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CN110272866A - 一种提升改善细胞状态的方法及其应用 - Google Patents

一种提升改善细胞状态的方法及其应用 Download PDF

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CN110272866A
CN110272866A CN201910598578.4A CN201910598578A CN110272866A CN 110272866 A CN110272866 A CN 110272866A CN 201910598578 A CN201910598578 A CN 201910598578A CN 110272866 A CN110272866 A CN 110272866A
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mycoplasma
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cells system
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王素娜
吴绮婷
龙有国
黄启键
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Cancer Center of Guangzhou Medical University
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Abstract

本发明涉及一种提升改善细胞状态的方法及其应用，所述方法为：向免疫缺陷小鼠体内移植支原体阳性细胞系，并饲养小鼠，再从小鼠体内分离出细胞系，获得支原体阴性细胞系。该去除细胞中支原体污染的方法相对于目前常用的去除细胞支原体污染的方法其操作流程更为简单也更加安全，同时该方法避免了抗生素和高温因素，可把对细胞的伤害降到最低，且处理周期较短，也能够彻底清除支原体污染且不复发。

Description

一种提升改善细胞状态的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提升改善细胞状态的方法及其应用。
背景技术
细胞培养是体外扩增细胞的一种常规实验技术，目前被广泛运用于科研、临床实验。细胞培养成功的关键之一是控制污染，细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等都是引起培养细胞污染的微生物，其中支原体污染是细胞培养过程中的一种主要污染源。
支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。巨噬细胞、lgG及IgM对支原体均有一定的杀伤作用。世界范围内超过15％的培养细胞都有支原体污染，被支原体污染的细胞，一般没有明显的细胞损伤，不易被察觉，但会在细胞代谢、免疫或生化特性、生长状况以及细胞存活等多方面发生改变，从而直接影响了科研工作、临床医学以及生物制品的稳定性和可靠性。
支原体在体型上比细菌和真菌小，一般光学显微镜不能观察到其存在，支原体难以察觉，同时也难以消除，支原体能轻易通过标准滤膜，同时也能拮抗绝大多数的抗生素。支原体对细胞的影响，主要从两方面考虑：一方面是对细胞的直接影响，细胞被支原体污染后，增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁上脱落，部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际上潜伏着多方面的危险；另一方面，支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗力。总之，支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。
目前，培养细胞一旦发生支原体污染，大多的解决办法是灭活后丢弃，但是如果细胞非常珍贵则无法使用此种解决方法，而目前常用的去除细胞系支原体污染的方法主要有：抗生素处理法、加温处理法、巨噬细胞吞噬法。抗生素处理法的处理周期长，有一定的复发率，同时相对毒性较大，对细胞损害较大。加温处理法，对细胞损伤大，可能导致被处理的细胞发生形态变化，影响细胞状态。巨噬细胞吞噬法需要经过小鼠腹腔，有带入鼠类病毒污染的可能性。
CN106635950A公开了一种支原体污染的处理方法，其包括如下步骤：获取待处理的细胞；用含10μg/mL环丙沙星的培养基培养所述待处理的细胞；定时更新所述培养基，并且使所述待处理的细胞的生长密度保持在50％-80％；检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基。该发明能够彻底清除支原体污染，同时还具有停止使用环丙沙星后不复发的优势。但是该方法的处理周期较长，同时抗生素的使用毒性较大，对细胞损害较大。
CN101851603A公开了一种支原体清除试剂及其应用，包括下列重量百分比的组分：氟喹诺酮类抗生素1.3-1.5％；四环素类衍生物0.3-0.5％；大环内酯类抗生素0.1-0.3％；缓冲液97.7-98.3％。该发明的支原体清除试剂能够最有效抑制并杀死支原体，但存在与上述同样的弊端。
由此可见，现有技术中去除支原体污染的方法还很有限，且存在很多弊端，因此，开发出一种新型的、更加安全的、对细胞伤害小的、处理周期短的、且能彻底清除支原体污染的方法是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提升改善细胞状态的方法及其应用，尤其提供一种去除培养细胞中支原体污染的方法及其应用。该方法相对于目前常用的去除细胞支原体污染的方法更加安全，同时可对细胞伤害降到最低，处理周期较短，大约为4-5周，且能够彻底清除支原体污染，操作流程较为简单。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种提升改善细胞状态的方法，所述方法为：向免疫缺陷小鼠体内移植支原体阳性细胞系，并饲养小鼠，再从小鼠体内分离出细胞系，获得支原体阴性细胞系。
该去除细胞中支原体污染的方法相对于目前常用的去除细胞支原体污染的方法其操作流程更为简单也更加安全，同时该方法避免了抗生素和高温因素，可把对细胞的伤害降到最低，且处理周期较短，大约为4-5周，也能够彻底清除支原体污染且不复发。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)获取支原体阳性细胞系；
(2)将步骤(1)的支原体阳性细胞系移植入免疫缺陷小鼠体内并进行饲养；
(3)从步骤(2)中饲养后的小鼠体内分离出细胞系，得到支原体阴性细胞系。
优选地，步骤(1)所述细胞系包括肿瘤细胞系和免疫细胞系。
优选地，所述肿瘤细胞系包括HepG2、Huh7、MDA-MB-231、U-2OS或MRC-5。
优选地，所述免疫细胞包括B细胞、T细胞或NK细胞。
在本发明中，步骤(1)所述获取支原体阳性细胞系的方法为：用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，以此获得支原体阳性细胞系。
具体方式可以为：采用美国LONZA公司生产的MycoAlert Mycoplasma DetectionKit支原体检测试剂盒检测样品中的支原体污染。具体操作为：在室温条件下，取50μL待检测细胞的培养基上清，之后加入50μL A液，静置反应5分钟，5分钟后于荧光检测仪上检测得到第一次读数A值，之后向反应体系中，加入50μL B液，静置反应10分钟，10分钟后检测第二次读数B值。若B值与A值的比率(B/A)大于0.9时，则说明该样品中有支原体污染，否则，则没有支原体污染。
优选地，步骤(2)所述移植的方式包括皮下移植或尾静脉注射。
所述支原体阳性细胞系通过移植的方式进入免疫缺陷小鼠体内进行增殖并在此过程中逐步消除细胞中支原体的污染，因此，除了上述皮下移植和尾静脉注射方式，其他本领域常规移植方式都可实现。一般地，实体瘤细胞系采用皮下移植方式，免疫细胞系和血液肿瘤细胞系(如白血病细胞系)一般采用尾静脉注射的方式。
优选地，步骤(2)所述移植的细胞系数量为2×105-5×106，例如2×105、4×105、5×105、6×105、8×105、1×106或5×106等。
皮下移植的具体方式可以为：用酒精棉球蘸酒精后将小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒；用胰岛素针吸取200μL的细胞悬液，倾45度角注射到小鼠的皮下(不能太深，否则会容易进入肌肉)，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养。
尾静脉注射的具体方式可以为：在生物安全柜内，将麻药注射入小鼠腹腔内，小鼠麻醉后，用酒精棉球轻轻擦拭小鼠尾部，用胰岛素针吸取200μL的细胞悬液，通过尾静脉注射进小鼠体内，若进针点为小鼠尾静脉，推针时会有落空感。
优选地，步骤(2)所述饲养的时间为20-40天，例如20天、22天、25天、27天、30天、32天、35天或40天等。
优选地，步骤(2)所述免疫缺陷小鼠为NSI免疫缺陷小鼠。
NSI(NOD-Scid-IL2Rg-/-)小鼠是利用TALEN技术，在NOD-scid小鼠品系背景下，敲除IL2Rc基因，而获得的，其在专利申请号为201310229629.9的专利文件中有记载。NSI品系缺失B、T、NK细胞，此种小鼠用作肿瘤药物筛选、治疗疾病机理的试验时，对异体异种(人源)移植物无免疫排斥反应，是一个完全对异体移植无免疫排斥作用的小鼠模型。将支原体阳性细胞系移植到该品系小鼠体内，饲养一段时间后再分离出来即可得到支原体阴性细胞系。
优选地，若采用皮下移植的方式，步骤(3)所述从小鼠体内分离出细胞系的方法为：将小鼠处死并体表消毒，无菌剖出移植细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，再用胰蛋白酶酶解，得到支原体阴性细胞系。
上述分离出细胞系的具体方式可以为：将小鼠用脱颈椎法将其处死，将小鼠体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植细胞系组织，浸泡于RPMI1640完全培养液中，选取生长良好的组织块，将其剪碎，用胰酶酶解，用PBS清洗。
优选地，所述小鼠处死的方式为脱颈椎法。
优选地，所述用胰蛋白酶酶解之前将组织剪碎。
优选地，所述酶解的时间为3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min或8min等。
优选地，若采用静脉注射的方式，步骤(3)所述从小鼠体内分离出细胞系的方法为：先将小鼠做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液，可吸取1mL血液，使用细胞分离液和/或细胞分选试剂盒进行细胞的分选，得到支原体阴性细胞系。
优选地，若采用静脉注射的方式分离T细胞，步骤(3)所述从小鼠体内分离出细胞系的方法为：先将小鼠做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液，可吸取1mL血液。将吸取的血液与100μL抗凝剂混合，再将血液与等量PBS液充分混匀，用巴氏吸管沿管壁缓慢叠加于Ficoll淋巴细胞分离液液面上，比例为Ficoll淋巴细胞:(血液+PBS)＝1:2，注意保持清楚的界面，动作轻缓，水平离心800g，20min。离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll，在中间界面处有一层白膜层，以单个核细胞为主，单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞和血小板等。用巴氏吸管吸取白膜层到新的管中，加入5倍体积的PBS液，混匀，300g离心5min，洗涤Ficoll。弃上清，对细胞进行计数，之后用T细胞分选试剂盒进行T细胞磁珠分选，得到支原体阴性细胞系。
在本发明中，判断步骤(3)分离出的细胞系为支原体阴性细胞系的方法为：将分离得到的细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养5-10天(例如5天、6天、7天、8天、9天或10天等)后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，并进行STR检测验证细胞身份。
所述STR检测验证细胞身份的过程大致如下：
(1)用STR多扩增试剂盒扩增PCR(PowerPlexTM16HS System)；
(2)用3100型DNA分析仪检测PCR产物(Applied)；
(3)利用COX1基因扩增和电泳技术对样品进行了物种鉴定。
所述验证细胞身份的方法还可以采用流式细胞法。
作为本发明的优选技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，以此获得支原体阳性细胞系；
(2)将步骤(1)的支原体阳性细胞系通过皮下移植或尾静脉注射方式以2×105-5×106的细胞量移植入NSI免疫缺陷小鼠体内并进行饲养20-40天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，无菌剖出移植细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解3-8min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系；或者将步骤(2)中饲养后的小鼠做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液，使用细胞分离液和/或细胞分选试剂盒进行细胞的分选，得到支原体阴性细胞系。
再一方面，本发明提供一种如上所述的方法在去除培养细胞中支原体污染中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明运用免疫缺陷小鼠工具进行细胞中支原体的去除，该去除细胞中支原体污染的方法相对于目前常用的去除细胞支原体污染的方法其操作流程更为简单也更加安全，同时该方法避免了抗生素和高温因素，可把对细胞的伤害降到最低，且处理周期较短，大约为4-5周，也能够彻底清除支原体污染且不复发。
附图说明
图1为实施例1中MDA-MB-231细胞系的流式细胞检测图；
图2为实施例1中MDA-MB-231细胞系的流式细胞检测图；
图3-图4为实施例1中MDA-MB-231细胞系的STR分析结果图；
图5-图6为实施例2中HepG2细胞系的STR分析结果图；
图7-图8为实施例3中Huh7细胞系的STR分析结果图；
图9-图10为实施例4中U-2OS细胞系的STR分析结果图；
图11-图12为实施例5中MRC-5细胞系的STR分析结果图；
图13为本发明所述方法的流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例分别提供了去除MDA-MB-231、HepG2、Huh7、U-2OS、MRC-5细胞系中支原体污染的方法，实施例1中因涉及到细胞流式实验，因此采用的细胞系为MDA-MB-231-GL，该细胞系是通过慢病毒载体转染的，在MDA-MB-231细胞系基因组上插入了一个荧光报告基因luciferase，luciferase可以在细胞系中稳定表达。
实施例1
本实施例提供一种去除MDA-MB-231-GL细胞系中支原体污染的方法，具体包括以下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测MDA-MB-231-GL细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，结果如表6所示，B/A>0.9，获得支原体阳性MDA-MB-231-GL细胞系；
(2)用酒精棉球蘸酒精后将NSI免疫缺陷小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒，用胰岛素针吸取200μL的步骤(1)的支原体阳性MDA-MB-231-GL细胞系，以2×105的细胞量倾45度角注射到小鼠的皮下，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养20天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植MDA-MB-231-GL细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，选取生长良好的组织将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解3min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系。
将步骤(3)分离得到的MDA-MB-231-GL细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养5天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，结果如表7所示，说明分离得到的细胞系为支原体阴性细胞系。并进行细胞流式实验和STR检测验证细胞身份。
细胞流式实验结果如图1和图2所示：图1是通过细胞颗粒度将活的细胞画门，图2是在活细胞中，检测MDA-MB-231-GL目标细胞系，从流式细胞术层面初步鉴定从小鼠体内分离出的细胞为MDA-MB-231-GL细胞系。
STR检测结果如表1、图3和图4所示，图3的结果总结如表1，显示基因座上无三等位基因和四等位基因，且没有其他人类细胞系的污染；将STR检测结果输入ATCC数据库和DSMZ数据库进行比对分析(其具体操作均采用本领域技术人员常规使用的STR检测方式和流程进行检测)，结果显示细胞为MDA-MB-231细胞系；图4结果显示样本为人细胞系，且没有其他物种细胞系的污染。
表1
实施例2
本实施例提供一种去除HepG2细胞系中支原体污染的方法，具体包括以下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测HepG2细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，结果如表6所示，B/A>0.9，获得支原体阳性HepG2细胞系；
(2)用酒精棉球蘸酒精后将NSI免疫缺陷小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒，用胰岛素针吸取200μL的步骤(1)的支原体阳性HepG2细胞系，以2×105的细胞量倾45度角注射到小鼠的皮下，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养40天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植HepG2细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，选取生长良好的组织将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解8min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系。
将步骤(3)分离得到的HepG2细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养10天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，结果如表7所示，说明分离得到的细胞系为支原体阴性细胞系。并进行STR检测验证细胞身份。
STR检测结果如表2、图5和图6所示，图5的结果总结如表2，显示基因座上无三等位基因和四等位基因，且没有其他人类细胞系的污染；将STR检测结果输入ATCC数据库和DSMZ数据库进行比对分析(其具体操作均采用本领域技术人员常规使用的STR检测方式和流程进行检测)，结果显示细胞为HepG2细胞系；图6结果显示样本为人细胞系，且没有其他物种细胞系的污染。
表2
实施例3
本实施例提供一种去除Huh7细胞系中支原体污染的方法，具体包括以下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测Huh7细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，结果如表6所示，B/A>0.9，获得支原体阳性Huh7细胞系；
(2)用酒精棉球蘸酒精后将NSI免疫缺陷小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒，用胰岛素针吸取200μL的步骤(1)的支原体阳性Huh7细胞系，以2×106的细胞量倾45度角注射到小鼠的皮下，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养30天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植Huh7细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，选取生长良好的组织将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解5min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系。
将步骤(3)分离得到的Huh7细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养7天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，结果如表7所示，说明分离得到的细胞系为支原体阴性细胞系。并进行STR检测验证细胞身份。
STR检测结果如表3、图7和图8所示，图7的结果总结如表3，显示基因座上无三等位基因和四等位基因，且没有其他人类细胞系的污染；将STR检测结果输入ATCC数据库和DSMZ数据库进行比对分析(其具体操作均采用本领域技术人员常规使用的STR检测方式和流程进行检测)，结果显示细胞为Huh7细胞系；图8结果显示样本为人细胞系，且没有其他物种细胞系的污染。
表3
实施例4
本实施例提供一种去除U-2OS细胞系中支原体污染的方法，具体包括以下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测U-2OS细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，结果如表6所示，B/A>0.9，获得支原体阳性U-2OS细胞系；
(2)用酒精棉球蘸酒精后将NSI免疫缺陷小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒，用胰岛素针吸取200μL的步骤(1)的支原体阳性Huh7细胞系，以5×105的细胞量倾45度角注射到小鼠的皮下，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养35天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植U-2OS细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，选取生长良好的组织将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解5min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系。
将步骤(3)分离得到的U-2OS细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养5天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，结果如表7所示，说明分离得到的细胞系为支原体阴性细胞系。并进行STR检测验证细胞身份。
STR检测结果如表4、图9和图10所示，图9的结果总结如表4，显示基因座上无三等位基因和四等位基因，且没有其他人类细胞系的污染；将STR检测结果输入ATCC数据库和DSMZ数据库进行比对分析(其具体操作均采用本领域技术人员常规使用的STR检测方式和流程进行检测)，结果显示细胞为U-2OS细胞系；图10结果显示样本为人细胞系，且没有其他物种细胞系的污染。
表4
实施例5
本实施例提供一种去除MRC-5细胞系中支原体污染的方法，具体包括以下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测MRC-5细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，结果如表6所示，B/A>0.9，获得支原体阳性MRC-5细胞系；
(2)用酒精棉球蘸酒精后将NSI免疫缺陷小鼠的后腿腹股沟处的皮肤湿润并消毒，用胰岛素针吸取200μL的步骤(1)的支原体阳性MRC-5细胞系，以5×105的细胞量倾45度角注射到小鼠的皮下，可见鼓起的肿块，将小鼠放回正常环境中饲养35天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，在生物安全柜中，左手用镊子提起其肿瘤周围皮肤，右手用眼科剪将其剪开，无菌剖出移植MRC-5细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，选取生长良好的组织将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解5min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系。
将步骤(3)分离得到的MRC-5细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养5天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，结果如表7所示，说明分离得到的细胞系为支原体阴性细胞系。并进行STR检测验证细胞身份。
STR检测结果如表5、图11和图12所示，图11的结果总结如表5，显示基因座上无三等位基因和四等位基因，且没有其他人类细胞系的污染；将STR检测结果输入ATCC数据库和DSMZ数据库进行比对分析(其具体操作均采用本领域技术人员常规使用的STR检测方式和流程进行检测)，结果显示细胞为MRC-5细胞系；图12结果显示样本为人细胞系，且没有其他物种细胞系的污染。
表5
表6
表7
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种提升改善细胞状态的方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种提升改善细胞状态的方法，其特征在于，所述方法为：向免疫缺陷小鼠体内移植支原体阳性细胞系，并饲养小鼠，再从小鼠体内分离出细胞系，获得支原体阴性细胞系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)获取支原体阳性细胞系；
(2)将步骤(1)的支原体阳性细胞系移植入免疫缺陷小鼠体内并进行饲养；
(3)从步骤(2)中饲养后的小鼠体内分离出细胞系，得到支原体阴性细胞系。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述细胞系包括肿瘤细胞系和免疫细胞系；
优选地，所述肿瘤细胞系包括HepG2、Huh7、MDA-MB-231、U-2OS或MRC-5；
优选地，所述免疫细胞包括B细胞、T细胞或NK细胞。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述获取支原体阳性细胞系的方法为：用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，以此获得支原体阳性细胞系。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述移植的方式包括皮下移植或尾静脉注射；
优选地，步骤(2)所述移植的细胞系数量为2×105-5×106；
优选地，步骤(2)所述免疫缺陷小鼠为NSI免疫缺陷小鼠。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述饲养的时间为20-40天。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述从小鼠体内分离出细胞系的方法为：将小鼠处死并体表消毒，无菌剖出移植细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，再用胰蛋白酶酶解，得到支原体阴性细胞系；
优选地，所述小鼠处死的方式为脱颈椎法；
优选地，所述用胰蛋白酶酶解之前将组织剪碎；
优选地，所述酶解的时间为3-8min；
优选地，步骤(3)所述从小鼠体内分离出细胞系的方法为：先将小鼠做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液，使用细胞分离液和/或细胞分选试剂盒进行细胞的分选，得到支原体阴性细胞系。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，判断步骤(3)分离出的细胞系为支原体阴性细胞系的方法为：将分离得到的细胞系接种于含有10％FBS的RPMI完全培养液中，培养5-10天后用支原体检测试剂盒检测样品，判断样品中支原体的污染情况，并进行STR检测验证细胞身份。
9.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)用支原体检测试剂盒检测待检测细胞系，判断细胞系中支原体的污染情况，以此获得支原体阳性细胞系；
(2)将步骤(1)的支原体阳性细胞系通过皮下移植或尾静脉注射方式以2×105-5×106的细胞量移植入NSI免疫缺陷小鼠体内并进行饲养20-40天；
(3)将步骤(2)中饲养后的小鼠脱颈椎法处死并体表消毒，无菌剖出移植细胞系组织，浸泡于RPMI完全培养液中，将其剪碎，再用胰蛋白酶进行酶解3-8min，最后用PBS溶液清洗，得到支原体阴性细胞系；或者将步骤(2)中饲养后的小鼠做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液，使用细胞分离液和/或细胞分选试剂盒进行细胞的分选，得到支原体阴性细胞系。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法在去除培养细胞中支原体污染中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705040A (zh) * 2020-06-17 2020-09-25 国药集团动物保健股份有限公司 去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409468A (zh) * 2013-03-20 2013-11-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种免疫缺陷小鼠模型的建立方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409468A (zh) * 2013-03-20 2013-11-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种免疫缺陷小鼠模型的建立方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PANELDAVID N.HOWELL: "Elimination of mycoplasma from human B-lymphoblastoid cell lines", 《HUMAN IMMUNOLOGY》 *
武昱孜等: "支原体对细胞培养污染的研究概况", 《动物医学进展》 *
黄靖香等: "一种去除培养细胞中支原体的有效方法", 《军医进修学院学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705040A (zh) * 2020-06-17 2020-09-25 国药集团动物保健股份有限公司 去除伪狂犬病病毒液中支原体的方法

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