CN110241232A - 与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物分子育种学领域，公开了与藏绵羊耐低氧相关的遗传标记，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好。本发明公开的遗传标记能够用于鉴定藏绵羊耐低氧性能，还能够用于辅助选育耐低氧性能优秀的藏绵羊。
Description
技术领域
本发明涉及动物分子育种学领域，特别涉及一种与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用。
背景技术
高原土著动物耐低氧适应的分子机制是生物学和医学的研究热点，对人类医学发展和高原动物种质资源保护利用具有重要意义。高原土著动物经过漫长的选择，形成了独特的低氧适应策略，心肺功能相对发达，血红蛋白含量、肺动脉压升高，血液缓冲能力增强；血红蛋白与氧结合和释放的能力显著提高；通过提高血红蛋白含量和低氧适应性变异从分子水平上进一步适应了高原低氧环境。
藏绵羊分布在我国的青藏高原地区以及与之毗邻的川、甘、滇等高寒牧区，存栏量2500多万只，是青藏高原和中国羊业的主体，由于复杂的地域环境，使藏绵羊逐渐形成了独特的低氧适应策略来维持自身的氧平衡，且在形态、生理和分子上已获得稳定的高寒低氧适应性遗传特性。因此，探索藏绵羊低氧适应性进化的正选择基因序列及其遗传标记，有助于了解动物的保护利用、高原疾病和种质创新。
血红素加氧酶(Hem oxygenase,HMOX)是血红素代谢中的关键限速酶，在机体低氧胁迫代谢调控过程中扮演着重要角色，藏绵羊在长期进化过程中形成了独特的低氧适应策略以维持自身的氧平衡。但是截止目前，关于血红素加氧酶家族基因(HMOX2)在藏绵羊耐低氧适应性中的研究却鲜有报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明实施例选择藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)为研究对象，测定分析了藏绵羊和湖羊血液生理指标的差异，利用PCR-SSCP技术，对血红素加氧酶家族基因(HMOX2)进行分析，并对其基因进行变异位点的筛查，进一步分析变异位点对藏绵羊血液生理指标性状的影响。
本发明提供了与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；
所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；
所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。
本发明还提供了用于检测上述遗传标记的引物对，所述引物对为：
上游引物：GGACCAGAGGCGTGAGA；
下游引物：GGTGGGAGACACTGGAAAG。
本发明还提供了用于检测藏绵羊耐低氧性能的试剂盒。
本发明还提供了上述遗传标记在鉴定藏绵羊耐低氧性能中的应用，包括以下步骤：
(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；
(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；
(3)鉴定PCR扩增产物，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；
所述等位基因A7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；
所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处的碱基为C。
本发明还提供了上述遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。
所述PCR扩增时的扩增体系以20μL计为，Mix试剂10μL，dd H2O8.4μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板0.8μL。
所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃，5min；94℃，30s；Tm(退火温度)，30s；72℃，30s；35个循环；72℃，10min；4℃保存，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
所述鉴定PCR扩增产物是采用SSCP进行鉴定，包括将PCR产物2μL和变性缓冲液8μL混匀后在105℃变性10min，点样于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，电泳结束后根据银染方法显色并判定电泳带型。
附图说明
图1是实施例1中绵羊HMOX2基因H5引物SSCP检测结果；
图2是实施例1中绵羊HMOX2基因H6引物SSCP检测结果；
图3是实施例1中绵羊HMOX2基因H7引物SSCP检测结果；
图4是实施例1中绵羊HMOX2基因H8引物SSCP检测结果。
具体实施例
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
实施例1：
1.材料与方法
1.1试验样品
选择健康，体况良好，年龄为3岁的成年藏绵羊(低氧组)340只和湖羊(对照组)343只(见表1)，采样时间为上午8:00-10:00，颈静脉采集血样10ml于含有抗凝剂的真空采血管中用于提取基因组DNA和测定血液指标。部分血液制成FTA(Flinders TechnologyAssociates)卡备用。
表1绵羊的品种来源及样品数量
1.2血液理化指标测定
采样后在30分钟内完成血液指标测定，采用雅培I-stat300型(美国)血液分析仪测定血液中血血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、氧分压(PO2)、氧饱和度(SpO2)、酸碱度(pH)、二氧化碳分压(PCO2)、碳酸氢根(HCO3 -)、二氧化碳总量(TCO2)、血液酸碱度(BE)、钠离子(Na+)、钾离子(K+)及钙离子(Ca2+)等十二项指标。
1.3基因组DNA的提取
血液基因组DNA的提取参照北京全式金Blood Genomic DNA Kit说明书。根据Zhou等(2006)描述两步法提取FTA保存的血液基因组DNA。
1.4DNA混合池的构建
从藏绵羊和湖羊样品中各选择无血缘关系30份基因组DNA，用紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度各3次，取平均值，再将样品稀释到终浓度为100ng/μL，从同一品种30个DNA样品中各取5μL混合构建成2个品种DNA混合池。1.5HMOX2基因DNA混合池引物设计
根据NCBI里提绵羊HMOX2基因序列(GenBank No.NW_011942788)，针对HMOX2基因5'-UTR区域、6个外显子及3'-UTR区域设计5对引物(见表2)，引物由北京奥科鼎盛生物有限公司合成。
表2绵羊HMOX2基因DNA混合池引物
1.6HMOX2基因多态性引物设计
根据HMOX2基因DNA混合池测序确定的变异位点，设计HMOX2基因PCR引物H5、H6、H7和H8(见表3)，分别扩增绵羊HMOX2基因第1外显子-第1内含子、第2外显子-第2内含子、第2内含子和第5外显子-第6外显子区域。
表3绵羊HMOX2基因引物信息
1.7HMOX2基因PCR体系
PCR反应体系为20.0μL，Mix试剂(天根生化科技,北京)10μL，dd H2O 8.4μL，上下游引物(5μmol/L)各0.4μL，基因组DNA(100ng/μL)0.8μL。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，Tm(退火温度)，30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃保存。然后，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.8HMOX2基因SSCP电泳
将PCR产物2.0μL和变性缓冲液8.0μL混匀后在105℃变性10min，点样于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上。电泳结束后根据Byun等银染方法显色并判定电泳带型，HMOX2基因的引物SSCP电泳最佳条件见表4。
表4绵羊HMOX2基因PCR产物SSCP电泳
1.9测序
根据PCR产物的银染结果进行判型。纯合型PCR产物直接测序，杂合型PCR产物参照Gong进行切胶测序。由北京奥科鼎盛生物有限公司完成序列测定。
2.数据统计分析
2.1序列分析
利用Primer5.0软件设计目的基因引物、DANMAN8.0软件序列分析，以及氨基酸变异分析
2.2统计分析
应用MEGA5.0软件进行基因序列比对、Popgene32软件进行基因的遗传多态性分析以及χ2检验，PIC6.0软件进行多态性信息含量(PIC)的计算。
2.2.1等位基因频率和基因型频率计算
1)等位基因频率：某种等位基因在群体中出现的的比率。
设某一基因位点上有2个等位基因(X和Y)，基因频率分别为p和q，计则统计结果如下：
p＝(2nXX+nXY)/2N q＝(2nYY+nXY)/2N
式中，p:某一基因位点X的频率，q：某一基因位点Y的频率，N为总个体数。
2)基因型频率：某一种基因型个体数在群体总数中占有的比率。
基因型频率＝基因型个体数/所测定群体的总数。
2.2.2纯合度(Ho)和杂合度(He)
纯合度：指特定位点具有相同等位基因的个体所在群体的比率。
杂合度：指特定位点具有不同等位基因的个体所在群体的比率。
纯合度
杂合度
Pi：某一位点第i个等位基因的频率；n：指某一位点上等位基因的数量。
2.2.3有效等位基因数(Ne)
有效等位基因数：是反映群体遗传变异大小的一个指标。计算公式如下：
Pi有效等位基因：第i个等位基因的频率，n:群体出现等位基因数量。
2.2.4多态信息含量(PIC)
多态信息含量是衡量群体基因遗传多态性的指标。当PIC<0.25时，为低度多态；0.25<PIC<0.5时，属中度多态；PIC>0.5时，属高度多态。
n：群体的等位基因总数；Pi：群体中第i个等位基因频率；Pj：群体中第j个等位基因频率。
2.2.5变异位点与血液指标的相关性分析
因处于不同海拔高度的群体和年龄对血液指标有较大的影响，应用SPSS20.0软件中的一般线性混合效应模型分析HMOX2基因序列的变异位点与血液指标的相关性。
试验分析结果均采用“平均值±标准误”表示，当P<0.05时，为差异显著；当P<0.01时，为差异极显著。
3.结果与分析
3.1绵羊HMOX2基因第1外显子遗传多态性分析
3.1.1绵羊HMOX2基因第1外显子区域核苷酸变异分析
本试验设计的引物扩增藏绵羊和湖羊HMOX2基因第1外显子区，PCR产物经SSCP分析发现，绵羊HMOX2基因第1外显子区共检测到2种条带构建成3种基因型，分别定义为A5A5、B5B5和A5B5(如附图1所示)
序列对比发现，2条变异序列有2个SNPs，变异位点为c.806A>C和c.810T>C突变，均属于内含子突变，其中A5序列是c.806A和c.810T，B5序列是c.806C和c.810C(见表5)。
表5绵羊HMOX2基因的H5引物扩增序列的变异位点和等位基因
3.1.2绵羊HMOX2基因第1外显子-第1内含子区遗传多样性分析
对处于不同海拔条件下的藏绵羊和湖羊的HMOX2基因第1外显子-第1内含子区的遗传多样性分析(见表6)。两个绵羊群体检测到3种基因型，其中优势基因型均为B5B5，其基因型频率分别为0.4824和0.7843；优势等位基因均为B5，其等位基因频率为0.7233和0.598；有效等位基因数1.77和1.93，期望杂合度为0.52和0.21，观测杂合度为0.48和0.79，多态信息含量为0.38和0.37，两个群体均处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。Hardy–Weinberg平衡检验发现，藏绵羊群体的卡方值为1.96，P值大于0.05(P＝0.16)，处于平衡状态；湖羊群体的卡方值为8.34，P值小于0.05(P＝0.00)，处于不平衡状态。
表6绵羊HMOX2基因H5引物遗传多态性分析
3.2绵羊HMOX2基因第2外显子-第2内含子区遗传多态性分析
3.2.1绵羊HMOX2基因第2外显子-第2内含子域核苷酸变异分析
本试验设计的引物扩增藏绵羊和湖羊HMOX2基因第2外显子-第2内含子，PCR产物经SSCP分析发现，绵羊HMOX2基因第2外显子-第2内含子区共检测到2种条带构建成3种基因型，分别定义为A6A6、B6B6和A6B6(如附图2所示)
测序结果表明上述条带代表2个不同的核苷酸变异序列，即A6和B6。序列对比发现，2条变异序列有2个SNPs，变异位点为：c.20701A>G突变和c.20990T>C突变，均属于内含子突变，其中A6序列是c.20701G和c.20726T，B6序列是c.20701A和c.20726C(见表7)。
表7绵羊HMOX2基因H6的变异位点和等位基因
3.2.2绵羊HMOX2基因第2外显子-第2内含子区遗传多样性分析
对处于不同海拔条件下的藏绵羊和湖羊的HMOX2基因第1外显子-第1内含子区的遗传多样性分析(见表8)。两个绵羊群体检测到3种基因型，其中优势基因型均为A6A6，其基因型频率分别为0.7076和0.5190；优势等位基因均为A6，其等位基因频率为0.8116和0.7365；有效等位基因数1.44和1.63，期望杂合度为0.79和0.59，观测杂合度为0.21和0.41，多态信息含量为0.26和0.31，两个群体均处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。Hardy–Weinberg平衡检验发现，藏绵羊群体的卡方值为27.45，P值小于0.05(P＝0.00)，处于不平衡状态；湖羊群体的卡方值为0.53，P值大于0.05(P＝0.46)，处于平衡状态。
表8绵羊HMOX2基因H6引物遗传多态性分析
3.3绵羊HMOX2基因第2内含子区域遗传多态性分析
3.3.1绵羊HMOX2基因第2内含子域核苷酸变异分析
本试验设计的引物扩增藏绵羊和湖羊HMOX2基因第2内含子，PCR产物经SSCP分析发现，绵羊HMOX2基因第2内含子区共检测到2种条带构建成3种基因型，分别定义为A7A7、B7B7和A7B7(如附图3所示)
测序结果表明上述条带代表2个不同的核苷酸变异序列，即E和F。序列对比发现，2条变异序列有2个SNPs，变异位点为：c.20911C>T突变和c.20990C>T突变，均属于内含子突变，其中A7序列是c.20911C和c.20990T，B7序列是c.20911T和c.20990C(见表9)。
表9绵羊HMOX2基因H7的变异位点和等位基因
3.3.2绵羊HMOX2基因第2内含子区遗传多样性分析
对处于不同海拔条件下的藏绵羊和湖羊的HMOX2基因第2内含子区的遗传多样性分析(见表10)。两个绵羊群体检测到了3种基因型，其中藏绵羊的优势基因型为B7B7，其基因型频率分别为0.4037，优势等位基因为F，其等位基因频率为0.6923；湖羊的的优势基因型为A7B7，其基因型频率分别为0.7869，优势等位基因为B7，其等位基因频率为0.5099。藏绵羊和湖羊的有效等位基因数分别为1.74和2.00，期望杂合度为0.42和0.11，观测杂合度为0.58和0.89，多态信息含量为0.34he 0.39；两个群体均处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。Hardy–Weinberg平衡检验发现，藏绵羊和湖羊群体P值都小于0.05(P＝0.00)，都处于不平衡状态。
表10绵羊HMOX2基因H7引物遗传多态性分析
3.4绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子遗传多态性分析
3.4.1绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区域核苷酸变异分析
本试验设计的引物扩增藏绵羊和湖羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区，PCR产物经SSCP分析发现，绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区共检测到2种条带构建成3种基因型，分别定义为A8A8、B8B8和A8B8(如附图4所示)。
测序结果表明上述条带代表2个不同的核苷酸变异序列，即A8和B8。序列对比发现，2条变异序列有1个SNPs，变异位点为：c.23748C>T突变，属于外显子突变，氨基酸未发生改变，其中A8序列是c.23748T，B8序列是c.23748G(见表11)
表11绵羊HMOX2基因H8的变异位点和等位基因
3.4.2绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区遗传多样性分析
对处于不同海拔条件下的藏绵羊和湖羊的HMOX2基因第5外显子-第6外显子区的遗传多样性分析(见表12)。两个绵羊群体检测到3种基因型，其中藏绵羊的优势基因型为A8B8，其基因型频率分别为0.4130，优势等位基因为A8，其等位基因频率为0.5906；湖羊的的优势基因型为A8A8，其基因型频率为0.5123，优势等位基因为A8，其等位基因频率为0.6946。藏绵羊和湖羊的有效等位基因数分别为1.93和1.74，期望杂合度为0.59和0.64，观测杂合度为0.41和0.36，多态信息含量为0.37和0.33；两个群体均处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。Hardy–Weinberg平衡检验发现，藏绵羊群体的卡方值为2.18，P值大于0.05(P＝0.14)，处于平衡状态；湖羊群体的卡方值为2.43，P值大于0.05(P＝0.11)，处于平衡状态。
表12绵羊HMOX2基因H8引物遗传多态性分析
4.绵羊HMOX2基因多态性与低氧适应性相关分析
4.1绵羊HMOX2基因第1外显子区遗传变异与血液指标的相关分析
HMOX2基因Exon1基因型及等位基因与血液指标相关分析见表13和表14。分析表明，该区域遗传变异将影响绵羊HGB、HCT、PO2和SO2等血液指标的变化。通过比较发现，藏绵羊的PO2和SO2指标明显低于湖羊；藏绵羊HGB和HCT明显高于湖羊个体。藏绵羊中不同基因型比较发现，A5A5型个体的PO2和SO2值低于的B5B5型和A5B5型个体(P<0.05)，B5B5型和A5B5型个体的HGB和HCT高于A5A5型，但差异不显著(P>0.05)；湖羊不同基因型比较发现，A5A5型个体的PO2高于的B5B5型和A5B5型个体(P<0.01)，A5A5型个体的HGB低于的A5B5型个体(P<0.05)，A5A5型和A5B5型个体的SO2高于的B5B5型个体(P<0.05)。
建立不同的效应模型，评估不同绵羊品种HMOX2基因第1外显子区等位基因存在/缺失对血液指标的影响(见表14)，结果表明：等位基因B5对藏绵羊HGB(P＝0.039)的血液指标相关(P<0.05)，对PO2、SO2和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因A5的藏绵羊HGB值较高；等位基因对PO2、SO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)。
表13绵羊HMOX2基因Exon1基因型与血液指标的关联分析
表14藏绵羊HMOX2基因Exon1等位基因与血液指标关联分析
等位基因B5对湖羊PO2(P＝0.000)和SO2(P＝0.000)的血液指标相关(P<0.01)，对HCT的血液指标相关(P<0.01)，其中，缺失等位基因A5的藏绵羊PO2、SO2和HCT值较高；等位基因A5对湖羊SO2(P＝0.047)的血液指标相关(P<0.05)，对PO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因B5的藏绵羊SO2值较大。
4.2绵羊HMOX2基因第2外显子遗传变异与血液指标的相关分析
HMOX2基因Exon2基因型及等位基因与血液指标相关分析见表15和表16。方差分析表明，该区域遗传变异将影响绵羊HCT血液指标的变化。藏绵羊中不同基因型比较发现，A6A6型和A6B6型个体的HCT值高于B6B6型个体(P<0.01)；湖羊不同基因型比较发现，B6B6型个体的PO2、SO2和HCT值高于A6A6型，但其差异不显著(P>0.05)。
建立不同的效应模型，评估不同绵羊品种HMOX2基因第2外显子区等位基因存在/缺失对血液指标的影响(见表16)，结果表明：等位基因A6对藏绵羊HCT(P＝0.000)的血液指标相关(P<0.01)，对PO2、SO2和HGB的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因A6的藏绵羊HGB值较小；等位基因B6对藏绵羊HCT(P＝0.003)的血液指标相关(P<0.01)，对PO2、SO2和HGB的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因B6的藏绵羊HGB值较大；等位基因A6和等位基因B6对湖羊对PO2、SO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)。
表15绵羊HMOX2基因Exon2基因型与血液指标的关联分析
表16藏绵羊HMOX2基因Exon2等位基因与血液指标关联分析
4.3绵羊HMOX2基因第2内含子区遗传变异与血液指标的相关分析
HMOX2基因第2内含子区基因型及等位基因与血液指标相关分析见表17和表18。方差分析表明，该区域遗传变异将影响绵羊HGB、HCT、PO2和SO2等血液指标的变化。通过比较发现，藏绵羊PO2和SO2指标明显低于湖羊；藏绵羊HGB和HCT明显高于湖羊。藏绵羊中不同基因型比较发现，A7A7型个体的HCT值高于的B7B7型(P<0.05)，A7A7型和B7B7型个体的HCT和HGB值高于的A7B7型(P<0.05)，A7A7型个体的PO2和SO2值高于B7B7型，但差异不显著(P>0.05)；湖羊不同基因型比较发现，B7B7型个体的PO2、SO2和HGB值都高于A7A7型，但其差异不显著(P>0.05)。
表17绵羊HMOX2基因Inon2基因型与血液指标的关联分析
表18藏绵羊HMOX2基因Inon2等位基因与血液指标关联分析
建立不同的效应模型，评估不同绵羊品种HMOX2基因第2内显子区等位基因存在/缺失对血液指标的影响(见表18)，结果表明：等位基因B7对藏绵羊HCT(P＝0.000)指标相关(P<0.01)，对HGB(P＝0.039)指标相关(P<0.05)，对PO2、SO2的血液指标均没有影响(P>0.05)等位基因A7对PO2、SO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)。
等位基因B7对湖羊HCT(P＝0.003)的血液指标相关(P<0.01)，对PO2、SO2和HGB的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因B7的湖羊HCT值较低。等位基因A7对PO2、SO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)。
4.4绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区遗传变异与血液指标的相关分析
HMOX2基因第5外显子-第6外显子区基因型及等位基因与血液指标相关分析见表19和表20。方差分析表明，该区域遗传变异将影响绵羊HGB、HCT、PO2和SO2等血液指标的变化。通过比较发现，藏绵羊的PO2和SO2指标明显低于湖羊；藏绵羊HGB和HCT明显高于湖羊。藏绵羊中不同基因型比较发现，A8A8型个体的HCT值高于的B8B8型(P<0.01)，A8A8型个体的PO2值低于的B8B8型(P<0.01)，A8A8型个体的SO2值高于BB型，但差异不显著(P>0.05)；湖羊不同基因型比较发现，A8A8型个体的SO2和HCT值高于的B8B8型和A8B8型(P<0.01)，A8A8型个体的SO2值高于的A8B8型(P<0.01)，A8A8型个体的HGB值高于B8B8型，但其差异不显著(P>0.05)。
表19绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区基因型与血液指标的关联分析
表20绵羊HMOX2基因第5外显子-第6外显子区等位基因与血液指标关联分析建立不同的效应模型，评估不同绵羊品种在HMOX2基因第5外显子-第6外显子区等位基因存在/缺失对血液指标的影响(见表20)，结果表明：等位基因A8对藏绵羊HCT(P＝0.000)指标相关(P<0.01)，对PO2、SO2和HGB的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因A8的藏绵羊HCT值较低；等位基因B8对藏绵羊PO2(P＝0.004)和HCT(P＝0.000)指标相关(P<0.01)，对SO2(P＝0.040)指标相关(P<0.05)，其中，缺失等位基因B8的藏绵羊PO2和SO2值较低，缺失等位基因B8的藏绵羊HCT值较高。
等位基因B8对湖羊PO2(P＝0.000)、SO2(P＝0.005)和HCT(P＝0.000)的血液指标相关(P<0.01)，对HGB的血液指标均没有影响(P>0.05)，其中，缺失等位基因B8的湖羊PO2、SO2和HCT值较高。等位基因A8对PO2、SO2、HGB和HCT的血液指标均没有影响(P>0.05)。
5.讨论
5.1藏绵羊HMOX2基因遗传变异水平
通过检测和分析藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)HMOX2基因第1外显子-第1内含子、第2外显子-第2内含子、第2内含子和第5外显子-第6外显子区核苷酸变异特征，利用PCR-SSCP检测发现7个SNPs，其中，第1外显子-第1内含子检测到2个内含子突变、第2外显子-第2内含子检测到2个内含子突变、第2内含子检测到2个内含子突变和第5外显子-第6外显子区检测到1个外显子突变，且该突变属同义突变，未引起氨基酸的变化。有研究表明，内含子序列与相应的mRNA序列存在相互作用，对基因表达有重要作用，内含子的突变可能会改变基因的表达效率。从检查的结果发现，HMOX2基因的外显子区核苷酸序列相对较保守，可能在基因转录过程中发挥更重要的作用。Yang等通过研究发现HMOX2基因的一个多态位点rs4786504。通过高、低海拔条件下群体间比较分析发现，藏绵羊优势基因型和优势等位基因频率均的高于湖羊(P<0.01)，这种差异可能是受不同地理环境和气候条件或选样有偏差所致。由于藏绵羊经过长期的自然选择形成了较好的低氧适应能力，而HMOX2基因作为低氧适应的候选基因，在低氧适应性进化过程中受到了自然选择，将适应低氧环境的基因型进一步得到了选择。
5.2藏绵羊HMOX2基因变异与低氧适应的相关性
HMOX2在哺乳动物细胞中具有独特的氧传感和低氧应答作用，在低氧代谢通路调控过程中起到了非常重要的作用，如HMOX2基因敲除的小鼠在低氧环境下的死亡率比野生型小鼠高[120]。HMOX2不足的小鼠表现出低氧血症，表现为缺氧呼吸反应迟钝，肺静脉心肌肥大和颈动脉体扩大，因此，有学者认为HMOX2参与氧气应答[123]。Yang等(2016)研究发现HMOX2基因在藏族人群和平原汉族人群的比较分析中发现了一个功能性的突变位点，该突变位点与HGB有显著的相关性，因此，HMOX2作为一个修饰基因可以调节低氧代谢通路的下游血红蛋白的代谢，实现对高原低氧环境遗传适应[121]。本研究通过分析藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)HMOX2基因第1外显子-第1内含子、第2外显子-第2内含子、第2内含子和第5外显子-第6外显子区核苷酸变异与血液生理指标的相关性。第1外显子-第1内含子核苷酸变异与PO2、HCT和SO2指标相关，其中，缺乏等位基因B5的藏绵羊HCT和HGB值显著高于不含有等位基因B5的藏绵羊。这说明HMOX2基因第1外显子-第1内含子区变异可能增加HCT和HGB值，可能是等位基因B5上的突变引起了红细胞数的增多及血红蛋白含量的升高，提升了在低氧条件下血液的携氧能力。第2外显子-第2内含子核苷酸变异与HCT指标相关，其中，存在等位基因A6的藏绵羊HCT值显著高于不含有等位基因A6的藏绵羊，这说明HMOX2基因第2外显子-第2内含子区变异可能增加HCT值，HCT值的增加间接反映红细胞数的增加，红细胞数越多，其携氧能力就越强，可有效的缓解低氧环境下的缺氧。第2内含子核苷酸变异与HCT和HGB指标相关，其中，缺失等位基因B7的藏绵羊HCT和HGB值显著高于不含有等位基因B7的藏绵羊，这说明HMOX2基因第2内含子区变异可能增加HCT和HGB值。第5外显子-第6外显子核苷酸变异与PO2、HCT和SO2指标相关，其中，存在等位基因A8的藏绵羊PO2和SO2值显著高于不含有等位基因A8的藏绵羊，而缺乏等位基因B8的藏绵羊HCT和HGB值显著高于不含有等位基因B8的藏绵羊，这说明HMOX2基因第5外显子-第6外显子区c.23748C>T突变可能增加HCT和HGB值，可能是等位基因B8上的突变引起了红细胞数的增多及血红蛋白含量的升高，提升了在低氧条件下血液的携氧能力。
6.结论
高原土著动物的低氧适应能力在血液学上的突出特点是HGB、HCT值显著升高，其HGB与氧结合和释放的能力显著高于相应的平原品种，与平原同种动物相比，高原鼠兔(Ochotona curzoniae)、牦牛(Bos mutus)及藏山羊(Capra hircus)血液特征都表现为较高的HGB值。所以，藏绵羊HMOX2基因第2内含子区等位基因A7和B7是藏绵羊高原低氧适应的理想分子标记，对藏绵羊的高原低氧分子选育具有重要作用。选择藏绵羊个体中携带等位基因A7和B7个体留作种用。
实施例2
本实施例涉及检测藏绵羊耐低氧性能的试剂盒，包括：
1、引物对：
上游引物：GGACCAGAGGCGTGAGA；
下游引物：GGTGGGAGACACTGGAAAG。
2、PCR检测试剂：
PCR反应体系以20μL计为，Mix试剂10μL，dd H2O 8.4μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板0.8μL；
PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；Tm(退火温度)时间30s，72℃，30s；
35个循环；72℃，10min；4℃保存，最后使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
3、SSCP上样变性缓冲液：8μL
4、标准样的核苷酸序列如下；
等位基因A的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1：
TGCACCTTTCCAGTGTCTCCCACCCCTCAGATGTGGGAGCAGCTCTTAACTCCAGGGCTTTCCTTATTGGGTTGGGGGCAATTCACCTGAAGCCTCCAGTCACCCAGGCCTGCTCTTCATCATTGTCAGCCTCTCCTTATAGCCCTGTCATTGGCAAAGTTCTCTTTTTACATCTTGGAATAATTGCTGAAAATAAACTGTTGGCAGCAAT；
等位基因B序列的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2：
TGCACCTTTCCAGTGTCTCCCATCCCTCAGATGTGGGAGCAGCTCTTAACTCCAGGGCTTTCCTTATTGGGTTGGGGGCAATTCACCTGAAGCCTCCAGCCACCCAGGCCTGCTCTTCATCATTGTCAGCCTCTCCTTATAGCCCTGTCATTGGCAAAGTTCTCTTTTTACATCTTGGAATAATTGCTGAAAATAAACTGTTGGCAGCAAT。
该试剂盒的使用方法和对结构的分析方法参照实施例1。
将待测样本的SSCP电泳带型图与标准样的SSCP电泳带型图进行对比，对待测样本的耐低氧性能进行判断。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施例是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记及其应用
<130> 1233
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcacctttc cagtgtctcc cacccctcag atgtgggagc agctcttaac tccagggctt 60
tccttattgg gttgggggca attcacctga agcctccagt cacccaggcc tgctcttcat 120
cattgtcagc ctctccttat agccctgtca ttggcaaagt tctcttttta catcttggaa 180
taattgctga aaataaactg ttggcagcaa t 211
<210> 2
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcacctttc cagtgtctcc catccctcag atgtgggagc agctcttaac tccagggctt 60
tccttattgg gttgggggca attcacctga agcctccagc cacccaggcc tgctcttcat 120
cattgtcagc ctctccttat agccctgtca ttggcaaagt tctcttttta catcttggaa 180
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Claims (8)
1.与藏绵羊耐低氧性能相关的遗传标记，其特征在于，其位于HMOX2基因上，存在等位基因A7、B7，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊高原低氧适应性良好；
所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；
所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。
2.用于检测权利要求1所述遗传标记的引物对，其特征在于，所述引物对为：
上游引物：GGACCAGAGGCGTGAGA；
下游引物：GGTGGGAGACACTGGAAAG。
3.用于检测藏绵羊耐低氧性能的试剂盒。
4.权利要求1所述的遗传标记在鉴定藏绵羊耐低氧性能中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测藏绵羊的基因组DNA；
(2)以待测藏绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；
(3)鉴定PCR扩增产物，当所述等位基因为A7、B7时，所述藏绵羊耐低氧性能良好；
所述等位基因A7，在HMOX2基因第c.20911处的碱基为C，在第c.20990处的碱基为T；
所述等位基因B7，在HMOX2基因的第c.20911处的碱基为T，第c.20990处处的碱基为C。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增时的扩增体系以20μL计为，Mix试剂10μL，dd H2O 8.4μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板0.8μL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增时的PCR反应条件为：95℃，5min；94℃，Tm(退火温度)，30s；72℃，30s；35个循环；72℃，10min；4℃保存，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鉴定PCR扩增产物是采用SSCP进行鉴定，包括将PCR产物2μL和变性缓冲液8μL混匀后在105℃变性10min，点样于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，电泳结束后根据银染方法显色并判定电泳带型。
8.权利要求1所述的遗传标记在藏绵羊分子标记辅助育种中的应用。
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