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CN110261453A - 一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器 - Google Patents

一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器 Download PDF

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CN110261453A CN201910418115.5A CN201910418115A CN110261453A CN 110261453 A CN110261453 A CN 110261453A CN 201910418115 A CN201910418115 A CN 201910418115A CN 110261453 A CN110261453 A CN 110261453A
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spe
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Wuhan Zhongke Kang Kang Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及生物传感领域、病毒检测领域，具体公开了一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器。本发明采用丝网印刷的方式将工作电极、对电极、参比电极、导轨和绝缘层印刷到印刷基板表面制作成丝网印刷电极。通过在丝网印刷电极的工作电极上修饰纳米金和HRP，并且以HRP为载体固定抗H9N2禽流感病毒血凝素的兔多克隆抗体构建禽流感病毒电化学免疫传感器，利用碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体对传感器进行信号放大，实现对H9N2禽流感病毒的高灵敏测定。

Description

一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器
技术领域
本发明属于生物传感领域、病毒检测领域，具体涉及一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器。
背景技术
病毒性传染病一直以来都严重威胁着人类的健康和生命财产安全。以禽流感为例，它是一种世界性的禽类流行性传染病，如2013年爆发的禽流感疫情，不仅给人类造成了严重的经济损失，也对人类的健康和生命安全提出了前所未有的挑战。因此，提出简单、快速、高灵敏的病毒检测方法对于疾病的早期诊断、控制病毒的传播及感染具有重要意义。
电化学免疫分析法是以电化学原理为基础的免疫传感器技术。它将免疫分析和电化学技术相结合，除具有生物传感器制备简单、分析迅速、灵敏、选择性好等特点外，还纳入了便携、微型化、集成化等元素，大大地推动了其在临床医学、生物、化学、环境、农业、工业等领域的应用和发展。
虽然现有技术已经公开了多种检测禽流感病毒的电化学方法，但是对于如何提高检测灵敏度，仍是本领域技术人员的关注热点。本发明通过在丝网印刷电极的工作电极上修饰纳米金和HRP，并且以HRP为载体固定抗H9N2禽流感病毒血凝素的兔多克隆抗体构建禽流感病毒免疫电化学传感器，利用碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体对传感器进行信号放大，实现对H9N2禽流感病毒的高灵敏测定。
发明内容
在现有技术的基础上，发明人制备了一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器，建立检测禽流感病毒的新方法。
具体的，本发明采取了如下技术措施：
首先，制备丝网印刷电极，其步骤如下：
通过丝网印刷的方式将工作电极、对电极、参比电极、导轨和绝缘层印刷到印刷基板表面，制作成丝网印刷电极。所述工作电极和对电极为碳电极，参比电极为银/氯化银电极。
其次，制备一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器，其步骤如下：
（1）将本发明制备的丝网印刷电极在氯金酸溶液中进行循环伏安扫描，得到纳米金修饰的丝网印刷电极Au/SPE，将所述Au/SPE放入巯基乙胺溶液中，4℃放置过夜进行巯基自组装；将巯基自组装后所得电极在含有戊二醛的磷酸缓冲液（PH7.2）中浸泡2h，超纯水洗涤，氮气吹干后，将5μL HRP溶液（1mg/mL，0.1MTris-HCl缓冲液）滴加到Au/SPE电极表面，置于37℃恒温箱中孵育30min，PBS冲洗后得到HRP/Au/SPE电极，4℃保存备用；
（2）取5μL抗H9N2禽流感病毒血凝素的兔多克隆抗体（Ab1）溶液(80ng/mL，0.1 mol/LPBS，pH7.0)滴加至HRP/Au/SPE电极表面晾干，用戊二醛进行交联，再用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，得到Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极；将所述Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极浸入BSA溶液中反应30 min，取出，用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，得到禽流感病毒免疫传感器(BSA/Ab1/HRP/Au/SPE)；将所述免疫传感器置于4℃冰箱中保存备用。
再次，一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器的信号放大及检测
将BSA/Ab1/HRP/Au/SPE免疫传感器浸入H9N2禽流感病毒溶液（40ng/mL，0.1 mol/LPBS，pH7.0）中孵育20 min，用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，滴加5 μL碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2），免疫结合1h，用磷酸缓冲溶液冲洗后，晾干；在-0.4 ~ 0.4 V电位范围内，进行差分脉冲伏安法测定，测试底液为20μM HQ和18mM葡萄糖的PBS溶液(0.1M，pH7.0)；
所述碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2）的制备方法为：0.5 mL羧基化碳纳米球（CNS）溶液和0.8 mL的葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液GOD-Ab2混合，室温搅拌过夜，加入BSA溶液室温搅拌，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，分离，得CNS-GOD-Ab2。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
（1）本发明制备的电化学传感器结构简单、操作方便且检测灵敏度高。
（2）本发明通过采用HPR与葡萄糖氧化酶联合催化，提高催化放大倍数，提高传感器检测的灵敏度，对H9N2禽流感病毒的检出限为0.083ng/mL。
（3）本发明利用丝网印刷电极制备电化学传感器。相比于玻碳电极，丝网印刷电极即用即抛，可避免人工打磨玻碳电极造成的误差，实验数据重现性高。
附图说明
图1为本发明所述的一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器制备过程示意图。
图2为本发明所述的一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器对不同浓度（0.1ng/mL、3 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL和120ng/mL）的H9N2禽流感病毒溶液的电流响应值的校准曲线。
图3为本发明制备的SPE电极（a）、Au/SPE（b）、HRP/Au/SPE（c）、pAb1/HRP/Au /SPE（d）和BSA/pAb1/HRP/Au /SPE（e）的交流阻抗图。
图4为本发明所述的一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作为进一步具体的说明；但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
丝网印刷电极的制备
通过丝网印刷的方式将工作电极、对电极、参比电极、导轨、绝缘层印刷到印刷基板表面，制作成印刷电极。所述工作电极为导电碳浆，对电极为导电碳浆，参比电极为银/氯化银混合油墨，导轨为导电银浆，绝缘层为绝缘油墨，印刷基板为PET。
实施例2
一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器的制备方法，如图1所示：
（1）将实施例1制备的丝网印刷电极在氯金酸溶液中进行循环伏安扫描，得到纳米金修饰的丝网印刷电极Au/SPE，将所述Au/SPE放入巯基乙胺溶液中，4℃放置过夜进行巯基自组装；将巯基自组装后所得电极在含有戊二醛的磷酸缓冲液（PH7.2）中浸泡2h，超纯水洗涤，氮气吹干后，将5μL HRP溶液（1mg/mL，0.1MTris-HCl缓冲液）滴加到Au/SPE电极表面，置于37℃恒温箱中孵育30min， PBS冲洗后得到HRP/Au/SPE电极，4℃保存备用；
（2）取5μL抗H9N2禽流感病毒血凝素的兔多克隆抗体（Ab1）溶液(80ng/mL，0.1 mol/LPBS，pH7.0)滴加至HRP/Au/SPE电极表面晾干，用戊二醛进行交联，再用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，得Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极；将所述Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极浸入BSA溶液中反应30min，取出，用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，即得禽流感病毒免疫传感器(BSA/Ab1/HRP/Au/SPE)；将所述免疫传感器置于4℃冰箱中保存备用。
实施例3
一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器信号放大及检测
将免疫传感器在一系列不同的浓度（0.1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL和120ng/mL）H9N2禽流感病毒溶液（0.1 mol/L PBS，PH7.0）中孵育20 min，再于碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2）中孵育1h，接着用磷酸缓冲溶液冲洗后，晾干。在-0.4 ~ 0.4 V电位范围内，进行差分脉冲伏安法测定，测试底液为20μM HQ和18mM葡萄糖的PBS溶液(0.1M，pH7.0)。检测原理：葡萄糖氧化酶将检测液中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同时将氧气还原成H2O2，丝网印刷电极上固定的HRP能够进一步催化H2O2和HQ发生氧化还原反应，从而达到双酶联合催化信号，利用该信号对H9N2禽流感病毒进行定量检测。
以免疫传感器识别H9N2禽流感病毒的电流响应值(I)对H9N2禽流感病毒浓度(c)作图，如图2所示，其响应电流值随H9N2禽流感病毒浓度增加而线性增大，在0.1～120.0ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为： I (µA) = 0.420 c (ng/mL) +7.639 (R=0.995)，检出限为0.083 ng/mL。另外，将本发明所制备的不同批次电化学生物传感器按照本实施例所述的方法进行5次平行测定，3.1%的较低标准差证明所发明的电化学生物传感器具有良好的重现性。
所述碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2）的制备方法为：0.5 mL羧基化碳纳米球（CNS）溶液和0.8 mL的葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液GOD-Ab2混合，室温搅拌过夜，加入BSA溶液室温搅拌，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，分离，得CNS-GOD-Ab2。
实施例4
对实施例3中所制得的修饰电极进行电化学交流阻抗谱（EIS）表征，EIS是探索化学修饰电极界面性质的有效工具之一。其图由低频区和高频区两部分组成，其中的低频区对应于扩散控制区，而半圆部分的高频区则对应于动力学控制区，其半圆的直径大小反映电极表面电荷转移电阻大小。在5.0mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe(CN) 6]（1:1）+0.1 mol/L PBS（pH=7.0）+0.1mol/L KCl溶液中进行交流阻抗表征。传感器制备过程中修饰电极的Nyquist曲线如图3所示，可以看出丝网印刷电极（曲线a）的交流阻抗谱图在高频部分的半圆很小；当用电化学方法在电极表面修饰纳米金后，其高频部分的半圆直径减小（曲线b），阻抗减小；曲线c是HRP修饰到Au/SPE电极表面的交流阻抗谱图，阻抗进一步增加；当Ab1修饰到电极表面后，Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极的高频部分半圆直径增加（曲线d），这是由于蛋白质是不利于电子传递的生物大分子，会阻碍界面的电子传递。进一步的，将Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极用BSA进行封闭后，BSA/Ab1/HRP/Au/SPE电极阻抗进一步增加（曲线e），这是由于BSA是不利于电子传递的生物大分子。以上结果表明，本发明经逐步修饰后，成功制备出电化学传感器。
实施例5
一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器的特异性
为了检测一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器的特异性，配制6份溶液（含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒和500 ng/mL的灭活的新城疫病毒（NDV）、含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒和500 ng/mL的口蹄疫病毒（FMDV）、含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒和500ng/mL的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒和500 ng/mL的传染性支气管炎病毒（IB）、含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒和500 ng/mL的H5N1禽流感病毒(H5N1)溶液和含10 ng/mL的H9N2禽流感病毒）,按照实施例3所述的方法分别进行电化学测试，实验结果如图4所示，加入干扰物前后免疫传感器电流响应差值基本不变，说明该免疫传感器特异性好。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (3)

1.一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器，其特征在于，其步骤如下：
（1）将丝网印刷电极在氯金酸溶液中进行循环伏安扫描，得到纳米金修饰的丝网印刷电极Au/SPE，将所述Au/SPE放入巯基乙胺溶液中，4℃放置过夜进行巯基自组装；将巯基自组装后所得电极在含有戊二醛的磷酸缓冲液（PH7.2）中浸泡2h，超纯水洗涤，氮气吹干后，将5μL HRP溶液（1mg/mL，0.1MTris-HCl缓冲液）滴加到Au/SPE电极表面，置于37℃恒温箱中孵育30min，PBS冲洗后，得到HRP/Au/SPE电极，4℃保存备用；
所述丝网印刷电极的工作电极和对电极为碳电极，参比电极为银/氯化银电极；
（2）取5μL抗H9N2禽流感病毒血凝素的兔多克隆抗体（Ab1）溶液(80ng/mL，0.1 mol/LPBS，pH7.0)滴加至HRP/Au/SPE电极表面晾干，用戊二醛进行交联，再用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，得到Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极；将所述Ab1/HRP/Au/SPE修饰电极浸入BSA溶液中反应30 min，取出，用磷酸缓冲液冲洗，晾干，得到禽流感病毒电化学免疫传感器(BSA/Ab1/HRP/Au/SPE)，将所述电化学免疫传感器置于4℃冰箱中保存备用。
2.一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器的信号放大及检测，其特征在于，其步骤如下：
将BSA/Ab1/HRP/Au/SPE免疫传感器浸入H9N2禽流感病毒溶液（40ng/mL，0.1 mol/LPBS，pH7.0）中孵育20 min，用磷酸缓冲溶液冲洗，晾干，滴加5 μL碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2），免疫结合1h，用磷酸缓冲溶液冲洗后，晾干；在-0.4 ~ 0.4 V电位范围内，进行差分脉冲伏安法测定，测试底液为20μM HQ和18mM葡萄糖的PBS溶液(0.1M，pH7.0)；
所述碳纳米球标记葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液（CNS-GOD-Ab2）的制备方法为：0.5 mL羧基化碳纳米球（CNS）溶液和0.8 mL的葡萄糖氧化酶标抗H9N2禽流感病毒血凝素的单克隆抗体溶液GOD-Ab2混合，室温搅拌过夜，加入BSA溶液室温搅拌，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，分离，得CNS-GOD-Ab2。
3.一种基于丝网印刷电极的禽流感病毒电化学传感器，其特征在于，它是用来检测H9N2禽流感病毒的。
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