CN110272912B - 蛋白激酶atm基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因序列工程技术领域，为了调节植物叶片衰老进程，本发明公开了一种蛋白激酶ATM基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法，其中，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明方法可以有效调节植物叶片衰老进程。
Description
技术领域
本发明涉及基因序列工程技术领域，尤其涉及一种蛋白激酶ATM基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
叶片是植物利用光能合成有机化合物的重要场所，叶片光合功能的效率以及时长对农业生产具有重要意义。在作物遗传改良上，长期以来人们十分注重提高叶片的光合效率，而对如何通过直接调节叶片光合功能期和提高营养物质转运效率来提高作物的产量和品质关注较少。后者的调节实质上就是对叶片衰老进程的调控。
植物叶片衰老过程是一个程序化的细胞死亡过程，受到严格的遗传调控。叶片衰老是一个复杂的过程，受多种内、外源因子的影响，内源因子主要有：叶龄、内源植物激素以及胞内环境变化等，外源因子主要包括外界刺激与胁迫。
如何有效调控植物叶片衰老是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种蛋白激酶ATM基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法，本发明提供的方法可有效调节植物叶片衰老进程。
本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明第一方面的实施例提供了一种蛋白激酶ATM基因序列，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第二方面的实施例提供了一种蛋白激酶ATM基因序列在植物中的应用，所述的应用为调控植物叶片衰老进程和/或培育晚衰高产转基因序列植物品种，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，所述植物为拟南芥。
本发明第三方面的实施例提供了一种调控植物叶片衰老进程的方法，包括调控ATM基因序列在植物中的表达，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的ATM基因序列插入到真核细胞表达载体中；
(2)将重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达ATM基因序列；
(3)筛选抗性植物，得到晚衰植株。
进一步的，所述真核细胞表达载体为pEGAD。
进一步的，所述转化采用农杆菌介导法。
进一步的，所述植物为拟南芥。
与现有技术相比，本发明蛋白激酶ATM基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法至少具有如下有益效果：
本发明通过利用外源基因序列表达载体将编码序列为SEQ ID NO:1所示的ATM基因序列导入到植物植株中，过表达ATM基因序列，植物植株表现为叶片衰老延缓。本发明通过调控ATM基因序列在植物中的表达进而用于培育叶片衰老可调控的、高产植物新品种，为培育新的作物品种提供了新思路，在高产分子育种上具有极大的应用价值。
本发明通过筛选拟南芥突变体库，获得一个叶片早衰突变体atm，ATM基因序列编码一种丝苏蛋白激酶。atm突变体对博来霉素(BLM，一种能引起DNA双链断裂损伤的抗生素)超敏感，表明ATM基因序列在DNA损伤修复方面具有重要的功能。本发明还采用过表达ATM基因序列延缓叶片衰老进程。此项研究阐述了ATM基因序列在调控植物叶片衰老中具有重要作用以及通过转基因序列延缓叶片衰老进程从而培育新的作物品种提供了新思路。
附图说明
图1为真核细胞表达载体pEGAD载体图谱，图中LB表示左边界，RB表示右边界，EcoRl-Smal-HindIII-BamH1为多克隆位点；
图2为本发明过表达ATM植株(35S:GFP-ATM)的荧光成像结果图；
图3为拟南芥Col-0野生型植株、atm突变体以及ATM转基因序列植物(ATMox)的衰老表型图；
图4为拟南芥Col-0野生型植株及atm突变体对博来霉素(BLM)诱导的叶片衰老超敏感图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将说明本发明的具体实施方式。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，下面描述的仅仅是本发明的一些实施例，不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以其他的实施方式。
以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂和材料如无特殊说明，均为市售商品。其中，使用的各种突变体均购自ABRC，各种药品试剂，如无特殊说明均购自Sigma公司。
一种蛋白激酶ATM基因序列，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
一种蛋白激酶ATM基因序列在植物中的应用，所述的应用为调控植物叶片衰老进程和/或培育晚衰高产转基因序列植物品种，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施例中，所述植物为拟南芥。
一种调控植物叶片衰老进程的方法，包括调控ATM基因序列在植物中的表达，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施例中，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的ATM基因序列插入到真核细胞表达载体中；
(2)将重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达ATM基因序列；
(3)筛选抗性植物，得到晚衰植株。
在本发明的一些实施例中，所述真核细胞表达载体为pEGAD。
在本发明的一些实施例中，所述转化采用农杆菌介导法。
在本发明的一些实施例中，所述植物为拟南芥。
实施例1
(1)构建过表达ATM的克隆
如图1所示，本实施例以野生型拟南芥Col-0的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增得到ATM基因序列的CDS。引物为：
正向引物F:5’-ATGGTTGCTTCGAGGGATGTCCATGAGATC-3’(序列如SEQ ID NO:2所示)，
反向引物R:5’-CTAGCAAGTCCGATGCCAATTAACCAAACA-3’(序列如SEQ ID NO:3所示)，
PCR引物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，然后胶回收。把回收产物和图1所示的pEGAD载体分别用SmaI酶切，然后经胶回收；用T4连接酶在4℃连接过夜，连接产物经70℃、15分钟灭活后，通过热激的方法转到大肠杆菌，在卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，并经测序鉴定。
(2)构建转基因序列植物pEGAD:GFP-ATM(ATMox)
本实施例构建了转基因序列植物pEGAD:GFP-ATM(ATMox)，构建方法包括如下步骤：
PCR扩增目标片段ATM基因序列编码区，通过核酸内切酶酶切目标片段和质粒pEGAD产生平末端，将片段和质粒用连接酶连接，通过测序鉴定得到质粒pEGAD:GFP-ATM；
取2μl质粒加入100μl农杆菌GV3101中，2200V电击后迅速加入800μl LB培养基，28℃、220rpm培养1.5小时，均匀涂在50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素LB培养基上，28℃倒置培养1天；
接种单个菌落于5ml LB培养基(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+卡那霉素50μg/ml)，28℃220rpm培养过夜；
以体积比1：100扩大培养于500mL含适当抗生素的LB(利福平50μg/ml+25μg/ml庆大霉素+卡那霉素50μg/ml)中，继续摇培5-8hr左右至生长密度为OD600值1.0-1.2；
室温，5000g，离心10min，收集菌体；
用转化介质(质量百分含量为5％的蔗糖，2.033g/L MgCl2)悬浮菌体；Silwet L-77(200μl/L)(高效有机硅表面活性剂，为拟南芥、油菜等转化必须试剂之一,能够降低水的表面张力，有效成分为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷)对菌液有伤害，应在转化植物前加入；
将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序都浸入转化介质中(莲座基部的花序可用枪浇淋)，30s～120s；
取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿24hr；
将拟南芥扶起，光下培养，约3-4周后长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子；
将种子播种在含basta的MS培养基筛选转基因序列植物，不含抗性种子不能萌发，若种子正常萌发并生长即得转基因序列植物35S:GFP-ATM(ATMox)。
(3)过表达ATM基因序列调控植物叶片延缓衰老进程
本实施例中将构建好的过表达ATM的克隆(ATMox)，转化到野生型拟南芥Col-0中。将转基因序列纯合体种子播种在MS培养基上，放置在人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m-2s-1)下生长5天后转移土里，在植物培养室培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。利用荧光显微成像术，发现转基因序列植株ATMox根里面有GFP信号，表明转基因序列成功(图2)。然后观察叶片衰老情况，在第40天的时候，野生型的叶片都是绿色的，而atm的部分叶片已经变黄衰老了(图3A)；第45天的时候，野生型有一半的叶片已经枯萎死亡了，ATMox的叶片都是绿色的(图3B)。以上结果表明，过表达ATM的植物相比较野生型植物而言，其叶片正常生长衰老时间有所延迟，即过表达植物ATM基因序列可以延缓叶片衰老进程。
(4)atm突变体植物叶片对博来霉素超敏感
本实施例中，将野生型拟南芥Col-0和atm突变体种子播种在MS培养基上，放置在人工培养箱内培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照，在光(用白炽灯作为光源进行光照，连续作用光强度为200μmol·m-2s-1)下生长5天后转移土里，在植物培养室培养，培养温度为22℃，湿度为60％，16小时光照、8小时黑暗的长日照培养。在第21天的时候，取第四片叶片，用1μg/ml的博来霉素(BLM)处理，分别在第一天到第五天，测量衰老相关参数(Fv/Fm)。野生型Col-0的叶片随着处理时间的增加，Fv/Fm数值逐渐下降，表明叶片衰老的进程。与Col-0相比，atm的叶片的Fv/Fm下降的更快，表明叶片衰老加速。以上数据表明，atm突变体对对博来霉素超敏感。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> 蛋白激酶ATM基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7797
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 1
atggttgctt cgagggatgt ccatgagatc gtctccaagc tctcgtcaga taaagccaag 60
actcgcgaag atggtgtcaa gttattgaat acatggctcg aaggggaaag gtcaattacc 120
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aatacgttct tgctgaagga tggtcctaat ttaggctctt tgtcattgga aattcataat 780
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cttcagaatt caatattgta tgtaggtgag accagcgaga atgagaggga caagctgatt 3840
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cctccagttc ctactttttc tcgtgacact atttcacttg cagttcaaac agttgtggat 3960
ggttttctgg aaaacactga ttatcctaag aatgcggcca tcactgacag gataaacatt 4020
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gaagaaagca ctgaatttat atactcaaca gtagtgaaac ttcagattct tcatcatctt 6540
ggactagttt gggatcttcg ctggacgaca tcttcgcatc aaagtgtgca tggctatcta 6600
gtcaaacaaa tggcatgcgt agaccccgtc attccaacaa tggatcagtt gtcttggctg 6660
aataaggatt ggaactctat tattacgcaa actcagttgc acatgacttt gttggagcca 6720
tttatcgcat ttaggcgagt tcttctccaa atcttgggat gtgagaaatg taccatgcaa 6780
catcttttgc agtctgcttc attacttcgc aagggaacaa ggttttctca tgcagctgcg 6840
tctctgcatg agttcaagtt tctttgtgca agaagtaatg gacaacaacc cgttccagac 6900
tggcttggaa agcttgaaga ggcgaagcta ttacatgccc aagggcggca tgaagtttcc 6960
attagtcttg caaactacat tttacataat tatcaattaa aggaagaggc ttcagatata 7020
tatcgtgtca ttggaaagtg gctagcagaa accagatcta gcaattctag aactatttta 7080
gagaagtatc tcaggcctgc agtttcgctt gctgaagaac agagttccaa gatctgcaaa 7140
agattagtag atagacagag ccaaacttgg tttcatctgg ctcattatgc agatgctcta 7200
tttaagagtt atgaggaaag actctcctcc agtgaatggc aagctgcact gcggctacga 7260
aaacacaaga cgaaagagtt ggaggtgctt attaaacggt ttaagagttc aaagaaggcg 7320
gagcaatctg actattcact gaagatccaa gatctgcaga agcaactaac aatggataaa 7380
gaagaagcag aaaaactgca ggttgacagg gataactttc tgaaacttgc attggagggt 7440
tataaacgtt gtctggaaat tggtgacaag tatgatgttc gagtggtatt tcggcaagta 7500
tccatgtggt tcagtcttgc ctcccagaaa aatgttattg ataacatgtt gagcaccatt 7560
aaagaggtcc agtcctacaa atttataccc cttgtttatc aaattgcttc aaggttgggc 7620
agttccaaag atgaatcagg atctaacagc tttcagtctg cattggtttc gcttatcaga 7680
aaaatggcca ttgatcatcc ataccataca atcttgcagg ttctgaagtg ttatccatct 7740
cttgtactct ttatatttct tcttttctgt ttggttaatt ggcatcggac ttgctag 7797
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
atggttgctt cgagggatgt ccatgagatc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
ctagcaagtc cgatgccaat taaccaaaca 30
Claims (7)
1.一种蛋白激酶ATM基因序列在植物中的应用，其特征在于，所述的应用为调控植物叶片衰老进程和/或培育晚衰高产转基因序列植物品种，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
3.一种调控植物叶片衰老进程的方法，其特征在于，包括调控ATM基因序列在植物中的表达，所述ATM基因序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建重组表达载体，将SEQ ID NO:1所示基因序列的ATM基因序列插入到真核细胞表达载体中；
(2)将重组表达载体转化到目的植物的细胞中，过表达ATM基因序列；
(3)筛选抗性植物，得到晚衰植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述真核细胞表达载体为pEGAD。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化采用农杆菌介导法。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。
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