CN110283903B

CN110283903B - 用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群

Info

Publication number: CN110283903B
Application number: CN201910692038.2A
Authority: CN
Inventors: 吴东; 柏小寅; 张晟瑜; 李佳宁; 施文; 李玥; 李景南; 杨爱明
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110283903A

Abstract

本发明公开了用于诊断胰腺炎的肠道微生物，同时公开了上述肠道微生物在在胰腺炎诊断中的应用。本发明通过提取粪便中微生物菌群的DNA并测序从而获得微生物种类和丰度的特征，并以微生物的丰度特征为基础进行胰腺炎的诊断。本发明提供了一种完全无创，且能更准确的诊断胰腺炎的方法。

Description

用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群

技术领域

本发明涉及生物技术、疾病诊断和生物医药领域，具体涉及用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群。

背景技术

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是引起急性腹痛的常见疾病之一，它是由多种病因导致胰腺内的胰酶被激活，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血，胰腺局部发生炎症反应为主要特征的疾病，病情严重者可发生全身炎性反应综征(Systemicinflammatoryresponse syndrome，SIRS)，并伴有器官功能障碍(Organ dsfunction,OD)。急性胰腺炎的临床表现多种多样，特异性低，对于不良预后的预测敏感性低于40％(SteinbergWM.Predictors of severity of acute pancreatitis[J].GastroenterolC1inN Am,1990,19(4):849-61.)，且AP发生全身炎性反应综合征的病理学基础尚未明确。由于AP病因多样、发病机制复杂、死亡率较高，急性胰腺炎的总体病死率达5％～10％，重度急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)患者病死率高达36％～50％(LankischPG,Apte M,Banks PA.Acute pancreatitis[J].Lancet,2015,386(9988):85-96)，因此尽早判断急性胰腺炎患者的严重程度，鉴别病情变化，及时对患者进行密切监测和积极治疗，对提高患者生存率和减轻经济压力等至关重要。

肠道微生物是存在于人体肠道中的微生物群落，是人体的“第二基因组”。人肠道菌群和宿主构成一个相互关联的整体，具有重要作用，包括形成微生物屏障防止病原菌定植、执行免疫调节及代谢功能。肠道微生物数量、结构及稳定性的改变，尤其是菌群的失衡会改变机体的免疫状态。研究表明肠道菌群失衡与某些疾病的发生发展息息相关，包括糖尿病、帕金森症等，然而有时肠道菌群失衡并不直接导致疾病的表达，而作为疾病标记。随着人体基因组测序完成及高通量测序技术的高速发展，基因筛查成为诊断的方向。因此通过对肠道菌群的研究筛选出与疾病相关性高的生物标志物有重要意义。一方面，利用疾病有关的生物标记物可以提供诊断疾病的方法。另一方面，通过将获得的生物标志物中的某些保护性微生物进行分离、纯化、培养和加上制成益生菌，可以用于改善并恢复肠道微生物平衡，对于疾病治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供特异性的针对胰腺炎的肠道微生物生物标志物，为早期胰腺炎的检测和评估提供一种非侵入式的，无创的方法。

本发明的第一个方面提供了一种诊断胰腺炎的生物标志物，所述生物标志物选自以下物种中的至少一个：uncultured_bacterium_g__Finegoldia、uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、unclassified_f__Lachnospiraceae。以上物种均是在分类学上种水平的分类。

本发明的第二个方面提供了前面所述的生物标志物在制备诊断胰腺炎的产品中的应用。

进一步，所述产品包括能检测出前面所述的生物标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片或高通量测序平台。

更进一步，所述试剂包括引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

本发明的第三个方面提供了一种诊断胰腺炎的产品，所述产品能够检测前面所述的生物标志物。

优选地，所述产品能够检测前面所述的生物标志物的丰度或含量。

进一步，所述产品包括能够检测出前面所述的标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片或高通量测序平台。

本发明的第三个方面提供了一种干预胰腺炎的食物、益生菌或者药物，所述食物、益生菌或者药物能够增加或者减少前面所述的生物标志物的丰度或含量。

具体的，针对uncultured_bacterium_g__Finegoldia设计的食物、益生菌或者药物能够降低uncultured_bacterium_g__Finegoldia的丰度或含量。针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的食物、益生菌或者药物能够增加uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group的丰度或含量。针对unclassified_f__Lachnospiraceae设计的食物、益生菌或者药物能够增加unclassified_f__Lachnospiraceae的丰度或含量。

具体地，针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的食物、益生菌或者药物包含uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group。针对unclassified_f__Lachnospiraceae设计的食物、益生菌或者药物包含unclassified_f__Lachnospiraceae。

本发明的第四个方面提供了前面所述的生物标志物在制备前面所述的食物、益生菌或者药物中的应用。

本发明的第五个方面提供了一种筛选干预胰腺炎的食物、益生菌或者药物的方法，所述方法包括检测候选食物、益生菌或者药物干预之前和干预之后的前面所述的生物标志物的丰度或者含量。

所述方法具体包括：

(1)采集候选食物、益生菌或药物治疗或干预前后的个体粪便样本并妥善保存；

(2)从个体粪便中提取DNA；

(3)以粪便DNA为模板，对16s rRNA基因进行PCR扩增和建库；

(4)对16s rRNA基因进行测序，获得测序结果；

(5)对测序结果进行生物信息学分析，确定所述个体的粪便中所述肠道微生物标志物的量。

(6)若相比候选食物、益生菌或药物干预前，候选食物、益生菌或药物干预后uncultured_bacterium_g__Finegoldia丰度或含量降低，和/或，uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group丰度或含量增加，和/或，unclassified_f__Lachnospiraceae丰度或含量增加，则表示该候选食物、益生菌或药物是能有效治疗胰腺炎的食物、益生菌或药物。

本发明的第五个方面提供了一种诊断胰腺炎的方法，该方法包括：比较受试者粪便样本和健康对照组粪便样本中前面所述的生物标志物的相对数量。

可通过任何合适的方法，包括物理方法、化学方法或两者的组合，进行细胞裂解和/或从细胞中提取核酸。可使用剪切方法从生物样品中分离核酸，该方法保持了基因组DNA的完整性和连续性。

本发明使用的核酸样品可包括全部类型的DNA和RNA。核酸长度可为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000或10,000,000个核苷酸或碱基对长度。

扩增子方法可用于制备DNA以供微生物谱分析。该方法可包括若干步骤，例如，PCR、样品定量(例如，Qubit、nanodrop、生物分析仪等)、Blue Pippin大小选择、0.5xAmpure纯化、样品定量、DNA末端修复、0.5x Ampure纯化、平端衔接子连接、外切核酸酶处理、两个0.5x Ampure纯化和最后的Blue Pippin大小选择。

本发明可使用诸如长读长单分子测序等测序方法进行检测。长读测序可在低至每种微生物的菌株分辨率水平上提供微生物分类。本发明内容可用于实现长读长的测序技术的实例包括，来自Pacific Biosciences的SMRT测序系统、长读长Sanger测序、长读总体测序方法，例如，Illumina/Moleculo测序和潜在的其他单分子测序方法，如Nanopore测序技术。

长读测序可包括提供例如长于500个碱基、长于800个碱基、长于1000个碱基、长于1500个碱基、长于2000个碱基、长于3000个碱基或长于4500个碱基的连续序列读取的测序。

可通过任何合适的方法，例如克隆合适的序列和直接化学合成来制备本发明中使用的引物。引物还可从商业来源获得。此外，可利用计算机程序设计引物。

定义

如本文所述的术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

如本文所述的术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(bas epair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

如本文所述的术语“丰度差异”是指与健康对照体内水平相比，在患有胰腺炎的患者体内得到更高或更低水平的微生物。

如本文所用术语“微生物”可指细菌、古细菌、真核生物(例如原生动物、真菌、酵母)和病毒，包括细菌病毒(即噬菌体)。

如本文所用的术语“益生菌”可指一种或多种微生物，其在适当施用时可以给宿主或受试者带来健康益处。益生菌的一些非限制性实例包括：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、吲哚梭菌、园环梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Rose buria cecicola、Roseburiainulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipeshadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburiafaeccis、Roseburiahominis、Roseburiaintestinalis及其任意组合。

如本文所用的术语“测序”是指测定核酸分子(例如，DNA或RNA核酸分子)中的核苷酸碱基——A、T、C、G和U——的顺序的测序方法。

如本文所用的术语“芯片”可指具有附着有吸附剂的、一般为平面的表面的固体基底。生物芯片的表面可包含多个可寻址的位置，其中每个位置可结合有吸附剂。生物芯片可适合于接合探针接口，并因此用作探针。蛋白质生物芯片适用于捕获多肽，并可包含在可寻址位置处附着有层析或生物特异性吸附剂的表面。微阵列芯片一般用于DNA和RNA基因表达检测。

如本文所用的术语“16S”、“16S核糖体亚基”和“16S核糖体RNA(rRNA)”可在本文中互换使用，并且可指原核生物(例如细菌、古细菌)核糖体小亚基(例如30S)的组分。16SrRNA在微生物物种之间在进化上是高度保守的。因此，16S核糖体亚基的测序可用于鉴定和/或比较样品中存在的微生物(例如微生物组)。

如本文所用的术语“受试者”是指任何动物受试者，包括：人、实验室动物、家畜和家养宠物。受试者可以寄居有多种微生物。受试者可在其身体之上和之内的各种生境中具有不同的微生物组。受试者可被诊断出疾病或被怀疑具有患病的高风险。受试者可具有导致疾病的微生物组状态(生态失调)。在一些情况下，受试者不一定被诊断出疾病或被怀疑具有患病的高风险。在一些情况下，受试者可以遭受感染或有发生感染或将感染传播给他人的风险。

如本文所用术语“生物标志物”应做广义理解。其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物、属标志物)以及功能标志物((KO标志物)。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经修饰的DNA或者RNA，也可以为未经修饰的DNA从或者RNA。在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。

如本文所用的术语“诊断”是指确认病理状态的存在或者特征，而本发明的目的不仅在于确认胰腺炎的发病与否，还包括判断受试者将来患有胰腺炎的风险，以及经过胰腺炎的治疗后，对应个体是否发生复发、转移、药物反应性、耐药性等。

如本文所用的术语“诊断胰腺炎”包括诊断区分胰腺炎患者与健康人。

如本文所用的术语“干预”包括预防或者治疗。

如本文所用的术语“治疗”可指用于获得有益的或期望的结果的方法，该结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处可意指正在被治疗的潜在疾病的根除或改善。另外，治疗性益处也能如下实现：根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受到该潜在病症的折磨。预防性效果包括延缓、防止或消除疾病或病状的出现，延缓或消除疾病或病状的症状发作，减慢、终止或逆转疾病或病状的进展，或其任意组合。对于预防性益处，具有发展成特定疾病的风险的受试者或报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者可接受治疗，即使可能尚未作出该疾病的诊断。

附图说明

图1显示三种肠道微生物的丰度差异统计图；

图2显示利用肠道微生物诊断胰腺炎的AUC值统计图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除另外定义，本文所用的所有科技术语一般具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。一般地，本文所用的命名和实验方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术进行的所有操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求以及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的目的和由此带来的有利方面对于本领域技术人员来说是显而易见的。

实施例1筛选与胰腺炎相关的肠道微生物菌群

1、样本收集

采集医院确诊的胰腺炎患者和正常人的新鲜的，中后段粪便样本，立即冻存于-80℃冰箱，样本信息如表1所示。

表1样本信息

2、DNA抽提

步骤：粪便样本DNA根据MOBIO

DNA Isolation Kit 12888-100说明书进行操作提取。

DNA提取信息如表2所示。完成基因组DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

表2 DNA提取信息

3、PCR扩增

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。

为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；

PCR仪：ABI

9700型；

全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。4、光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

5、Miseq文库构建

1)通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；

2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；

3)Tris-HCl缓冲液洗脱，2％琼脂糖电泳检测；

4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

试剂：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit

6、Miseq测序

1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；

2)以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；

3)变性、退火后，芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；

4)PCR扩增，产生DNA簇；

5)DNA扩增子线性化成为单链。

6)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；

7)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；

8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；

9)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

7、原始数据处理

Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。

数据去杂方法和参数：

1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；

2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；

3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；

4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；

使用软件：FLASH、Trimmomatic；

8、物种注释与评估

OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种、分组等)设置的统一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行聚类(cluster)。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常对在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。

软件平台：Usearch(vsesion 7.0http://drive5.com/uparse/)

分析步骤如下：

对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)；

去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；

按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。

为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：

domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。

比对数据库如下:

16S细菌和古菌核糖体数据库：

Silva(Release128http://www.arb-silva.de)；

功能基因：

FGR，RDP整理来源于GeneBank的(Release7.3http://fungene.cme.msu.edu/)的功能基因数据库。

软件及算法：Qiime平台(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)，RDP Classifier(version 2.2http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)，置信度阈值为0.7。

根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样本在各分类水平上的分类学比对情况。在结果中，包含了两个信息：

1)样本中含有何种微生物；

2)样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。

物种差异分析根据得到的群落丰度数据，运用相关的分析方法进行分析，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析模块的内容包括：组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。

组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。

1)Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)，也叫曼-惠特尼U检验(Mann–Whitney U test)，是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异，通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异，该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析，并对P值进行多种方法的校正。

2)多重检验校正，即对P值进行多重检验校正方法为"fdr"。

3)双尾检验，用于指定所求置信区间的类型，选择双尾检验(求置信区间)。

4)CI计算方法，即计算置信区间的方法，方法为DP：Welch’s confidenceinverted。置信度选择：0.95。

运用DP的方法计算影响大小(effect size)，即mean1–mean2；运用Welch T检验的方法计算置信区间。软件：R的stats包和python的scipy包。

结果：

筛选标准P<0.05。轻度胰腺炎和正常人的肠道微生物在种水平上存在几百个个显著差异物种。其中，uncultured_bacterium_g__Finegoldia、uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、unclassified_f__Lachnospiraceae的表达情况见图1，差异具有统计学意义(P*<0.05)。

实施例2肠道微生物菌群的临床诊断价值

9、模型预测分析

随机森林(Random Forest)属于机器学习算法，是一个包含多棵决策树的分类器，它的分类结果根据检测样本的各个维度上的属性，在不同的决策树上进行判定，综合考虑所有判定结果后给出最终分类，对于分类问题结果取概率最大值，回归分析则取概率均值，它可以高效快速挑选出对样本分类最为重要的物种类别(biomarker)。软件：R(randomForest package)，使用随机森林，设置500个决策树，分类水平为种，进行重要性排序。对排序好的物种从重要性由大到小每次增加一个构建分类模型，计算AUC。

AUC计算结果如图2所示。由图2可知，当物种为3时，分类效果最好。这3个物种分别是s__uncultured_bacterium_g__Finegoldia、s__uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、s__unclassified_f__Lachnospiraceae。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims

1.检测生物标志物的试剂在制备诊断胰腺炎的产品中的应用，所述生物标志物为以下组合：s-uncultured_bacterium_g__Finegoldia、s-uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group和s-unclassified_f__Lachnospiraceae。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒、芯片或高通量测序平台。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。