CN110366563A

CN110366563A - 抗lilrb3抗体及其使用方法

Info

Publication number: CN110366563A
Application number: CN201780087114.6A
Authority: CN
Inventors: 淑霞·陈; 潘平英; 陈慧明; W·范德图夫
Original assignee: Xi Naishanyikan Medical College
Current assignee: Xi Naishanyikan Medical College
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-10-22
Also published as: WO2018119425A3; EP3559042A2; WO2018119425A2; US20200071398A1; US11787858B2; EP3559042A4; JP2020511950A; CA3047833A1

Abstract

公开了特异性结合LILRB3的抗体和抗体片段。本文还提供了包含特异性结合LILRB3的抗体和抗体片段的组合物及其使用方法。

Description

抗LILRB3抗体及其使用方法

联邦赞助的研究或开发

本公开是在政府的支持下基于由美国国立卫生研究所颁发的批准号CA109322和CA127483完成的。政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本发明一般性地涉及抗体或其抗原结合片段，其结合调节白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LILR)B3(LILRB3)(“抗LLIRB3抗体”)，并调节LLIRB3信号传导，以诱导髓系细胞中M1或M2功能表型的获取；包含抗LLIRB3抗体的组合物；及其用途。

背景技术

白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LILR)，又称免疫球蛋白样转录物(ILT)，是白细胞受体复合物中编码的抑制性和刺激性细胞表面受体家族，由髓系和淋巴系的免疫细胞类型表达。ILT对天然和获得性免疫系统均有影响，并表现出LILR信号传导对免疫细胞活性的广泛影响。抑制性受体(LILRB)的抑制活性发生在与激活受体共交联时。

髓源性抑制细胞(MDSC)是具有免疫抑制功能的髓系祖细胞，其已包括小鼠的Gr1+CD11b+CD115+Ly6C+单核(M)细胞和Gr1+CD11b+Ly6G粒(G)细胞(Gabrilovich等人，CancerRes.67:425,2007；Huang等人，Cancer Res.66:1123-1131,2006)。人MDSC表征为CD33+CD14+CD16+、CD11b+CD14LowCD33+或Lin-HLA-DRLow-CD33+髓系细胞(Chen等人，Clin.CancerRes.,21(18):4073-2742,2015；Ostrand-Rosenberg等人，J.Immunol.182:4499-4506,2009；Raychaudhuri等人，Neuro.Oncol.13:591-599,2011)。近年来，已发现MDSC在感染、恶性肿瘤、移植和其他免疫疾病的免疫应答的调节中发挥着重要的作用(例如，Yin等人，J.Immunol.185:5828-5834,2010)。

MDSC可分化并极化为M1和M2系细胞(M1细胞表达iNOS、TNF-α、IFN-gR、MHC I类和CCR7，和M2细胞表达精氨酸酶、IL-10、CD36、CD206、CD163、PD-L1、DC-SIGN和CCR2)。M2细胞在T细胞共培养和体内中与其M1样对应物相比具有增强的抑制Teff活化和增殖的能力(Ma等人，Immunity34:385-395,2011)。M2细胞在体外和体内的Treg扩增能力均高于M1表型的细胞(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。由于M2细胞抑制Teff的活化和增殖，促进Treg的扩增，故M2细胞可用于治疗自身免疫病，在此情况下需要减少促炎免疫应答。

M1细胞通过增加自由基、死亡配体、HLA-DR和免疫刺激细胞因子-TNFa具有增加的直接肿瘤杀伤并促进抗肿瘤免疫的发展(参见，例如Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)，因此，M1细胞可用于治疗癌症或其他需要增加促炎免疫应答的疾病。

发明内容

本公开的特征是结合白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体B3(“LILRB3”)的抗体和其抗原结合片段，例如抗LILRB3抗体或其抗原结合片段。这些抗体可分为两类：第一类(I类)包括用于治疗癌症的LILRB3拮抗剂抗体及其抗原结合片段；第二类(II类)包括用于治疗免疫抑制的LILRB3激动剂抗体和其抗原结合片段。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：重链互补决定区(CDR)1，其包含如SEQ ID NOs:44至52、54至55、57至58之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ IDNOs:44至52、54至55、57至58之一中记载的氨基酸序列；重链CDR2，其包含如SEQ ID NOs:59至70之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NOs:59至70之一中记载的氨基酸序列；和重链CDR3，其包含如SEQ ID NOs:71-86之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:71-86之一中记载的氨基酸序列。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：轻链CDR1，其包含如SEQ ID NOs:1-17之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:1-17之一中记载的氨基酸序列；轻链CDR2，其包含如SEQ ID NO：18-26之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NO:18-26之一中记载的氨基酸序列；和轻链CDR3，其包含如SEQ ID NOs:27-43之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:27-43之一中记载的氨基酸序列。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：(i)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、MNTYSGVP(SEQ ID NO:59)和CARMGRGSLYGMDYW(SEQ ID NO:71)；(ii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHSYSLYVMGYW(SEQ ID NO:72)；(iii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHNYSLYVMGYW(SEQ ID NO:73)；(iv)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARGALYYFDNW(SEQ ID NO:74)；(v)分别为GYMFTTYG(SEQ ID NO:45)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(vi)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(vii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(viii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CTRIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:76)；(ix)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGNN(SEQ ID NO:61)和CVRGYYYYGSRAMDYW(SEQ ID NO:77)；(x)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGND(SEQ ID NO:62)和CVRGYYYYGSRAMDCW(SEQ ID NO:78)；(xi)分别为GFSFSDYG(SEQ ID NO:48)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CGPSDYWYFDVW(SEQ ID NO:79)；(xii)分别为GFTFSDYG(SEQ ID NO:49)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CARDYFYGNNYGFPYW(SEQ ID NO:80)；(xiii)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNINS(SEQ ID NO:64)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xiv)分别为GYTFISYY(SEQ ID NO:51)、IYPGNVNT(SEQ IDNO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xv)分别为GYTFTSYY(SEQ ID NO:52)、IYPGNVNT(SEQ ID NO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xvi)分别为GFSLTNYD(SEQ ID NO:54)、IWTGGNT(SEQ ID NO:66)和CVREGFRQGYYAMDYW(SEQ ID NO:82)；(xvii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、IDTKNGGT(SEQ ID NO:67)和CASGGRGYW(SEQ ID NO:83)；(xviii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYTGEP(SEQ ID NO:68)和CTRNYYRPYYYAMDYW(SEQ ID NO:84)；(xix)分别为GYSFTGYT(SEQ ID NO:57)、INPYNDNT(SEQ ID NO:69)和CAREGNYYGASPWFAYW(SEQ ID NO:85)；和(xx)分别为GYTFTHYG(SEQ ID NO:58)、INTSTGET(SEQ ID NO:70)和CARYYYGSSRWRDYWFAYW(SEQ ID NO:86)。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3：(i)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、MNTYSGVP(SEQ IDNO:59)和CARMGRGSLYGMDYW(SEQ ID NO:71)；(ii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHSYSLYVMGYW(SEQ ID NO:72)；(iii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHNYSLYVMGYW(SEQ ID NO:73)；(iv)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARGALYYFDNW(SEQ ID NO:74)；(v)分别为GYMFTTYG(SEQ ID NO:45)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(vi)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(vii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYSGVP(SEQID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；(viii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CTRIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:76)；(ix)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGNN(SEQ ID NO:61)和CVRGYYYYGSRAMDYW(SEQ ID NO:77)；(x)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGND(SEQ ID NO:62)和CVRGYYYYGSRAMDCW(SEQ ID NO:78)；(xi)分别为GFSFSDYG(SEQ ID NO:48)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CGPSDYWYFDVW(SEQID NO:79)；(xii)分别为GFTFSDYG(SEQ ID NO:49)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CARDYFYGNNYGFPYW(SEQ ID NO:80)；(xiii)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNINS(SEQ ID NO:64)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xiv)分别为GYTFISYY(SEQ ID NO:51)、IYPGNVNT(SEQ ID NO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xv)分别为GYTFTSYY(SEQ IDNO:52)、IYPGNVNT(SEQ ID NO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xvi)分别为GFSLTNYD(SEQ ID NO:54)、IWTGGNT(SEQ ID NO:66)和CVREGFRQGYYAMDYW(SEQ ID NO:82)；(xvii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、IDTKNGGT(SEQ ID NO:67)和CASGGRGYW(SEQ ID NO:83)；(xviii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYTGEP(SEQ ID NO:68)和CTRNYYRPYYYAMDYW(SEQ ID NO:84)；(xix)分别为GYSFTGYT(SEQ ID NO:57)、INPYNDNT(SEQ ID NO:69)和CAREGNYYGASPWFAYW(SEQ ID NO:85)；和(xx)分别为GYTFTHYG(SEQ ID NO:58)、INTSTGET(SEQ ID NO:70)和CARYYYGSSRWRDYWFAYW(SEQ ID NO:86)；和轻链可变区，所述轻链可变区包含由以下氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3：(xxi)分别为QSLLISTNQKNY(SEQ ID NO:1)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSIPPTF(SEQ ID NO:27)；(xxii)分别为QSLFISTNQKNY(SEQID NO:2)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSSPPTF(SEQ ID NO:28)；(xxiii)分别为QSLLISTNQINY(SEQ ID NO:3)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYDPPLTF(SEQ ID NO:29)；(xxiv)分别为QSLLISTNQKNY(SEQ ID NO:1)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQHHYDPPLTF(SEQ ID NO:30)；(xxv)分别为QNLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:4)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYNTPPTF(SEQ IDNO:31)；(xxvi)分别为QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:5)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSPPPTF(SEQ ID NO:32)；(xxvii)分别为QSLLISSNQNNY(SEQ ID NO:6)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSTPPTF(SEQ ID NO:33)；(xxviii)分别为QDISNY(SEQ ID NO:7)、YTS(SEQ ID NO:19)和CQQGHTLPYTF(SEQ ID NO:34)；(xxix)分别为QDISNY(SEQ ID NO:7)、YTS(SEQ ID NO:19)和CQQGNTLPYTF(SEQ ID NO:35)；(xxx)分别为QNVGTN(SEQ ID NO:8)、STS(SEQ ID NO:20)和CQQYNSYPFTF(SEQ ID NO:36)；(xxxi)分别为QTIGTW(SEQ ID NO:9)、AAT(SEQ ID NO:21)和CQQLYSTPLTF(SEQ ID NO:37)；(xxxii)分别为QNIRTA(SEQ ID NO:10)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；(xxxiii)分别为QNVRTA(SEQ ID NO:11)、LAS(SEQ IDNO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；(xxxiv)分别为LNVRTA(SEQ ID NO:12)、LAS(SEQID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；(xxxv)分别为QSLLYSSNQKNY(SEQ ID NO:13)、WAS(SEQ ID NO:23)和CQQYYSYRTF(SEQ ID NO:39)；(xxxvi)分别为QNVYTT(SEQ ID NO:14)、SAS(SEQ ID NO:24)和CQQYNSYPYTF(SEQ ID NO:40)；(xxxvii)分别为ENIYSY(SEQ IDNO:15)、DAK(SEQ ID NO:25)和CQHHYGFPYTF(SEQ ID NO:41)；(xxxviii)分别为ETVDTYGNRF(SEQ ID NO:16)、RAS(SEQ ID NO:26)和CQQSNEDPFTF(SEQ ID NOL 42)和(xxxix)分别为QDVSNA(SEQ ID NO:17)、SAS(SEQ ID NO:24)和CPQHYSTLCTF(SEQ ID NO:43)。

在某些方面，分离的抗体或抗原结合片段是LILRB3活性的拮抗剂。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含：重链互补决定区(CDR)1，其包含SEQ ID NO：50、52、53、55和109-114之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：50、52、53、55和109-114之一中记载的氨基酸序列；重链CDR2，其包含SEQ ID NO：65和115-123之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：65和115-123之一中记载的氨基酸序列；以及重链CDR3，其包含SEQ ID NO：81、124-131之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：81、124-131之一中记载的氨基酸序列。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含：轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：1-17之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：10、11、87-94之一中记载的氨基酸序列；轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：19、22、23、95-99之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：19、22、23、95-99之一中记载的氨基酸序列；和轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：38、100-108之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：38、100-108之一中记载的氨基酸序列。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，由以下氨基酸组成：(xl)分别为GFTFTGYW(SEQ ID NO:109)、ILPVSGIT(SEQ ID NO:115)和CARRGSPYFDYW(SEQ ID NO:124)；(xli)分别为GFSLNTFDMG(SEQ ID NO:110)、IWWDDDK(SEQ ID NO:116)和CGRKPGGYGNYVL(SEQ ID NO:125)；(xlii)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:111)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；(xliii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、LNPYNGGT(SEQID NO:118)和CARGSGNSFYAMDYW(SEQ ID NO:127)；(xliv)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNVNS(SEQ ID NO:119)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xlv)分别为GYSITSGYY(SEQ ID NO:112)、ISYDGSN(SEQ ID NO:120)和CTSIYGRFVYW(SEQ ID NO:128)；(xlvi)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:111)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；(xlvii)分别为GYTFTNFW(SEQ ID NO:113)、IHPNSGST(SEQ ID NO:121)和CARNSGDYLVYFDSW(SEQ ID NO:129)；(xlviii)分别为GYSFTGYF(SEQ ID NO:114)、INPSTGDT(SEQ ID NO:122)和CARGATVVDYPFDYW(SEQ ID NO:130)；或(xlix)分别为GYTFTSYW(SEQ IDNO:53)、IHPNGGST(SEQ ID NO:123)和CTRGLTGLFAYW SEQ ID NO:131)。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3：(xl)分别为GFTFTGYW(SEQ ID NO:109)、ILPVSGIT(SEQ IDNO:115)和CARRGSPYFDYW(SEQ ID NO:124)；(xli)分别为GFSLNTFDMG(SEQ ID NO:110)、IWWDDDK(SEQ ID NO:116)和CGRKPGGYGNYVL(SEQ ID NO:125)；(xlii)分别为GFSLTRYG(SEQID NO:111)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；(xliii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、LNPYNGGT(SEQ ID NO:118)和CARGSGNSFYAMDYW(SEQ ID NO:127)；(xliv)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNVNS(SEQ ID NO:119)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；(xlv)分别为GYSITSGYY(SEQ ID NO:112)、ISYDGSN(SEQ ID NO:120)和CTSIYGRFVYW(SEQ ID NO:128)；(xlvi)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:111)、IWSGGST(SEQ IDNO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；(xlvii)分别为GYTFTNFW(SEQ ID NO:113)、IHPNSGST(SEQ ID NO:121)和CARNSGDYLVYFDSW(SEQ ID NO:129)；(xlviii)分别为GYSFTGYF(SEQ ID NO:114)、INPSTGDT(SEQ ID NO:122)和CARGATVVDYPFDYW(SEQ ID NO:130)；或(xlix)分别为GYTFTSYW(SEQ ID NO:53)、IHPNGGST(SEQ ID NO:123)和CTRGLTGLFAYW SEQ ID NO:131)；以及轻链可变区，该轻链可变区包含由以下氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3：(l)分别为SSVSSSY(SEQ ID NO:87)、GTS(SEQ ID NO:95)和CHQYHRSPFTF(SEQ ID NO:100)；(li)分别为SSVSY(SEQ ID NO:88)、DTS(SEQ ID NO:96)和CFQGSGYPFTF(SEQ ID NO:101)；(lii)分别为QSVLYSSDQKNY(SEQ ID NO:89)、WAS(SEQ IDNO:23)和CHQYLSHTF(SEQ ID NO:102)；(liii)分别为QDVNTA(SEQ ID NO:90)、WAS(SEQ IDNO:23)和CQQLYKLPRTF(SEQ ID NO:103)；(lv)分别为QNIRTA(SEQ ID NO:10)、LAS(SEQ IDNO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；(lvi)分别为SSVNY(SEQ ID NO:92)、YTS(SEQ IDNO:19)和CQQFSSSPYTF(SEQ ID NO:105)；(lvii)分别为QNVRTA(SEQ ID NO:11)、LAS(SEQID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；(lviii)分别为SSVSY(SEQ ID NO:88)、DTS(SEQID NO:96)和CQQWRSYQLTF(SEQ ID NO:106)；(lvix)分别为QNINVW(SEQ ID NO:93)、KAS(SEQ ID NO:98)和CQQGQSYPLTF(SEQ ID NO:107))；和(lvx)分别为QDINSY(SEQ ID NO:94)、RAN(SEQ ID NO:99)和CLQYDEFLLTF(SEQ ID NO:108)。

在某些方面，分离的抗体或抗原结合片段是LILRB3活性的激动剂。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区CDR1，其包含如SEQ ID NOs:44、46、49-52、54、112、153、190-214之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:44、46、49-52、54、112、153、190-214之一中记载的氨基酸序列；重链CDR2，其包含如SEQ ID NOs:60、63、64、65、119、123、215-237之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:60、63、64、65、119、123、215-238之一中记载的氨基酸序列；和重链CDR3，其包含如SEQ ID NOs：81、82、239-272之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:81、82、239-272之一中记载的氨基酸序列。

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：轻链CDR1，其包含如SEQ ID NOs：7、8、10、11、13、15、56、87、88、94、134-156之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:7、8、10、11、13、15、56、87、88、94、134-156之一中记载的氨基酸序列；轻链CDR2，其包含如SEQ ID NOs:18、19、20、21、22、23、24、26、95、99、157-163之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:18、19、20、21、22、23、24、26、95、99、157-163之一中记载的氨基酸序列；和轻链CDR3，其包含如SEQ ID NOs:38、39、40、100、108、164-189之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:38、39、40、100、108、164-189之一中记载的氨基酸序列。

在某些方面，本公开提供了一种编码如本文公开的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。本公开还提供了包含编码如本文公开的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的核酸分子的载体。本文还提供了包括原核或真核细胞在内的宿主细胞，其包括含有编码如本文所公开的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的核酸分子的载体。

在某些方面，本公开提供了制备抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：(a)在适于根据权利要求8所述的宿主细胞表达LILRB3抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞；和(b)回收LILRB3抗体或其抗原结合片段。

本文公开了一种组合物，其包含抗LILRB3抗体或其抗原结合片段及其合适的药物载体。在某些方面，该组合物还包括化学治疗剂或止痛剂。在某些方面，该组合物还包括选自由以下组成的组的一种或多种附加药剂：髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂

本公开的组合物可配制用于，例如，静脉、肌内、口服、皮下、腹膜内、鞘内、瘤内或肌内施用。

在某些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段。在某些方面，所述方法还包括向哺乳动物施用化学治疗剂或止痛剂。

在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段(例如Fab或scFv)和药学上可接受的载体。

在上述方面的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有约150pM至约100nM的表观单价亲和力。

在所有上述方面的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Facb、Fv、Fd、双价抗体(diabody)、scFv或sc(Fv)2。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段是Fab。

如本文所用，术语“一个(种)或多个(种)”包括“一个(种)或多个(种)”所指的术语的至少一个(种)，更适当地，一、二、三、四、五、十、二十、五十、一百、五百个(种)等。

除非另有定义，此处使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。用于本发明的方法和材料在此描述；还可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不是意在限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都以引用的方式全部并入本文。在发生冲突的情况下，本说明书，包括定义在内，将占主导。

本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和附图以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1A至1C是显示在用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5μg/ml)、或同种型对照孵育24小时接着用LPS(100ng/ml)刺激后从健康供体获得的人外周血单核细胞(PBMC)中产生TNF-α的图。抗LILRB mAb按抑制TNFα释放的克隆至增强TNFα分泌的克隆的顺序排列。TNF-α的水平通过ELISA确定。示出了基于图1A中的TNFα的产生的克隆排列。图1A中TNFα水平的总体差异示于图1B，而TNFα释放的相对倍数变化示于图1C。

图2A至2B是显示在用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5μg/ml)、或同种型对照处理24小时接着用LPS(100ng/ml)刺激6小时后从健康供体获得的来自PBMC的IL-10的产生的图。收集上清液并通过ELISA测定IL-10浓度。IL-10浓度的总体差异示于图2A，而相对倍数变化示于图2B。对于各图2A和图2B，克隆根据图1A所示克隆排列进行排序。

图2C是在拮抗性(CTAD_12F9)或激动性抗体(CTAD_1B9)处理下对人CD33+CD14+CD16+MDSC群体(下图)和M1/M2标记物(上图)的流式细胞术分析。在M-CSF 50ng/ml的存在下将从健康PBMC中分选的CD33+髓系细胞诱导分化为单核来源的巨噬细胞(MDM)5天。然后MDM用干扰素γ(50ng/ml，M1多聚化条件)和抗LILRB3抗体(5μg/ml)共同培养2天。收获供试细胞进行流式细胞术分析。

图3A是显示在抗LILRB3 mAb上清液或纯化的mAb(5μg/ml)的存在下低剂量(0.3μg/ml)抗CD3(OKT3)刺激来自健康供体的PBMC后OKT3介导的T细胞增殖(CPM)的图。处理3天后，用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测T细胞增殖。在培养的最后8小时加入胸苷，然后在闪烁计数器上测量。给出了根据图1中的TNFα的克隆排列。T细胞增殖(CPM)的相对倍数变化示于图3A。

图3B是显示来自健康供体的人PBMC用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5μg/ml)、或同种型对照处理24小时，然后用LPS(100ng/ml)刺激6小时之后IFN-γ的产生的图。收集上清液，通过ELISA测定IFNγ浓度。

图3C是一组来自经培养的纯化人T细胞(应答者)的流式细胞术数据，所述T细胞用CFSE标记并在IgG同种型对照或所述的LILRB3抗体(5μg/ml)的存在下受辐照(30Gy)的非亲缘供体PBMC(刺激者)刺激。应答者/刺激者之比为1/3。共培养5天后，通过流式细胞术分析活的CD4 T细胞(上图)和CD8 T细胞(下图)。具有代表性的流式图显示为CFSE稀释和细胞分裂百分比。

图4A是显示抗LILRB3抗体(5μg/ml)或同种型对照处理4天后人髓系白血病细胞(U937)增殖(CPM)的图。用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测U937细胞增殖。培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲处理细胞。与对照Ig的相对倍数变化示于图4A。

图4B至4C是显示抗LILRB3抗体(5μg/ml)或同种型对照处理4天后人髓系白血病细胞(HL-60)增殖(CPM)的图。INFγ预处理HL60细胞3天，再用抗体(抗LILRB3抗体(5μg/ml)或同种型对照)处理2～5天。通过[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法测定HL60细胞增殖。培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲处理细胞。原始数据示于图4B，细胞增殖(CPM)的相对倍数变化示于图4C。

图5是显示LILRB3+MDAMB231乳腺癌细胞的迁移/侵袭活性的图。(A)采用transwell侵袭试验评价LILRB3+MDAMB231的迁移/侵袭活性。将3×10⁵细胞接种于上腔，加入抗LILRB3 mAb或对照Ig(5μg/ml)。24小时后，用结晶紫染色transwell膜，计数每视场的细胞。照片显示出表明下底图(20X)处迁移的细胞。(B)比较各抗LILRB3 mAb处理的LILRB3+MDAMB231细胞中的活化的RhoA的表达。

图6是显示U937细胞的肿瘤生长被异种移植模型中的拮抗性克隆抑制的图。将2×10⁶U937细胞皮下植入NOD/SCID小鼠。(A)当肿瘤大小达到3-5mm²时，通过静脉注射来输注抗LILRB3 mAb、即克隆8H10(圆线)或对照IgG1(菱形线)(150微克/小鼠，每3天一次)。(B)示出了另一克隆-抗-LILRB3 mAb、即克隆P_6H3(圆线)或对照IgG1(菱形线)(150微克/小鼠，每3天一次)的抗肿瘤作用。

图7是显示抗LILRB3对人PBMC增殖的共刺激作用的图。在1μg/ml a-PD-1,1μg/ml4-1BBL,100ng/ml OX40L或1μg/ml GITRL的存在下用低剂量抗CD3(OKT3，0.3微克/ml)以及抗LILRB3 Abs(5微克/ml)刺激来自健康供体的1×10⁵总PBMC。处理3天后，用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测T细胞增殖。在培养的最后18小时加入胸苷，然后在闪烁计数器上测量。示出CTAD_3G7(7A)和P_2G11(7B)对T细胞增殖(CPM)的影响。

图8是显示了识别LLRIB3拮抗剂和激动剂的标准的流程图。

具体实施方式

本公开的特征是特异性结合LILRB3的抗体和抗原结合片段。

本公开还提供了编码本文描述的抗体和其抗原结合片段的多核苷酸。此外，本公开涉及在治疗癌症和/或刺激促炎免疫应答中使用抗LILRB3抗体和其抗原结合片段的方法。

为了提供对说明书和权利要求的清楚理解，下文提供了以下定义。

定义

应当理解的是，无论在此以“包括”的语言描述实施方案，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的其他类似实施方案。

术语“抗体”是指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标如蛋白质(例如，LILR3、其亚基或受体复合物)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述组合的免疫球蛋白分子。典型抗体至少包括通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每条重链包括“重链可变区”或“重链可变结构域”(这里简称为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括“轻链可变区”或“轻链可变结构域”(这里简称为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域C1。V_H和V_L区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变异性区，穿插(intersperse)有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个V_H和V_L区由3个CDR和4个FR组成，由氨基端到羧基端依照以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。如本文所用，术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Facb和Fv片段)、单链Fv(scFv)、小体(如sc(Fv)2、二价抗体)、多特异性抗体如至少两种完整抗体产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出期望的生物活性即可。因此，术语"抗体"包括整个抗体及其任何抗原结合片段或其单链。抗体可以裸露或与其他分子如毒素、放射性同位素、小分子药物、多肽等缀合。

术语"分离的抗体"是指已从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境中的杂质组分是干扰抗体诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量％的抗体，如Lowry方法测定的，并且包括超过99重量％的抗体，(2)至足以通过旋转杯定序器获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染通过SDS-PAGE同质化。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为抗体的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“人源化”免疫球蛋白是指包含人类框架区和一个或多个非人源(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。不需要存在恒定区，但如果存在恒定区，则必须与人免疫球蛋白恒定区实质上相同，即至少约85-90％，优选约95％以上相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了可能的CDR，与天然人免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。“人源化抗体”是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体不会包括上文定义的典型嵌合抗体，例如，这是因为嵌合抗体的整个可变区是非人的。

术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分，并指完整抗体的抗原决定区。本领域已知抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。抗原结合抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fd和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。在某些情况下，抗体片段可以通过完整或全抗体的蛋白水解消化来制备。例如，抗体片段可以通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等酶处理整个抗体而获得。全抗体的木瓜蛋白酶消化产生F(ab)2或Fab片段；全抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab')2或Fab'；全抗体的纤溶酶消化产生Facb片段。

术语“Fab”是指与用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常为IgG)获得的抗体片段基本等同的抗体片段。Fab片段的重链段是Fd片(piece)。此类片段可通过完整抗体的片段化而酶学或化学地产生，或由编码部分抗体序列的基因重组地产生，或者完全或部分合成地产生。术语“F(ab')2”是指抗体片段，其基本等同于用酶胃蛋白酶在pH4.0-4.5下消化免疫球蛋白(通常为IgG)而获得的片段。此类片段可通过完整抗体的片段化而酶学或化学地产生，或由编码部分抗体序列的基因重组地产生，或者完全或部分合成地产生。术语“Fv”是指通过非共价相互作用而结合在一起的由一个NH和一个N结构域组成的抗体片段。

如本文所用，术语“scFv”或“scFv分子”包括由一个轻链可变结构域(VL)或其一部分、和一个重链可变结构域(VH)或其一部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其一部分)衍生自相同或不同的抗体。单链Fv分子优选包含一个介于VH结构域和VL结构域之间的scFv接头。示例性scFv分子是本领域已知的，并记载于例如美国专利5,892,019；Ho等人，Gene,77:51(1989)；Bird等人，Science,242:423(1988)；Pantoliano等人，Biochemistry,30:101 17(1991)；Milenic等人，Cancer Research,51:6363(1991)；Takkinen等人，Protein Engineering,4:837(1991)。此处使用的术语“scFv接头”是指在scFv的VL和VH结构域之间插入的部分。scFv接头优选将scFv分子维持在抗原结合构象中。在一个实施方案中，scFv接头包含或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含或由Gly-Ser肽接头组成。在其他实施方案中，scFv接头包括二硫键。

术语“LILRB3抗体”、“抗LILRB3抗体”、“抗LILRB3”、“结合LILRB3的抗体”及其任何语法变体是指能够特异性结合LILRB3并具有足够亲和力的抗体，因此该抗体可用作靶向LILRB3的治疗剂或诊断试剂。本文所公开的抗LILRB3抗体与不相关的非LILRB3蛋白的结合程度小于该抗体与LILRB3结合的约10％，如通过放射免疫测定(RIA)、BIACORE^TM(使用重组LILRB3作为分析物和抗体作为配体，反之亦然)，或其它本领域已知的结合试验所测定的。在某些实施方案中，结合LILRB3的抗体的解离常数(KD)为<1μM，<100nM，<50nM，<10nM，或<1nM。

两个多肽(或多核苷酸)序列之间的术语“％相同”是指在比较窗口上序列共享的相同匹配位置的数量，考虑到必须引入添加或缺失(即空位)才能使两个序列最佳地对齐。匹配位置是指在靶序列和参考序列中出现相同的核苷酸或氨基酸的任何位置。目标序列中出现的空位不计入，这是因为空位不是核苷酸或氨基酸。同样，由于对目标序列核苷酸或氨基酸计数，而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸，因此未对参考序列中出现的空位进行计数。序列同一性的百分比是通过确定两个序列中相同氨基酸残基或核酸碱基出现的位置数来获得匹配位置数、将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100来获得序列同一性的百分比来计算的。比较序列和确定两个序列之间的百分比序列同一性，可以使用现成的软件实现，既可在线使用，也可下载。合适的软件程序可以从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列的比对。一个确定百分比序列同一性的合适程序是bl2seq，它是BLAST程序包的一部分，该程序包可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，是EMBOSS生物信息学程序包的一部分，也可从www.ebi.ac.uk/Tools/psa的欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的百分比同一性“X”计算为100x(Y/Z)，其中Y是在第一序列与第二序列对齐中评分为相同匹配的氨基酸残基的数量(通过目视检查或特定序列比对程序对齐)，Z是第二序列中的总残基数量。如果第一序列的长度比第二序列长，则第一序列与第二序列的百分比同一性将高于第二序列与第一序列的百分比同一性。本领域技术人员将理解，生成用于计算百分比序列同一性的序列比对并不限于仅由主序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可以从多个序列比对中导出。一个适合生成多序列比对的程序是ClustalW2，可从www.clustal.org(ClustalX是ClustalW2程序移植到Windows环境中的版本)获得。另一个合适的程序是MUSCLE，可从www.drive5.com/muscle获得。另外，ClustalW2和MUSCLE还可例如从EBI获得。

术语“治疗剂”是指用于治疗疾病或病症的任何生物或化学剂。治疗剂包括任何合适的生物活性化合物，生物衍生的组分如细胞、肽类、抗体和多核苷酸，以及放射化学治疗剂如放射性同位素。在一些实施方案中，所述治疗剂包括化学治疗剂或止痛剂。

关于与细胞死亡增加有关的病症例如缺血，如本文中所用的术语“治疗(treat和treating)”是指动物或人的组织和/或细胞损伤的发生率减少。预防可以是完全的，例如，在受试者中完全没有组织损伤。预防也可以是部分的，使得受试者的组织损伤的发生率比没有治疗剂的情况下发生得少。

本文所用的术语"预防(prevent、preventing和prevention)"应指疾病的发生率减少或受试者获得疾病或其相关症状的风险减少。预防可以是完全的，例如，受试者中完全没有疾病或病理性细胞。预防也可以是部分的，使得在受试者的疾病或病理性细胞的发生比没有本发明的情况下发生得少。

LILRB3

术语“白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体B3”或“LILRB3”是指哺乳动物(如人)LILRB3蛋白或mRNA，或源自哺乳动物(如人)LILRB3蛋白或mRNA的LILRB3蛋白或mRNA。本文描述了LILRB3蛋白和mRNA的非限制性实例。本领域已知LILRB3蛋白和mRNA的其他实例。

人LILRB3的两种氨基酸多态性如下：

(AAI04994)

MTPALTALLCLGLSLGPRTRVQAGPFPKPTLWAEPGSVISWGSPVTIWCQGSLEAQEYRLDKEGSPEPLDRNNPLEPKNKARFSIPSMTEHHAGRYRCHYYSSAGWSEPSDPLELVMTGFYNKPTLSALPSPVVASGGNMTLRCGSQKGYHHFVLMKEGEHQLPRTLDSQQLHSGGFQALFPVGPVNPSHRWRFTCYYYYMNTPQVWSHPSDPLEILPSGVSRKPSLLTLQGPVLAPGQSLTLQCGSDVGYDRFVLYKEGERDFLQRPGQQPQAGLSQANFTLGPVSRSHGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLNILMAGQIYDTVSLSAQPGPTVASGENVTLLCQSWWQFDTFLLTKEGAAHPPLRLRSMYGAHKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSYSSNPHLLSFPSEPLELMVSGHSGGSSLPPTGPPSTPGLGRYLEVLIGVSVAFVLLLFLLLFLLLRRQRHSKHRTSDQRKTDFQRPAGAAETEPKDRGLLRRSSPAADVQEENLYAAVKDTQSEDRVELDSQSPHDEDPQAVTYAPVKHSSPRREMASPPSSLSGEFLDTKDRQVEEDRQMDTEAAASEASQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEGEPPAEPSIYATLAIH(SEQ ID NO:132)及其变体

(XP_006723046.1):

MTPALTALLCLGLSLGPRTRMQAGPFPKPTLWAEPGSVISWGSPVTIWCQGSLEAQEYQLDKEGSPEPWDRNNPLEPKNKARFSIPSMTQHHAGRYRCHYYSSAGWSEPSDPLELVMTGFYNKPTLSALPSPVVASGGNMTLRCGSQKGYHHFVLMKEGEHQLPRTLDSQQLHSGGFQALFPVGPVTPSHRWRFTCYYYYTNTPWVWSHPSDPLEILPSGVSRKPSLLTLQGPVLAPGQSLTLQCGSDVGYDRFVLYKEGERDFLQRPGQQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILITGQIYDTVSLSAQPGPTVASGENMTLLCQSRGYFDTFLLTKEGAAHPPLRLRSMYGAHKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSRSSNPHLLSFPSEPLELMVSGHSGGSSLPPTGPPSTPGLGRYLEVLIGVSVAFVLLLFLLLFLLLLRQRHSKHRTSDQRKTDFQRPAGAAETEPKDRGLLRRSSPAADVQEENLCKRKRGDKWGCWRDRSPKISVATGRGWEGSGAPWKMVLPHTVGPPCIRWPHLGAGQGASRTERSQRTRRRTPCSAPADAAVKDTQSEDRVELDSQSPHDEDPQAVTYAPVKHSSPRREMASPPSSLSGEFLDTKDRQVEEDRQMDTEAAASEASQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEGEPPAEPS IYATLAIH(SEQ ID NO:133)及其变体。

术语“LILRB3激动剂”是指特异性结合LILRB3蛋白并激活哺乳动物细胞中LILRB3信号通路的药剂。本文描述了LILRB3激动剂的非限制性实例。LILRB3信号通路的实例公开于WO2013/181438，其全部内容并入本文。

术语“LILRB3拮抗剂”是指特异性结合LILRB3蛋白并降低哺乳动物细胞中LILRB3信号通路的活性、活化或功能的药剂。本文描述了LILRB3拮抗剂的非限制性实例。

抗LILRB3抗体

本公开提供了特异性结合LILRB3的抗体和其抗原结合片段。表1提供了抗LILRB3拮抗剂抗体(鼠)的实例。

尽管上表公开了根据Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))的CDR，本公开的抗体可包括根据任何CDR定义(例如，Kabat、Chothia、Enhanced Chothia、contact、IMGT、AbM)的CDR。可以例如通过使用AbYsis数据库确定根据不同CDR定义的抗体的CDR。

在某些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段具有表1和表2中所公开的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或全部六种CDR(其中所述CDR可根据任何CDR定义)。

本文描述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的V_H和/或V_L区可与恒定区(例如，野生型人Fc区或包括一种或多种改变的Fc区)连接。在一些实施方案中，抗体具有源自人κ序列的轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体具有源自人λ序列的轻链恒定区。在具体实施方案中，轻链恒定区包括人亚基κ1序列。在某些实施方案中，抗体具有选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的同种型。重链恒定区可以是野生型人Fc区，或包含一个或多个氨基酸取代的人Fc区。抗体可具有稳定免疫球蛋白两条重链之间二硫键的突变，例如IgG4的铰链区的突变，如本领域公开的(例如，Angal等人，Mol.Immunol,30:105-08(1993))。另见，例如，美国2005/0037000。重链恒定区也可具有改变抗体性质的取代(例如，减少一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、脱酰胺、与补体结合或甲硫氨酸氧化)。在某些情况下，抗体可具有突变，如美国专利5,624,821和5,648,260中所公开的突变。在一些实施方案中，修饰抗体以降低或消除效应功能。在一些实施方案中，重链恒定区具有以下突变的一种或多种：S228P；N297Q；和T299A(根据Kabat编号)。重链恒定区可以是嵌合的，例如，Fc区可以包含IgG4同种型的IgG抗体的CH1和CH2结构域，以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域(参见例如，美国专利申请No.2012/0100140A1，通过引用将其全部内容并入本文)。在具体实施方案中，本文所述的人源化抗LILRB3抗体具有嵌合恒定区，该嵌合恒定区包括IgG4同种型的IgG抗体的CH1和CH2结构域，以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，并且还包含S228P和N297 Q突变(根据Kabat编号)。

抗LILRB3抗体的抗原结合片段也由本公开包含。在一些实施方案中，抗LILRB3抗体或其抗原结合分子包含或由以下组成：(i)单链Fv(“scFv”)；(ii)二价抗体；(iii)sc(Fv)2；(iv)抗体的多肽链；(v)F(ab')2；或(vii)F(ab)。在一个实施方案中，抗原结合片段是Fab分子。片段抗原结合区(Fab片段)是一种结合抗原的抗体区域。它由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。这些结构域形成了异位体，即抗原结合位点。酶木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白单体裂解为两个Fab片段和一个Fc片段。重组方法也可用于制备Fab分子。在另一个实施方案中，抗原结合片段是单链片段变体(scFv)。scFv包括抗体的重链和轻链的可变区。它仅为Fab片段大小的一半，但保留了母体免疫球蛋白的原始特异性。制备ScFv的方法在本领域是公知的(参见，例如，Ahmad等人，Clinical and DevelopmentalImmunology,vol.2012,Article ID 980250,15pages,2012.doi:10.1 155/2012/980250)。

在某些实施方案中，抗LILRB3抗体或其抗原结合分子可以是靶向部分。这些靶向部分在将目标药剂(如治疗剂、小分子药物)运送到细胞中是有用的。

本公开还提供了“嵌合分子”，所述“嵌合分子”包括，例如，本文公开的至少一种LILRB3抗体或其抗原结合片段，其与至少一个异源部分连接和/或缀合和/或以其他方式相关联。在某些实施方案中，异源部分是运送或输送到细胞或其局部环境的试剂。这样的试剂可以是例如治疗剂如化学治疗剂。本文中公开的嵌合分子包括包含以下的任意分子：(i)本文中公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子(例如，Fab或scFv)，和(ii)至少一个(例如，一、二、三、四)异源部分(例如，治疗部分、化学治疗剂、半衰期延伸部分)，并且任选地包括一个或多个接头。在一些实施方案中，嵌合分子是嵌合蛋白，即嵌合分子，其中其所有组分(异源部分和/或接头)是多肽。其他嵌合分子可包含非多肽异源部分(如PEG、脂质、碳水化合物、核酸、小分子治疗剂、放射性核素、荧光探针等)和/或非多肽接头。

在一些实施方案中，嵌合分子包括衍生自第一来源的第一氨基酸序列，共价或非共价键合到衍生自第二来源的第二氨基酸序列，其中第一来源和第二来源不相同。不同的第一来源和第二来源可以包括两个不同的生物实体，或者来自相同的生物实体、或者生物实体和非生物实体的两种不同的蛋白质。嵌合分子可以包括例如衍生自至少两种不同生物来源的蛋白质。生物来源可包括任何非合成产生的核酸或氨基酸序列(例如，如本文进一步描述的基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒粒子或上述任何一种的突变体或类似物)。合成来源可以包括化学地而不是通过生物系统(例如，氨基酸序列的固相合成)产生的蛋白质或核酸序列。嵌合分子还可包括衍生自至少两种不同合成来源的蛋白质或衍生自至少一种生物来源和至少一种合成来源的蛋白质。嵌合分子还可包含衍生自第一来源的第一氨基酸序列，其共价或非共价连接到衍生自任何来源的核酸或衍生自任何来源的小的有机或无机分子。嵌合分子还可包括在第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间或在第一氨基酸序列与核酸之间，或在第一氨基酸序列与小的有机或无机分子之间的连接分子。

本文所公开的嵌合分子的异源部分可包括、由以下组成、或基本上由以下组成：例如，预防剂和/或治疗剂(例如，化学治疗剂或止痛剂)，能够改善药代动力学(PK)特性的分子(例如，血浆半衰期延长部分)，和可检测部分(例如，荧光分子或放射性核素)。在一些实施方案中，异源部分包括凝血因子(例如因子VII)。在一些实施方案中，异源部分包含可以改变缺乏这种异源部分的嵌合分子的物理化学性质的分子。在其他实施方案中，异源部分掺入嵌合分子可改善一种或多种药代动力学特性，而不会显著影响其生物活性或功能。在其他实施方案中，异源部分增加本发明嵌合分子或其片段的稳定性。

在一些实施方案中，异源部分是一种多肽，其基本上由至少约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000个氨基酸组成、或由其组成。在其他实施方案中，异源部分是一种多肽，其基本上由约100至约200个氨基酸、约200至约300个氨基酸、约300至约400个氨基酸、约400至约500个氨基酸、约500至约600个氨基酸、约600至约700个氨基酸、约700至约800个氨基酸、约800至约900个氨基酸，或约900至1000个氨基酸组成，或由其组成。

在一些实施方案中，嵌合分子包含至少一种异源部分，即“半衰期延伸部分”。半衰期延伸部分可以包括，例如，(i)XTEN多肽；(ii)Fc；(iii)白蛋白，(iv)白蛋白结合多肽或脂肪酸，(v)人绒毛膜促性腺激素β亚单位C末端肽(CTP)；(vi)PAS；(vii)HAP；(viii)转铁蛋白；(9)聚乙二醇(PEG)；(x)羟乙基淀粉(HES)；(xi)聚唾液酸(PSA)；(xii)清除受体或其阻断嵌合分子与清除受体的结合的片段；(xiii)低复杂度肽类；(xiv)vWF；或(xv)其任何组合。在一些实施方案中，半衰期延伸部分包括Fc区。在其他实施方案中，半衰期延伸部分包括由接头融合的两个Fc区。示例性异源部分还包括，例如，FcRn结合部分(例如，完整Fc区或其结合FcRn的部分)，单链Fc区(scFc区，例如，如记载于美国公开No.2008-0260738和国际公开WO 2008-012543和WO2008-1439545)，或可加工的scFc区。在一些实施方案中，异源部分可包括非多肽部分例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或这些部分的任何衍生物、变体或组合的连接位点。

在某些实施方案中，本公开的嵌合分子包含至少一个(例如，一个、两个、三个或四个)半衰期延伸部分，该半衰期延伸部分与不存在这种异源部分的相应嵌合分子的体内半衰期相比，增加嵌合分子的体内半衰期。嵌合分子的体内半衰期可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，例如，活性测定(显色测定或一阶段凝血aPTT测定)、ELISA等。在一些实施方案中，一种或多种半衰期延伸部分的存在导致嵌合分子的半衰期与不存在这类一种或多种半衰期延伸部分的相应嵌合分子的半衰期相比增加。包括半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期为至少约1.5倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，至少约6倍，至少约7倍，至少约8倍，至少约9倍，至少约10倍，至少约11倍，或至少约12倍长于不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期。

在一个实施方案中，包含半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期为约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍、或约1.5倍至约10倍长于不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期。在另一个实施方案中，与不存在这类半衰期延伸部分的相应嵌合分子的体内半衰期相比，包含半衰期延伸部分的嵌合分子的半衰期延伸约2倍至约10倍，约2倍至约9倍，约2倍至约8倍，约2倍至约7倍，约2倍至约6倍，约2倍至约5倍，约2至约4倍，约2至约3倍，约2.5至约10倍，约2.5至约9倍，约2.5至约8倍，约2.5至约7倍，约2.5至约6倍，约2.5至约5倍，约2.5至约4倍，约2.5至约3倍，约3至约10倍，约3至约9倍，约3至约8倍，约3至约7倍，约3至约6倍，约3至约5倍，约3至约4倍，约4至约6倍，约5倍至约7倍，或约6倍至约8倍。

抗体的特性

本文所述抗体的LILRB3结合特性可通过任何标准方法测量，例如，以下一种或多种方法：表面等离子共振(SPR)、BIACORE^TM分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)、和荧光共振能量转移(FRET)。

使用系统可以分析目标蛋白(抗LILRB3抗体或其功能片段)与靶标(如LILRB3)的结合相互作用。在这种方法中，FortéBio公司制造的几种仪器(如Qke和QK)中的一种用于确定蛋白质相互作用、结合特异性和表位映射。系统提供了一种简单的方法，通过测量偏振光的变化来监测实时结合，偏振光沿着定制的吸管端(tip)传播，然后返回到传感器。

目标蛋白(抗LILRB3抗体或其功能片段)与靶标(如LILRB3)的结合相互作用可使用表面等离子共振(SPR)分析。SPR或生物分子相互作用分析(Biomecular InteractionAnalysis，BIA)实时检测生物特异性相互作用，而没有标记任何相互作用物质。BIA芯片的结合表面处质量的变化(表示结合事件)导致近表面光的折射率发生变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)。折射率的变化产生可检测的信号，测量其作为生物分子之间的实时反应的指示。使用SPR的方法记载于例如美国专利No.5,641,640；Raether(1988)SurfacePlasmons Springer Verlag；Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和由BIAcore InternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的在线资源。来自SPR的信息可用于提供平衡离解常数(Kd)和动力学参数(包括Kon和Koff)的准确和定量的测量，以使生物分子与靶标结合。

也可通过使用BIACORE色谱技术评估不同抗LILRB3抗体或其功能片段相互竞争与人LILRB3结合的能力来直接定位表位(Pharmacia BIAtechnology Handbook,“EpitopeMapping”,Section 6.3.2,(May 1994)；另见Johne等人(1993)J.Immunol.Methods,160:191-198)。

当采用酶免疫测定法时，将包含抗体的样品，例如，抗体产生细胞的培养上清液或纯化抗体添加到抗原包被板中。加入标记有碱性磷酸酶等酶的二抗，培养板，洗涤后加入对硝基苯磷酸等酶底物，测定吸光度，评估抗原结合活性。

评估抗体的其他一般指南，如Western印迹和免疫沉淀试验，可见于Antibodies:ALaboratory Manual,由Harlow和Lane编辑,Cold Spring Harbor press(1988))。

为了表征抗体的拮抗和激动生物活性，发明人进行了LPS刺激的PBMC(最重要的，主要靶向髓系细胞)和OKT3刺激的PBMC(主要靶向T细胞)作为中试筛选策略。如图8所示，该图提供了识别LLRIB3拮抗剂和激动剂的标准，拮抗性抗体可增加TNFa，伴以降低/未改变的IL-10分泌，同时增加/未改变的T细胞增殖(TNFa>1.5倍，IL-10<1.1倍)。而激动性抗体能增加IL-10分泌，伴以降低/未改变的TNFa分泌，同时降低的T细胞增殖(IL-10>1.2倍，TNF a<1.1倍，T细胞增殖<0.8倍)。抗体候选物对LPS和OKT3刺激的PBMC的影响见表3-6。值得注意的是，从基于T细胞的试验中筛选的抗体候选物的拮抗和激动生物活性多数是与基于髓系细胞的试验一致的，但少数会与其不一致。此外，对抗体候选物进行LILRB3报告试验、M1/M2分化/人MDSC标记物CD163、CD206、HLA-DR、PD-L1和CD14、CD16(图2C)以及混合淋巴细胞反应(图3C)。拮抗剂可降低M2的分化程度(下调CD163、CD206、PD-L1)，增加HLA-DR，降低人MDSC CD33+CD14+CD16+，而相对地，激动剂则可反调节或维持上述参数。这些试验为抗体候选物的活性的测定或效价的比较提供了重要的参数。

其他药剂

MDSC

MDSC最近被认为是免疫系统的中央调节剂之一。MDSC代表包括髓系祖细胞、未成熟巨噬细胞、未成熟粒细胞和未成熟树突状细胞在内的髓系来源的细胞的异质性群体。MDSC分化并极化为Gr1⁺CD11b⁺CD115⁺Ly6C⁺单核(M)-细胞和Gr1⁺CD11b⁺Ly6G⁺粒细胞(G)-细胞(Gabrilovich等人，Cancer Res.67:425,2007；Huang等人，Cancer Res.66:1123-1131,2006；Movahedi等人，Blood 111:4233-4244,2008)。人MDSC表征为CD11b⁺CD14^LowCD33⁺或Lin-HLA-DR^Low-CD33⁺髓系细胞(Ostrand-Rosenberg等人，J.Immunol.182:4499-4506,2009；Raychaudhuri等人，Neurol.Oncol.13:591-599,2011)。反映了1型经典活化样巨噬细胞(M1)和2型替代活化样巨噬细胞(M2)的命名，MDSC可分化并极化为M1细胞和M2细胞(M1细胞表达iNOS、TNF-α、IFN-gR、MHC I类和CCR7，M2细胞表达精氨酸酶、IL-10、CD36、CD206和CCR2)。肿瘤相关MDSC主要表现为M2样表型，具有促肿瘤和免疫抑制活性。M2细胞由多种增强的特征标记物如IL-10、精氨酸酶、IL-10、Tie-2、CD36、CD206、IL-4R和CCR2表型表征(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M1细胞的iNOS、NO、TNF-α、IFN-γR、MHCI、CCR7的表达升高(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。G2细胞上调精氨酸酶、CCL2、CCL5和MMP-9的表达。相反，G1细胞显示TNF-α、Fas和ICAM-1的表达水平升高。

MDSC通过与T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞经由多种机制相互作用而发挥免疫抑制作用。关于MDSC与其他免疫细胞如何相互作用的详细描述见Bunt等人(J.Leukoc.Biol.85:996-1004,2009)、Ostrand-Rosenberg等人(Nat.Rev.Immunol.12:253-268,2012)、和Sinha等人(J.Immunol.179:977-983,2007)。就T细胞而言，MDSC可诱导效应性T细胞(Teff)失活和凋亡(参见，例如，Apolloni等人，J.Immunol.165:6723-6730,2000)和扩增调节性T细胞(Treg)(参见，例如，Adeegbe等人，Cell Transplant.20:941-954,2011)。MDSC对T细胞抑制和Treg扩增的调节是细胞接触、MHCⅡ类、NO和/或精氨酸酶依赖的。M2细胞与其M1样对应物相比在T细胞共培养中具有较强的抑制Teff活化和扩增的能力(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M2细胞在体外和体内的Treg扩增能力均高于M1细胞(Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M2细胞诱导的Treg细胞增加可似乎是IL-10、IL-4和IL-13介导的以及精氨酸酶依赖的(Ma等人，Immunity34:385-395,2011)。与M1/M2细胞的功能相似，G1和G2细胞分别具有抗肿瘤和促肿瘤活性(Fridlender等人，Cancer Cell 16:183-194,2009)。

MDSC亚群从一种表型向另一种表型的极化是伴随着功能变化的。M2细胞主要通过包括增加精氨酸酶和免疫抑制细胞因子的增强免疫抑制作用来促进肿瘤生长(参见，例如Ma等人，Immunity 34:385-395,2011)。M1细胞通过增加自由基、死亡配体和免疫刺激细胞因子，增加直接杀伤肿瘤并促进抗肿瘤免疫的发展(参见，例如Ma等人Immunity 34:385-395,2011)。M1/M2的极化平衡可对疾病和健康有显著影响。

本领域已知制备和分离MDSC的方法。例如，可以使用识别本文所述不同MDSC亚群的任何特定蛋白标记物的抗体利用荧光辅助细胞分选来分离MDSC。制备和分离MDSC的示例性方法记载于美国专利申请公开第2008/0305079号和WO 11/087795号中(其各自均以引用的方式并入本文)。

动员剂

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种动员剂。动员剂刺激哺乳动物骨髓中MDSC的释放。动员剂的非限制性实例包括：例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、环磷酰胺、AMD3100、Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、GM-CSF、M-CSF、IL-34、TSLP-1、SCF、FK560、S100A8、和S100 A9。

在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含动员剂和至少一种LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4和/或LILRB5激动剂。在一些实施方案中，组合物包含动员剂，至少一种LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4和/或LILRB5激动剂，和至少一种JNK抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了进一步包含动员剂且不包括MDSC的组合物。

JNK抑制剂

在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种JNK抑制剂。JNK抑制剂的非限制性实例包括例如，BI-78D3、SP600125、AEG 3482、JIP-1、SU 3327、TCS JNK 5a和TCS JNK6o。JNK抑制剂的其他实例记载于WO 00/35906、WO 00/35909、WO 00/35921、WO 00/64872、WO 01/12609、WO 01/12621、WO 01/23378、WO 01/23379、WO 01/23382、WO 01/47920、WO01/91749、WO 02/046170、WO 02/062792、WO 02/081475、WO 02/083648和WO 03/024967，其各自均以引用方式并入本文。

抗炎剂

在某些情况下，该组合物还可包含一种或多种抗炎剂。抗炎剂包括，例如，皮质类固醇、非甾体抗炎剂(NSAID，例如，环氧合酶I(COXI)抑制剂和环氧合酶II(COX-II)抑制剂)、免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)和生物制品。本文所述或本领域已知的任何示例性抗炎剂均可包括在本文所述的组合物中。

NSAID的非限制性实例为水杨酸盐(如阿司匹林、双氟尼酸(diflusinal)和双水杨酸盐(salsalate))、丙酸衍生物(如布洛芬、右布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普嗪和洛索洛芬)、乙酸衍生物(如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸和萘丁美酮)、烯醇酸衍生物(如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康和伊索昔康)、芬那酸衍生物(如甲氨蝶呤酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸和托芬那酸)、磺胺类(如尼美舒利)、利克飞龙(licofelone)和赖氨酸氯尼辛。在一些实施方案中，NSAID是COX-I抑制剂或COX-II抑制剂。COX-I抑制剂的非限制性实例包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。COX-II抑制剂的非限制性实例包括塞来昔布、伐地昔布和罗非昔布。

ImSAID的非限制性实例包括FEG(Phe-Glu-Gly)、其D-异构体feG和SGP-T肽。皮质类固醇的非限制性实例包括氢化可的松、醋酸可的松、替可的松特戊酸酯(tixocortolpivalate)、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德、曲安奈德醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地索奈德、氟欣诺隆(fluocinolone)、哈西奈德、倍他米松、地塞米松和氟可龙。生物制品的非限制性实例包括托珠单抗、赛妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、阿那白滞素、阿巴西普、依法利珠单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗和戈利木单抗。

免疫抑制剂

本文所述的组合物也可包含一种或多种免疫抑制剂。免疫抑制剂的非限制性实例包括霉酚酸酯、环孢素、环孢素、他克莫司、西罗莫司和吡美莫司。本领域已知其他免疫抑制剂。

化学治疗剂

在一些实施方案中，该组合物还包含一种或多种化学治疗剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂(例如，环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、瘤可宁和美法仑)、蒽环类(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)、埃坡霉素类、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(如伏立诺他和罗米地辛)、拓扑异构酶II抑制剂(如依托泊苷、替尼泊苷和他氟泊苷(tafluposide))、激酶抑制剂(如硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、和Vismodegib)、贝伐单抗、西妥昔单抗、易匹木单抗(ipilimumab)、易匹木单抗、奥法木单抗、奥美珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、维罗非尼、赫赛汀、核苷酸类似物(如阿扎胞苷、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨、阿糖胞苷、多西氟尿苷、双氟尼酸、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤和硫代鸟嘌呤)、肽类抗生素(如博来霉素和放线菌素)、铂类药物(如卡铂、顺铂和奥沙利铂)、维甲酸类(如维A酸、阿曲替诺和贝沙罗汀，和长春花生物碱(如长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)。

止痛剂

在一些实施方案中，组合物可进一步包含一种或多种止痛剂。本文所述或本领域已知的任何示例性止痛剂均可包括在本文所述的组合物中。止痛剂的非限制性实例包括阿片类药物(如吗啡、鸦片、可待因、羟考酮、氢可待因、二吗啡、二氢吗啡、哌替啶(pethidine)、丁丙诺啡、芬太尼、美沙酮、哌替啶(meperidine)、喷他佐辛、二哌酮和曲马多)、对乙酰氨基酚、文拉法辛、氟哌替汀、奈福帕姆、加巴喷丁、普瑞巴林、罗非那定、环苯那平、曲唑酮、可乐定、度洛西汀和阿米替林。

抗LILRB3抗体的制备方法

本公开的抗LILRB3抗体(或抗体的抗原结合结构域或其功能片段)可在细菌或真核细胞中产生。为了产生目标多肽，构建了编码该多肽的多核苷酸，将其导入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达。采用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，筛选转化子，培养宿主细胞，回收抗体。

如果要在细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))中表达抗体，则表达载体应具有允许在细菌细胞中扩增该载体的特征。此外，当以大肠杆菌如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue为宿主时，载体必须具有启动子，例如可允许在大肠杆菌中有效表达的lacZ启动子(Ward等人341:544-546(1989)、araB启动子(Better等人，Science,240:1041-1043(1988))、或T7启动子。例如，此类载体的实例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用此表达载体时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可包含用于抗体分泌的信号序列。对于产生进入大肠杆菌的周质，PelB信号序列(Lei等人，J.Bacteriol.,169:4379(1987))可用作抗体分泌用信号序列。对于细菌表达，可采用氯化钙法或电穿孔法将表达载体导入细菌细胞。

如果要在CHO、COS、293、293T和NIH3T3细胞等动物细胞中表达抗体，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))、或CMV启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列之外，重组表达载体还可以携带其他序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制的起点)和可选择的标记基因。可选择的标记基因有助于选择已导入载体的宿主细胞(参见例如美国专利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型的可选择的标记基因使已引入有载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤产生耐药性。具有可选择的标记的载体的示例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体。表达多肽的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，与DHFR可选择的标记一起使用，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601 621)中所述)、人胚肾293细胞(如293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞系如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、以及来自转基因动物如转基因哺乳动物的细胞。例如，该细胞是乳腺上皮细胞。

本公开的抗体可以从宿主细胞的内部或外部(如培养基)分离出来，并且被纯化为实质上纯且均一的抗体。通常用于多肽的分离和纯化方法可用于本文所述抗体的分离和纯化，但不限于任何特定方法。抗体可以通过适当的选择和结合以下来分离和纯化：例如柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和重结晶。层析包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析(Strategies for Protein Purification and Characterization:ALaboratory Course Manual.Daniel R.Marshak等人编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press,1996)。采用HPLC和FPLC等液相色谱仪进行层析。用于亲和层析的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GEHealthcare Biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。

本公开还提供了编码本文公开的抗LILRB3抗体或其抗原结合分子的核酸分子或核酸分子组。在一个实施方案中，本发明包括编码多肽链的核酸分子，其包括如本文所述的抗LILR3抗体的轻链或其抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明包括编码多肽链的核酸分子，其包括如本文所述的抗LILR3抗体的重链或其抗原结合分子。

还提供了一种载体或载体组，该载体或载体组包括该核酸分子或该核酸分子组或其互补体，以及包含该载体的宿主细胞。

本公开还提供了一种制备本文公开的LILRB3或其抗原结合分子或嵌合分子的方法，这种方法包括培养本文公开的宿主细胞并从培养基中回收抗体、其抗原结合分子或嵌合分子。

多种方法可用于重组地生产本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文公开的嵌合分子。可以理解的是，由于密码子的简并性，各种核酸序列将编码多肽的氨基酸序列。所需的多核苷酸可以通过从头固相DNA合成或通过PCR突变早先制备的多核苷酸来产生。

为了重组生产，将编码多肽(例如，本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文公开的任何嵌合分子)的多核苷酸序列插入适当的表达载体中，即，包含所插入的编码序列的转录和翻译必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下，插入复制和翻译必需元件。

编码多肽(例如，本文公开的LILRB3抗体或其抗原性结合分子，或本文公开的任何嵌合分子)的核酸以适当的阅读框插入载体。然后将该表达载体转染到合适的靶细胞中，该靶细胞将表达该多肽。本领域已知的转染技术包括但不限于磷酸钙沉淀(Wigler等人，1978,Cell 14:725)和电穿孔(Neumann等人，1982,EMBO J.1:841)。各种宿主表达载体系统可用于在真核细胞中表达本文所述的多肽(例如，本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文公开的任何嵌合分子)。在一个实施方案中，真核细胞是动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，293细胞、PerC6细胞、CHO细胞、BHK细胞、Cos细胞、HeLa细胞)。当该多肽在真核细胞中表达时，编码该多肽(例如，本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文公开的任何嵌合分子)的DNA也可编码信号序列，该信号序列允许该多肽分泌。本领域技术人员将理解，当翻译多肽时，信号序列被细胞裂解以形成成熟的嵌合分子。各种信号序列在本领域是已知的，并且是熟练技术人员所习知的。或者，如果信号序列不包括在内，则可以通过裂解细胞来回收多肽(例如，本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子，或本文公开的任何嵌合分子)。

药物组合物

本公开还提供了包含以下的一种或多种的药物组合物：(i)本文公开的LILRB3抗体或其抗原结合分子；(ii)如本文公开的编码LILRB3抗体或抗原结合分子的核酸分子或核酸分子组；或(iii)本文公开的一种或多种载体，以及药学上可接受的载体。

本文所述的抗LILRB3抗体或其片段可配制为向受试者施用的药物组合物，例如，用于治疗本文所述的疾病。通常，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有在生理上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。该组合物可包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如Berge,S.M.,等人，(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。

药物制剂是一种公认的技术，并进一步记载于例如Gennaro(编辑),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编辑),Handbook of Pharmaceutical Excipients American PharmaceuticalAssociation,第3版(2000)(ISBN:091733096X)。

药物组合物可以有多种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。首选的形式可以取决于预期的施用和治疗应用方式。典型的用于本文所述药剂的组合物是以可注射或可输注的溶液的形式。

在一个实施方案中，本文描述的抗体用赋形剂材料如柠檬酸钠、七水磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、和稳定剂配制。例如，可在缓冲溶液中以合适的浓度提供，并可储存在2-8℃下。在一些其他实施方案中，组合物的pH约为5.5至7.5(例如，5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5)。

药物组合物还可包括在配制时减少抗体聚集的试剂。聚集减少剂的实例包括选自由甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的组的一种或多种氨基酸。可将这些氨基酸加入制剂中，使其浓度为约0.5mM至约145mM(例如，0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM)。药物组合物还可包括糖(例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇)和/或强力改性剂(tonicity modifier)(例如，氯化钠、甘露醇或山梨醇)和/或表面活性剂(例如，聚山梨酯-20或聚山梨酯-80)。

该组合物可配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其它适于在高浓度下稳定储存的有序结构。无菌注射溶液可通过在适当溶剂中加入所需量的本文所述的试剂和上述一种成分或成分的组合(根据需要)，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将本文所述的试剂加入到含有基本分散体介质和来自上文列举的那些所需的其他成分的无菌载体中来制备的。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所述试剂以及其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分的粉末。例如，通过使用卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在组合物中加入延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长注射组合物的吸收。

在某些实施方案中，抗体可用载体制备，该载体可保护化合物免受快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可生物降解的、与生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚酯和聚乳酸。许多制备此类制剂的方法是专利的或普遍已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。

在一个实施方案中，药物制剂包含浓度约为0.005mg/mL至500mg/mL的抗体(例如，0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL)，与药学上可接受的载体一起配制。在一些实施方案中，抗体是在无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水中配制的。药物制剂的pH值可在5.5至7.5之间(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)。

药物组合物可包括本文所述的“治疗有效量”的药剂。这种有效量可以根据施用药剂的作用或如果使用了多于一种药剂则为药剂的组合作用来确定。治疗有效量的药剂也可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化，以及化合物在个体中引起期望反应的能力，例如至少一种疾病参数的改善或至少一种病症的改善。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害的作用被治疗有益作用超过的量。

施用

抗体或其抗原结合片段，或编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核酸，可通过各种方法施用给受试者，例如需要其的受试者，例如人或动物受试者。对于许多应用，施用途径是静脉注射或肠胃外注射(IV)、皮下注射(SC)、腹腔注射(IP)或肌肉注射(IT)中的一种。还可以使用其他的肠胃外施用模式。这种模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经皮、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射。

在一个实施方案中，本发明抗体的施用途径为肠胃外施用。本文中使用的术语肠胃外包括静脉、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。肠胃外施用的静脉形式是优选的。虽然所有这些形式的施用显然被认为是在本发明的范围内，但施用形式将是一种注射溶液，尤其是静脉或动脉内注射或滴注。通常，合适的注射用药物组合物可包括缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在与本文的教导相容的其他方法中，多肽可直接递送至不利细胞群体的部位，从而增加病损组织于治疗剂的暴露。

肠胃外施用制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。药学上可接受的载体包括，但不限于，0.01-0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％生理盐水。其他常见的肠胃外运载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉内的运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地说，适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水)或分散体和用于即时制备无菌注射用溶液或分散体的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须是无菌的，并且应该是流体的，以致于存在容易的可注射性。它应在制造和储存条件下保持稳定，并优选防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

可以通过各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等，来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，将优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注射组合物的吸收。

在任何情况下，无菌注射溶液均可通过在适当的溶剂中加入所需量的活性化合物(例如，单独的多肽或与其他活性剂组合的多肽)，并根据需要与其中列举的一种或多种成分组合，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将活性化合物加入无菌运载体中来制备的，该载体含有基本的分散体介质和所需的来自上文列举的其他成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末以及其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分。对注射制剂进行处理，装入安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶等容器中，并按照本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以包装和以试剂盒的形式销售。这类制造品优选具有标签或包装说明书，表明相关的组合物可用于治疗患有或易发生凝血障碍的受试者。

本公开组合物的用于治疗病况的有效剂量，取决于许多不同因素，包括施用手段、靶点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物也可以治疗。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法进行滴定，以优化安全性和有效性。

抗LILRB3抗体或其片段的施用途径和/或方式也可例如通过监测受试者根据个体情况而定。

抗体或其片段可以固定剂量或以毫克/千克剂量施用。剂量也可选择以减少或避免产生针对抗LILRB3抗体或其片段的抗体。调整剂量方案以提供期望的应答，例如治疗应答或组合治疗效果。通常，可以使用抗体或其片段的剂量(以及任选的第二种药剂)，以便向受试者提供生物可利用量的药剂。例如，可以施用0.1-100mg/kg、0.5-100mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、0.5-20mg/kg、0.1-10mg/kg、或1-10mg/kg的剂量。还可以使用其他剂量。在某些实施方案中，需要治疗的受试者的抗体或其片段以约1mg/kg至约30mg/kg的剂量施用该抗体或其片段。在一些实施方案中，需要用抗LILRB3抗体或其片段治疗的受试者以1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg 10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、或50mg/kg的剂量施用。在具体实施方案中，抗体或其片段以1mg/kg至3mg/kg的剂量皮下施用。在另一实施方案中，其抗体或片段以4mg/kg至30mg/kg的剂量静脉施用。

组合物可包括约1mg/mL至100mg/ml或约10mg/mL至100mg/ml或约50至250mg/mL或约100至150mg/ml或约100至250mg/ml的抗体或其片段。

本文所用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适合接受治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每一单位含有一定量的抗体或其片段，其计算成产生与所需的药物载体相关并任选地与另一种药物相关的所需治疗效果。可施用一次或多次剂量。另外，抗体或其片段可以通过连续输注施用。

抗体或其片段的剂量可例如在一段时间内(一个疗程)以周期性间隔施用，足以包括至少2剂、3剂、5剂、10剂或更多剂，例如，每日一次或两次，或每周约一至四次，或优选每周地、每两周地(每两周一次)，每三周地，每月地，例如，约1至12周，优选2至8周，更优选3至7周，甚至更优选4、5或6周。可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间的因素包括：疾病或病症的阶段或严重程度、制剂、递送途径、以前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及现有的其他疾病。此外，用治疗有效量的化合物向受试者进行治疗可包括单一治疗，或优选地，可包括一系列治疗。

如果受试者有发生本文所述疾病的风险，抗体或其片段可在疾病完全发作前施用，例如作为预防措施。这种预防性治疗的持续时间可以是单剂量的抗体或其片段，或者治疗可以继续(例如，多剂量)。例如，患有该病的人或有此病倾向的人可以用抗体或其片段治疗数天、数周、数月甚至数年，以防止该病的发生或暴发。

在某些实施方案中，其抗体或片段以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度皮下施用(例如，1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL，200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL)。在一个实施方案中，抗LILRB3抗体或其片段以50mg/mL的浓度皮下施用。在另一个实施方案中，抗体或其片段以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度静脉施用。在一个实施方案中，抗体或其片段以50mg/mL的浓度静脉施用。

抗LILRB3抗体或其片段可单独或与(即，通过联合施用或序贯施用)其他可用于治疗本文所述癌症或免疫疾病的治疗剂联合施用，可以是期望的。这种治疗剂可以是化学或生物性质的。术语"生物"或"生物剂"是指由生物体和/或其产品制成的任何药学上的活性剂用作治疗剂。在一个实施方案中，附加治疗蛋白包括在本发明的药物组合物中。

上述范围中的中间剂量也意欲在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据经经验分析确定的任何其他时间表施用此类剂量。示例性治疗需要多剂量施用，持续时间至少为6个月。在一些方法中，两种以上的多肽可以同时施用，在这种情况下，每种多肽的施用剂量在所指示的范围内。

本发明的多肽可多次施用。单次施用之间的间隔可以是每日、每周、每月或每年。通过测量患者的修饰多肽或抗原的血液水平，间隔也可以是不规则的。或者，多肽可以作为一种缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少频繁的施用。剂量和频率随患者的多肽半衰期而变化。

施用的剂量和频率可因治疗是预防性的还是治疗性的而有所不同。在预防性应用中，包含本发明多肽或其混合物的组合物施用至尚未处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力或最小化疾病的影响。这样的量被定义为“预防性有效剂量”。在较长的时间内，相对低的剂量是以相对不频繁的间隔施用的。有些患者的余生将继续接受治疗。

使用方法

本公开的抗体或其抗原结合片段可用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法。疾病或状况可包括但不限于癌症。

例如，本发明包括使用抗LILRB3，包括具有抗LILRB3活性的拮抗剂或激动剂。本发明包括向受试者施用抗LILRB3抗体或其片段，并考虑人类和兽医治疗用途。说明性的兽医受试者包括哺乳动物受试者，如农场动物和家畜。

本文提供了在哺乳动物中刺激促炎免疫应答的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB3抗体或其片段。

在一些实施方案中，哺乳动物的促炎免疫应答增加可检测为哺乳动物的一种或多种促炎蛋白水平增加(例如，C反应蛋白、IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-23、IL-17、和基质金属蛋白酶中的一种或多种增加)或哺乳动物中效应T细胞(Teff)的数量增加(例如，与处理前哺乳动物中一种或多种促炎蛋白的水平和/或哺乳动物中效应T细胞的水平相比，或与对照健康哺乳动物中存在的一种或多种促炎蛋白的水平和/或效应T细胞的水平相比)。

本文提供的是哺乳动物治疗方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB3抗体或其片段。

在一些实施方案中，哺乳动物(例如，人类)先前被诊断为患有癌症(例如，本文所述的任何不同类型的癌症)。癌症的非限制性实例包括：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、心脏肿瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、头颈部癌、心脏癌、肝癌、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、口癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、阴茎癌、垂体肿瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌，子宫癌、阴道癌和外阴癌。患有癌症的哺乳动物可出现以下一种或多种症状：疲乏、皮肤下可感觉到的肿块或增厚、体重变化、皮肤变化(如发黄、皮肤变暗或发红、不能愈合的疮或现有的痣变化)、肠道或膀胱习惯的变化、持续咳嗽、吞咽困难、声音嘶哑、进食后持续的消化不良或不适，持续的、无法解释的肌肉或关节疼痛，以及无法解释的和持续的发热或盗汗。哺乳动物所经历的特定症状将取决于特定类型的癌症。哺乳动物可根据观察哺乳动物中的一种或多种癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何癌症症状)而被诊断为患有癌症。哺乳动物也可根据成像(例如，磁共振成像、计算机断层扫描和/或X射线)和/或组织活检结果被诊断为癌症。哺乳动物也可根据使用分子诊断试验(例如，基于前列腺癌特异性抗原的检测，或乳腺癌易感2蛋白、乳腺癌易感1蛋白或肿瘤抑制蛋白(例如，p53)的突变)被诊断为患有癌症。本领域已知其他诊断哺乳动物患有癌症的方法。治疗癌症的有效性可通过哺乳动物中癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何癌症症状)的数量减少和/或哺乳动物中一种或多种癌症症状(例如，本文所述或本领域已知的任何症状)的频率和/或严重程度的减少来检测。对哺乳动物中的癌症进行有效治疗也可通过哺乳动物中的肿瘤生长速率的下降来评估(例如，与治疗施用前哺乳动物中的肿瘤生长速率相比，或与未施用治疗或施用不同治疗的患有相同类型癌症的对照哺乳动物相比)。哺乳动物癌症的有效治疗也可以通过哺乳动物癌症缓解时间的延长来观察(例如，与未施用治疗或施用不同治疗的患有相同类型癌症的对照哺乳动物相比)。

哺乳动物可以是女性或男性，也可以是成年或少年(如婴儿)。哺乳动物可以以前曾接受过化学治疗剂和/或止痛剂治疗和/或对化学治疗剂和/或止痛剂反应不佳。哺乳动物可以患有非转移性癌症。在一些实施方案中，哺乳动物可以患有转移性癌症。如果哺乳动物是成人，哺乳动物可以是，例如18至20岁或至少或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁，或至少或约100岁。

还提供了在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗LILRB3抗体或其片段。

治疗用装置和试剂盒

包括本文所述的抗LILRB3抗体或其片段的药物组合物可与医疗装置一起施用。该装置可设计为具有便携性、室温储存和易用性等特点，以便在紧急情况下使用，例如由未受过训练的受试者或现场急救人员从医疗设施和其他医疗设备中取出。该装置可包括，例如，一个或多个壳体用于储存含有抗LILRB3抗体或其片段的药物制剂，并可递送抗体或其片段的一个或多个单位剂量。该装置还可配置成施用第二试剂，例如化学治疗剂，作为也包括抗LILRB3抗体或其片段的单一药物组合物，或作为两种单独的药物组合物。

抗LILRB3抗体或其片段可在试剂盒中提供。在一个实施方案中，该试剂盒包括(a)含有包含本文所述的抗LILRB3抗体或其片段的组合物的容器，以及任选地(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、营销的或其他与本文所述方法和/或为治疗目的使用试剂有关的材料。

在一个实施方案中，该试剂盒还包括用于治疗本文所述疾病的第二试剂。例如，该试剂盒包括包含抗LILRB3抗体或其片段的组合物的第一容器和包含第二试剂的第二容器。

这些试剂盒的信息材料的形式不受限制。在一个实施方案中，所述信息材料可包括关于所述化合物的生产、所述化合物的分子量、浓度、到期日期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及施用抗LILRB3抗体或其片段的方法，例如，以合适的剂量、剂型或施用方式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用方式)施用，以治疗具有或存在本文所述疾病风险的受试者。这些信息可以各种格式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或对实质性材料提供例如在因特网上的链接或地址的信息。

除抗LILRB3抗体或其片段外，试剂盒中的组合物还可包括其他成分，如溶剂或缓冲液、稳定剂或防腐剂。抗LILRB3抗体或其片段可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优选实质上纯和/或无菌。当试剂在液体溶液中提供时，液体溶液优选为水溶液。在某些实施方案中，液体溶液中的抗LILRB3抗体或其片段的浓度为约25mg/mL至约250mg/mL(例如，40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL和200mg/mL)。当抗LILRB3抗体或其片段作为冻干产品提供时，其抗LILRB3抗体或其片段为约75mg/小瓶至约200mg/小瓶(例如，100mg/小瓶、108.5mg/小瓶、125mg/小瓶、150mg/小瓶)。冻干粉通常通过加入合适的溶剂来复溶。溶剂，例如无菌水或缓冲液(例如PBS)，可以任选地提供在试剂盒中。

该试剂盒可包括针对组合物或包含试剂的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于组合物和信息材料的单独容器、隔板或隔室。例如，组合物可以包含在瓶子、小瓶或注射器中，信息材料可以包含在塑料套管或包装中。在其他实施方案中，该试剂盒的单独的元件包含在单个的、不被分割的容器中。例如，该组合物包含信息材料以标签形式附在其上的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，该试剂盒包括多个(例如，包装的)单独的容器，每个容器包含一种或多种单位剂型(例如，本文所述的剂型)的试剂。容器可包括组合单位剂量，例如，包括抗LILRB3抗体或其片段和第二种试剂二者的单位，例如，以期望的比率。例如，该试剂盒包括多个注射器、安瓿、铝箔包装、泡罩包装或医疗器械，例如，各自包含单一的组合单位剂量。该试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，不透湿或不透蒸发的)和/或不透光的。

该试剂盒任选地包括适于施用该组合物的装置，例如注射器或其它合适的递送装置。该装置可以预先装有一个或两个试剂，或者可以是空的，但适合装载。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，其不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

抗体纯化

克隆性杂交瘤细胞在ClonaCell-HY培养基A(StemCellTechnologies)中培养，然后用杂交瘤SFM(ThermoFisher Scientific)适应无血清条件。将杂交瘤细胞在50mL的杂交瘤细胞系SFM中扩增2周或直至培养液耗尽。将含抗体的上清液离心，然后无菌0.22微米过滤。抗体采用Amicon Ultra-15离心过滤浓缩器浓缩，标称分子量限为100kDa(Millipore)。然后根据制造商的说明使用Nab蛋白A/G Spin试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化浓缩抗体。纯化的抗体用Zeba旋转柱(Thermo Fisher Scientific)脱盐。

杂交瘤IgL和IgH链测序

用Trizol抽提法从杂交瘤克隆中提取RNA。利用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)，根据生产厂家的指示，从纯化的RNA合成cDNA。用简并引物对Ig重链和轻链进行PCR。扩增的PCR产物随后测序(GeneWiz)，并使用国际免疫遗传学信息系统的IMGT/V-QUEST进行验证。

杂交瘤序列

利用小鼠κ和重链Ig基因侧翼的简并引物，对所述克隆测定重链和轻链基因及互补决定区(CDR)。用RT-PCR方法将从早期杂交瘤细胞中提取的总RNA转化为cDNA，然后对重链和轻链基因进行PCR扩增。PCR产物经Sanger测序后与数据库中已知的等位基因框架进行Ig-BLAST比较。生产性抗体序列列于表3，显示最接近对齐的小鼠等位基因和CDR1-3。

抗LILRB3拮抗剂促进TNFα分泌，而抗LILRB3激动剂在低剂量LPS刺激下促进从总外周血单核细胞(PBMC)的IL-10分泌。发明人在炎症条件下筛选了几种具有总PBMC生物学功能的单克隆抗体(mAb)。具有拮抗功能特征的mAb可进一步促进低剂量LPS刺激下从总PBMC的TNFα产生，但不影响IL-10的分泌。另一方面，激动性克隆可以增加IL-10的产生(图1)。诱导TNFα分泌的那些克隆被认为是拮抗剂，而诱导IL-10的那些被认为是激动剂。

实施例1：抗LILRB3抗体在体外调节TNFα分泌.

来自健康供体的总PBMC用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5微克/ml)处理24小时，然后用LPS(100ng/ml)刺激6小时。收集上清液并通过ELISA测定TNFα浓度。同种型处理用作对照。抗LILRB mAb按抑制TNFα释放的克隆至增强TNFα分泌的克隆的顺序排列。克隆排列基于图1A中的TNF的产生。图1A中TNFα水平的总体差异见图1B(即，减去背景TNF-α)，而TNFα释放的相对倍数变化见图1C。

实施例2.

抗LILRB3抗体在体外调节IL-10的产生.

来自健康供体的总PBMC用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5微克/ml)处理24小时，然后用LPS(100ng/ml)刺激6小时。收集上清液并通过ELISA测定IL-10浓度。同种型处理用作对照。IL-10浓度的总体差异见图2A，减去如通过对照样品测定的背景IL-10的产生，同时相对倍数变化示于图2B。对于各图2A和图2B，克隆根据图1A所示克隆排列进行排序。

抗LILRB3对M1/M2分化的影响

将CD33+髓系细胞从健康PBMC中分选并通过M-CSF 50ng/ml诱导分化为单核来源的巨噬细胞(MDM)5天。MDM用具有拮抗性和激动性活性的抗LILRB3抗体(5μg/ml)在M_1极化条件下在干扰素γ(50ng/ml)的存在下处理2天。参与M1/M2分化(CD163、CD206、PD-L1、HLA-DR)的多种表面标记物和人CD33+CD14+CD16+MDSC群体示于(图2C)。

实施例3.

抗LILRB3抗体在体外调节T细胞增殖和IFNγ分泌.

用低剂量(0.3微克/ml)抗CD3(OKT3)刺激来自健康供体的PBMC，同时加入抗LILRB3 mAb上清液或纯化的mAb(5微克/ml)。处理3天后，用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测T细胞增殖。在培养的最后8小时加入胸苷，然后在闪烁计数器上测量。给出了根据图1中的TNFα的克隆排列。T细胞增殖(CPM)的相对倍数变化见图3A。

抗LILRB3抗体在体外调节IFNγ的释放.

来自健康供体的PBMC用抗LILRB3杂交瘤上清液或纯化抗体(5微克/ml)处理24小时，然后用LPS(100ng/ml)刺激6小时。收集上清液，通过ELISA测定IFNγ浓度(图3B)。同种型处理用作对照。

抗LILRB3抗体在体外抑制同种异体T细胞增殖.

纯化后的人T细胞(应答者)用CFSE标记，用辐照(30Gy)的非亲缘供体PBMC(刺激者)刺激，同时加入IgG同种型对照或所述的LILRB3抗体(5微克/ml)。应答者/刺激者之比为1/3。共培养5天后，通过流式细胞术分析CD4 T细胞(上图)和CD8 T细胞(下图)。具有代表性的流式图显示为CFSE稀释和细胞分裂百分比。

OKT3介导的T细胞增殖和IFNγ分泌被拮抗性克隆增强，而激动性克隆抑制增殖和IFNγ产生，或对不同的健康供体无影响(图3A和3B)。示出了抗体介导的混合淋巴细胞反应(MLR)抑制作用(图3C)。

实施例4.

抗LILRB3抑制白血病细胞的增殖.

本发明人进一步试验了抗LILRB3 mAb对髓系白血病细胞增殖的影响。如图4所示，拮抗性克隆抑制U937和HL 60细胞的增殖活性。

用对照Ig或mAb(5微克)处理LILRB3^hi U937白血病细胞4天。用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测U937细胞增殖。培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲处理细胞。与对照Ig的相对倍数变化见(图4A)。

用INFγ预处理HL60细胞3天，再用对照Ig或mAb(5微克/ml)处理2～5天。通过[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法测定HL60细胞增殖。培养的最后8小时用[³H]-胸苷脉冲处理细胞。原始数据见(图4B)，细胞增殖(CPM)的相对倍数变化见(图4C)。

实施例5.

LILRB3拮抗剂抑制LILRB3⁺MDAMB231乳腺癌细胞的迁移能力.

LILRB3+乳腺癌细胞展现增加的侵袭能力和活化的RhoA，提示该群体可具有较高的迁移和侵袭能力。根据transwell侵袭试验的结果(图5A)，在5微克/ml浓度时，拮抗性克隆8H10和激动性克隆8D5实质性地抑制LILRB3+MDAMB231细胞的迁移，而其它则无。此外，在拮抗性克隆8H10处理的LILRB3+MDAMB231乳腺癌细胞中，活化的RhoA也降低。相反，12C5、6F3和12B1克隆对LILRB3+MDAMB231的RhoA活化作用影响不大(图5B)。这些数据支持了我们的假设，即对LILRB3的阻断可抑制LILRB3+癌细胞群的生长、侵袭和转移。

进行transwell侵袭试验来评价LILRB3+MDAMB231的迁移/侵袭活性。将3×10⁵细胞接种于上腔，加入抗LILRB3 mAb或对照Ig(5微克/ml)。24小时后，用结晶紫染色transwell膜，计数每视场的细胞。照片显示出表明下底图(20X)处迁移的细胞(图5，子图A)。比较各抗LILRB3 mAb处理的LILRB3⁺MDAMB231细胞中的活化的RhoA的表达(图5，子图B)。

LILRB3拮抗剂在体内抑制髓系白血病的生长。

本发明人进一步评价了在异种移植小鼠模型中抗LILRB3 mAb对U937白血病细胞的抗肿瘤作用。我们检测了抗LILRB3 mAb(克隆8H10，工程化IgG1)的抗肿瘤作用，发现拮抗性克隆8H10对U937细胞也发挥强的抗肿瘤作用(图6)。这些数据提示LILRB3拮抗性抗体可抑制肿瘤的生长。

将2×10⁶U937细胞皮下植入NOD/SCID小鼠。当肿瘤大小达到3～5mm²时，通过静脉注射来输注抗LILRB3 mAb、即克隆8H10(圆线)或对照IgG1(菱形线)(150微克/小鼠，每3天一次)。对肿瘤的大小进行评估并示出。

实施例6

抗LILRB3对人PBMC增殖的共刺激作用

用低剂量(0.3微克/ml)抗CD3(OKT3)刺激来自健康供体的1×10⁵总PBMC，加入抗LILRB3 mAb上清液或纯化的mAb(5微克/ml)1μg/ml a-PD-1,1μg/ml4-1BBL,100ng/mlOX40L或1μg/ml GITRL，共3天。进行³H-胸腺嘧啶核苷掺入试验。处理3天后，用[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法检测T细胞增殖。在培养的最后18小时加入胸苷，然后在闪烁计数器上测量。CTAD_3G7(图7(A))和P_2G11(图7(B))对T细胞增殖(CPM)的影响见图7。

表4-7提供了实施例1-6的原始数据。

表7显示最接近对齐的选定的抗LILRB3抗体(鼠)与小鼠等位基因和CDR1-3。

其他项目

应当理解的是，虽然已经结合本发明的详细说明对本公开进行了描述，但以上描述旨在说明但不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围定义。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，其中

重链CDR1包含如SEQ ID NOs:44至52、54至55、57至58之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NOs:44至52、54至55、57至58之一中记载的氨基酸序列，

重链CDR2包含如SEQ ID NOs:59至70之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NOs:59至70之一中记载的氨基酸序列，和

重链CDR3包含如SEQ ID NOs:71-86之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:71-86之一中记载的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体或抗原结合片段进一步包含轻链CDR1、2和3，

其中轻链CDR1包含如SEQ ID NOs:1-17之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:1-17之一中记载的氨基酸序列，

轻链CDR2包含如SEQ ID NO：18-26之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NO：18-26之一中记载的氨基酸序列，和

轻链CDR3包含如SEQ ID NOs:27-43之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:27-43之一中记载的氨基酸序列。

3.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：

(i)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、MNTYSGVP(SEQ ID NO:59)和CARMGRGSLYGMDYW(SEQ ID NO:71)；

(ii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHSYSLYVMGYW(SEQ ID NO:72)；

(iii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARSGHNYSLYVMGYW(SEQ ID NO:73)；

(iv)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARGALYYFDNW(SEQID NO:74)；

(v)分别为GYMFTTYG(SEQ ID NO:45)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；

(vi)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；

(vii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CARIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:75)；

(viii)分别为GYTFTTYG(SEQ ID NO:44)、INTYSGVP(SEQ ID NO:60)和CTRIGNTNSLYTVHYW(SEQ ID NO:76)；

(ix)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGNN(SEQ ID NO:61)和CVRGYYYYGSRAMDYW(SEQ ID NO:77)；

(x)分别为GYSITSGHY(SEQ ID NO:47)、ISYDGND(SEQ ID NO:62)和CVRGYYYYGSRAMDCW(SEQ ID NO:78)；

(xi)分别为GFSFSDYG(SEQ ID NO:48)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CGPSDYWYFDVW(SEQID NO:79)；

(xii)分别为GFTFSDYG(SEQ ID NO:49)、ISSGSSTI(SEQ ID NO:63)和CARDYFYGNNYGFPYW(SEQ ID NO:80)；

(xiii)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNINS(SEQ ID NO:64)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；

(xiv)分别为GYTFISYY(SEQ ID NO:51)、IYPGNVNT(SEQ ID NO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；

(xv)分别为GYTFTSYY(SEQ ID NO:52)、IYPGNVNT(SEQ ID NO:65)和CAMTNSSAMDYW(SEQID NO:81)；

(xvi)分别为GFSLTNYD(SEQ ID NO:54)、IWTGGNT(SEQ ID NO:66)和CVREGFRQGYYAMDYW(SEQ ID NO:82)；

(xvii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、IDTKNGGT(SEQ ID NO:67)和CASGGRGYW(SEQID NO:83)；

(xviii)分别为GYTFTNYG(SEQ ID NO:46)、INTYTGEP(SEQ ID NO:68)和CTRNYYRPYYYAMDYW(SEQ ID NO:84)；

(xix)分别为GYSFTGYT(SEQ ID NO:57)、INPYNDNT(SEQ ID NO:69)和CAREGNYYGASPWFAYW(SEQ ID NO:85)；和

(xx)分别为GYTFTHYG(SEQ ID NO:58)、INTSTGET(SEQ ID NO:70)和CARYYYGSSRWRDYWFAYW(SEQ ID NO:86)。

4.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

a)重链可变区，其包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3：

由以下氨基酸序列组成：

(xx)分别为GYTFTHYG(SEQ ID NO:58)、INTSTGET(SEQ ID NO:70)和CARYYYGSSRWRDYWFAYW(SEQ ID NO:86)；和

b)轻链可变区，其包含由以下氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3：

(xxi)分别为QSLLISTNQKNY(SEQ ID NO:1)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSIPPTF(SEQID NO:27)；

(xxii)分别为QSLFISTNQKNY(SEQ ID NO:2)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSSPPTF(SEQID NO:28)；

(xxiii)分别为QSLLISTNQINY(SEQ ID NO:3)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYDPPLTF(SEQID NO:29)；

(xxiv)分别为QSLLISTNQKNY(SEQ ID NO:1)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQHHYDPPLTF(SEQID NO:30)；

(xxv)分别为QNLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:4)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYNTPPTF(SEQID NO:31)；

(xxvi)分别为QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:5)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSPPPTF(SEQID NO:32)；

(xxvii)分别为QSLLISSNQNNY(SEQ ID NO:6)、FAS(SEQ ID NO:18)和CQQHYSTPPTF(SEQID NO:33)；

(xxviii)分别为QDISNY(SEQ ID NO:7)、YTS(SEQ ID NO:19)和CQQGHTLPYTF(SEQ IDNO:34)；

(xxix)分别为QDISNY(SEQ ID NO:7)、YTS(SEQ ID NO:19)和CQQGNTLPYTF(SEQ ID NO:35)；

(xxx)分别为QNVGTN(SEQ ID NO:8)、STS(SEQ ID NO:20)和CQQYNSYPFTF(SEQ ID NO:36)；

(xxxi)分别为QTIGTW(SEQ ID NO:9)、AAT(SEQ ID NO:21)和CQQLYSTPLTF(SEQ ID NO:37)；

(xxxii)分别为QNIRTA(SEQ ID NO:10)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ IDNO:38)；

(xxxiii)分别为QNVRTA(SEQ ID NO:11)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ IDNO:38)；

(xxxiv)分别为LNVRTA(SEQ ID NO:12)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ IDNO:38)；

(xxxv)分别为QSLLYSSNQKNY(SEQ ID NO:13)、WAS(SEQ ID NO:23)和CQQYYSYRTF(SEQID NO:39)；

(xxxvi)分别为QNVYTT(SEQ ID NO:14)、SAS(SEQ ID NO:24)和CQQYNSYPYTF(SEQ IDNO:40)；

(xxxvii)分别为ENIYSY(SEQ ID NO:15)、DAK(SEQ ID NO:25)和CQHHYGFPYTF(SEQ IDNO:41)；

(xxxviii)分别为ETVDTYGNRF(SEQ ID NO:16)、RAS(SEQ ID NO:26)和CQQSNEDPFTF(SEQ ID NOL 42)；和

(xxxix)分别为QDVSNA(SEQ ID NO:17)、SAS(SEQ ID NO:24)和CPQHYSTLCTF(SEQ IDNO:43)。

X.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，其中，

重链CDR1包含如SEQ ID NOs:44、46、49-52、54、112、153、190-214之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:44、46、49-52、54、112、153、190-214之一中记载的氨基酸序列，

重链CDR2包含如SEQ ID NOs:60、63、64、65、119、123、215-237之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:60、63、64、65、119、123、215-238之一中记载的氨基酸序列，和

重链CDR3包含如SEQ ID NOs：81、82、239-272之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:81、82、239-272之一中记载的氨基酸序列。

根据权利要求X所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体或抗原结合片段还包含轻链CDR1、2和3，

其中轻链CDR1包含如SEQ ID NOs：7、8、10、11、13、15、56、87、88、94、134-156之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:7、8、10、11、13、15、56、87、88、94、134-156之一中记载的氨基酸序列，

轻链CDR2包含如SEQ ID NOs:18、19、20、21、22、23、24、26、95、99、157-163之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:18、19、20、21、22、23、24、26、95、99、157-163之一中记载的氨基酸序列，和

轻链CDR3包含如SEQ ID NOs:38、39、40、100、108、164-189之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:38、39、40、100、108、164-189之一中记载的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合是LILRB3活性的拮抗剂。

6.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-5任一项所述的抗LILRB3的抗体或其抗原结合片段。

7.一种载体，其包含根据权利要求6所述的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核或真核细胞。

10.一种制备和抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：

(a)在适于根据权利要求8所述的宿主细胞表达LILRB3抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞；和

(b)回收所述LILRB3抗体或其抗原结合片段。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。

12.一种组合物，其包含根据权利要求1-5任一项所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段以及合适的药物载体。

13.根据权利要求12所述的组合物，其还包括化学治疗剂或止痛剂。

14.根据权利要求13所述的组合物，其还包括选自由以下组成的组的一种或多种附加药剂：髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物配制用于静脉、肌内、口服、皮下、腹膜内、鞘内、瘤内或肌内施用。

16.一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-5任一项所述的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段。

17.根据权利要求16所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用化学治疗剂或止痛剂。

18.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，其中重链CDR1包含SEQ ID NO：50、52、53、55和109-114之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：50、52、53、55和109-114之一中记载的氨基酸序列，

重链CDR2包含SEQ ID NO：65和115-123之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：65和115-123之一中记载的氨基酸序列，以及

重链CDR3包含SEQ ID NO：81、124-131之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：81、124-131之一中记载的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体或抗原结合片段还包含轻链CDR1、2和3，其中轻链CDR1包含SEQ ID NO：10、11、87-94之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：10、11、87-94之一中记载的氨基酸序列，

轻链CDR2包含SEQ ID NO：19、22、23、95-99之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：19、22、23、95-99之一中记载的氨基酸序列，和

轻链CDR3包含SEQ ID NO：38、100-108之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的SEQ ID NO：38、100-108之一中记载的氨基酸序列。

20.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3：

(xl)分别为GFTFTGYW(SEQ ID NO:109)、ILPVSGIT(SEQ ID NO:115)和CARRGSPYFDYW(SEQ ID NO:124)；

(xli)分别为GFSLNTFDMG(SEQ ID NO:110)、IWWDDDK(SEQ ID NO:116)和CGRKPGGYGNYVL(SEQ ID NO:125)；

(xlii)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:111)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；

(xliii)分别为GYTFTDYY(SEQ ID NO:55)、LNPYNGGT(SEQ ID NO:118)和CARGSGNSFYAMDYW(SEQ ID NO:127)；

(xliv)分别为GYTFINYY(SEQ ID NO:50)、IYPGNVNS(SEQ ID NO:119)和CAMTNSSAMDYW(SEQ ID NO:81)；

(xlv)分别为GYSITSGYY(SEQ ID NO:112)、ISYDGSN(SEQ ID NO:120)和CTSIYGRFVYW(SEQ ID NO:128)；

(xlvi)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:111)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；

(xlvii)分别为GYTFTNFW(SEQ ID NO:113)、IHPNSGST(SEQ ID NO:121)和CARNSGDYLVYFDSW(SEQ ID NO:129)；

(xlviii)分别为GYSFTGYF(SEQ ID NO:114)、INPSTGDT(SEQ ID NO:122)和CARGATVVDYPFDYW(SEQ ID NO:130)；或

(xlix)分别为GYTFTSYW(SEQ ID NO:53)、IHPNGGST(SEQ ID NO:123)和CTRGLTGLFAYWSEQ ID NO:131)。

21.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

c)重链可变区，其包含由以下氨基酸序列组成的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3：

xl)分别为GFTFTGYW(SEQ ID NO:109)、ILPVSGIT(SEQ ID NO:115)和CARRGSPYFDYW(SEQ ID NO:124)；

(xlvi)分别为GFSLTRYG(SEQ ID NO:11)、IWSGGST(SEQ ID NO:117)和CARDGRVYAMDYW(SEQ ID NO:126)；

(xlix)分别为GYTFTSYW(SEQ ID NO:53)、IHPNGGST(SEQ ID NO:123)和CTRGLTGLFAYWSEQ ID NO:131)；和

d)轻链可变区，其包含由以下氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3：

(l)分别为SSVSSSY(SEQ ID NO:87)、GTS(SEQ ID NO:95)和CHQYHRSPFTF(SEQ ID NO:100)；

(li)分别为SSVSY(SEQ ID NO:88)、DTS(SEQ ID NO:96)和CFQGSGYPFTF(SEQ ID NO:101)；

(lii)分别为QSVLYSSDQKNY(SEQ ID NO:89)、WAS(SEQ ID NO:23)和CHQYLSHTF(SEQ IDNO:102)；

(liii)分别为QDVNTA(SEQ ID NO:90)、WAS(SEQ ID NO:23)和CQQLYKLPRTF(SEQ IDNO:103)；

(liv)分别为；

(lv)分别为QNIRTA(SEQ ID NO:10)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ ID NO:38)；

(lvi)分别为SSVNY(SEQ ID NO:92)、YTS(SEQ ID NO:19)和CQQFSSSPYTF(SEQ ID NO:105)；

(lvii)分别为QNVRTA(SEQ ID NO:11)、LAS(SEQ ID NO:22)和CLQHWNYPFTF(SEQ IDNO:38)；

(lviii)分别为SSVSY(SEQ ID NO:88)、DTS(SEQ ID NO:96)和CQQWRSYQLTF(SEQ IDNO:106)；

(lvix)分别为QNINVW(SEQ ID NO:93)、KAS(SEQ ID NO:98)和CQQGQSYPLTF(SEQ IDNO:107))；和

(lvx)分别为QDINSY(SEQ ID NO:94)、RAN(SEQ ID NO:99)和CLQYDEFLLTF(SEQ ID NO:108)。

22.根据权利要求18-21任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合是LILRB3活性的激动剂。

23.一种分离的核酸分子，其编码权利要求18-22任一项所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段。

24.一种载体，其包含根据权利要求22所述的核酸分子。

25.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的载体。

26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核或真核细胞。

27.一种制备和抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：

(a)在适于根据权利要求26所述的宿主细胞表达LILRB3结合蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和

(b)回收所述LILRB3结合蛋白。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

29.一种组合物，其包含根据权利要求18-22任一项所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段以及合适的药物载体。

30.根据权利要求29所述的组合物，其还包含化学治疗剂或止痛剂。

31.根据权利要求30所述的组合物，其还包含选自由以下组成的组的一种或多种附加药剂：髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述组合物配制用于静脉、肌内、口服、皮下、腹膜内、鞘内、瘤内或肌内施用。

33.一种减少哺乳动物中促炎免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-21任一项所述的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段。

34.根据权利要求33所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用一种或多种的髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为具有炎症、自身免疫病或移植排斥。

36.一种治疗哺乳动物中的炎症、自身免疫病或移植排斥的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-21任一项所述的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段。

37.根据权利要求36所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用一种或多种的髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物被诊断为具有炎症、自身免疫病或移植排斥。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述哺乳动物被选择用于器官或组织移植。

40.一种分离的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，其中

重链CDR2包含如SEQ ID NOs:60、63、64、65119、123、215-237之一中记载的氨基酸序列，或在两个以下的氨基酸位置处有取代的如SEQ ID NOs:60、63、64、65119、123、215-238之一中记载的氨基酸序列，和

41.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体或抗原结合片段还包含轻链CDR1、2和3，

42.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求40-41任一项所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段。

43.一种载体，其包含根据权利要求42所述的核酸分子。

44.一种宿主细胞，其包含根据权利要求43所述的载体。

45.根据权利要求44所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核或真核细胞。

46.一种制备和抗LILRB3抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：

(a)在适于根据权利要求44所述的宿主细胞表达LILRB3抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞；和

(b)回收所述LILRB3抗体或其抗原结合片段。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。

48.一种组合物，其包含根据权利要求40-41任一项所述的抗LILRB3抗体或其抗原结合片段以及合适的药物载体。

49.根据权利要求48所述的组合物，其还包含化学治疗剂或止痛剂。

50.根据权利要求48所述的组合物，其还包含选自由以下组成的组的一种或多种附加药剂：髓源性抑制细胞、动员剂、c-jun N-末端激酶抑制剂、抗炎剂和免疫抑制剂。

51.根据权利要求48所述的组合物，其中所述组合物配制用于静脉、肌内、口服、皮下、腹膜内、鞘内、瘤内或肌内施用。

52.一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求40-41任一项所述的特异性结合LILRB3的抗体或其抗原结合片段。

53.根据权利要求52所述的方法，其还包括向所述哺乳动物施用化学治疗剂或止痛剂。