CN110402392A

CN110402392A - 诊断方法和用于诊断的系统

Info

Publication number: CN110402392A
Application number: CN201880015488.1A
Authority: CN
Inventors: 雷内·雷蒙德·帕钦; 瑟法斯·安东尼·摩尔
Original assignee: BIOSPARQ BV
Current assignee: BIOSPARQ BV
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2019-11-01
Also published as: BR112019018198A2; JP2020510829A; EP3589953A1; NL2019320B1; US20200232984A1

Abstract

用于诊断生物体中的微生物感染的方法，使用该方法，所述微生物感染至少部分地在生物体的细胞物质中作为原体(elementary body)存在。该方法包括以下步骤：(1)提供来自生物体的细胞物质的样品；(2)处理样品以获得富集了原体的测试组合物，只要样品包含任何原体；以及(3)使一定体积的包含至多预先确定的最大数目的原体的测试组合物经历MALDI质谱分析方法以鉴定微生物感染的存在。样品处理更特别地涉及细胞裂解和从裂解的细胞物质分离原体。随后，使原体(和附着至其的任何其他物质)与基质材料接触，促进MALDI质谱分析。

Description

诊断方法和用于诊断的系统

发明领域

本发明涉及一种用于诊断生物体中的微生物感染的方法，其中所述微生物感染至少部分地在生物体的细胞环境中作为包涵体存在。

本发明还涉及一种用于诊断的系统。

发明背景

微生物感染导致对生物体诸如哺乳动物并且更特别地对人类的健康的威胁。多种诊断方法可用于鉴定这样的感染。然而，这样的鉴定可能是费力的。此外，微生物感染可以是无症状的，使得被感染的宿主生物体没有意识到感染。这使得感染扩散。此外，一些微生物感染以细胞内感染存在。

广义上，特定类别的感染至少部分地以包涵体存在。这样的包涵体是可染色物质(通常是蛋白)的核聚集物或细胞质聚集物。包涵体通常代表病毒或细菌繁殖的部位。在多种情况中，特别地在衣原体属(Chlamydia)和嗜衣原体属(Chlamydophila)的情况中，包涵体可以包含呈两种形式的感染性物质：适合用于繁殖的一种形式和适合用于细胞感染的另一种形式。后一种形式可以离开受感染的细胞并且扩散进入其他细胞。前述一种形式也称为网状体(reticulate body)并且前述另一种形式被称为原体(elementary body)。这两种形式在若干方面不同，诸如RNA/DNA的比率、核物质的密度和细胞壁的类型。可以以细胞外形式存活的原体具有低的RNA/DNA比率，例如低于1，具有电子致密核物质和相对坚硬的细胞壁。它们还诱导吞噬作用并且抑制吞噬体功能。网状体因此是非感染性的，是代谢上有活性的，具有较高的RNA/DNA比率，例如3-4。它们还具有松散分布的拟核，更薄更柔韧的细胞壁并且通过二分分裂更替(replace)。本发明利用了原体的特性。虽然已知这样的原体存在于衣原体属和嗜衣原体属中，但不排除其他微生物感染，例如病毒或革兰氏阴性细菌通过相似的原体机制进行扩散，即具有包含致密核物质的形式或阶段并且总体相对坚硬以使得能够实现细胞外存在。

包涵体的存在可能是由于已经感染宿主生物体的细菌并且更特别地是细胞内细菌。然而，包涵体还可能由于来自一种类型的生物体(诸如真核细胞)的重组基因在另一种生物体(诸如原核细胞)中的表达而产生。包涵体的类别的实例包括病毒包涵体、红细胞中的包涵体、皮肤状况中的包涵体、康氏小体(Councilman body)和杜勒小体(Dohle body)。病毒包涵体可以是细胞质内的、核内的，例如嗜酸性的或嗜碱性的并且此外可以是核内的和细胞质内的二者。红细胞中的包涵体可以作为发育细胞器、原生动物包涵体和作为异常血红蛋白沉淀物。许多重要的病毒和感染被了解为呈包涵体形式，包括狂犬病中的内氏小体(negri body)、单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒中的Cowdry A型、黄热病中的Torres体(Torres body)和脊髓灰质炎和腺病毒中的Cowdry B型。植物中的病毒包涵体的实例包括病毒颗粒的聚集物(如黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)的病毒颗粒的聚集物)和病毒蛋白的聚集物(如马铃薯Y病毒组(potyviruses)的圆柱状包涵体)。

一种细胞内类型的细菌的相关细菌感染，并且至少部分地呈包涵体形式并且包含在衣原体属并且更特别地沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)中发现的网状体和原体二者。支原体属(Mycoplasma)物种感染也被理解为细胞内细菌感染。在下文中，将关注于衣原体属的细菌物种的包涵体。

沙眼衣原体(下文也简称为CT)是与失明(沙眼)相关的单个最重要的感染因子(infectious agent)；全世界约8400万人患有沙眼衣原体(C.Trachomatis)眼部感染，并且800万人由于感染而失明。此外，沙眼衣原体感染现在是最常见的细菌性性传播疾病，影响普通人群中约4.2％的女性和2.7％的男性，以及STD诊所中高达15％的人们和高危群体中超过20％的人们。美国疾病控制和预防中心(US Centers for Disease Control andPrevention)和欧洲疾病预防和控制中心(European Centre for Disease Preventionand Control)二者均报道了近年来衣原体属感染率的增加。若干因素可以解释诊断出的CT感染的增加，包括性行为的改变和缺乏预防和教育，但也包括用改进的检测系统进行更频繁的测试。然而，许多感染是无症状的，并且仍然保持未被检测到。据估计，85％的女性和高达60％的男性是无症状的，导致许多未被治疗的CT感染。感染是尿道炎和宫颈炎的常见原因，但主要问题是女性中的后期并发症，包括PID、异位妊娠和输卵管性不孕。这些后期并发症是许多筛查的原因，以主动降低CT患病率从而减少这些后期并发症，这既为了受影响的女性也为了社会成本。

衣原体属物种是专性细胞内细菌，并且在宿主中以两种发育形式为代表：(1)代表呈复制形式的细菌的细胞内非感染性网状体(RB)、和(2)作为靶向宿主细胞的感染性颗粒起作用的细胞外原体(EB)。为了简洁，缩写RB和EB还将在下文被使用。

在细菌外膜蛋白和不同的宿主细胞受体之间的相互作用后，EB能够内化到宿主细胞中。在内化后，EB表达防止与溶酶体融合的细菌包含蛋白，并且转运至微管组织中心。在该位置，EB分化为RB，RB能够通过二分分裂来复制并且随后在发育周期结束时再分化为EB。EB可以在宿主细胞裂解后或通过挤出而离开细胞，并且可以感染其他宿主细胞。衣原体属EB通过固有免疫系统的受体(称为病原体/模式识别受体)被宿主生物体识别，并且诱导固有免疫反应和适应性免疫反应二者。然而，与免疫应答相关的炎症通常较不显著，并且大多数感染保持无症状。

不幸地，目前沙眼衣原体的诊断是费时并且昂贵的，并且不存在具有高灵敏度和特异性的良好的快速诊断测试(RDT)或所谓的护理点(Point of Care,PoC)测试。存在两种主要的可用方法：针对真正存活CT颗粒(EB)的旧的金标准的基于培养物的诊断和目前是金标准的核酸扩增测试(NAAT)。

长期以来，基于培养物的诊断测试被认为是用于CT检测的参考测试。来自不同的解剖学部位的拭子可以被用作用于基于培养物的诊断的样本。样品被离心，落在特化细胞系的细胞单层上，并且在48小时-72小时后，可以通过高度特异性的染色来分析细胞的特征性细胞质内包涵体的存在。然而，由于培养需要存活的生物体，灵敏度可能受不适当的样本收集、储存和运输、临床样本中的毒性物质的损害，并且低细菌载量可能无法被检测到。此外，该方法是非常费时并且劳动密集的，并且因此现今除了在儿童虐待情况中以外，很少在诊断实验室中被使用。此外，与NAAT相比，其灵敏度在最佳培养实验室中最大为50％-60％。NAAT目前通常被认为是用于CT诊断的金标准。NAAT不依赖于存活的病原体和较高的载量，并且因此比培养物要灵敏得多。大多数NAAT基于聚合酶链式反应(PCR)，并且使用荧光标记的探针以实时检测扩增的PCR产物。现今，NAAT通常靶向两个区域，因为过去已经显示出关于靶区域的缺失和重组甚至包括无质粒变体的问题，并且质粒区域是优选的区域，因为与染色体靶相比其以10X更多存在。原则上，所有相关的临床材料可以通过NAAT来分析，然而在男性中首段尿(first void urine)是推荐的样品类型，并且阴道拭子是用于女性的推荐的样品类型。与男性相比，女性更经常被测试，这是基于女性具有的后期并发症负担，这有别于男性。NAAT和基于培养物的测试通常在中心实验室(central laboratory)进行，并且需要将样本进行运输和将测试结果传输至临床医师。因此，它们还需要患者的第二次访问。延迟的治疗，或如果患者不再出现(特别是低的社会、经济和教育环境)则根本无治疗，可以导致高的感染发生率。因此，开发可以在患者附近(护理点)进行的快速诊断测试(RDT)是期望的。这样的RDT将进一步允许在阳性测试的情况中进行立即的抗生素治疗，并且没有由第二次访问而引起的经济水平上的社会损失。然而，与培养物和NAAT相比，这些目前的RDT显著地较不灵敏和特异，并且没有在任何地方实施。在发达国家和不发达国家二者中，RDT开发是对抗CT感染的第一要务。

此外，已知的是，应用MALDI-TOF MS(即基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析)以检测体液中存在的病原体的感染。该技术在WO2009/065580中被详细说明，并且还在由本发明人和共同作者C.Boogen、M.Schwarz和M.Kostrzewa在美国传染病学会(Infectious Diseases Society of America)2008年年会上呈现的会议文章中讨论。如在摘要中呈现的，将尿液(1ml)以两个步骤(在2000g 30sec，和在15,500g 5min)离心以获得团状物。然后通过添加甲酸和乙腈从团状物提取蛋白。若干种细菌可以通过该方法来正确地鉴定。根据WO2009/065580，基本上相同的方法还可以被用于鉴定病毒诸如立克次氏体属(Rickettsia)和衣原体属。然而，其需要超速离心以获得足够大量的呈病毒体形式的病毒。术语“病毒体”已知是指病毒颗粒，而不是被感染的细胞。病毒颗粒包含作为外部蛋白壳的衣壳。在WO2009/065580中呈现的方法中，病毒颗粒根据特殊分解方法被分解以获得衣壳的外壳蛋白并且使它们溶解以用于掺入到基质晶体中。所公开的方法显示出是用于将体液中的病毒颗粒浓缩成团状物的第一步骤，和用于分解病毒颗粒的团状物的第二步骤，在其后相关的蛋白将存在于上清液中。

然而，该描述在多于一个方面是有问题的。首先，没有呈现出关于所述特殊分解过程的信息。此外，没有给出足够大量将是什么样的量的鉴定。这样，无论如何，对于衣原体属的有效和及时检测显示出是困难的。事实上，将期望获得一种方法，该方法允许在病毒已经在患者中发展成疾病前(换言之，当病毒的有效量仍然低时)检测衣原体属。

因此，仍然存在对一种经证明有效的方法的需要，以能够实现通过MALDI质谱分析来鉴定衣原体属。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供一种用于诊断生物体中的微生物感染的改进的方法，诸如诊断沙眼衣原体的改进的方法，该方法具有至少与NAAT型测试的临床灵敏度相当的临床灵敏度并且不需要患者第二次访问临床医师。

此外，本发明的一个目的是提供一种用于诊断微生物感染、特别是沙眼衣原体的系统。

根据第一个方面，本发明提供了一种用于诊断生物体中的微生物感染的方法，其中所述微生物感染至少部分地在生物体的细胞物质中作为原体存在，该方法包括以下步骤：

-提供来自生物体的细胞物质的样品；

-处理样品以获得富集了原体的测试组合物，只要样品包含任何原体，以及

-使一定体积的包含至多预先确定的最大数目的原体的测试组合物经历MALDI质谱分析方法以鉴定微生物感染的存在。

根据第二个方面，本发明提供了一种用于诊断微生物感染的系统，该微生物感染至少部分地在生物体的细胞物质中作为原体存在，该系统包括以下的组合：(1)用于裂解细胞物质的样品的装置(means)；(2)分离装置，该分离装置用于将原体与通过细胞裂解获得的其他物质分离；(3)混合装置，该混合装置用于将基质材料的组合物与如此分离的原体混合，以获得包含所述原体的测试组合物，(4)分配单元，该分配单元用于分配一定体积的包含预先确定的最大数目的原体的所述测试组合物，(5)MALDI质谱仪，该MALDI质谱仪被配置用于产生所述测试组合物的质谱，以及(6)处理器，该处理器用于从多于一个个体体积的质谱产生均值谱(mean spectrum)，并且用于将均值谱与通常来自数据库的参考进行比较。

根据第三个方面，本发明包括一种用于鉴定原体的系统，该系统包括以下的组合：(1)用于裂解细胞物质的样品的装置；(2)分离装置，该分离装置用于将原体与通过细胞裂解获得的其他物质分离；(3)混合装置，该混合装置用于将基质材料的组合物与如此分离的原体混合，以获得包含所述原体的测试组合物，(4)分配单元，该分配单元用于分配一定体积的包含预先确定的最大数目的原体的所述测试组合物，(5)MALDI质谱仪，该MALDI质谱仪被配置用于产生所述测试组合物的质谱，以及(6)处理器，该处理器用于从多于一个个体体积的质谱产生均值谱。

在又另一个方面中，本发明涉及本发明的系统用于鉴定原体和/或用于诊断微生物感染的用途。鉴定生物体中的原体的用途包括：(1)提供来自生物体的细胞物质的样品；(2)处理样品以获得富集了原体的测试组合物；(3)使测试组合物的至少一部分经历MALDI质谱分析方法以鉴定所述一个或更多个原体。

本发明基于这样的见解，即原体可以与其他细胞物质有效地分离，以获得测试组合物，其中原体中的蛋白通过质谱分析是可检测的。更特别地，产生每体积包含有限数目的原体的测试组合物的体积是可行的。有限数目例如是至多10个，优选地至多5个，并且更优选地至多2个。每体积一个原体是最优选的。这允许使用具有高信噪比的质谱分析。此外，使一系列体积连续地经历质谱分析是可行的。由于每个体积具有基本上相同的内容物(即有限的并且可能地预先定义的数目的原体)，因此容易以有意义的方式组合和/或分析所得的质谱和/或其他结果。

此外，原体中的蛋白的浓度对于通过MALDI质谱分析方法的诊断是有益的。MALDI质谱分析的一种特别优选的类型被称为MALDI-TOF MS，其是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析的缩写。这是一种用于高通量、有成本效益的和快速微生物鉴定的新兴技术。本文中，微生物通过将其蛋白指纹(fingerprint)(即其总蛋白内含物)与通常来自文库的参考进行比较来鉴定。

在优选的实施方案中，方法还包括产生测试组合物的液滴的步骤，所述液滴为连续地经历MALDI质谱分析方法的体积。液滴通常基于由已知致动器(诸如例如压电致动器)实施的致动由微流体分配器芯片产生。液滴的体积合适地在皮升的范围中，例如1皮升-10皮升。

在与这一点高度相关的实施方式中，选择步骤在产生液滴后进行。这样的选择步骤确保每个体积具有少于预先定义的最大数目的原体。更特别地，该步骤被实施，以确保每个体积已经包含至少最小数目的原体。优选地，所有体积包含相同数目的原体，并且更优选地，该数目是1。然而，不排除原体的数目大于1，至少在部分体积中大于1。此外，可行的是，还产生了不具有原体的体积。这样的体积可以被用于鉴定背景。在一个其他处理步骤中，可以从具有一个或更多个原体的体积的质谱中减去这样的不具有原体的体积的质谱。这被认为进一步增加了信噪比。

优选地，选择步骤通过光学图像分析来实施。光学图像分析例如是用照相机实现的。未被选择用于通过质谱分析的测量的液滴或其他体积可以例如通过电磁开闭器(electromagnetic shutter)从液滴流去除。优选地，在与液滴分配器的孔相邻的位置处查看液滴。然后，经查看的液滴将在下一次分配事件后作为自由飞行的液滴从孔中喷射出。在一种形式中，用合适的波长照射颗粒，以产生颗粒、更特别地气溶胶颗粒中特定物质的荧光。合适的照射源是激发激光。可选地，这些液滴选择性地不被电离，即不用激光处理以进行电离。

光学图像分析的一个优点是可以配准特定体积的光学图像。配准可以是呈图像的形式，或任选地呈分析数据的形式。这样的数据可以例如是显示出对比度的图像，和/或图像中对应于原体的数目的点的数目的指示。呈分析数据的形式的存储可以是合适的，以限制待存储的数据的量。存储的图像或其分析数据可以被处理器使用，以基于由质谱仪产生的多于一个质谱产生样品结果。这是可行的，因为图像或其分析数据可以被直接地链接至一个个体产生的质谱。

此外，如果随后的光学图像示出不存在任何原体，那么处理器可以进入特定协议中。光学成像中这样的阴性结果可以意味着不存在原体或错误已经发生。然后，协议的一部分是验证处理和分配的适当的设置的算法。在一些实施方案中，这可以作为向操作者提供信号或警报来实施。然而，根据另一个实施方式，明显没有原体的预先定义的数目的液滴可以被选择。然后所得的质谱分析被用于验证明显的阴性结果。

优选地，将样品处理成测试组合物包括以下步骤：细胞裂解和将原体与裂解的细胞物质的其他部分分离。本申请的发明人已经理解，细胞裂解和随后的分离允许维持原体的完整性，而其他细胞物质，包括例如网状体和细胞膜被碎裂成细胞碎片并且然后被去除。虽然已知若干种方法用于细胞裂解，但最优选的方法是声处理(sonication)。该方法能够裂解细胞并且破坏多种细胞部分，同时使较为坚硬的原体保持完整。然而，不排除另外的裂解技术诸如液体均质化、机械裂解技术、电裂解技术(电穿孔)、化学裂解技术(可能地与珠磨法(bead beating)组合)。在声处理中，高频声波剪切细胞。被用于声处理的功率例如在40W-100W的范围中，例如50W-80W。优选地，它使用超声波浴或超声波探头来进行。附接至探头的电源以电子方式产生声能，例如在20kHz-50kHz的范围内。优选地，声处理以具有间歇时间段的多于一个时间段被实施。合适地，涡旋在所述声处理时间段之间被实施。声处理时间段合适地在15秒-40秒的范围内，诸如20秒-30秒，间歇时间段可以短至0.5秒-5秒。不排除其变化形式。这些声处理设置用于常规细胞裂解。发现这样的设置导致其中的细胞壁被裂解，但原体不被裂解。

在另外的实施方式中，分离步骤通过离心来实施。这种离心处理被配置使得原体最终在上清液中并且与细胞碎片分离。最合适地，具有原体的组合物随后被浓缩。此处，可以再次应用离心处理，其中原体将成团。可选地，可以使用另外的分离技术，诸如过滤和免疫磁性分离。原体的这种进一步浓缩被理解为增加了随后通过MALDI质谱分析的测量的分辨率。为了清楚起见，观察到与WO2009/065580A1中公开的用于细菌的细胞裂解技术相比，本发明在细胞裂解后实施离心处理，以从原体去除细胞碎片。分离的原体被处理以获得团状物。

优选地在该浓缩步骤之后，添加包含基质材料的组合物以获得测试组合物。基质材料的使用在MALDI方法中是必要的，如从以下MALDI的全称是明显的：基质辅助激光解吸电离。优选的基质材料根据EP2210110B1是已知的，其通过引用包括在本文中。基质材料通常作为在挥发性溶剂和另外一种或更多种添加剂中的组合物被提供。醇，诸如乙醇，是优选的溶剂。添加剂的存在例如用于控制测试组合物的pH。添加剂例如包括水和挥发性酸，诸如三氟乙酸。术语“挥发性”在本发明的上下文中被使用以指可以在范围从室温至100℃的温度蒸发的化合物。更优选地，使用被称为单细胞MALDI TOF MS的MALDI TOF MS类型。这种技术本身是已知的，其中样品制备使得通过质谱仪检测的每个样品包含来自单细胞的物质。

在一个实施方式中，与用于在MALDI质谱分析方法中使用的基质材料的组合物的混合通过成团的原体的重悬浮来实施。在一个实施方案中，观察到测试组合物的富集包括原体的实质分离。然而，这不被认为是必要的。还可以的是，测试组合物富集了原体，而其他固体物质仍然是组合物的一部分。合适地，原体的量是基于测试组合物中的总固体物质按重量计至少50％。更优选地，量是基于总固体按重量计至少70％，或甚至至少80％。

在分配液滴和液滴的任何任选的选择之后，基质材料将被结晶到固体物质上，更具体地结晶到原体上。本文中，基质材料的组合物的挥发性溶剂被蒸发。本文中，产生了包被的液滴的流，其也被称为气溶胶束。然后用激光(通常使用UV光)照射一个或更多个原体的表面上的具有结晶的物质的分析物。这具有这样的效果：结晶的基质吸收激光的能量并且将其传输至原体；直接照射原体反而将破坏所述原体。此外，由于激光的吸收(其导致蛋白电离)，将产生带电荷的颗粒，诸如质子。蛋白的这种电离形成了用于成功的飞行时间质谱分析测量的基础。在一个另外的实施方式中，液滴从环境气氛另外传输到真空气氛中。真空气氛在本文中是在压力足够低以允许质谱分析的气氛。

本发明方法的第一个优点是，样品收集不被认为是至关重要的。在诊断CT的情况中，样品可以由经历诊断的患者收集，或可以由临床医师收集。基于初步经验，包含悬浮液中的细菌细胞的所有样品是用于单颗粒MALDI-TOF MS分析的适当的样品，包括首段尿和拭子(的稳定化缓冲液)。

本发明方法的其他优点是，可以在短的时间段中进行诊断。初步实验指示出持续时间为15分钟-30分钟，诸如20分钟，而NAAT测试轻易地便花费5小时。这允许通过护理点治疗来应用该方法，即其中患者可以等待诊断的结果。如果诊断为阳性，可以给患者开处呈药物诸如抗生素形式的治疗。

除此之外，该方法的总体分辨率显示良好。原体中的蛋白的高密度促进通过依赖于蛋白的MALDI MS的适当的检测。此外，液滴的定义(即各自包含预先定义的有限数目的原体)是有帮助的，因为其允许以有意义的方式将基于个体液滴的质谱组合。例如，基于多于一个个体液滴的质谱产生均值谱。质谱的数目合适地是10个-200个，例如20个-100个或40个-80个质谱。获得具有足够的信噪比的质谱的这种能力从而不仅仅允许证实存在指示感染的原体，而且还鉴定感染的类型，并且更具体地鉴定导致感染的特定微生物。

该方法已经被测试并且已经发现检测在尿液中、在肛门拭子和阴道拭子中的衣原体属是可行的，其中病原体浓度等于或小于10⁴CFU/ml，例如10³CFU/ml，如对于拭子来说是典型的。本发明具有检测基于少至10CFU/ml的存在的衣原体属的潜力。

将理解的是，虽然本申请的方法主要预期用于检测微生物感染，诸如CT感染，但并不排除该方法同样地被应用于原体的鉴定。

附图简述

将参考附图进一步说明本发明的这些和其他方面，附图仅仅是示意性的并且未按比例绘制，其中：

图1示出了具有用于液体测试组合物的优选的预处理的MALDI质谱分析装置的示意图，以及

图2示出了图1的装置内的颗粒流动路径和质谱仪的示意图。

图3A-3B示意性地示出根据本发明方法的一个实施方案的处理步骤，其中图3A示出液滴的产生和选择并且图3B示出MALDI TOF质谱分析。

图4示出了根据本发明方法的一个实施方案的样品处理的流程图；

图5示出了根据本发明的初步实验中获得的质谱。

示例性实施方案的详细描述

图1示出了用于MALDI质谱分析的装置的第一个实施方案的示意图。图2更详细地示出了装置的部分200，在下文中也被称为飞行路径单元200。MALDI质谱分析特别适合用于生物物质的鉴定。一种优选类型的生物物质是微生物，诸如细菌、真菌和病毒。可以用MALDI鉴定的其他类型的生物物质包括例如血细胞、肽。

装置包括样品接收器10、导管11、第一混合单元12、第二混合单元14和飞行路径单元200。飞行路径单元包括干燥室15、电离室191和飞行时间管194。液滴诸如例如基于压电谐振器由任何液滴喷射器16喷射出。液滴遵循液滴束24，该液滴束24从干燥室15延伸到飞行时间管194中。在干燥后，液滴束24实际上被转换成颗粒束192。在通过来自脉冲激光18的辐射电离后，颗粒束192被转换成离子束195。质谱仪(未示出)测量离子束195的离子并且基于其产生质谱。根据本发明的一个实施方案，使用传感器20、22以用于确定形态学参数以选择通过脉冲激光18的激光脉冲电离的颗粒。特别地，这样进行是为了仅使那些可以产生有用的质谱信息的颗粒电离。

第一混合单元12包括第一混合器120、用于溶剂和/或反溶剂(antisolvent)诸如水的容器122和检测器124。可以存在两个单独的容器，而不是一个容器122。例如从患者获得的样品材料在第一混合器120中用溶剂和/或反溶剂稀释。检测器124合适地是光学检测器，该光学检测器被配置为当微生物流动通过测量光束时检测由个体微生物散射的光。根据在每单位时间间隔平均检测到的微生物的计数，可以确定密度。这样的检测器124本身是已知的，并且例如是细胞仪或流式细胞仪。颗粒检测器124显示与第一混合器120的控制输入耦合。将控制机构布置成增加溶剂和/或抗溶剂的量，直到测量的密度已经下降到或低于预先定义的密度。优选地，将两者以预先定义的比率添加。液体循环回路可以被用于使组合物循环直到已经实现期望的密度。第二混合单元14包括第二混合器14和基质材料储存器142。基质材料储存器142与第二混合器140耦合。第二混合器14被配置成将基质材料混合到从第一混合单元12获得的测试组合物中。

液滴产生器16可以设有用于评价液滴是否包含单个微生物或任何其他数目的微生物的装置。这样的检测装置可以被布置成在通过喷嘴喷射出之前查看通道中的悬浮液。产生器16还可以设有用于取决于从检测装置获得的信息将喷射出的液滴引导至第一位置或第二位置的装置。第一位置则是靶位置，即朝向其中激光源可以将辐射射出到颗粒上以使它电离的位置的流动路径。第二位置是废弃物(waste)位置。引导装置被配置用于液滴或机动台的偏转，该机动台被配置用于引导喷嘴。这样的装置本身根据EP2577254B1是已知的，并且通过引用包括在本文中。

图3A更详细地示出了液滴产生器16和室15的一个实施方案。在该图中，液滴束24通过室15的流动路径可以具有垂直方向。在该实施方案中，检测装置161被布置成在液滴从液滴产生器16的喷嘴喷射出之后光学地感测液滴。传感器161与选择装置162耦合，选择装置162优选地为电磁开闭器，以去除不包含任何微生物的那些液滴。

由于小的液滴尺寸，已经发现液滴快速地，即在流动路径的前几厘米中，实现恒定速率。这个速率是重力和空气动力学阻力的平衡。由于干燥，液滴束24被转换成颗粒束192。室15设有温度受控的壁，以保持室15中的温度恒定。在一个实施方案中，选择22℃-30℃的温度。室15还设有用于气体的入口165，产生均匀地分布的鞘流。气体包括例如空气或氮气，并且关于水蒸气和任选地任何溶剂的浓度被控制。合适地，控制水蒸气浓度，例如使得相对湿度为30％或更高。在通过干燥室15的飞行期间，液滴中的基质材料在分析物(通常是微生物)上结晶，而液滴在飞行中进行干燥，产生干燥的颗粒，其也被称为测试样品。通常地，液滴以在30μm-60μm的范围中的直径发射。在第一个实施方案中，干燥的颗粒具有小于3.0μm的空气动力学直径，其中测试样品包含单个细菌。鞘流将液滴转运朝向气溶胶飞行时间质谱仪的入口。

图3B图示了基于颗粒束中产生的测试样品的鉴定方法。从脉冲激光18向干燥的颗粒发射激光脉冲。这导致来自测试样品的物质的电离。电离的物质然后在电离室191中被加速，在电离室191中存在高电压以使电离的物质加速。电离的元素通过带电荷的网格216。因此，离子束195的个体离子在没有电场的漂移区194中被分离。该漂移区也被称为飞行时间管。分离的离子通过检测器220检测。与其耦合的处理器处理获得的数据，以产生可以与已知的数据集进行比较的质谱或数据集230(“指纹”)。这样的已知的数据集通常存储于文库中。

实施例

用已经在HeLa细胞的细胞系中生长的沙眼衣原体物种进行测试。Hela细胞的细胞系是用于科学研究的永生细胞系中的一种细胞类型。样品制备在图4中示出。起始组合物包含培养基M中的A(HeLa细胞中的所述物种)。通过声处理裂解HeLa细胞，使用在70W的三个声处理时间段(每个时间段为20秒)，其使用涡旋被2秒的间歇时间段中断。这导致其中的原体(EB)可以被收集，而其他细胞物质被破坏成细胞碎片(D)。在声处理后，在培养基(M)中因而存在EB+D。然后将细胞物质转移至离心机，用于分离细胞碎片(D)和原体(EB)。在该实施例中，使用递增的旋转速率，即500×g、2500×g和15,000×g，进行三个随后的步骤(C1、C2、C3)。因此，首先去除了培养基M，然后去除细胞碎片D的一部分，并且然后去除剩余的细胞碎片D。这产生了原体(EB)的团状物。在去除细胞碎片方面，通常首先去除更粗糙的细胞碎片，并且其后去除更精细的细胞碎片。为了简洁起见，该图指示1/2D，如同两个步骤各自去除50％。这仅仅是示意性的，并且不是硬性要求。将理解的是，确切的旋转速率可以被修改。此外，虽然在根据本发明的一个实施方案中进行三个步骤，但是该数目可以变化。然后将团状物重悬浮到缓冲液(BUF)中，用于储存(例如在-80℃)或用于直接使用。

虽然该图示出了用于表征本发明方法的特定实施方案，但将理解的是，当用于诊断目的时，沙眼衣原体和HeLa细胞的使用通常被可以包含沙眼衣原体的细胞的使用替代。在这样的诊断方法中，细胞可以在破坏步骤之前与培养基混合。在破坏步骤之后，原体EB将与细胞碎片和培养基分离。其中离心的使用是优选的，尽管离心可以部分地或全部被其他分离技术替代，包括过滤、膜过滤和/或活化的(顺)磁珠。

然后通过将原体(EB)的团状物与基质材料接触来产生测试组合物。在该实施例中，使用重悬浮，其中2-巯基-4,5-二甲基噻唑作为基质材料。液滴是用液滴产生器产生的。每个液滴具有在10皮升-100皮升的范围内的体积。图像传感器，更具体地是照相机，在能够实现记录在液滴分配器的出口处的液滴的位置处提供。图像传感器与处理器耦合以检查通常比液滴的其他部分更暗的点状元素是否存在于液滴中。当液滴包含一个点状元素时，选择该液滴。如果液滴没有被选择，则通过电磁开闭器从液滴束去掉该液滴。其后液滴通过干燥区。这导致产生适合用于MALDI质谱分析的包被的颗粒。

其后对个体液滴进行MALDI质谱分析。产生个体液滴的质谱。积累包含足够信号的质谱，使得信噪比变得足够大以区分质谱内的20个-30个显著的峰。在本文中，从信号减去基线，该基线对应于在颗粒之间变化的信号部分导致的质谱水平。强度已经用基线的高度的局部方差归一化。具有强度为至少1的峰被认为是足够显著的。获得了图5中示出的质谱。

在预期除了仅原体之外存在其他对象的情况中，可以实施分类。其中可以使用EP2836958中详细说明的方法，其通过引用被包含在本文中。

Claims

1.用于诊断生物体中的微生物感染的方法，其中所述微生物感染至少部分地在所述生物体的细胞物质中作为原体存在，所述方法包括以下步骤：

-提供来自所述生物体的细胞物质的样品；

-处理所述样品以获得富集了原体的测试组合物，只要所述样品包含任何原体；

-使一定体积的包含至多预先确定的最大数目的原体的所述测试组合物经历MALDI质谱分析方法以鉴定所述微生物感染的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括产生所述测试组合物的液滴的步骤，所述液滴是连续地经历所述MALDI质谱分析方法的体积。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每体积的原体的所述预先确定的最大数目是10，优选地是5。

4.根据权利要求3所述的方法，其中每个体积包含至多2个原体，并且其中优选地一个液滴包含单个原体。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中使所产生的液滴经历选择步骤，所述选择步骤包括液滴的光学图像的配准和基于对所述光学图像的分析选择液滴。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品的处理包括以下步骤：裂解所述细胞物质，以及将所述原体与其他裂解的物质分离。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述裂解通过声处理来进行。

8.根据权利要求6-7所述的方法，其中所述分离包括离心处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述离心处理提供包含与细胞碎片分离的所述原体的上清液。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，所述方法还包括浓缩所分离的原体的组合物的步骤。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品的处理还包括将基质材料的组合物添加至所富集的样品，从而产生所述测试组合物。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物感染由至少一种细胞内细菌物种产生。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细菌物种属于衣原体属(Chlamydia)，并且更具体地为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物感染是无症状的。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MALDI质谱分析方法包括：

-处理所述一定体积的所述测试组合物，优选地液滴，以使其基质材料结晶到包含在所述一定体积中的至少一个原体上，从而获得分析物；

-使所述分析物的至少一部分电离；

-使用飞行时间检测器分离电离的组分以获得质谱；

-将所述质谱与至少一个参考进行比较，以鉴定所述微生物感染。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品的提供是来自包含先前收集的材料的容器的样品的提供。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体是哺乳动物，优选地人类。

18.一种用于诊断微生物感染的系统，所述微生物感染至少部分地在生物体的细胞物质中作为原体存在，用于诊断的所述系统包括以下的组合：

-用于裂解细胞物质的样品的装置；

-分离装置，所述分离装置用于将原体与通过细胞裂解获得的其他物质分离；

-混合装置，所述混合装置用于将基质材料的组合物与如此分离的原体混合，以获得包含所述原体的测试组合物；

-分配单元，所述分配单元用于分配一定体积的包含预先确定的最大数目的原体的所述测试组合物，

-MALDI质谱仪，所述MALDI质谱仪被配置用于产生所述测试组合物的质谱，以及

-处理器，所述处理器用于基于多于一个个体体积的质谱产生均值谱并且用于将所述均值谱与通常来自数据库的参考进行比较。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述分配单元是用于产生所述测试组合物的液滴的液滴产生器。

20.根据权利要求19所述的系统，所述系统还包括光学图像分析装置，所述光学图像分析装置包括光学图像记录器和用于分析记录的光学图像的处理装置。

21.根据权利要求20所述的系统，所述系统还包括液滴去除装置，所述液滴去除装置基于通过所述处理装置的所述分析而被驱动。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的系统，其中所述裂解装置包括声处理装置。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的系统，其中所述分离装置包括离心机。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的系统用于鉴定原体和/或诊断微生物感染的用途。