CN110484563B - 哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用，该表达载体上插入有ARE序列、IRES序列、WPRE序列以及筛选标记基因序列，所述ARE序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，所述IRES序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，组合表达载体的结构为：ARE‑启动子‑目的基因‑WPRE‑IRES‑BSR‑PolyA。该载体利用抗阻遏元件进行载体不同元件的优化组合，一方面克服转基因沉默，另一方面使目的基因在宿主细胞中高效、持久、稳定表达。

Description

哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞组合表达载体，同时还涉及包含该表达载体的表达系统、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

重组蛋白是运用基因工程技术、通过将目的基因构建到表达载体，在异源细胞实现目的表达产生的蛋白。重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核蛋白表达、酵母蛋白表达、昆虫细胞蛋白表达及哺乳动物细胞蛋白表达。结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质，在重组蛋白生产中发挥着至关重要的作用，是当前重组药物蛋白生产中最为常用的表达系统。由于E.coli原核表达系统及低等真核生物表达系统如酵母缺乏复杂的翻译后修饰功能，因此重组蛋白药物需要在高等哺乳动物细胞中表达以具备活性。目前近70%采用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞表达系统。但是由于转基因沉默（Transgene silencing）导致的目的基因表达水平低下已经成为CHO细胞表达系统的瓶颈技术，此外还存在高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。

近年来，围绕着提高哺乳动物细胞重组蛋白的表达，研究者进行了许多有益的尝试，其中进行载体的优化是一种有效的策略，如构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、核基质结合区、或在转基因操作时进行去甲基化处理等。但目前的载体优化大多数集中在某一元件的功能鉴定和研究，如公开号为CN104975018A的发明专利公开了一种新型增强子及其应用，该增强子特别适用于CHO细胞，在动物细胞中的外源蛋白表达量获得大幅提升，表达水平提高了约2～3倍，如公开号为201410129979.2的发明专利公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体，其两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的质粒特别适用于CHO细胞，与不含两端加有人工转录因子结合位点的核基质结合区元件MAR核心片段的质粒相比，动物细胞中的外源蛋白的表达量获得大幅提高，表达量提高了10-17倍。但是这些元件在提高转基因表达水平方面仍不尽理想，另外表达载体不同元件之间具有匹配性，如MAR序列和不同启动子进行组合，其提高CHO细胞目的基因表达的水平存在差异（Ho SC, Mariati, Yeo J H, Fang S G, YangY. Impact of using differentpromoters and matrix attachment regions on recombinant protein expressionlevel and stability in stably transfected CHO cells.Mol Biotechnol. 2015;57(2):138-44），因此需要在载体不同元件之间进行优化组合，筛选出高效表达载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体，能使目的基因在宿主细胞中高效、长期、稳定表达。

本发明的另一目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种哺乳动物细胞组合表达载体的真核细胞表达系统，制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种哺乳动物细胞组合表达载体，所述表达载体上插入有如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的抗阻遏元件序列（anti-repressor elements，ARE）、如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的内核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）、如SEQ ID NO:7所示的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）以及筛选标记基因序列；所述ARE序列位于启动子上游，所述WPRE序列位于目的基因下游，所述筛选标记基因位于所述IRES序列下游，所述目的基因位于启动子与IRES序列之间。

进一步地，所述筛选标记基因序列选自如SEQ ID NO:8所示的杀稻瘟菌素抗性基因序列（blasticidin resistance，BSR）。

进一步地，所述表达载体的出发载体为pIRES-neo2或pIRES-neo3。

本发明提供上述哺乳动物细胞组合表达载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：PCR扩增EGFP，分别双酶切EGFP报告基因扩增产物及出发载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体I ；

步骤b：分别双酶切ARE序列和表达载体I，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体II；

步骤c：将IRES序列无缝克隆到表达载体II，得到表达载体III；

步骤d：分别双酶切WPRE序列和表达载体III，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体IV；

步骤e：将筛选标记基因序列无缝克隆到表达载体IV，得到哺乳动物细胞组合表达载体V。

本发明提供包含上述哺乳动物细胞组合表达载体的真核细胞表达系统。

本发明还提供上述真核细胞表达系统的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：将目的基因插入上述组合表达载体的启动子与IRES序列之间，构建得到重组表达载体；

步骤b：将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到表达系统。

上述宿主细胞选自DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S等中的任意一种。优选为CHO-S细胞。上述转染的方法包括磷酸钙法、电转法、脂质体转染法等，优选为电转法。

上述哺乳动物细胞组合表达载体、真核细胞表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明组合表达载体上插入有抗阻遏元件序列、内核糖体进入位点序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件和杀稻瘟菌素抗性基因（筛选标记基因），表达载体的结构为：ARE-启动子-目的基因-WPRE-IRES-BSR-polyA。该载体利用抗阻遏元件进行载体不同元件的优化组合，一方面克服转基因沉默，另一方面可以使目的基因在宿主细胞中高效、持久、稳定表达。同等条件下，与不含ARE序列以及优化之前的表达载体相比，本发明组合表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产。

附图说明

图1为实施例1中出发载体pIRES-neo2的质粒图谱。

图2为实施例1中哺乳动物细胞组合表达载体pIRES-4的质粒图谱。

图3为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的稳定表达水平。

图4为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的长期表达水平。

图5为ELISA检测乙肝疫苗在不同表达载体中的表达水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例及试验例中所用的质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司（货号：CW0500S）；无缝克隆试剂盒购自碧云天生物公司（货号：D7010S），工具酶、培养基等均为市售商品；pIRES-neo2、pEGFP-C1质粒购自美国Clontech生物公司。实施例及试验例中所用细胞系、质粒载体、试剂、工具酶等均为市售商品。

实施例一 构建哺乳动物细胞组合表达载体

本实施例为含有人工合成的ARE-1、IRES-1、WPRE、BSR序列的组合表达载体的构建，包括以下步骤：

1.1构建含EGFP报告基因的表达载体pIRES-EGFP

（1）EGFP报告基因扩增

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein（EGFP）基因序列（GenBank：U55763.1，第613~1410位碱基）设计上游引物P-F和下游P-R，引物的5′端分别引入Not I、EcoRI酶切位点，引物序列如下所示（下划线处为酶切位点）：

P-F：5′-CCGGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P-R：5′-CTAGAATTCTTACTAGATCCGGTGGATCC-3′。

以pEGFP-C1载体为模板，使用引物P-F、P-R扩增EGFP基因。PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR反应体系	试剂浓度	终浓度	体积(μL)
				10×PCRbuffer	10×	1×	2.5
引物P-F	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
				引物P-R	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
dNTP	25μmol/L	200μmol/L	2.0
				模板DNA	100ng/μL	4.0ng/μL	1.0
Taq酶	5U/μL	0.1U/μL	0.5
				<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	/	/	17

反应程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸40s，每个退火温度4个循环；最后55℃退火1min，共30个循环，72℃延伸3min；4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

（2）构建含EGFP序列和出发载体pIRES-neo2的表达载体pIRES-EGFP

用Not I、EcoRI双酶切EGFP的PCR扩增产物（经测序验证正确的序列），同时用NotI、EcoRI双酶切出发载体pIRES-neo2的DNA（pIRES-neo2质粒图谱见图1），琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和出发载体pIRES-neo2的DNA 。

EGFP序列的酶切体系为：10×NE Buffer 3.1 3μL，Not I/Bam HI（10U/μL）各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3h。

出发载体pIRES-neo2的酶切体系为：10×NE Buffer 3.1 2μL，Not I/Bam HI（10U/μL）酶各0.5μL，0.81μg/μL pIRES-neo2的DNA1.23 μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

用T4连接酶连接酶切后的EGFP序列片段和出发载体pIRES-neo2。

出发载体pIRES-neo2的连接体系为：2×Quick Ligation Buffer10μL，pIRES-neo2的线性DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL的T4连接酶1μL，补足水至20μL，16℃连接过夜。

将连接产物加入大肠杆菌（E.coli）JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒，用Not I/Bam HI双酶切细菌质粒，酶切体系为：10×NE Buffer 3.1 2μL，NotI/Bam HI（10U/μL）酶各0.5μL，0.81μg/μL pIRES-neo2的DNA1.23 μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。核酸电泳验证，酶切正确的条带大小为720bp，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，最后获得正确的表达载体I，本实施例命名为pIRES-EGFP。

1.2构建含ARE-1序列的表达载体pIRES-1

设计并人工合成ARE-1序列（如SEQ ID NO:1所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。为便于克隆及保证序列完整性，合成ARE-1序列时，5'端引入GTCTCGCGA序列，其中GTC为保护碱基，TCGCGA为NruI酶切位点；3′端引入AGCACGCGT，其中AGC作为酶切的保护碱基，ACGCGT为MluI酶切位点。

用NruI/MluI双酶切合成的ARE-1序列，同时用NruI/MluI双酶切pIRES-EGFP载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的ARE-1序列片段和pIRES-EGFP线形质粒DNA。

ARE-1序列的双酶切体系为：ARE-1序列10μL（1μg/μL），10×NE Buffer 3.1 3μL，NruI/MluI（10U/μL）各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

pIRES-EGFP载体的双酶切体系为：pIRES-EGFP质粒5μL（1μg/μL），10×NE Buffer3.1 2μL，NruI/MluI（10U/μL）各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的ARE-1序列片段和pIRES-EGFP线形质粒DNA（摩尔比5:1），使用NEB公司™的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切（NruI/MluI）验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，得到构建正确的表达载体II，本实施例命名为pIRES-1。

1.3构建含IRES-1序列的表达载体pIRES-2（替换pIRES-1载体上的IRES序列）

（1）合成IRES-1序列

设计并人工合成IRES-1序列（如SEQ ID NO:4所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。

（2）构建表达载体pIRES-2

采用无缝克隆试剂盒将pIRES-1载体的IRES序列核苷酸序列替换为IRES-1构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，得到构建正确的表达载体III，本实施例命名为pIRES-2。

1.4构建含WPRE序列的表达载体pIRES-3

（1）合成WPRE序列

设计并人工合成WPRE序列（如SEQ ID NO:7所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。为便于克隆及保证序列完整性，合成WPRE序列时，5'端引入CCGGAATTC序列，其中CCG为保护碱基，GAATTC为EcoRI酶切位点；3′端引入CTAGGATCC，其中CTA作为酶切的保护碱基，GGATCC为BamHI酶切位点。

（2）构建表达载体pIRES-3

用EcoRI/BamHI双酶切合成的WPRE序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切pIRES-2载体DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的WPRE序列片段和pIRES-2载体DNA。

WPRE序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-2载体的酶切体系为：10×K buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL pIRES-2的DNA 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

用T4连接酶连接酶切后的WPRE序列片段和pIRES-2载体。

pIRES-2载体的连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-2的线性DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL的T4连接酶1μL，补足水至20μL，16℃连接过夜。

将连接产物加入大肠杆菌（E.coli）JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒，用EcoRI和BamHI双酶切细菌质粒，酶切体系为：10×K buffer 2μL，10U/μL的EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL连接载体的DNA 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

核酸电泳验证，酶切正确的条带大小为720bp，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，最后获得正确的表达载体IV，本实施例命名为pIRES-3。

1.5构建含BSR序列的表达载体pIRES-4

（1）合成BSR序列

设计并人工合成BSR序列（如SEQ ID NO:8所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。

（2）构建哺乳动物细胞组合表达载体pIRES-4

采用无缝克隆试剂盒将人工合成BSR序列插入到pIRES-3载体，替换pIRES-3载体上的筛选标记基因序列为杀稻瘟菌素抗性基因BSR序列；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，得到构建正确的表达载体V，本实施例命名为pIRES-4（质粒图谱见图2）。在组合表达载体pIRES-4中启动子与IRES-1序列之间插入目的基因后得到的哺乳动物细胞组合表达载体结构为：（ARE-1）-启动子-目的基因-WPRE-（IRES-1）-BSR-PolyA。

实施例二 构建真核细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5%CO₂条件下，在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞（3×106/孔）。铺板培养24h后细胞达到约90%融合度时进行转染。以Lipo3000（Lipofectamine®3000）为转染试剂，将实施例一得到的组合表达载体pIRES-4转染进入CHO细胞中，转染24h后，用浓度为800μg/mL的G418筛选2周出现阳性克隆时，将浓度为800μg/mL的G418更换为400μg/mL浓度的G418稳定培养1个月，即得哺乳动物宿主细胞CHO。

实施例三 哺乳动物来源蛋白质的表达方法

3.1构建包含EGFP基因序列以及人工合成的ARE-1、IRES-1、WPRE、BSR的核苷酸序列的组合表达载体pIRES-4，构建方法同实施例一。

3.2将组合表达载体pIRES-4转染进入哺乳动物宿主细胞CHO中，转染方法和上述哺乳动物宿主细胞的实施例二中的转染方法相同。

3.3培养CHO细胞，表达目的蛋白。

试验例1

设计并人工合成ARE-2序列（如SEQ ID NO:2所示）、ARE-3序列（如SEQ ID NO:3所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。

设计并人工合成IRES-2序列（如SEQ ID NO:5所示）、IRES-3序列（如SEQ ID NO:6所示），具体交由通用生物基因（安徽）有限公司完成。

哺乳动物细胞组合表达载体的对比例1：参照实施例一中步骤1.2，采用NruI/MluI双酶切，将pIRES-1载体的ARE-1序列替换为ARE-2（如SEQ ID NO：2所示）构成新的表达载体；用NruI/MluI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体II，命名为pIRES-1A；其他同实施例一。

哺乳动物细胞组合表达载体的对比例2：参照实施例一中步骤1.2，采用NruI/MluI双酶切，将pIRES-1载体的ARE-1序列替换为ARE-3（如SEQ ID NO：3所示）构成新的表达载体；用NruI/MluI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体II，命名为pIRES-1B；其他同实施例一。

哺乳动物细胞组合表达载体的对比例3：参照实施例一中步骤1.3，采用无缝克隆试剂盒将pIRES-2载体的IRES-1序列替换为IRES-2（如SEQ ID NO：5所示）构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体III，命名为pIRES-2A；其他同实施例一。

哺乳动物细胞组合表达载体的对比例4：参照实施例一中步骤1.3，采用无缝克隆试剂盒将pIRES-2载体的IRES-1核苷酸序列替换为IRES-3（如SEQ ID NO：6所示）构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体III，命名为pIRES-2B；其他同实施例一。

哺乳动物宿主细胞的对比例1：将构建哺乳动物宿主细胞的实施例二中的表达载体pIRES-1替换为哺乳动物细胞组合表达载体的对比例1中的表达载体pIRES-1A，其他同实施例二。在启动子与IRES-1序列之间插入目的基因后所得哺乳动物细胞组合表达载体结构为：（ARE-2）-启动子-目的基因-WPRE-（IRES-1）-BSR-PolyA。

哺乳动物宿主细胞的对比例2：将构建哺乳动物宿主细胞的实施例二中的表达载体pIRES-1替换为哺乳动物细胞组合表达载体的对比例1中的表达载体pIRES-1B，其他同实施例二。在启动子与IRES-1序列之间插入目的基因后所得哺乳动物细胞组合表达载体结构为：（ARE-3）-启动子-目的基因-WPRE-（IRES-1）-BSR-PolyA。

哺乳动物宿主细胞的对比例3：将构建哺乳动物宿主细胞的实施例二中的表达载体pIRES-2替换为哺乳动物细胞组合表达载体的对比例1中的表达载体pIRES-2A，其他同实施例二。在启动子与IRES-2序列之间插入目的基因后所得哺乳动物细胞组合表达载体结构为：（ARE-1）-启动子-目的基因-WPRE-（IRES-2）-BSR-PolyA。

哺乳动物宿主细胞的对比例4：将构建哺乳动物宿主细胞的实施例二中的表达载体pIRES-2替换为哺乳动物细胞组合表达载体的对比例1中的表达载体pIRES-2B，其他同实施例二。在启动子与IRES-3序列之间插入目的基因后所得哺乳动物细胞组合表达载体结构为：（ARE-1）-启动子-目的基因-WPRE-（IRES-3）-BSR-PolyA。

将实施例1中得到的表达载体pIRES-1、pIRES-2、pIRES-3、pIRES-4，及表达载体的对比例1~4中表达载体pIRES-1A、pIRES-1B、pIRES-2A、pIRES-2B分别转染进入CHO细胞，具体步骤如下：

（1）细胞转染

CHO细胞于37℃、5%的CO₂条件下，在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞（3×106/孔）。铺板培养24h后细胞达到约90%融合度。

试验共分为10组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染对照载体pIRES-EGFP；③转染表达载体pIRES-1；④转染表达载体pIRES-1A；⑤转染表达载体pIRES-1B；⑥转染表达载体pIRES-2；⑦转染表达载体pIRES-2A；⑧转染表达载体pIRES-2B；⑨转染表达载体pIRES-3；⑩转染表达载体pIRES-4。以Lipo 3000（Lipofectamine®3000）为转染试剂，将各试验组载体转染进入CHO细胞中。

（2）稳定转染细胞系的筛选

转染24h后，再将各试验组载体分别转染培养于24孔板（500μL/well）的CHO细胞中（CHO的细胞个数约为2×106个），①~⑧组用浓度为800μg/mL的G418筛选2周出现阳性克隆时，将浓度为800μg/mL的G418更换为400μg/mL浓度的G418稳定培养1个月，然后收集各试验组细胞进行流式细胞检测。⑨~⑩组使用浓度为15μg/mL的杀稻瘟菌素筛选1周后出现阳性克隆（筛选时间缩短1周），将浓度为15μg/mL的杀稻瘟菌素更换为10μg/mL浓度的杀稻瘟菌素稳定培养1个月，然后收集各试验组细胞进行流式细胞检测。

（3）对EGFP基因稳定表达的影响

①~⑧组用含浓度为500μg/mL G418的培养基、⑨~⑩组使用浓度10μg/mL浓度的杀稻瘟菌素传代培养筛选获得的多克隆CHO细胞30天后，收集各试验组细胞进行流式细胞检测，结果见图3。由3可知，在相同的条件下，与对照载体pIRES-EGFP的平均表达量相比，pIRES-1、pIRES-1A、pIRES-1B、pIRES-2、pIRES-2A、pIRES-2B、pIRES-3、pIRES-4载体分别提高2.87、2.15、1.76、3.24、2.65、2.31、3.74、4.58倍，表达趋势为pIRES-4>pIRES-3>pIRES-2A>pIRES-2B>pIRES-1>pIRES-1A>pIRES-1B，即pIRES-4表达量最高，比最初原始载体pIRES-EGFP提高4.58倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。

（4）对EGFP长期表达的影响

筛选获得的多克隆CHO细胞30天后，继续培养到180天，收集各试验组细胞进行流式细胞检测，分析不同表达载体对重组目的基因长期表达的影响，结果见图4。

由图4可知，与对照载体pIRES-EGFP相比，pIRES-1、pIRES-1A、pIRES-1B、pIRES-2、pIRES-2A、pIRES-2B、pIRES-3、pIRES-4载体中，只有pIRES-1B、pIRES-2A两个表达载体EGFP基因的表达稳定性低于对照载体pIRES-EGFP，其余6个载体都能在一定程度上提高EGFP基因的稳定表达，其中pIRES-4载体EGFP基因表达最稳定，保持率高达87.6%，比对照载体pIRES-EGFP稳定表达增加1.39倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。

试验例2

本试验例中乙肝疫苗基因（GenBank: V00867.1）合成由通用生物基因（安徽）有限公司完成合成。

（1）构建含乙肝疫苗目的基因的重组表达载体

用EcoRI/BamHI双酶切人工合成的乙肝疫苗基因序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切表达载体pIRES-EGFP、pIRES-1、pIRES-2、pIRES-3、pIRES-4。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的乙肝疫苗基因序列片段和pIRES-1、pIRES-2、pIRES-3、pIRES-4的线形质粒DNA。

乙肝疫苗基因序列的双酶切体系为：乙肝疫苗序列片段10μL（1μg/μL），10×NEBuffer2.13μL，EcoRI/BamHI酶（10U/μL）各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

质粒的双酶切体系为：质粒15μL（1μg/μL），10×NE Buffer2.12μL，EcoRI/BamHI（10U/μL）各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的乙肝疫苗基因序列片段和线形质粒DNA（摩尔比5:1），使用NEB公司™的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌（E.coli）JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组表达载体并进行双酶切（EcoRI/BamHI）验证，取酶切验证正确的载体进行测序验证，最后获得正确的组合表达载体，含表达载体pIRES-EGFP、pIRES-1、pIRES-2、pIRES-3、pIRES-4的组合表达载体分别命名为pIRES-EH、pIRES-1H、pIRES-2H、pIRES-3H、pIRES-4H。

（2）细胞转染及稳定转染细胞系的筛选

1）细胞转染

CHO细胞于37℃、5%CO₂条件下，在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞（3×106/孔）。铺板培养24h后细胞达到约90%融合度。试验共分为6组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染对照载体pIRES-EH；③转染重组载体pIRES-1H；④转染重组载体pIRES-2H；⑤转染重组表达载体pIRES-3H；⑥转染重组表达载体pIRES-4H。以Lip3000（Lipofectamine®3000）为转染试剂，将各试验组载体共转染进入CHO细胞中。

2）稳定转染细胞系的筛选

载体共转染培养于24孔板（500μL/well）的CHO细胞中（CHO的细胞个数约2×106个），用浓度为800μg/mL的G418筛选2周，当阳性克隆出现时，换浓度为400μg/mL的G418稳定培养2周后，每毫升接种细胞量为50~60万，摇床转速设置为110-120 rpm/min，悬浮培养第7天收集培养液上清。

（3）乙肝疫苗表达量检测

用ELISA试剂盒检测乙肝疫苗表达量。结果见图5。由图5可知，含组合表达载体pIRES-EH、pIRES-1H、pIRES-2H、pIRES-3H、pIRES-4H的乙肝疫苗的表达量分别为9.21μg/d/106 cells、24.04μg/d/106 cells、28.73μg/d/106 cells、33.62μg/d/106 cells、38.96μg/d/106 cells。与对照组pIRES-EH相比，含组合表达载体pIRES-1H、pIRES-2H、pIRES-3H、pIRES-4的乙肝疫苗表达量提高了2.61、3.12、3.65、4.23倍，即本发明的表达载体可以显著提高外源蛋白在动物细胞中的表达量。

未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning:a laboratory manual. 2001），或者产品制造厂商提供的说明书等。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡医学院 华兰生物疫苗有限公司

<120> 哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用

<130> 2019

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2101

<212> DNA

<213> ARE-1

<400> 1

aggtgggtgg atcacccgag gtcaggagtt caagaccagc ctggccaaca tggtaaaacc 60

tcgtctctac taaaaaatac gaaaaattag ctggttgtgg tggtgcgtgc ttgtaatccc 120

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acttagctta actttcataa tgcatctgtc tggcctaaga cgtggtgagc tttttatgtc 420

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gcagtgacca agaaaatagc actaggagaa agctggtcca tgagcagctg gtgagaaaag 1140

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tttattttta ttattattgt tattatgtcc agtctcactc tgtcgcctaa gctggcatga 2100

t 2101

<210> 2

<211> 1586

<212> DNA

<213> ARE-2

<400> 2

tgagttgggg tcctaagcca gaagttaact atgctttcat atattcttgc aagtagaagt 60

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cacatacaca cataaataat acttaaattt ttcaatgatg ttccaattat gtaaaatata 1020

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<210> 3

<211> 1031

<212> DNA

<213> ARE-3

<400> 3

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<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> IRES-1

<400> 4

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<210> 5

<211> 580

<212> DNA

<213> IRES-2

<400> 5

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<210> 6

<211> 221

<212> DNA

<213> IRES-3

<400> 6

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gtgtgagagg gaagcgccgc ggcctgtatt tctagacctg cccttcgcct ggttcgtggc 120

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<210> 7

<211> 621

<212> DNA

<213> WPRE

<400> 7

gacctcgagg gaattccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 60

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ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 360

gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga 420

cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 480

gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 540

tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 600

cctccccgca tcgggaattc g 621

<210> 8

<211> 399

<212> DNA

<213> BSR

<400> 8

atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc 60

aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc 120

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gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240

aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300

catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360

cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaa 399

Claims (7)

1.一种哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述表达载体上插入有如SEQ IDNO:1所示的ARE序列、如SEQ ID NO:4所示的IRES序列、如SEQ ID NO:7所示的WPRE序列以及筛选标记基因序列；所述ARE序列位于启动子上游，所述WPRE序列位于目的基因下游，所述筛选标记基因位于所述IRES序列下游，所述目的基因位于启动子与IRES序列之间，所述表达载体结构为ARE-启动子-目的基因-WPRE-IRES-BSR-PolyA；所述目的基因为乙肝疫苗基因；所BSR为杀稻瘟菌素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因序列选自如SEQ ID NO:8所示的BSR序列。

3.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞组合表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pIRES-neo2或pIRES-neo3。

4.权利要求1~3任一项所述的哺乳动物细胞组合表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：PCR扩增EGFP，分别双酶切EGFP报告基因扩增产物及出发载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体I；

步骤b：分别双酶切ARE序列和表达载体I，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体II；

步骤c：将IRES序列无缝克隆到表达载体II，得到表达载体III；

步骤d：分别双酶切WPRE序列和表达载体III，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到表达载体IV；

步骤e：将筛选标记基因序列无缝克隆到表达载体IV，得到哺乳动物细胞组合表达载体V。

5.包含权利要求1~3任一项所述哺乳动物细胞组合表达载体的真核细胞表达系统。

6.权利要求5所述真核细胞表达系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：将目的基因插入权利要求1~3任一项所述组合表达载体的启动子与IRES序列之间，构建得到重组表达载体；

步骤b：将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到表达系统。

7.权利要求1~3任一项所述哺乳动物细胞组合表达载体、权利要求5所述真核细胞表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。

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