个循环的在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式qPCR扩增] 根据以下循环条件，针对[SNAP-外显子7q_正向：(5' → 3')ATGGATGAAAACCTAGAGC; 和SNAP-外显子8q_反向：(5' → 3') CTTCCCAGCATCTTTGTT]的一组外显子特异性引物，对1 μL稀释100倍的每种cDNA溶液进行20 μL实时PCR反应：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下10秒和在60℃下30秒。随后用靶向外显子7和外显子8的连接的[(5' → 3') 5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ]的Taqman探针进行qPCR反应，以定量全长SNAP25 mRNA。
图48B提供了qPCR数据，其中用10 zM和100 zM的“SNAP-ASO 3”处理的细胞中的全长mRNA水平分别显著降低(student氏t-检验)约50%和20%。然而，用1,000zM “SNAP-ASO 3”处理的细胞中的全长mRNA水平略高于没有ASO处理的细胞(即阴性对照)的水平。
qPCR数据的倒置剂量响应模式与“SNAP25实施例1”中描述的外显子跳跃期间全长mRNA水平的剂量响应模式相当一致，表明随着ASO剂量从10 zM增加至1,000 zM，转录上调。因此，与大鼠SNAP25前mRNA的13-聚体互补重叠不足以敲低由外显子跳跃期间累积的EIciRNA诱导的转录上调。
SNAP25实施例3. 用“SNAP-ASO 1”处理的PC12细胞中的SNAP25 mRNA的qPCR。
表8中指定的“SNAP-ASO 1”是与跨越人SNAP25前mRNA中的内含子6和外显子7的连接的3'剪接位点的16-聚体序列完全互补的16-聚体ASO。“SNAP-ASO 1”与16-聚体靶标序列互补重叠，所述16-聚体靶标序列如[(5' → 3') │的30-聚体人前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“SNAP-ASO 1”具有与内含子6的6-聚体重叠和与外显子7的10-聚体重叠。然而，ASO与大鼠SNAP25前mRNA具有单个错配，如在[(5' → 3') │(其中单个错配用引号(" ")符号标记)的25-聚体前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
除非另有说明，否则如“SNAP25实施例2”中所述通过SNAP25巢式qPCR评估"SNAP-ASO 1"诱导PC12细胞中的大鼠SNAP25 mRNA水平的变化的能力。
图48C提供了qPCR数据，其中用10 zM、100 zM和1,000 zM的“SNAP-ASO 1”处理的细胞中的全长mRNA水平分别显著降低(student氏t-检验)约50%、40%和70%。
与“SNAP-ASO 3”的情况一样，当剂量从10 zM增加至100 zM时，用“SNAP-ASO 1”部分再现倒置剂量响应模式。然而，考虑到随着ASO浓度增加至1,000 zM，全长mRNA水平进一步降低，“SNAP-ASO 1”的外显子跳跃效力似乎强于“SNAP-ASO 3”的外显子跳跃效力。“SNAP-ASO 1”与大鼠前mRNA的15-聚体互补重叠将导致更高的外显子跳跃效力。
SNAP25实施例4. "SNAP-ASO 3"对PC12细胞中的SNAP25蛋白表达的抑制。
如下评估“SNAP-ASO 3”抑制PC12细胞中的SNAP25蛋白的表达的能力。
使PC12细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 zM(阴性对照)、1zM、10 zM、30 zM、100 zM、300 zM、1 aM、3 aM或10 aM的“SNAP-ASO 3”处理48小时。存在4个阴性对照的培养皿以补偿在Western印迹分析期间潜在的技术伪像。
[细胞裂解] 然后将细胞在冰上用补充有1% SDS和1X蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete Mini, Roche)的200 μL 1X RIPA缓冲液(目录号9806, Cell Signaling Tech)进行裂解。将裂解物收集于1.5 mL e-管中，与100 μL 5X样品缓冲液混合，并煮沸5分钟。
[Western印迹] 将裂解物在4-15% TGX-PAGE梯度凝胶(目录号456-1086，Bio-Rad)上进行电泳分离，且然后转移至0.45 μm PVDF膜上。将膜用抗SNAP25抗体(目录号S9684，Sigma)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号A3845，Sigma)探测。
图49A提供了用PC12细胞裂解物获得的SNAP25 western印迹数据(顶部图)以连同通过光密度测定法针对β-肌动蛋白归一化的相对SNAP25表达水平(底部图)。用“SNAP-ASO3”处理的细胞中的SNAP25蛋白水平降低10至60%。阴性对照(即0 zM “SNAP-ASO 3”)的表达水平是4个样品的平均表达水平。
SNAP25实施例5. "SNAP-ASO 1"对PC12细胞中的SNAP25蛋白表达的抑制
除非另有说明，否则如“SNAP25实施例4”中所述评估“SNAP-ASO 1”抑制PC12细胞中的SNAP25蛋白表达的能力。将PC12细胞用0(阴性对照)、100或1,000 zM的“SNAP-ASO 1”处理48小时或72小时。(每个ASO浓度一个培养皿)。
图49B提供了48小时(左)和72小时(右)的ASO处理的western印迹数据。“SNAP-ASO1”在两个时间点都显著抑制PC12细胞中的SNAP25蛋白的表达。
SNAP25实施例6. "SNAP-ASO 3"对SiMa细胞中的SNAP25蛋白表达的抑制。
如下评估“SNAP-ASO 3”抑制SiMa人神经母细胞瘤细胞中的SNAP25蛋白的表达的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将SiMa细胞(目录号ACC164, DSMZ)在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素、1% L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中在5% CO2气氛下在37℃下维持。使SiMa细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 (阴性对照)、1 zM至100 aM的"SNAP-ASO 3"处理48小时。存在3个阴性对照的培养皿以补偿在Western印迹分析期间潜在的技术伪像。
[裂解] 将细胞在冰上用补充有0.1% SDS和1X蛋白酶抑制剂混合物(cOmpleteMini, Roche)的200 μL 1X RIPA缓冲液(目录号9806, Cell Signaling Tech)进行裂解。然后将裂解物收集于1.5 mL e-管中，与100 μL 5X样品缓冲液混合，并煮沸5分钟。
[Western印迹] 将裂解物在12% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移至0.2 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用抗SNAP25抗体(目录号ab41455，Sigma)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号A3845，Sigma)探测。
图50A提供了用SiMa细胞裂解物获得的SNAP25 western印迹数据(顶部图)以连同通过光密度测定法针对β-肌动蛋白归一化的相对SNAP25表达水平(底部图)。用“SNAP-ASO3”处理的细胞中的SNAP25蛋白水平降低40至50%。
SNAP25实施例7. 用“SNAP-ASO 3”处理的SiMa细胞中的SNAP25 mRNA的qPCR。
如下通过SNAP25巢式qPCR评估“SNAP-ASO 3”诱导SiMa细胞中的人SNAP25 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 使SiMa细胞在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长，并用0 zM(阴性对照)、1 zM、10 zM、100 zM或1 aM、10 aM或100 aM的“SNAP-ASO 3”处理。(每个ASO浓度2个培养皿)。
[RNA提取和cDNA合成] 根据制造商的说明，使用"RNeasy Mini Kit"(目录号74106, Qiagen)从细胞提取总RNA。使用针对随机六聚体的PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(目录号6110B，Takara)，对200ng RNA模板进行25 μl逆转录反应。
[qPCR扩增] 用靶向外显子6和外显子7的连接的Taqman探针[(5' → 3') 56-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ]，针对一组外显子特异性引物[SNAP-外显子6_正向：(5' → 3') GACGAACGGGAGCAGATG; 和SNAP-外显子8_反向(2)：(5' → 3')ATCTCATTGCCC-ATATCCAGG]监测PCR反应。循环条件：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下15秒和在60℃下30秒。
图50B提供了qPCR数据，其中用1 zM、100 zM、1 aM和100 aM的“SNAP-ASO 3”处理的细胞中的全长人SNAP25 mRNA水平显著降低(student氏t-检验)20至40%。用100 aM的ASO处理的细胞显示40%的最强抑制。
SNAP25实施例8. 用“SNAP-ASO 1”局部施用的小鼠的皮肤中的SNAP25蛋白表达的抑制。
"SNAP-ASO 1"是与跨越从小鼠基因组DNA(从NCBI参考序列：NC_000068获得)读出的小鼠SNAP25前mRNA中的内含子6和外显子7的连接的3'剪接位点完全互补的16-聚体ASO。如下评估“SNAP-ASO 1”抑制局部施用后的皮肤中的SNAP25蛋白的表达的能力。
[剪毛和分组] 在第0天，用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉8只雌性C57BL/6小鼠(5周龄)，并用剪毛器切下背部的毛发(约3 cm x 4 cm)。将小鼠随机分成4组，即没有ASO处理组(阴性对照)以及1 fM、10 fM和100 fM "SNAP-ASO 1"的3个处理组。(每组2只动物)。
[局部施用] 通过将"SNAP-ASO 1"的储备水溶液在补充有3%(v/v)甘油的30%(v/v)水性乙醇中系列稀释至0、1、10和100 fM "SNAP-ASO 1"来制备局部溶液。在第0天至第4天，使用棉球在每只动物脱毛的背部皮肤中局部施用约100 μL局部溶液，每天两次。
[皮肤取样] 在第4天下午，将动物用舒泰(zoletil)/隆朋(rompun)麻醉，以便对用ASO局部处理的皮肤部分进行取样。然后如下所述对皮肤样品进行针对SNAP25蛋白的IHC。
[SNAP25 IHC] 将皮肤样品冷冻切片并连续用1:200稀释的一级抗SNAP25抗体(目录号ab41455，Abcam)、用1:200稀释的二级抗IgG(目录号BA-1100，Vector)、且然后用1:200稀释的用于红色荧光标记的Dylight 594-链霉抗生物素蛋白(目录号SA-5594, Vector,CA, USA)进行免疫染色。抗SNAP25抗体探测SNAP25蛋白的C-末端。在Zeiss载片扫描仪上捕获IHC图像以评估SANP25蛋白的表达。进行DAPI染色以观察皮肤微观结构。
图51提供了按组的SNAP25 IHC图像的代表性集合。在阴性对照组中，SNAP25蛋白表达在真皮正下方的肌肉层中高。肌肉层中的SNAP25蛋白表达被认为源自嵌入肌肉层的运动-神经元轴突中的SNAP25蛋白表达。随着剂量增加，肌肉层中的SNAP25蛋白表达逐渐降低。在100fM处理组中观察到最显著的降低。
通过IHC的皮肤中的全长SNAP25蛋白表达的抑制似乎比PC12细胞中观察到的通过western印迹的抑制更强(参见“SNAP25实施例5”)。原代细胞中通过EIciRNA的转录上调(如果有的话)看起来不与包括PC12和SiMa细胞的癌细胞中涉及的上调一样显著。
TYR ASO的体外活性的实施例
酪氨酸酶(TYR)是参与黑色素生成或皮肤色素沉着的酶。设计表10中的式I的PNA衍生物以互补地靶向人或小鼠TYR前mRNA中的外显子2的3'剪接位点。评估TYR ASO在人黑色素细胞中以及B16F10(小鼠黑色素瘤)细胞中的TYR反义外显子跳跃活性。本文提供的生物学实施例用于说明作为式I的化合物的实例的TYR ASO的外显子跳跃活性，并且因此不应解释为将本发明的范围限制为TYR ASO。
TYR实施例1. B16F10细胞中的“TYR-ASO 4”诱导的外显子跳跃。
表10中指定的“TYR-ASO 4”是与跨越小鼠TYR中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点完全互补的13-聚体TYR ASO，所述3'剪接位点如[(5' → 3') │的30-聚体小鼠TYR前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。同时，“TYR-ASO 4”与跨越人TYR前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点具有4个错配，如在[(5' → 3') │的30-聚体前mRNA序列中用引号(“ ”)符号标记。
如下评估“TYR-ASO 4”诱导B16F10黑色素瘤细胞中的小鼠TYR外显子2的跳跃的能力。“TYR-ASO 4”可以充当“TYR-ASO 1”的良好替代化合物，其与人TYR前mRNA完全互补。
[细胞培养和ASO处理] 将B16F10小鼠黑色素瘤细胞(目录号CRL-6475，ATCC)在补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素和0.01 mg/ml牛胰岛素的DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle氏基本最小培养基)中维持。将在含有5 mL DMEM的60 mm培养皿中生长的B16F10细胞与0 (阴性对照)、1、10、100或1000 aM的"TYR-ASO 4"孵育5小时。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成] 根据制造商的说明，使用“通用RNA提取试剂盒”(目录号9767, Takara)提取总RNA。使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，针对[TYR-外显子1_正向：(5' →3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; 和TYR-外显子4_反向：(5' → 3') AGAGCGGTATGAAAGGAA]的一组外显子特异性引物，将200 ng RNA模板用于根据以下循环条件的25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在52℃下30秒和在72℃下40秒。
[巢式PCR扩增] 根据以下循环条件，针对[TYR-外显子1n_正向：(5' → 3')GAGAACTAACTGGGGATGA; 和TYR-外显子4n_反向：(5' → 3') CGATAGGTGCATTGGCTT]的一组外显子特异性引物，将1 μL cDNA在20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)中进一步扩增：95℃持续5分钟，随后30个循环的在95℃下30秒、在52℃下30秒和在72℃下40秒。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图52A提供了PCR产物的电泳数据。没有ASO处理的细胞产生两个PCR条带，一个用于全长TYR mRNA，且另一个用于缺乏外显子2和3的剪接变体TYR mRNA，表明外显子2-3的自发跳跃。然而，用1至1,000 aM的“TYR-ASO 4”处理的细胞基本上仅产生缺乏外显子2和3的剪接变体TYR mRNA。因此，“TYR-ASO 4”增加B16F10黑色素瘤细胞中的外显子2-3的跳跃的倾向。
经测序，外显子跳跃的PCR产物为缺乏外显子2-3的mRNA剪接变体，如图52B中所示。
TYR实施例2. 用“TYR-ASO 4”处理的B16F10细胞中的TYR mRNA的qPCR。
如下通过TYR巢式qPCR评估“TYR-ASO 4”诱导B16F10细胞中的小鼠TYR mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的B16F10细胞用0 (阴性对照)、1、10、100或1000 aM的"TYR-ASO 4"处理。(每个剂量2个培养皿)。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成] 如“TYR实施例1”中所述提取总RNA并进行cDNA合成。
[巢式qPCR扩增] 根据以下循环条件，针对靶向外显子2和外显子3的连接的TaqMan探针组(目录号Mm00495818_m1, Thermo Fisher Scientific)，对1 μL稀释100倍的每种cDNA溶液进行20 μL实时PCR反应：95℃持续3分钟，随后为30个循环的在95℃下10秒和在60℃下30秒。
[统计学分析] 将巢式qPCR实验独立重复4次，并将来自各实验的个别mRNA水平针对没有ASO处理的mRNA水平归一化。合并从所有4个独立实验获得的mRNA水平，用于通过student氏t-检验进行统计学分析。因此，每个ASO浓度的RNA样品数目为8。
图52C提供了合并的qPCR数据，其中用1至1,000 aM的“TYR-ASO 4”处理的细胞中的全长mRNA水平显著(student氏t-检验)降低约40%。
TYR实施例3. B16F10细胞中“TYR-ASO 4”对TYR蛋白表达的抑制。
如下所述评估“TYR-ASO 4”抑制B16F10细胞中的TYR蛋白的表达的能力。
在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的B16F10细胞用0 zM(阴性对照)、10zM、100 zM、1 aM或10 aM的“TYR-ASO 4”处理24小时，并用200 μL补充有1X蛋白酶抑制剂混合物(目录号P8340, Sigma)的1X细胞裂解缓冲液(目录号9803, Cell Signaling Tech)进行裂解。将200 μL每种裂解物与100 μL 5X样品缓冲液混合，并在100℃下煮沸5分钟。将20μL每种裂解物在4-15%梯度TGX凝胶(目录号456-1086, Bio-Rad)上进行电泳分离，并将蛋白转移至0.45 μm PVDF膜上。将膜用抗TYR抗体(目录号9319, Cell Signaling Tech)和抗β-肌动蛋白抗体(目录号a3845, Sigma)探测。
图53A提供了用B16F10细胞裂解物获得的TYR western印迹数据。在阴性对照的裂解物中的TYR蛋白水平大幅高于用“TYR-ASO 4”处理的细胞的裂解物。
TYR实施例4. B16F10细胞中“TYR-ASO 4”对黑色素生成的抑制。
如下所述评估“TYR-ASO 4”抑制B16F10细胞中的黑色素生成的能力。
在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的B16F10细胞用0 (阴性对照)或1至1,000 aM的"TYR-ASO 4"或用作为阳性对照的10或100 μg/mL熊果苷处理。(每个剂量2个培养皿) 24小时后，将细胞用200 μL 1N NaOH进行裂解。将每种裂解物收集在1.5 mL e-管中，并在室温下保持过夜。在ELISA阅读器上通过475 nm处的吸光度测定每种裂解物中的黑色素含量。使用不同世代的细胞重复实验四次。合并四组黑色素含量数据，用于通过针对没有处理的黑色素含量(阴性对照)的student氏t-检验进行统计学分析。
图53B概述了与“TYR ASO 4”或熊果苷孵育24小时后B16F10细胞中的黑色素含量的变化。用10 μg/mL和100 μg/mL熊果苷处理的细胞中的黑色素含量分别显著降低约15%和25%。在用“TYR-ASO 4”处理的细胞的情况下，黑色素含量显著降低约15%而没有太大的剂量依赖性。“TYR-ASO 4”的抑制活性与10 μg/mL熊果苷的抑制活性相当。
TYR实施例5. 用“TYR-ASO 1”处理的人黑色素细胞中的TYR mRNA的qPCR。
表10中指定的“TYR-ASO 1”是与跨越人TYR中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点完全互补的13-聚体TYR ASO，所述3'剪接位点如[(5' → 3') │的30-聚体人TYR前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。
如下通过TYR巢式qPCR评估“TYR-ASO 1”诱导人原代表皮黑色素细胞中的TYRmRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将原代表皮黑色素细胞(目录号PCS-200-013, ATCC)细胞在补充有成人黑色素细胞生长试剂盒组分(目录号PCS-200-042, ATCC)的真皮细胞基础培养基(目录号PCS-200-030, ATCC)中维持。在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的黑色素细胞用0 zM(阴性对照)、1 zM、100 zM或10 aM的“TYR-ASO 1”处理。(每个浓度3个培养皿)。
[RNA提取和通过一步PCR的cDNA合成] 在与“TYR-ASO 1”孵育5小时后，根据制造商的说明使用“RNeasy Mini Kit” (目录号74106, Qiagen)提取总RNA。使用具有Platinum® Taq聚合酶的Super Script®一步RT-PCR试剂盒(目录号10928-042, Invitrogen)，针对[TYR-外显子1_正向(2)：(5' → 3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; 和TYR-外显子5_反向：(5'→ 3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT]的一组外显子特异性引物，对200 ng RNA模板进行根据以下指定循环条件的25 μL逆转录反应：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为15个循环的在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 将1 μL cDNA针对[TYR-外显子2n_正向：(5' → 3')GATAAAGCTGCCAATTTC; 和TYR-外显子3n_反向：(5' → 3') TTGTGCATGCTGCTTTGA]的一组外显子特异性引物，针对Taqman探针[(5' → 3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]在20 μL巢式PCR反应(目录号K2612, Bioneer)中进一步扩增。循环条件：95℃持续3分钟，随后为40个循环的在95℃下10秒和在60℃下30秒。
图53C提供了qPCR数据，其中用1 zM至10 aM的“TYR-ASO 1”处理的人黑色素细胞中的全长TYR mRNA水平降低约30%。在用1 zM和10 aM的“TYR-ASO 1”处理的细胞中观察到的降低是显著的(student氏t-检验)。
PD-1 ASO的生物活性的实施例
PD-1，也称为程序性细胞死亡蛋白1或CD279，是在免疫细胞中表达的细胞表面受体。PD-1是参与免疫应答的下调的免疫检查点蛋白。PD-1单克隆抗体诸如尼沃单抗和派姆单抗已被用于通过增加免疫应答来治疗实体瘤。
设计表11中的式I的PD-1 ASO以互补地靶向人或小鼠PD-1前mRNA中的外显子2的3'剪接位点或5'剪接位点。评估PD-1 ASO在Jurkat细胞中的反义外显子跳跃活性，以及在负载同系肿瘤的野生型小鼠中的抗肿瘤活性。本文提供的生物学实施例用于说明作为式I的化合物的实例的PD-1 ASO的外显子跳跃活性，并且因此不应解释为将本发明的范围限制为PD-1 ASO。
PD-1实施例1. 在Jurkat细胞中由“PD-ASO 3”诱导的外显子跳跃。
表11中指定的“PD-ASO 3”是与跨越人PD-1前mRNA中的外显子2和内含子2的连接的5'剪接位点完全互补的14-聚体PD-1 ASO，所述5'剪接位点如[(5' → 3')的30-聚体人PD-1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“PD-ASO 3”具有与外显子2的9-聚体重叠和与内含子2的5-聚体重叠。
如下评估“PD-ASO 3”诱导Jurkat细胞中的人PD-1外显子2的跳跃的能力。
[细胞培养和ASO处理] 将Jurkat细胞(目录号TIB-152, ATCC)在补充有10% FBS和1%链霉素/青霉素的RPMI-1640中维持。在含有5 mL培养基的60 mm培养皿中生长的Jurkat细胞用0 (阴性对照)、10、100或1,000 aM的"PD-ASO 5"处理5小时。
[RNA提取和通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据制造商的说明，使用RNAeasy微量制备试剂盒(Qiagen, USA)提取总RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对一组外显子特异性引物[PD-外显子1_正向：(5' → 3') GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; 和PD-外显子5_反向：(5' → 3') GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]，对500 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应。循环条件：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为30个循环的在94℃下30秒、在53℃下30秒和在72℃下1分钟。
[巢式PCR扩增] 使用以下循环条件，针对一组外显子特异性引物[PD-外显子1n_正向：(5' → 3') GGCTGGCGGCCAGGATGGTTC; 和PD-外显子5n_反向：(5' → 3')GAAAGACAATGGTGGCATACTCC]，将1 μL稀释100倍的cDNA在20 μL巢式PCR (Invitrogen,USA)中进一步扩增：在95℃下20秒，在56℃下30秒，和在72℃下40秒，持续40个循环。
[外显子跳跃产物的鉴定] 将所得巢式PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集靶标大小的条带并通过Sanger测序进行分析。
图54A提供了PCR产物的电泳数据。没有ASO处理的细胞仅产生全长mRNA的PCR产物条带。同时，在用PD-1 ASO处理的细胞中新形成三个PCR产物条带。根据Sanger测序分析，在三个PCR产物条带中，约470 bp大小的条带(在图54A中标记为“非特异性”)不是具有外显子跳跃的PD-1 mRNA剪接变体。
通过Sanger测序，用10和100 aM的“PD-ASO 3”处理的细胞产生对应于外显子2的跳跃的PCR产物条带。然而，在用1,000 aM "PD-ASO 3"处理的细胞中，外显子2跳跃的PCR产物消失，并且全长mRNA水平高于在较低ASO浓度下处理的细胞中的全长水平。指定至外显子2和外显子3的跳跃的两个PCR条带通过Sanger测序证实。(参考图54B) 巢式PCR数据中的倒置剂量响应模式可能是由于通过用“PD-ASO 3”的外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的转录上调。[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264(2015)]。
PD-1实施例2. 用“PD-ASO 3”处理的Jurkat细胞中的PD-1 mRNA的qPCR。
如下通过PD-1巢式qPCR评估“PD-ASO 3”诱导Jurkat细胞中的人PD-1 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在60 mm培养皿中生长的Jurkat细胞用1μg/mL的抗CD3抗体(目录号16-0037, eBioscience)和0.5μg/mL的抗CD28抗体(目录号16-0289,eBioscience)活化48小时。然后将培养基用新鲜培养基替换，并用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的“PD-ASO 3”处理24小时。(每个ASO浓度4个培养皿)。
[RNA提取和通过一步RT-PCR的cDNA合成] 根据制造商的说明，使用RNAeasy微量制备试剂盒(Qiagen, USA)提取总RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen, USA)，针对一组外显子特异性引物[PD-外显子1_正向：(5' → 3') GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; 和PD-外显子5_反向：(5' → 3') GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]，对500 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应。循环条件：50℃持续30分钟和94℃持续2分钟，其随后为30个循环的在94℃下30秒、在53℃下30秒和在72℃下1分钟。
[通过SYBR的巢式qPCR] 根据以下循环条件，针对一组外显子特异性引物[PD-外显子2_正向：(5' → 3') ACAACGCCACCTTCACCTGC; 和PD-外显子2_反向：(5' → 3')GCCAGCTTGTCCGTCTGGTTG]，对1 μL稀释100倍的每种cDNA溶液进行20 μL巢式PCR扩增：在95℃下20秒，在56℃下30秒，和在72℃下40秒，持续40个循环。用SYBR (Bio-Rad, USA)探测qPCR反应。
图55A提供了qPCR数据，其中用10和100 aM的“PD-ASO 3”处理的细胞中的PD-1mRNA水平显著(student氏t-检验)降低> 80%。在用1,000 aM的ASO处理的细胞的情况下，PD-1 mRNA水平反弹至阴性对照水平的约55%。在1,000 aM下的mRNA水平的反弹与“PD-1实施例1”中观察到的倒置剂量响应模式一致。(参考图54A)。
PD-1实施例3. 用“PD-ASO 3”处理的Jurkat细胞中的IL-2 mRNA的qPCR。
已知PD-1活性的下调上调白介素2 (IL-2)的表达。[Am. J. Clin. Oncol. Vol39(1), 98-106 (2016)] 如下通过IL-2巢式qPCR评估“PD-ASO 3”诱导Jurkat细胞中的人IL-2 mRNA水平变化的能力。
[细胞培养和ASO处理] 在60 mm培养皿中生长的Jurkat细胞用1μg/mL的抗CD3抗体(目录号16-0037, eBioscience)和0.5μg/mL的抗CD28抗体(目录号16-0289,eBioscience)活化48小时。然后将培养基用新鲜培养基替换，并用0(阴性对照)、10、100或1,000 aM的“PD-ASO 3”处理24小时。(每个ASO浓度4个培养皿)。
[RNA提取和cDNA合成] 根据制造商的说明，使用RNeasy微量制备试剂盒(Qiagen,USA)提取总RNA。根据制造商的说明，使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(Takara,Japan)，对500 ng RNA模板进行25 μL逆转录反应。
[通过SYBR的qPCR] 根据以下循环条件，针对靶向IL-2 mRNA的一组引物[IL-2_正向：(5' → 3') GTCACAAACAGTGCACCTAC; 和IL-2_反向：(5' → 3') GGTGAGTTTGGGATT-CTTGTA]，对1 μL每种cDNA溶液进行20 μL qPCR扩增：在95℃下20秒，在56℃下30秒，和在72℃下40秒，持续40个循环。用SYBR (Bio-Rad, USA)探测qPCR反应。
图55B提供了IL-2 qPCR数据，其中分别用10、100和1,000 aM的“PD-ASO 3”处理的细胞中的IL-2 mRNA水平显著(student氏t-检验)增加约140%、120%和40%。倒置剂量响应模式与“PD-1实施例1”和“PD-1实施例2”中观察到的倒置剂量响应模式一致。(参考图54A和图55A)。
PD-1实施例4. 用“PD-ASO 1”处理的Jurkat细胞中的PD-1 mRNA的qPCR。
表11中指定的“PD-ASO 1”是与跨越人PD-1前mRNA中的内含子1和外显子2的连接的3'剪接位点完全互补的14-聚体PD-1 ASO，所述3'剪接位点如[(5' → 3')的30-聚体人PD-1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“PD-ASO 1”具有与内含子1的5-聚体重叠和与外显子2的9-聚体重叠。
除非另有说明，否则如“PD-1实施例2”中所述通过PD-1巢式qPCR评估"PD-ASO 1"诱导Jurkat细胞中的人PD-1 mRNA水平的变化的能力。
图56A提供了qPCR数据，其中用100和1,000 aM的“PD-ASO 1”处理的细胞中的PD-1mRNA水平显著(student氏t-检验)降低约60%。与“PD-ASO 3”的情况不同，“PD-ASO 1”显示没有倒置剂量响应模式的明显迹象。
PD-1实施例5. “PD-ASO 2”针对C57BL/6小鼠中的B16F10黑色素瘤的抗肿瘤活性。
表11中指定的“PD-ASO 2”是与跨越小鼠PD-1前mRNA中的外显子2和内含子2的连接的5'剪接位点完全互补的16-聚体PD-1 ASO，所述5'剪接位点如[(5' → 3')的30-聚体小鼠PD-1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“PD-ASO 2”具有与外显子2的10-聚体重叠和与内含子2的6-聚体重叠。
同时，“PD-ASO 2”与人PD-1前mRNA具有四个错配，如在[(5' → 3')(其中四个错配用引号(" ")符号标记)的30-聚体人PD-1前mRNA序列中标记为“粗体”和“下划线”。“PD-ASO 2”可以用作人PD-1前mRNA的“PD-ASO 3”的替代ASO。
评估“PD-ASO 2”在注射B16F10黑色素瘤细胞的雄性C57BL/6小鼠(4周龄)中的抗肿瘤活性，如下所提供。
[B16F10黑色素瘤细胞的接种] 将B16F10小鼠黑色素瘤细胞(目录号CRL-6475,ATCC)在含有补充有10% FBS、1%链霉素/青霉素和0.01 mg/ml牛胰岛素的DMEM的150mm培养皿中维持。在第0天，将溶解于50 μL PBS中的约1x105个B16F10细胞注射至每只动物的右后侧腹中。
[分组和ASO处理] 在第3天，将动物按重量随机分配至0(阴性对照)、2、10和50pmol/Kg "PD-ASO 2"的4个组。(每组N = 15)。
对于阴性对照、2、10和50 pmol/Kg "PD-ASO 2"，分别通过将"PD-ASO 2"的水性母液储备溶液在PBS中连续稀释至0 nM(仅PBS)、0.4 nM、2 nM和12.5 nM “PD-ASO 2”来制备注射溶液。
在第3天至第17天期间，以5 mL/Kg向动物皮下施用注射溶液，每周2次。
[抗肿瘤活性] 通过每个ASO处理组和阴性对照组之间的肿瘤体积的变化评价抗肿瘤活性。
图56B提供了在第0天至第19天期间观察到的分组肿瘤体积。在第10天至第19天期间，2 pmol/Kg中的肿瘤生长被显著抑制。在第19天观察到的抑制为约55%(对于2 pmol/Kg和阴性对照组分别为约375 mm3和850 mm3)。在第10天至第17天期间，50 pmol/Kg组的抗肿瘤活性与2 pmol/Kg组的抗肿瘤活性相当。然而，在第19天，50 pmol/Kg组的抗肿瘤活性消失。10 pmol/Kg组的抗肿瘤活性在整个时段都是微不足道的，且没有显著性。
奇怪的剂量响应模式可能是由于通过用“PD-ASO 2”的外显子跳跃期间累积的“外显子内含子环状RNA (EIciRNA)”的转录上调。[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3),256-264 (2015)] 然而，考虑到由US FDA批准的PD-1单克隆抗体药物尼沃单抗，在肿瘤患者中显示钟形的剂量响应模式[J. Clin. Oncol. Vol 33(18), 2013-2020 (2015)]，“PD-ASO 2”的奇怪的剂量响应模式可能是由于PD-1抑制的内在药理学。
在第19天，处死动物以按组测量肿瘤重量。对于2 pmol/Kg组和阴性对照组，平均肿瘤重量分别为约0.35 g和1.20 g。因此，在2 pmol/Kg组中，肿瘤生长按重量显著抑制约70%。(通过student氏t-检验，p <0.01)。

Claims (14)

1.由式I代表的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10和25之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地代表氘[D]，氢[H]，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
X和Y独立地代表氢，甲酰基[H-C(=O)-]，氨基羰基[NH2-C(=O)-]，氨基硫代羰基[NH2-C(=S)-]，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的芳基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，取代或未取代的芳基氨基羰基，取代或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代或未取代的芳基氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基氧基硫代羰基，取代或未取代的芳基氧基硫代羰基，取代或未取代的烷基磺酰基，取代或未取代的芳基磺酰基，取代或未取代的烷基膦酰基，或取代或未取代的芳基膦酰基基团；
Z代表氢，羟基，取代或未取代的烷基氧基，取代或未取代的芳基氧基，未取代的氨基[-NH2]，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的芳基氨基，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；且
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自非天然核碱基，其具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基基团。
2.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10和25之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn独立地代表氘，氢，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
X和Y独立地代表氢，甲酰基，氨基羰基，氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的芳基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，取代或未取代的芳基氨基羰基，取代或未取代的烷基氨基硫代羰基，取代或未取代的芳基氨基硫代羰基，取代或未取代的烷基氧基硫代羰基，取代或未取代的芳基氧基硫代羰基，取代或未取代的烷基磺酰基，取代或未取代的芳基磺酰基，取代或未取代的烷基膦酰基基团，或取代或未取代的芳基膦酰基基团；
Z代表氢，羟基，取代或未取代的烷基氧基，取代或未取代的芳基氧基，未取代的氨基，取代或未取代的烷基氨基，取代或未取代的芳基氨基，取代或未取代的烷基，或取代或未取代的芳基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基：
其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
L1、L2和L3是由式V代表的共价接头，其将碱性氨基基团共价连接至核碱基部分：
其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧(-O-)、硫(-S-)和取代或未取代的氨基基团[-N(H)-，或–N(取代基)-]；且
m是1和15之间的整数。
3.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和23之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，氨基羰基，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基，氧和氨基基团；且
m是1和11之间的整数。
4.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和21之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补，或与靶标前mRNA序列部分互补且具有一个或两个错配；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢，和取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基，氧和氨基基团；且
m是1和11之间的整数。
5.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11和19之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表氢，取代或未取代的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，取代或未取代的烷基氧基羰基，取代或未取代的烷基氨基羰基，或取代或未取代的芳基磺酰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢基团，且R2、R4和R6独立地代表氢，或取代或未取代的烷基基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；且
m是1和9之间的整数。
6.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是12和19之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X和Y独立地代表取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，或取代或未取代的烷基氧基羰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基团；
Q1和Qm是亚甲基基团，且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、…、和Qm-1独立地选自亚甲基和氧基团；且
m是1和9之间的整数。
7.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药用盐：
其中，
n是12和18之间的整数；
式I的化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成；
式I的化合物与靶标前mRNA序列完全互补；
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1和Tn是氢基团；
X是氢基团；
Y代表取代或未取代的烷基酰基，取代或未取代的芳基酰基，或取代或未取代的烷基氧基羰基基团；
Z代表未取代的氨基，或取代或未取代的烷基氨基基团；
B1、B2、…、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、…、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV代表的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基团；
L1代表-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、-CH2-O-(CH2)5-、-CH2-O-(CH2)6-或-CH2-O-(CH2)7-，其中右末端直接连接至碱性氨基基团；且
L2和L3独立地选自-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-和-(CH2)2-O-(CH2)3-，其中右末端直接连接至碱性氨基基团。
8.通过使用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物，在细胞中诱导所述肽核酸衍生物的靶标前mRNA内的靶标外显子的跳跃的方法。
9.通过施用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物，在受试者中诱导所述肽核酸衍生物的靶标前mRNA内的靶标外显子的跳跃的方法。
10.通过施用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物，治疗涉及所述肽核酸衍生物的靶标基因的的表达的疾病或病况的方法。
11.通过使用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物，在细胞中调节所述肽核酸衍生物的靶标基因的功能活性的方法。
12.通过施用根据权利要求1所述的肽核酸衍生物，在受试者中调节所述肽核酸衍生物的靶标基因的功能活性的方法。
13.权利要求1-7中任一项的化合物，其中所述化合物与14-聚体靶标剪接位点序列具有至少10-聚体互补重叠，所述14-聚体靶标剪接位点序列由来自靶标前mRNA内的内含子的7-聚体和来自靶标前mRNA内的外显子的7-聚体组成，其中所述靶标剪接位点序列不是人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3') UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3')UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3') AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU]。
14.权利要求1-7中任一项的化合物，其中所述化合物与靶标前mRNA内的靶标剪接位点具有至少10-聚体互补重叠，其中所述靶标剪接位点序列不包含人雄激素受体前mRNA内的[(5' → 3') UUGCCUGGUAAGGA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UUUUUGCGUAAGUA]，人HNA-1α前mRNA内的[(5' → 3') UAAGUAGGAUAAGU]，人SNAP25前mRNA内的[(5' → 3')AUCCCAGGGUAACA]，人SCN9A前mRNA内的[(5' → 3') UGUUUAGGUACACU]，或人酪氨酸酶前mRNA内的[(5' → 3') UGUACAGAUUGUCU]。
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