CN110305961B - miR-1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用。本发明采用高通量测序法寻找喉鳞癌及癌旁组织中呈现显著性差异表达的基因，结合生物信息学分析，从候选的miRNA中挑选出miR‑1207‑3p及其靶基因KC6和LINC00319进行RT‑PCR验证，结果显示miR‑1207‑3p及其靶基因和喉鳞癌具有很好的相关性，本发明为临床提供新的喉鳞癌基因诊断和治疗的重要靶点。

Description

miR-1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，具体涉及miR-1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用。

背景技术

喉癌是头颈部鳞癌的常见的恶性肿瘤之一，喉癌绝大多数是鳞状细胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)(Chu EA,Kim YJ.Laryngeal cancer:diagnosis and preoperative work-up[J].Otolaryngol Clin NorthAm,2008,41(4):673-95.)，这种病理类型相当普遍，在所有癌症中发病率居第六位。喉癌的发病率在头颈部肿瘤中排第2位，约占全身肿瘤的1～5％，国内外的研究调查表明，喉癌的发病率的增量一直处在高位。

喉鳞癌的发生与多种因素相关，如吸烟、酗酒等不良的嗜好，性别、年龄因素，以及患者所从事的职业，生活习惯及性格等(Hashibe M，Boffetta P，Zaridze D,etal.Contribution of tobacco and alcohol to the high rates of squamous cellcarcinoma of the supraglottis and glottis in Central Europe[J].Am JEpidemio1,2007,165(7):814-20.)。由正常组织恶变为肿瘤是一个非常复杂的过程，喉癌亦是如此，目前其发病机制尚不清楚，涉及多个基因、多种因素的参与，主要包括癌基因的激活、凋亡基因的失控、抑癌基因的失活，多信号通路激活等多方面因素相互作用的结果。

尽管喉癌的治疗手段越来越多，但喉癌治疗的效果却并没有得到明显的提高，尤其是病人的生存率甚至有下降的趋势，这种情况在晚期喉癌病人中更甚(Gourin CG,Conger BT,Sheds C,et al.The effect of treatment on survival in patients withadvanced laryngeal carcinoma[J].Laryngoscope 2009,119(7)1312-17)。目前喉鳞癌的治疗方式普遍上仍主要施以手术切除，但是喉鳞癌5年生存率和前期相比并没有太大的变化。如何有效的控制喉鳞癌的复发和转移，提高病人的预后，是临床研究的一道难题，因此亟需深入探索喉鳞癌侵袭转移的分子生物学机制，应用于临床来提高对喉鳞癌的诊断、治疗以及预后评价。喉癌的预后与很多因素相关，比如患者的病理分化程度，临床分期，有无远处转移，以及治疗方式的选择等，目前关于喉癌预后的有效的分子标志物相对较少。

MicroRNA(miRNA)又称微小RNA，其广泛存在于真核生物中，其碱基的长度约为21-25碱基，碱基长度相对来讲并不是很长，是非编码RNA的一种，它的重要功能表现在它能够通过与靶基因序列特异性相互作用在转录或翻译水平调节基因表达，然后启动下游信号通路，从而调控细胞增殖、分化、凋亡和脂肪代谢，以及其他多种生物学过程。大量研究表明miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关(Pang Y,Young CY，Yuan H.MicroRNAs and prostatecancer[J]Acta Biochim Biophys Sin,2010,42(6):363-369.)。研究miRNA及其靶基因与喉鳞癌的关系，对于有效的预测喉鳞癌，寻找潜在的分子靶点，制订正确的治疗方案及判断预后具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供用于喉鳞癌诊断的生物标志物，通过检测生物标志物的表达水平，可以判断受试者是否患有喉鳞癌或者存在患喉鳞癌的风险，以期实现患者的个性化诊断以及精准化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测生物标志物的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用，所述生物标志物为miR-1207和/或miR-1207调控的靶基因。在本发明中，所述miR-1207选自以下组中的至少一种：miR-1207初始miRNA、miR-1207前体miRNA、成熟miR-1207；所述miR-1207初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟的miR-1207；所述miR-1207前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-1207，优选的所述miR-1207为成熟的miRNA。

进一步，miR-1207为成熟的miR-1207-3p，miR-1207-3p在喉鳞癌患者中表达下调。

进一步，miR-1207调控的靶基因为KC6、LINC00319，其中，KC6、LINC00319在喉鳞癌患者中表达上调。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA、miRNA、lncRNA)。作为一种优选的实施方式，“表达的基因”指转录成RNA但不翻译成多肽的基因。

“表达上调”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

“表达下调”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

“KC6”位于18号染色体上，基因ID为641516，包括KC6基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的KC6，以及源自细胞中加工的任何形式的KC6。该术语涵盖KC6的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的KC6的序列如NR_002838.2所示。

“LINC00319”位于21号染色体上，基因ID为284836，包括LINC00319基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的LINC00319，以及源自细胞中加工的任何形式的LINC00319。该术语涵盖LINC00319的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的LINC00319的序列如NR_152722.1所示。

进一步，检测生物标志物的试剂选自：

特异性识别生物标志物的探针；或

特异性扩增生物标志物的引物。

进一步，扩增miR-1207的引物序列如SEQ ID NO.1所示，扩增KC6、LINC00319的引物序列分别如SEQ ID NO.2-3和SEQ ID NO.4-5所示。

本文所用的“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。作为一种优选的实施方式，用作探针的分子包括RNA、DNA。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品中提取RNA。

本发明提供了一种诊断喉鳞癌的产品，所述产品包括检测miR-1207和/或miR-1207调控的靶基因的试剂。miRNA-1207包括但不限于pri-miR-1207pre-miR-1207、成熟miR-1207，优选的，所述miR-1207为成熟的miR-1207；更为优选的，所述miR-1207为miR-1207-3p。

进一步，miR-1207调控的靶基因为KC6、LINC00319。

进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。

进一步，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别miR-1207和或miR-1207调控的靶基因KC6、LINC00319的探针。

所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米；膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

进一步，所述试剂盒包括特异性结合miR-1207和/或miR-1207调控的靶基因KC6、LINC00319的引物、探针或芯片。

进一步，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂、显色剂或指示剂、核酸分析软件或使用说明书。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。

在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miR-1207-3p及其靶基因KC6、LINC00319的表达水平与喉鳞癌相关，通过检测受试者样本中miR-1207-3p及其靶基因KC6、LINC00319的表达水平，可以判断受试者是否患有喉鳞癌，以及患喉鳞癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，同时采用分子标志物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。

附图说明

图1是miR-1207-3p在喉鳞癌组及对照组中的相对表达量图。

图2是miR-1207-3p的靶基因在喉鳞癌组及对照组中的相对表达量图，其中图A是靶基因KC6，图B是靶基因LINC00319。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1筛选与喉鳞癌相关的生物标志物

1、样本收集

收集6例喉鳞癌组织及相对应的癌旁组织样本，进行高通量测序。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织RNA，步骤如下：

1)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末。

2)把样品粉末转入到装有TRIzol裂解液的2.0mL EP管中，剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min。

3)10000rpm，4℃离心5min。

4)吸取上清液至新的2.0mL EP管中，每毫升裂解液加入200μL氯仿/异戊醇，剧烈颠倒混匀。

5)10000rpm，4℃离心10min。

6)吸取上清液至新的1.5mL离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀。

7)放入-20℃冰箱沉淀1h。

8)13600rpm，4℃离心20min。

10)吸弃上清，加入1mL 75％乙醇，用移液器吹洗沉淀。

11)10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min。

12)用30-100μL DEPC水或者RNase-free水溶解沉淀。

13)使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano Kit)检测总RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。

3、建库及上机测序

建库和上机测序由华大基因来完成。

3.1转录组建库及测序

1)总RNA DNase Ⅰ消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的mRNA中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成二链cDNA，反应产物用试剂盒进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复。末端修复产物用试剂盒进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基。加“A”产物用试剂盒进行纯化回收；

8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接酶反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用试剂盒进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的连接产物进行扩增。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶选择所需的DNA片段大小，用试剂盒进行纯化回收。回收产物溶于EB溶液中。贴上标签，文库制备至此完成；

11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-TimePCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序，PE150策略。

3.2小RNA建库及测序

1)RNA片段选择:将Total RNA使用PAGE电泳切胶分离18-30nt的RNA。

2)3’接头连接:使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到中1)RNA的3’端。

3)逆转录引物退火:将RT引物加入2)体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。

4)5’接头连接:5’接头连接至3)中产物的5’端，由于接头优先连接于单链分子，而不与3’接头和RT引物的杂交链连接，极大减少了接头自连。

5)一链cDNA合成:以3)中RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。

6)PCR扩增:使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5’接头的cDNA，放大文库产量。

7)文库片段选择:使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，有效去除了引物二聚体等副产物。

8)文库定量及pooling环化。

9)上机测序：BGISEQ-500平台上机测序，SE50策略。

4、生物信息学分析

对差异表达的lncRNA以及小RNA进行生物信息学分析，筛选差异表达的基因，对差异表达的lncRNA采用limma包分析，采用标准是p<0.05；对差异表达的miRNA采用meta包分析，采用标准是p<0.05,|combined.ES|>1；利用包括miRWalk、miRanda、RNAhybrid及Targetscan这些算法预测差异表达miRNA的靶向lncRNA。

5、结果

测序结果显示，miR-1207-3p在喉鳞癌中的表达显著下调，利用靶基因预测软件，结合测序中lncRNA的差异表达的结果，从靶向且负相关的差异表达mRNA中挑选了效果较为突出的KC6、LINC00319进行后续的验证，KC6、LINC00319在喉鳞癌中的表达显著上调。

实施例2 QPCR检测喉鳞癌样本中miRNA及其靶基因的表达

1、按照实施例1的收集方式收集的29例喉鳞癌患者癌组织样本和癌旁组织样本对差异表达基因进行大样本QPCR验证。

2、RNA的提取

使用TRIZOL法提取组织RNA，具体步骤同时实例1。

3、逆转录合成cDNA

3.1逆转录合成lncRNA cDNA

采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录。

1)去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μl，TotalRNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl。

2)水浴锅中42℃加热3min。

3)将10×Fast RT Buffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl混合后加入上述试管中一起混合共20μl。

4)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

3.2逆转录合成miRNA cDNA

采用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(货号：KR211-02)进行miRNA cDNA反转录。

1)在试管中分别加入Total RNA 2μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl，MiRNA RT Enzyme Mix 2μl，RNase-Free ddH₂O，补至20μl，轻轻混匀

2)水浴锅中42℃加热60min，95℃加热3min。

4、Real-Time PCR

4.1引物设计

根据基因序列设计扩增基因的引物，引物的具体序列如表1所示，具体引物由博迈德公司合成或者在天根公司购买，在对KC6和LINC00319进行检测时采用双内参GAPDH以及β-Actin，miR-1207-3p采用内参U6。

表1引物序列

4.2 lncRNA荧光定量检测

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行，反应体系如表2所示。

表2 Real Time反应体系

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4.3 miRNA荧光定量检测

配置20μl反应体系，如表3所示。

表3 Real Time反应体系

PCR反应程序设置，如表4所示。

表4反应程序

4.4数据分析

根据RealTimePCR原始检测结果，按照2^-△△ct相对定量计算公式，即

计算出各样品的目的基因相对定量结果，其他各个样品相对于对照样品，目的基因转录水平的差异。

5、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，miR-1207-3p在喉鳞癌组织中表达下调，其靶基因KC6、LINC00319在喉鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示可通过检测miR-1207-3p及其靶基因KC6、LINC00319的表达水平来诊断受试者是否患有喉鳞癌。通过与KC6、LINC00319喉鳞癌之间的关系可以设计靶向KC6、LINC00319的shRNA、siRNA从而治疗喉鳞癌。

序列表

<110> 南方医科大学深圳医院

<120> miR-1207及其靶基因在检测喉鳞癌中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcagctggcc ctcatttc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggacggtcaa gttggtatcc a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgtggagga aaagctggac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgtagtcg cctccacctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctgttcct ccggcacatt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims (6)

1.检测生物标志物表达水平的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为miR-1207调控的靶基因，所述靶基因为KC6和LINC00319，所述试剂选自：特异性识别生物标志物的探针；或特异性扩增生物标志物的引物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，扩增KC6、LINC00319的引物序列分别如SEQID NO.2-3和SEQ ID NO.4-5所示。

3.一种诊断喉鳞癌的试剂盒在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测miR-1207调控的靶基因的表达水平的试剂，所述靶基因为KC6和LINC00319。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括芯片。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别miR-1207调控的靶基因KC6、LINC00319的探针。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括特异性结合miR-1207调控的靶基因KC6、LINC00319的引物或探针。

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