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CN110234773B - 治疗含融合基因的癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗挟带一种或多种特定融合基因的癌症患者的方法。它至少部分基于以下发现：由MAN2A1‑FER融合基因编码的蛋白质显示激酶活性，并且靶向MAN2A1‑FER的酪氨酸激酶抑制剂的使用在除前列腺癌之外的癌症(例如肝细胞癌)中导致异种移植了癌症的动物的存活率显著提高。

Description

治疗含融合基因的癌症的方法
优先权信息
本申请要求2016年12月13日提交的美国临时专利申请系列号62/433,600的优先权，其通过引用全文纳入本文。
资助信息
本发明是在美国国立卫生研究院授予的批准号RO1 CA098249和美国军队医学研究和物资司令部授予的W81XWH-16-1-0364的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
1.介绍
本发明涉及治疗挟带一种或多种特定融合基因的患者的方法。
2.背景技术
在美国，前列腺癌是男性中观察到的最常见的恶性肿瘤之一。2014年，前列腺癌的死亡率达到27540，是男性第二大致命癌症(Siegel等.(2015)A Cancer Journal ForClinicians 65:5-29))。如WO 2015/103057和WO 2016/011428中所公开的，在已经显示出复发和致死的前列腺癌中鉴定了由染色体重排产生的许多融合基因。这些融合基因的表达在侵袭性前列腺癌中广泛存在，但不存在于正常组织中。WO 2015/103057公开了用酪氨酸抑制剂处理表达MAN2A1/FER融合基因的前列腺癌细胞，导致前列腺癌细胞的体外细胞死亡。
一般而言，在美国，癌症是导致死亡的主要原因之一。仅在美国，2015年癌症死亡率就达到了595690，成为心血管疾病后死亡的第二大致命原因(Siegel等.(2016)A CancerJournal For Clinicians 66(1):7-30)。肝癌是全世界男性和女性癌症相关死亡的主要原因之一(Jemal等.(2011)全球癌症统计(Global cancer statistics).CA Cancer J Clin61:69-90)。尽管在过去几十年中取得了重大进展，但关于癌症发展和进展的机制仍有许多尚待理解。癌症的治疗，特别是转移性癌症的治疗仍然存在问题，并且癌症的治愈仍然是难以捉摸的。因此，本领域仍需要治疗癌症的方法。
3.发明概述
本发明涉及治疗患有癌症或携带一种或多种特定融合基因的恶变前或肿瘤病症的患者的方法。它至少部分基于以下发现：由MAN2A1-FER融合基因编码的蛋白质显示激酶活性，并且靶向MAN2A1-FER的酪氨酸激酶抑制剂的使用在除前列腺癌之外的癌症(例如肝细胞癌)中导致携带癌症异种移植物的动物的存活率显著提高。
在不同非限制性实施方式中，本发明提供了用于鉴定对象中的融合基因的方法和组合物，所述对象例如患有或疑似患有癌症或肿瘤或恶变前病症的对象。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。在某些实施方式中，癌症不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。此类融合基因包括TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。此外，基于特定融合基因的存在，本发明提供了治疗携带一种或多种特定融合基因的对象的方法，例如，通过给予治疗有效量的融合基因特异性试剂。在某些实施方式中，融合基因是MAN2A1-FER。
在某些非限制性实施方式中，本发明还提供了用于进行治疗携带融合基因的对象的方法的试剂盒。在某些实施方式中，对象不具有前列腺癌。在某些实施方式中，对象不患有肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包括用于PCR分析的核酸引物或用于RNA原位分析的核酸探针，以检测来自对象的样品中一种或多种融合基因的存在。在某些非限制性实施方式中，一种或多种融合基因可选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，MTOR-TP53BP，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG11，及其组合。在某些实施方式中，融合基因是MAN2A1-FER。例如但非限制地，本发明的试剂盒可包括用于PCR分析的核酸引物或用于RNA原位分析的核酸探针，以检测MAN2A1-FER融合基因的存在。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包括药物组合物，其包含对一种或多种融合基因具有特异性的一种或多种抑制剂。例如但非限制地，本发明的试剂盒可包含药物组合物，其包含FER抑制剂，例如克唑替尼，和EGFR抑制剂，例如卡奈替尼，用于治疗携带MAN2A1-FER融合基因的患癌对象。
4.附图说明
图1.独特的融合基因事件。左图：融合基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：融合基因的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列(SEQ ID NO:45-52)。右图：融合基因翻译产物的图表。蓝色驱动基因翻译产物；红色-乘客基因(passenger gene)翻译产物；橙色-新型翻译产物，其归因于来自非基因区域的移码或翻译产物。
图2.融合基因的基因组断点分析。上图：融合基因基因组，转录方向，连接基因之间的距离和染色体连接的方向的微型图。中图：融合基因组和转录方向的微型图。下图：代表性的测序色谱图，包括染色体的连接断点(SEQ ID NO:53-55)。
图3A-B.前列腺癌中的PTEN-NOLC1融合基因。(A)PTEN-NOLC1融合转录物。上图：PTEN和NOLC1基因的基因组，转录方向，连接基因之间的距离和融合的方向的微型图。中图：PTEN-NOLC1转录物的代表性测序色谱图。显示了连接基因序列(SEQ ID NO:56)。下图：融合转录物的翻译产物图。蓝-头部基因翻译产物；红-尾部基因翻译产物。(B)PTEN和NOLC1基因组重组和FISH探针位置的示意图。
图4.MAN2A1-FER的基序分析。MAN2A1、FER和MAN2A1-FER融合蛋白的功能结构域图。在融合基因MAN2A1-FER中，FER的N末端的SH2和FHC结构域缺失。这些结构域被糖苷水解酶和α-甘露糖苷酶中间结构域(来自MAN2A1)取代。
图5.基因组编辑的示意图，其靶向在CCNH-C5orf30阳性的前列腺癌细胞中的融合基因断裂点。前列腺癌病例3T中的基因组重组在染色体5中产生断点，其将CCNH的内含子6与C5orf30的内含子1连接。包含原型间隔区相邻基序(PAM)序列的23bp的指导RNA(gRNA)被设计为对断点区域具有特异性。将对应于该靶序列的DNA序列人工连接到含有gRNA和Cas9的剩余部分的载体中。将该序列重组并包装到重组病毒(腺病毒或慢病毒)中。将无启动子单纯疱疹病毒1型(HSV-1)胸苷激酶构建进入腺病毒的穿梭载体，与来自CCNH外显子7的内含子/外显子接合点的剪接标签序列一起。还将来自各侧围绕CCNH-C5orf30断裂点的500bp序列连接到穿梭载体中，以产生有效的同源重组以完成供体DNA构建。将载体重组并包装到AdEasy中以产生重组病毒。可将这些病毒给予呈CCNH-C5orf30融合转录物阳性的癌症患者或动物。这导致供体DNA插入靶位点(融合断裂点)。由于重组病毒中的HSV-1 TK是无启动子的(promoterless)，如果HSV-1 TK cDNA不整合到转录活性基因组中，则不会发生转录。然而，如果HSV-1 TK整合到患者的CCNH-C5orf30的靶位点，则HSV-1 TK的转录是活跃的，并且当给予患者更昔洛韦(ganciclovir)或其口服同系物缬更昔洛韦(valganciclovir)时，同系物容易通过HSV-1 TK转化为三磷酸鸟嘌呤类似物并整合进入癌细胞的基因组中。这导致CCNH-C5orf30阳性的细胞中DNA延伸停止。
图6.融合基因的示意图。左图：融合伴侣基因组的示意图。显示了遗传基因座，伴侣之间的距离，转录方向和融合方向。中图：围绕每个融合基因的融合点的桑格测序的直方图(SEQ ID NO:40-44)。右图：融合基因的预测蛋白质产物。蓝色：头部基因蛋白质；黄色：移码翻译；红色：尾部。
图7.ZMPSTE24-ZMYM5融合形成的示意图。指示了功能结构域。ZMPSTE24和ZMYM4之间的融合形成产生自ZMPSTE24的C末端的159个氨基酸截短和自ZMYM4的N末端的1315个氨基酸截短。基序分析表明，ZMPSTE24-ZMYM4融合体将从ZMPSTE24中缺失约50％的肽酶结构域并从ZMYM4中移除所有锌指，但将保留完整的ZUF3504(未知功能的结构域)和凋亡抑制剂结构域。
图8.CLTC-ETV1融合形成的示意图。指示了功能结构域。CLTC-ETV1融合在ETV1中保留了基本上完整的转录结构域，并从CLTC中缺失了3个网格蛋白结构域。ETV1的N末端截短消除了ETV1的所有这些调节元件。
图9.ACPP-SEC13融合形成的示意图。指示了功能结构域。在ACPP-SEC13融合中，仅保留ACPP的N-末端72个氨基酸，并且超过2/3的磷酸酶结构域被截短，而SEC13从其N-末端丢失196个氨基酸并且缺失3个WD-重复结构域。
图10.DOCK7-OLR1融合形成的示意图。指示了功能结构域。DOCK7-OLR1不产生嵌合蛋白。DOCK7和OLR1的单独翻译发生在融合转录物上。融合基因使DOCK的胞质分裂区域的显著部分缺失，而融合转录物将产生完整的OLR1蛋白。
图11.PCMTD1-SNTG1融合形成的示意图。指示了功能结构域。PCMTD1-SNTG1融合不产生嵌合蛋白。PCMTD1-SNTG1融合产生截短的PCMTD1，其去除PCMTD1的一半甲基转移酶结构域，并且SNTG1保持完整。
图12.SLC45A2-AMACR嵌合蛋白的示意图。SLC45A2和AMACR之间的融合导致SLC45A2中三分之二的(MFS)结构域的截短，但在很大程度上保留了AMACR的CoA-转移酶结构域。SLC45A2-AMACR产生嵌合蛋白，其具有SLC45A2的N末端187个氨基酸和AMACR的C末端311个氨基酸。SLC45A2-AMACR用来自AMACR的完整消旋酶结构域替换SLC45A2的5跨膜和胞质结构域，同时使胞外和N末端跨膜结构域保持完整。
图13A-D.人恶性肿瘤中的MAN2A1-FER。(A)MAN2A1，FER和MAN2A1-FER蛋白的示意图。FCH表示FER-CP4同源区。PK表示蛋白质激酶。SH2表示Src同源物2。(B)MAN2A1-FER的染色体断点位于MAN2A1的内含子13和FER的内含子14中。通过全基因组测序在前列腺癌样品PRCa159T中鉴定出一个断点。通过巢式PCR在肝癌细胞系HUH7中鉴定出另一个断点。(C)MAN2A1-FER融合转录物在多形性胶质母细胞瘤(GBM)，肝细胞癌(HCC)，前列腺癌(PRCA)，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌(OV)和食管腺癌(ESCA)中的频率。指出了检查的样品数量。(D)MAN2A1-FER蛋白在人类癌症中的表达。使用对MAN2A1或FER具有特异性的抗体，对来自肝癌细胞系HUH7和HEP3B、对MAN2A1-FER转录物呈阳性(PRCA159T和PRCA23T)或阴性(PRCA25T，PRCA20T和PRCA119T)的前列腺癌样品的蛋白质提取物进行的免疫印迹。指示MAN2A1，FER和MAN2A1-FER。使用GAPDH抗体的免疫印迹用作对照。
图14A-D.MAN2A1-FER融合蛋白位于高尔基体中。(A)MAN2A1-FER-FLAG在pCDNA4-MA2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TO转化的NIH3T3(NMF)和HEP3B(HEPMF)细胞中的表达。使用对FLAG或GAPDH具有特异性的抗体进行免疫印迹。(B)MAN2A1-FER-FLAG与高尔基体驻留蛋白N-乙酰半乳糖胺基转移酶共定位。FLAG和N-乙酰半乳糖胺基转移酶的免疫荧光染色。用共焦显微镜拍摄照片。(C)经诱导表达MAN2A1-FER-FLAG的HEPMF细胞的蔗糖梯度超速离心。组分编号显示在顶部。亚细胞位置显示在底部。使用指定的抗体进行免疫印迹(右)。受体结合癌相关表面抗原(RCAS1)用作高尔基体的标志物。(D)高尔基体中的MAN2A1-FER通过高尔基体分离方法确认。分离表达MAN2A1-FER的HUH7(上图)和NMF(下图)细胞的高尔基体部分，并用对FER(HUH7)或FLAG(NMF)具有特异性的抗体进行免疫印迹。对RCAS1、GAPDH和组蛋白3具有特异性的抗体用作纯度对照。G-高尔基体；C-细胞质；N-核。
图15A-G.MAN2A1-FER的酪氨酸激酶活性。(A)使用聚(EY 4:1)作为底物的体外激酶测定。GST-FER，GST-MAN2A1-FER和GST蛋白在大肠杆菌中表达。BL21，通过谷胱甘肽柱提取和纯化。定量激酶活性并将其标准化为pmol/蛋白质。(B)克唑替尼抑制GST-MAN2A1-FER的激酶活性。(C)EGFR的GST-MAN2A1-FER磷酸化酪氨酸88。上图：HisTAG-EGFRaa1-650(泳道1-8)或HisTAG-ΔEGFR N-末端Y88A(泳道9)的ATP剂量依赖性磷酸化。通过GST-MAN2A1-FER对HisTAG-ΔEGFRaa1-650进行磷酸化，过量的肽3(FLKTIQEVAGYVLIALNTVER(SEQ ID NO:144))或突变肽3(FLKTIQEVAGAVLIALNTVER(SEQ ID NO:145))(泳道7-8)。下图：GST-MAN2A1-FER对表4中列出的合成肽进行磷酸化测定。(D)来自具有或不具有MAN2A1-FER-FLAG的HEPMF细胞的部分消化的EGFR产物的免疫印迹分析。将来自HEPMF细胞的蛋白质提取物暴露于凝血酶或羟胺。然后通过对EGFR的N-末端具有特异性的抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物在15％SDS-PAGE中分离，并用抗体特异性磷酸酪氨酸进行免疫印迹。(E)MAN2A1-FER-FLAG激活EGFR。诱导具有诱导型MAN2A21-FER-FLAG的PC3(PMF)或HEPMF细胞表达MAN2A1-FER-FLAG。使用对pY1068、pY845或pY具有特异性的抗体进行免疫印迹。EGFR和GAPDH用作对照。(F)EGFR的Y88是MAN2A1-FER-FLAG诱导的EGFR活化所必需的。上图：用pCMV-ΔEGFRY88A-c-myc(泳道1-2)或pCMV-EGFR-c-myc(泳道3-4)转染HEPMF细胞。诱导这些细胞表达MAN2A1-FER-FLAG并用抗c-myc抗体免疫沉淀。然后用抗磷酸酪氨酸抗体印迹免疫沉淀物。下图：按上图进行的MAN2A1-FER-FLAG表达的诱导。然后进行EGFR-c-myc的交联，然后用抗c-myc抗体进行印迹。(G)对于MAN2A1-FER呈阳性(右)或阴性(中)的前列腺癌样品中EGFR pY1068的免疫染色。正常前列腺(左)用作阴性对照。
图16A-D.通过MAN2A1-FER激活EGFR信号转导途径。用pCDNA4-MAN2A1-FERFLAG/pCDNA6-TO转化的PC3(PMF)、HEP3B(HEPMF)、NIH3T3(NMF)和A-172(GMF)细胞用四环素处理以诱导MAN2A1-FERFLAG的表达(泳道1-8)。通过免疫印迹检查EGFR pY1068、B-raf pS445、MEK1/2pS221和Akt pS473的磷酸化状态。还将GAPDH，EGFR，B-raf，MEK1/2和Akt作为标准化对照进行免疫印迹。(B)将显性负性突变体ΔEGFRaa1-650转染到(A)的细胞中(泳道9-16)。进行与(A)类似的免疫印迹。用四环素处理用pCDNA4-ΔMAN2A1-FER-FLAGK723A/pCDNA6-TO转化的PC3(PMFΔK)，HEP3B(HEPMFΔK)，NIH3T3(NMFΔK)，A-172(GMFΔK)细胞以诱导MAN2A1-FERK723A-FLAG的表达(泳道17-24)。进行与(A)类似的免疫印迹。(D)HUH7细胞中MAN2A1-FER的中断降低了EGFR，B-raf，MEK和Akt的过度磷酸化。
图17A-F.MAN2A1-FER的促生长和侵袭活性。(A)用pCDNA4-ΔMAN2A1-FER-FLAGK723A/pCDNA6-TO或其野生型对应物转化的细胞的细胞周期分析。在HEPMF细胞中使用显性负性突变体ΔEGFRaa1-650来检查MAN2A1-FER促生长活性是否依赖于EGFR活化。采用HUH7及其MAN2A1-FER敲除对应物(KO)检查细胞生长是否依赖于MAN2A1-FER。(B)来自(A)的重复的集落形成测定。(C)具有或不具有MAN2A1-FER-FLAG的PMF，DMF，HEPMF GMF和HMF细胞的基质胶横向分析。(D)MAN2A1-FER增加了异种移植的人类癌症的肿瘤体积。(E)MAN2A1-FER增加异种移植人类癌症的转移率。(F)MAN2A1-FER增加了具有人类癌症异种移植物的小鼠的死亡率。
图18.用克唑替尼或卡奈替尼杀伤MAN2A1-FER阳性的癌细胞。上图：用各种浓度的克唑替尼或卡奈替尼处理HUH7或其MAN2A1-FER敲除对应细胞。然后通过膜联蛋白V和碘化丙锭染色定量细胞死亡的部分。中图：用不同浓度的克唑替尼或卡奈替尼处理用或不用四环素诱导的PMF细胞。然后通过膜联蛋白V和碘化丙锭染色定量细胞死亡的部分。下图：用不同浓度的克唑替尼或卡奈替尼处理用或不用四环素诱导的GMF细胞。然后通过膜联蛋白V和碘化丙锭染色定量细胞死亡的部分。
图19A-C.MAN2A1-FER增加了对激酶抑制剂克唑替尼和卡奈替尼的癌症敏感性。(A)克唑替尼或卡奈替尼的治疗减少了MAN2A1-FER阳性的异种移植癌的体积。(B)克唑替尼或卡奈替尼的治疗减少了MAN2A1-FER阳性的异种移植癌的转移事件，但对MAN2A1-FER的阴性转移事件无此情况。(C)克唑替尼或卡奈替尼的治疗降低了异种移植了MAN2A1-FER阳性的癌的SCID小鼠的死亡率，但没有降低MAN2A1-FER阴性的死亡率。
图20A-E.MAN2A1-FER-FLAG在体细胞Pten缺失的小鼠中诱导自发性肝癌。(A)操作示意图。(B)具有大体肝癌(gross liver cancer)(右)的小鼠和阴性对照(左)的代表性图片。AAV-CRE加对照载体pT3用作对照。(C)尾静脉流体动力学注射pT3-MAN2A1-FER-FLAG增加肝脏大小。AAV-CRE加对照载体pT3用作对照。(D)pT3-MAN2A1-FER-FLAG的尾静脉流体动力学注射诱导EGFR和Akt的活化。AAV-CRE加对照载体pT3用作对照。(E)通过尾静脉流体动力学注射pT3-MAN2A1-FER-FLAG产生的肝癌进展。AAV-CRE加对照载体pT3用作对照。
图21.AAV-cre和pT3-MAN2A1-FER-FLAG处理的Ptentm1Hwu/J小鼠的Ki-67，谷氨酰胺合酶和油染色的代表性图像。AAV-cre和pT3处理的小鼠用作对照。
图22.HCC和正常肝脏器官供体样品的Taqman定量反转录(RT)PCR。显示了TaqmanRT-PCR的原始标准化图。*通过桑格测序验证MAN2A1-FER融合。
图23A-B.MAN2A1-FER在体外和体内结合EGFR。(A)MAN2A1-FER-FLAG与EGFR的共免疫沉淀。(B)纯化的重组GST_MAN2A1-FER与EGFR N末端(HisTAG-DEGFRaa1-650)的体外结合。IP，免疫沉淀；WB，Western印迹。
图24.肝脏中转移性癌结节的代表性图像。指示了异种移植的肿瘤细胞和四环素(tet)治疗。绿色箭头表示肝脏中的转移性癌结节。
图25.MAN2A1和FER基因的转录组测序读取分布。该图表示单个样品的MAN2A1(左上)或FER(左下)的前3个外显子的读取计数与所有外显子的读数的比率或MAN2A1(右上)或FER(右下)的最后3个外显子的读数与所有外显子的读数的比率的分布。橙色样品来自癌症基因组图谱(TCGA)数据集(550个样品)；Luo等数据集(54个样品)(Luo等.前列腺癌和正常前列腺组织中融合转录物的发现和分类(Discovery and classification of fusiontranscripts in prostate cancer and normal prostate tissue)Am J Pathol 185:1834-1845(2015))。指示P值。
图26.运输至质膜的EGFR-SNAP的脉冲追踪分析。将pEGFR-SNAP转染到HEPMF细胞中。然后用或不用5mg/mL四环素处理这些细胞以诱导MAN2A1-FER-FLAG的表达，如图14所示。通过用10mM SNAP-Cell Block(溴代苯基硫脲)阻断培养基替换培养基20分钟来阻断荧光。通过用培养基洗涤这些细胞两次来消解(release)阻断。然后用SNAP-Cell 505-Star(5mM)脉冲EGFR-SNAP蛋白30分钟，并追踪0、1、2、3、4、5和6小时。纯化质膜组分。通过荧光酶标仪在532nM下定量质膜中EGFR-SNAP蛋白的荧光。RFU，相对荧光单位。
5.发明详述
为了清楚而非限制，本发明的详细描述分为以下小节：
(i)融合基因；
(ii)融合基因检测；
(iii)癌症靶标；
(iv)治疗方法；
(v)药物组合物；和
(vi)试剂盒。
5.1融合基因
本文所用术语“融合基因”指核酸或蛋白质序列，其以野生型/正常核酸或蛋白质序列中未发现的方式组合所述基因的元件或其RNA转录物。例如但非限制性地，在基因组DNA形式的融合基因中，相对于野生型/正常序列(例如，如NCBI染色体位置或本文所示序列中反映的)，所述基因的基因组序列的部分的相对位置有改变。在mRNA形式的融合基因中，存在来自两种组成基因的RNA转录物的部分(不一定在与野生型转录物相同的登记信息(register)中，并且可能包括通常不存在于正常成熟转录物中的部分)。在非限制性实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含至少约10个连续核苷酸，或至少约20个连续核苷酸，或至少约30个连续核苷酸，或至少40个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含融合基因中存在的基因的核苷酸序列的至多约10个连续核苷酸，至多约50个连续核苷酸，至多约100个连续核苷酸，至多约200个连续核苷酸，至多约300个连续核苷酸，至多约400个连续核苷酸，至多约500个连续核苷酸，至多约600个连续核苷酸，至多约700个连续核苷酸，至多约800个连续核苷酸，至多约900个连续核苷酸，至多约1,000个连续核苷酸，至多约1,500个连续核苷酸或至多约2,000个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分可包含融合基因中存在的基因的核苷酸序列的不超过约10个连续核苷酸，约50个连续核苷酸，约100个连续核苷酸，约200个连续核苷酸，约300个连续核苷酸，约400个连续核苷酸，约500个连续核苷酸，约600个连续核苷酸，约700个连续核苷酸，约900个连续核苷酸，约1,000个连续核苷酸，约1,500个连续核苷酸或约2,000个连续核苷酸。在某些实施方式中，基因组DNA或mRNA的这种部分不包含融合基因中存在的基因的完整野生型/正常核苷酸序列。在蛋白质形式的融合基因中，存在来自两种组成基因的氨基酸序列的部分(非限制性地，至少约5个连续氨基酸或至少约10个氨基酸或至少约20个氨基酸或至少约30个氨基酸)。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分可包含由融合基因中存在的基因编码的氨基酸序列的至多约10个连续氨基酸，至多约20个连续氨基酸，至多约30个连续氨基酸，至多约40个连续氨基酸，至多约50个连续氨基酸，至多约60个连续氨基酸，至多约70个连续氨基酸，至多约80个连续氨基酸，至多约90个连续氨基酸，至多约100个连续氨基酸，至多约120个连续氨基酸酸，至多约140个连续氨基酸，至多约160个连续氨基酸，至多约180个连续氨基酸，至多约200个连续氨基酸，至多约220个连续氨基酸，至多约240个连续氨基酸，至多约260个连续氨基酸，至多约280个连续氨基酸或至多约300个连续氨基酸。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分可包含由融合基因中存在的基因编码的氨基酸序列的不超过约10个连续氨基酸，约20个连续氨基酸，约30个连续氨基酸，约40个连续氨基酸，约50个连续氨基酸，约60个连续氨基酸氨基酸，约70个连续氨基酸，约80个连续氨基酸，约90个连续氨基酸，约100个连续氨基酸，约120个连续氨基酸，约140个连续氨基酸，约160个连续氨基酸，约180个连续氨基酸，约200个连续氨基酸，约220个连续氨基酸，约260个连续氨基酸，约280个连续氨基酸或约300个连续氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，融合基因蛋白的这种部分不包含由融合基因中存在的基因编码的完整野生型/正常氨基酸序列。在该段中，由基因、转录物或蛋白质产生的部分不是指在两种基因的野生型形式中可能碰巧相同的序列(也就是说，这些部分是“非共享的”)。因此，一般而言，融合基因表示通常不连接在一起的基因组元件剪接在一起或融合。关于所公开的融合基因的其它信息，参见WO2010/103057和WO2016/011428，其内容通过引用并入本文。
融合基因TRMT11-GRIK2是tRNA甲基转移酶11同源物(“TRMT11”)和谷氨酸受体，离子型红藻氨酸盐2(“GRIK2”)基因之间的融合体。人TRMT11基因通常位于染色体6q11.1上，人GRIK2基因通常位于染色体6q16.3上。在某些实施方式中，TRMT11基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：60487，序列染色体6；NC_000006.11(126307576..126360422)和/或GRIK2基因是这样的人基因：具有NCBI基因编号：2898，序列染色体6；NC_000006.11(101841584..102517958)。在某些实施方式中，TRMT11-GRIK2融合基因的连接(在本文中也称为染色体断裂点和/或连接片段)包含如图1和/或表1中所示的序列。
融合基因SLC45A2-AMACR是溶质载体家族45，成员2(“SLC45A2”)和α-甲基酰基-CoA消旋酶(“AMACR”)基因之间的融合体。人SLC45A2基因通常位于人染色体5p13.2上，人AMACR基因通常位于染色体5p13上。在某些实施方式中，SLC45A2基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：51151，序列染色体5；NC_000005.9(33944721..33984780，互补物)和/或AMACR基因是这样的人基因：具有NCBI基因编号：23600，序列染色体5；NC_000005.9(33987091..34008220，互补物)。在某些实施方式中，SLC45A2-AMACR融合基因的连接和/或连接片段包含如图1和/或表1中所示的序列。
融合基因MTOR-TP53BP1是雷帕霉素的机制靶标(“MTOR”)和肿瘤蛋白p53结合蛋白1(“TP53BP1”)基因之间的融合体。人MTOR基因通常位于染色体1p36.2上，人TP53BP1基因通常位于染色体15q15-q21上。在某些实施方式中，MTOR基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：2475，序列染色体1NC_000001.10(11166588..11322614，互补物)和/或TP53BP1基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：7158，序列染色体15；NC_000015.9(43695262..43802707，互补物)。在某些实施方式中，MTOR-TP53BP1融合基因的连接和/或连接片段包含如图1和/或表1中所示的序列。
融合基因LRRC59-FLJ60017是含富含亮氨酸的重复序列的59(“LRRC59”)基因和“FLJ60017”核酸之间的融合体。人LRRC59基因通常位于染色体17q21.33上，编码人FLJ60017的核酸通常位于染色体11q12.3上。在某些实施方式中，LRRC59基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：55379，序列染色体17；NC_000017.10(48458594..48474914，互补物)和/或FLJ60017具有GeneBank AK_296299中所示的核酸序列。在某些实施方式中，LRRC59-FLJ60017融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2和/或表1中所示的序列。
融合基因TMEM135-CCDC67是跨膜蛋白135(“TMEM135”)和含卷曲螺旋结构域的67(“CCDC67”)基因之间的融合体。人TMEM135基因通常位于染色体11q14.2上，人CCDC67基因通常位于染色体11q21上。在某些实施方式中，TMEM135基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：65084，序列染色体11；NC_000011.9(86748886..87039876)和/或CCDC67基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：159989，序列染色体11；NC_000011.9(93063156..93171636)。在某些实施方式中，TMEM135-CCDC67融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2和/或表1中所示的序列。
融合基因CCNH-C5orf30是细胞周期蛋白H(“CCNH”)和染色体5开放阅读框30(“C5orf30”)基因之间的融合体。人CCNH基因通常位于染色体5q13.3-q14上，人C5orf30基因通常位于染色体5q21.1上。在某些实施方式中，CCNH基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：902，序列染色体5；NC_000005.9(86687310..86708850，互补物)和/或C5orf30基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：90355，序列染色体5；NC_000005.9(102594442..102614361)。在某些实施方式中，CCNH-C5orf30融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图2、图5和/或表1中所示的序列。
融合基因KDM4B-AC011523.2是赖氨酸(K)特异性脱甲基酶4B(“KDM4B”)和染色体区域“AC011523.2”之间的融合体。人KDM4B基因通常位于染色体19p13.3上，人AC011523.2区通常位于染色体19q13.4上。在某些实施方式中，KDM4B基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：23030，序列染色体19；NC_000019.9(4969123..5153609)；和/或AC011523.2区域包含如图1中所示的序列。在某些实施方式中，KDM4B-AC011523.2融合基因的连接和/或连接片段包含如图1和/或表1中所示的序列。
融合基因MAN2A1-FER是甘露糖苷酶，α，2A类，成员1(“MAN2A1”)和(fps/fes相关)酪氨酸激酶(“FER”)之间的融合体。人MAN2A1基因通常位于染色体5q21.3上，人FER基因通常位于染色体5q21上。在某些实施方式中，MAN2A1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：4124，序列染色体5；NC_000005.9(109025156..109203429)或NC_000005.9(109034137..109035578)；和/或FER基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：2241，序列染色体5：NC_000005.9(108083523..108523373)。在某些实施方式中，MAN2A1-FER融合基因的连接和/或连接片段包含如图1、图13和/或表1中所示的序列。
融合基因PTEN-NOLC1是磷酸酶和张力蛋白同源物(“PTEN”)和核仁与卷曲体磷蛋白1(“NOLC1”)之间的融合体。人PTEN基因通常位于染色体10q23.3上，人NOLC1基因通常位于染色体10q24.32上。在某些实施方式中，PTEN基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：5728，序列染色体10；NC_000010.11(87863438..87970345)和/或NOLC1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：9221，序列染色体10；NC_000010.11(102152176..102163871)。在某些实施方式中，PTEN-NOLC1融合基因的连接和/或连接片段包含如图3和/或表1中所示的序列。
融合基因ZMPSTE24-ZMYM4是锌金属肽酶STE24(“ZMPSTE24”)和锌指，MYM-型4(“ZMYM4”)之间的融合体。人ZMPSTE24通常位于染色体1p34上，人ZMYM4基因通常位于染色体1p32-p34上。在某些实施方式中，ZMPSTE24基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：10269，序列染色体1；NC_000001.11(40258050..40294184)和/或ZMYM4基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：9202，序列染色体1；NC_000001.11(35268850..35421944)。在某些实施方式中，ZMPSTE24-ZMYM4融合基因的连接和/或连接片段包含如图6中所示的序列。
融合基因CLTC-ETV1是网格蛋白，重链(Hc)(“CLTC”)和ets变体1(“ETV1”)之间的融合体。人CLTC通常位于染色体17q23.1上，人ETV1基因通常位于染色体7p21.3上。在某些实施方式中，CLTC基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：1213，序列染色体17；NC_000017.11(59619689..59696956)和/或ETV1基因是这样的人基因，其具有NCBI基因编号：2115，序列染色体7；NC_000007.14(13891229..13991425，互补物)。在某些实施方式中，CLTC-ETV1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6中所示的序列或其片段。
融合基因ACPP-SEC13是酸性磷酸酶，前列腺(“ACPP”)和SEC13同源物(“SEC13”)之间的融合体。人ACPP通常位于染色体3q22.1上，人SEC13基因通常位于染色体3p25-p24上。在某些实施方式中，ACPP基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：55，序列染色体3；NC_000003.12(132317367..132368302)和/或SEC13基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：6396，序列染色体3；NC_000003.12(10300929..10321188，互补物)。在某些实施方式中，ACPP-SEC13融合基因的连接和/或连接片段包含如图6中所示的序列。
融合基因DOCK7-OLR1是胞质分裂异构体7(“DOCK7”)和氧化低密度脂蛋白(凝集素样)受体1(“OLR1”)之间的融合体。人DOCK7通常位于染色体1p31.3上，人OLR1基因通常位于染色体12p13.2-p12.3上。在某些实施方式中，DOCK7基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：85440，序列染色体1；NC_000001.11(62454726..62688368，互补物)和/或OLR1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：4973，序列染色体12；NC_000012.12(10158300..10172191，互补物)。在某些实施方式中，DOCK7-OLR1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6中所示的序列。
融合基因PCMTD1-SNTG1是含蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-甲基转移酶结构域1(“PCMTD1”)和肌萎缩蛋白，γ1(“SNTG1”)之间的融合体。人PCMTD1通常位于染色体8q11.23上，人SNTG1基因通常位于染色体8q11.21上。在某些实施方式中，PCMTD1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：115294，序列染色体8；NC_000008.11(51817575..51899186，互补物)和/或SNTG1基因是这样的人基因：其具有NCBI基因编号：54212，序列染色体8；NC_000008.11(49909789..50794118)。在某些实施方式中，PCMTD1-SNTG1融合基因的连接和/或连接片段包含如图6中所示的序列。
5.2融合基因检测
上文在5.1节中描述的任何前述融合基因可通过本领域已知的方法鉴定。可以通过检测以DNA、RNA或蛋白质形式表现的融合基因来检测融合基因。在某些实施方式中，可以通过确定由融合基因编码的DNA分子，RNA分子或蛋白质的存在来检测融合基因。例如但非限制性地，可以通过确定融合基因编码的蛋白质的存在来检测融合基因的存在。
可以在对象的样品中检测融合基因，例如MAN2A1-FER。“患者”或“对象”在本文中可互换使用，指人或非人对象。非人类对象的非限制性实例包括非人灵长类动物，狗，猫，小鼠等。对象可能先前或可能未被诊断为患有癌症。
在某些非限制性实施方式中，样品包括但不限于培养中的细胞，细胞上清液，细胞裂解物，血清，血浆，生物液体(例如，血液，血浆，血清，粪便，尿液，淋巴液，腹水，导管灌洗，唾液和脑脊液)和组织样本。样品的来源可以是实体组织(例如，来自新鲜的，冷冻的和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物)，血液或任何血液成分，体液(例如尿液，淋巴液，脑脊液，羊水，腹膜液或间质液)，或来自个体的细胞，包括循环癌细胞。在某些非限制性实施方式中，样品获自癌症。在某些实施方式中，样品可以是“活检样品”或“临床样品”，其是源自对象的样品。在某些实施方式中，可以在从对象获得的一种或多种样品中检测一种或多种融合基因。在某些实施方式中，可以在从对象获得的样品的一个或多个细胞中检测一种或多种融合基因。在某些实施方式中，样品包括来自对象的一种或多种前列腺癌细胞。在某些实施方式中，样品不是前列腺癌样品。在某些实施方式中，样品不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌样品。
在某些非限制性实施方式中，通过核酸杂交分析，例如原位杂交，检测融合基因。原位杂交是一种可以直接鉴定细胞或生物样品中特定DNA或RNA序列的技术，并且能够目测确定组织样品中融合基因的存在和/或表达。在某些非限制性实施方式中，当融合基因组合通常不存在于同一染色体上的基因时，原位杂交分析可证明探针与同一染色体结合。例如但非限制性地，分析可以集中在一个基因通常存在的染色体上，然后可以进行杂交分析以确定另一个基因是否也存在于该染色体上。
在某些非限制性实施方式中，通过荧光原位杂交(FISH)分析检测融合基因，其中荧光探针用于检测细胞或生物样品中的特定DNA或RNA序列。
在某些非限制性实施方式中，通过DNA杂交检测融合基因，例如但不限于Southern印迹分析。
在某些非限制性实施方式中，通过RNA杂交检测融合基因，例如但不限于Northern印迹分析。在某些实施方式中，Northern印迹分析可用于检测融合基因，其中分离的RNA样品在变性琼脂糖凝胶上跑动，并转移至合适的支持物，例如活化的纤维素，硝酸纤维素或玻璃或尼龙膜。然后，将放射性标记的cDNA或RNA与制剂杂交，洗涤并通过放射自显影分析以检测RNA样品中融合基因的存在。
在某些非限制性实施方式中，通过核酸测序分析检测融合基因。
在某些非限制性实施方式中，融合基因通过DNA阵列，芯片或微阵列上存在的探针检测。例如但非限制性地，可以将对应于一种或多种融合基因的寡核苷酸固定在芯片上，然后将芯片与获自对象的样品的标记核酸杂交。用含有融合基因转录物的样品获得阳性杂交信号。
在某些非限制性实施方式中，通过包括反转录聚合酶链反应(“RT-PCR”)的方法检测融合基因。在某些实施方式中，通过包括使用本文公开的一对或多对引物的RT-PCR的方法(参见例如，表2)检测融合基因。
表2.用于RT-PCR的引物序列。
在某些非限制性实施方式中，通过抗体结合分析检测融合基因，例如但不限于Western印迹分析和免疫组化。
在某些非限制性实施方式中，当融合基因与通常不存在于同一染色体上的基因组合时，FISH分析可证明探针与同一染色体结合。例如，分析可以集中在一个基因通常存在的染色体上，然后可以进行杂交分析以确定另一个基因是否也存在于该染色体上。
5.3癌症靶标
可适于本发明公开的癌症的非限制性实例包括前列腺癌，乳腺癌，肝癌，肝癌，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，肉瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤和食管腺癌。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。在某些实施方式中，癌症不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。在某些实施方式中，治疗靶标是涉及肺，子宫颈，子宫内膜，胰腺，卵巢，胃，甲状腺，神经胶质，肠，食道，肌肉或B细胞的肿瘤或恶变前病症。在某些实施方式中，治疗靶标是携带一种或多种融合基因(例如MAN2A1-FER)的细胞。
5.4治疗方法
本发明提供了治疗携带一种或多种融合基因的对象的方法，所述对象例如患有癌症或疑似患有癌症或携带一种或多种融合基因的肿瘤或恶变前病症的对象(恶变前病症尤其具有如下特征：存在肿瘤或恶变前细胞)。在某些实施方式中，治疗方法包括治疗携带一种或多种融合基因的对象以产生抗癌作用，抗肿瘤作用和/或抗细胞增殖作用。融合基因的非限制性实例在本文和5.1节中公开。在某些实施方式中，融合基因是MAN2A1-FER。可使用所公开的方法治疗的癌症的非限制性实例在5.3节中提供。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。在某些实施方式中，癌症不是肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。
在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括确定从对象获得的样品(例如来自癌症的样品)中的一种或多种融合基因的存在。融合基因的非限制性实例包括TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。如果样品中存在一种或多种融合基因，则治疗对象以产生抗癌作用和/或抗肿瘤作用。在某些实施方式中，该方法可包括确定本文公开的融合基因中的一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种，十种或更多种，十一种或更多种，十二种或更多种，十三种或更多种或全部十四种的存在或不存在。例如但非限制性地，治疗患有癌症的对象的方法包括确定从对象获得的样品中MAN2A1-FER融合基因的存在。
在某些实施方式中，本公开提供了用于治疗患有肿瘤或恶变前病症的对象的方法。在某些实施方式中，通过在从对象获得的样品(或一种或多种细胞)内的一种或多种融合基因的存在来鉴定肿瘤或恶变前病症。在某些实施方式中，该方法包括确定从对象获得的样品(或样品的一个或多个细胞)中一种或多种融合基因的存在，其中如果在样品中检测到一种或多种融合基因，则治疗对象以产生抗肿瘤作用(例如，通过向对象施用治疗有效量的对融合基因产物具有特异性的试剂来进行)。本文全文公开了对融合基因产物具有特异性的试剂的非限制性实例。
“抗癌作用”是指聚集的癌细胞团减少，癌细胞生长速度降低，癌症进展减少，癌细胞增殖减少，肿瘤质量减小，肿瘤体积减小，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤生长速率降低和/或肿瘤转移减少中的一种或多种。在某些实施方式中，抗癌作用可以指完全应答，部分应答，稳定疾病(没有进展或复发)，在诊断患有癌症的患者中具有较晚复发或无进展存活的应答。类似地，“抗肿瘤作用”是指聚集的肿瘤细胞团减少，肿瘤细胞生长速率降低，肿瘤进展减少(例如，进行性去分化或上皮细胞向间充质细胞转变)，肿瘤细胞增殖减少，肿瘤质量减少，肿瘤体积减小和/或肿瘤生长速率降低中的一种或多种。
在某些实施方式中，治疗对象(例如，患有携带融合基因的癌症的对象或具有一种或多种包含融合基因的细胞的对象)的方法包括，确定从对象获得的样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果在样品中检测到一种或多种融合基因，则向对象施用治疗有效量的抑制剂，例如对融合基因产物具有特异性的抑制剂。在某些实施方式中，可以施用抑制剂以在对象中产生抗癌作用。例如但非限制性地，本发明提供了治疗对象的方法，该方法包括确定从对象获得的样品中MAN2A1-FER融合基因的存在，并且其中，若在样品中检测到MAN2A1-FER融合基因，则给予对象治疗有效量的抑制剂，例如对MAN2A1-FER融合基因产物具有特异性的抑制剂。
“治疗有效量”是指能够实现以下一种或多种作用的量：抗癌作用，抗肿瘤作用，存活期延长和/或复发期前时间延长。
在某些实施方式中，治疗对象的方法涉及抑制融合基因和/或抑制融合基因产物，例如融合基因编码的蛋白质和/或RNA。例如但非限制地，治疗本发明的对象的方法涉及抑制MAN2A1-FER融合基因和/或抑制MAN2A1-FER融合基因产物，例如由MAN2A1-FER融合基因编码的蛋白质和/或RNA。
本发明进一步提供了预防，最小化和/或减少肿瘤生长的方法，包括确定对象样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因则给对象施用治疗有效量的对融合基因产物具有特异性的试剂，以预防、最小化和/或减少肿瘤的生长。
本发明提供预防，最小化和/或减少癌细胞生长和/或增殖的方法，包括确定对象样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果样品中存在一种或多种融合基因，则给予对象治疗有效量的对融合基因产物具有特异性的试剂，以预防，最小化和/或减少癌细胞的生长和/或增殖。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供治疗和/或抑制对象中癌症和/或肿瘤和/或肿瘤生长进展的方法，包括确定对象的样品中一种或多种融合基因的存在，如果样品中存在一种或多种融合基因，则向对象施用治疗有效量的对融合基因产物具有特异性的试剂，以治疗和/或抑制癌症和/或肿瘤的进展。
在某些实施方式中，本发明提供了延长患有癌症的对象的存活期的方法。在某些实施方式中，所述方法包括，确定该对象的样品中一种或多种融合基因的存在，其中如果在样品中检测到一种或多种融合基因，则向对象施用治疗有效量的抑制剂，例如对融合基因产物具有特异性的抑制剂。在某些实施方式中，使用所公开的方法，患有癌症的对象的存活期可延长约1个月，约2个月，约4个月，约6个月，约8个月，约10个月，约12个月，约14个月，约18个月，约20个月，约2年，约3年，约5年或更长时间。
本发明进一步提供了用于确定对具有含一种或多种融合基因的一种或多种细胞的对象治疗的方法。在某些实施方式中，该方法包括：i)提供来自对象的样品；ii)确定对象的一个或多个细胞是否含有选自下组的一种或多种融合基因：TMEM135-CCDC67，TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1，PCMTD1-SNTG1及其组合；和iii)如果在对象的一个或多个细胞中检测到一种或多种融合基因，则指示给予治疗有效量的对检测到的一种或多种融合基因具有特异性的一种或多种抑制剂，其中对象不患有前列腺癌。
本发明进一步提供鉴定具有患癌症风险的对象的方法。在某些实施方式中，该方法包括确定从对象获得的一个或多个细胞是否含有一种或多种融合基因，其中如果一个或多个细胞含有一种或多种融合基因，则该对象具有患癌症的风险，其中癌症不是前列腺癌。
本发明还提供了诊断具有恶变前病症的对象的方法。在某些实施方式中，该方法包括确定从对象获得的一个或多个细胞是否含有一种或多种融合基因，其中如果一个或多个细胞含有一种或多种融合基因，则对象具有恶变前病症，其中对象不患前列腺癌。
在某些实施方式中，通过基因组测序检测样品中的融合基因。在某些实施方式中，通过RNA测序检测样品中的融合基因。例如但不限于，可以使用本文公开的引物进行RNA测序。在某些实施方式中，通过FISH检测样品中的融合基因。
抑制剂的实例包括但不限于抑制和/或降低融合基因编码的蛋白质的表达和/或活性的化合物，分子，化学品，多肽和蛋白质。或者或另外，抑制剂可包括抑制和/或降低融合基因的一个或多个下游靶标的表达(例如RNA表达或蛋白质表达)和/或活性的化合物，分子，化学品，多肽和蛋白质。抑制剂的其它非限制性实例包括核酶，反义寡核苷酸，shRNA分子和siRNA分子，其特异性抑制或降低融合基因的表达和/或活性和/或抑制或降低融合基因的一个或多个下游靶标的表达和/或活性。抑制剂的一个非限制性实例包括与融合基因序列的至少一部分同源的反义，shRNA或siRNA核酸序列，其中该部分相对于融合基因序列的同源性为至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％，其中同源性百分比可通过例如BLAST或FASTA软件确定。在某些实施方式中，反义，shRNA或siRNA核酸序列可以与“连接片段”处的序列同源，所述“连接片段”包括融合基因的剪接基因之间的边界，在本文中也称为染色体断裂点。与所公开的融合基因的连接片段序列同源的siRNA的非限制性实例显示在表1中。可以靶向的染色体断裂点的非限制性实例公开于表1和图1-3、6和13中。在某些实施方式中，抑制剂是与MAN2A1-FER的连接片段序列同源的siRNA。在某些实施方式中，反义，shRNA或siRNA核酸序列可包含与连接片段的一部分同源的序列。
在某些非限制性实施方式中，反义核酸，shRNA或siRNA分子的互补部分可构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少30个核苷酸，且反义核酸酸，shRNA或siRNA分子的长度可长达15或长达20或长达25或长达30或长达35或长达40或长达45或长达50或长达75或长达100个核苷酸。反义，shRNA或siRNA分子可包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于硫代磷酸酯残基和锁核酸。
在某些实施方式中，抑制剂可包括抗体或其衍生物，其特异性结合并抑制和/或降低由融合基因编码的蛋白质的表达和/或活性，例如拮抗性抗体。或者或另外，抑制剂可包括抗体或其衍生物，其特异性结合并抑制和/或降低融合基因的一个或多个下游靶标的表达和/或活性。短语“特异性结合”是指例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇的结合，使得结合可以与具有相同或相似表位，抗原或抗原决定簇的第二制剂置换或竞争。可以在所公开的方法中使用的抗体及其衍生物的非限制性实例包括多克隆或单克隆抗体，嵌合，人，人源化，灵长类化(CDR-移接)，单板(veneered)或单链抗体，相产生的抗体(例如，来自噬菌体展示文库)，以及抗体的功能性结合片段。抗体结合片段或其部分包括但不限于Fv，Fab，Fab'和F(ab')2。这些片段可以通过酶促切割或通过重组技术产生。在某些实施方式中，抑制剂可以是抗体或其衍生物，其特异性结合并抑制和/或降低由MAN2A1-FER融合基因编码的蛋白质的表达和/或活性，或者结合并抑制和/或降低MAN2A1-FER融合基因的一个或多个下游靶标的表达和/或活性。例如但非限制地，MAN2A1-FER融合基因的抑制剂，例如抗体或其衍生物，可以靶向MAN2A1，FER和/或MAN2A1-FER的下游靶标。例如但不限于，抑制剂可以抑制和/或降低EGFR，B-raf，MEK和/或AKT的表达和/或活性。
在某些实施方式中，当在对象样品中检测到的融合基因编码的蛋白质表现出激酶活性时，治疗对象(例如患有携带融合基因的癌症的对象)的方法可包括给予治疗有效量的抑制和/或降低由融合基因编码的蛋白质的激酶活性的受体抑制剂，即激酶抑制剂。激酶抑制剂的非限制性实例包括阿法替尼，艾乐替尼，阿西替尼，贝伐单抗，博舒替尼，西妥昔单抗，克唑替尼，卡奈替尼，达沙替尼，厄洛替尼，福他替尼，吉非替尼，GSK1838705A，依鲁替尼，伊马替尼，拉帕替尼，乐伐替尼，木利替尼，尼罗替尼，帕尼单抗，帕唑帕尼，哌加他尼，兰尼单抗，鲁索替尼，索拉非尼，舒尼替尼，su6656，曲妥珠单抗，托法替尼，凡德他尼和维莫非尼。例如但非限制性地，如果在对象样品中检测到的融合基因编码的蛋白质显示出酪氨酸激酶活性，则可向对象施用治疗有效量的酪氨酸激酶抑制剂。
在某些实施方式中，治疗对象(例如，患有癌症(例如，非前列腺癌)的对象)的方法可以包括确定对象样品中MAN2A1-FER的存在，其中如果MAN2A1-FER融合基因是存在于样品中，则用治疗有效量的FER抑制剂治疗对象。FER抑制剂的非限制性实例包括克唑替尼，TAE684，WZ-4-49-8，WZ-4-49-10和WZ-4-24-7。在特定的非限制性实施方式中，FER抑制剂可以衍生自二氨基嘧啶或吡唑并吡啶化合物。FER抑制剂的其它非限制性实例公开于PCT申请号WO2009/019708中，其内容通过引用全文并入本文。在某些实施方式中，FER抑制剂可包括酪氨酸激酶抑制剂和ALK抑制剂，因为FER表现出与ALK的高度序列相似性。在某些实施方式中，FER抑制剂是降低和/或抑制MAN2A1-FER蛋白的表达和/或活性的抗体。在某些实施方式中，FER抑制剂包含靶向MAN2A1-FER融合基因或MAN2A1-FER融合基因的接合序列的siRNA。靶向MAN2A1-FER融合基因的siRNA序列的非限制性实例显示于表1中。在某些实施方式中，可以使用所公开的方法靶向的MAN2A1-FER融合基因的染色体断裂点显示在表1和图1和13中。
或者或另外，治疗表达MAN2A1-FER融合基因的对象(例如，具有携带MAN2A1-FER融合基因的癌症的对象)的方法可包括向对象施用减少和/或抑制MAN2A1-FER融合基因的一个或多个下游靶标的活性和/或表达的化合物。例如但不限于，该方法可包括抑制EGFR-RAS-BRAF-MEK信号转导途径。抑制EGFR活性的化合物的非限制性实例包括厄洛替尼，西妥昔单抗，吉非替尼，贝伐单抗，卡奈替尼，帕尼单抗和硼替佐米。EGFR抑制剂的其它非限制性实例公开于Dziadziuszko和Jassem,Annals of Oncology 23(增刊_10):193-196(2012)。抑制B-raf活性的化合物的非限制性实例是RAF265。抑制MEK活性的化合物的非限制性实例包括贝美替尼，维莫非尼，PD-325901，司美替尼和曲美替尼。AKT抑制剂的非限制性实例公开于Nitulescu等,Int J Oncol.48(3):869-885(2016)(参见Nitulescu等(2016)的表1)。抑制EGFR-RAS-BRAF-MEK信号转导途径的化合物的其它非限制性实例包括TAK-733，和厚朴酚，AZD8330，PD318088，BIX 02188，匹瑟替尼(pimasertib)，SL-327，BIX 02189，PD98059，MEK162，PD184352和U0126-EtOH。
在某些实施方式中，该方法可以包括向对象施用降低和/或抑制融合基因的第一蛋白质的活性和/或表达的化合物，以及降低和/或抑制融合基因的第二蛋白质的活性和/或表达的化合物。例如，在某些实施方式中，治疗表达MAN2A1-FER融合基因的对象(例如，具有携带MAN2A1-FER融合基因的癌症的对象)的方法可包括向对象施用减少和/或抑制FER的活性和/或表达的化合物(例如，FER抑制剂)，联合使用减少和/或抑制MAN2A1-FER融合基因的一个或多个下游靶标的活性和/或表达的化合物。在某些实施方式中，联合使用不要求FER抑制剂和降低和/或抑制MAN2A1-FER融合基因的一个或多个下游靶标的活性和/或表达的化合物在给药前物理合并或者在同一时间段内进行给予它们。因此，降低和/或抑制MAN2A1-FER融合基因的一个或多个下游靶标的活性和/或表达的化合物可以在施用一个或多个剂量的FER抑制剂之前，同时或之后施用。例如但非限制地，治疗表达MAN2A1-FER融合基因的对象的方法可包括给予对象治疗有效量的克唑替尼和治疗有效量的卡奈替尼。
在某些实施方式中，治疗对象(例如，患有癌症或具有携带融合基因的恶变前或肿瘤病症的对象)的方法可包括，确定对象样品中SLC45A2-AMACR的存在，其中如果SLC45A2-AMACR融合基因存在于样品中，则用治疗有效量的消旋酶抑制剂和/或AMACR抑制剂治疗对象。消旋酶和/或AMACR抑制剂的非限制性实例包括：依布硒啉，2-(2,5-二羟基-4-甲基苯基)-5-甲基苯-1,4-二醇(DMPMB)，2-甲基硫烷基-7,9-二氢-3H-嘌呤-6,8-二硫酮(MSDTP)，2,5-二(吡唑-1-基)苯-1,4-二醇(DPZBD)，玫瑰红，刚果红，3,5-二(吡啶-4-基)-1,2,4-噻二唑(DPTD)，氧化依布硒啉和3,7,12-三羟基胆甾酰辅酶A(THCA-CoA)。在特定的非限制性实施方式中，消旋酶抑制剂可以是N-甲基硫代氨基甲酸酯。AMACR抑制剂的其它非限制性实例公开于Wilson等,Mol.Cancer Ther.(2011),10(5):825-838，其内容通过引用其全文并入本文。
在某些实施方式中，治疗对象(例如，患有携带本文公开的融合基因(例如MAN2A1-FER融合基因)的癌症的对象)的方法可进一步包括施用治疗有效量的抗癌剂或导致抗肿瘤作用的药剂。“抗癌剂”可以是具有抗癌作用的任何分子，化合物化学品或组合物。抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，放射治疗剂，细胞因子，抗血管生成剂，凋亡诱导剂或抗癌免疫毒素。在某些非限制性实施方式中，本文公开的抑制剂可以与一种或多种抗癌剂组合施用。如本文所用，“与......组合”是指将给予对象的一种或多种抑制剂化合物和/或药剂和一种或多种抗癌剂作为治疗方案或计划的一部分给予对象。该术语不要求抑制剂和/或激酶抑制剂和一种或多种抗癌剂在给药前物理合并，也不要求它们在相同的时间范围内给予。抗癌剂的其它非限制性实例包括，醋酸阿比特龙，比卡鲁胺，卡巴他赛，卡波德(比卡鲁胺)，地加瑞克，多西紫杉醇，恩杂鲁胺，醋酸戈舍瑞林，Jevtana(卡巴他赛)，醋酸亮丙瑞林，Lupron(醋酸亮丙瑞林)，Lupron Depot(亮丙瑞林)醋酸酯，Lupron Depot-3个月(醋酸亮丙瑞林)，Lupron Depot-4个月(醋酸亮丙瑞林)，Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)，米托蒽醌盐酸盐，泼尼松，普列威(西普鲁塞-T)，镭223二氯化物，西普鲁塞-T，泰素帝(多西紫杉醇)，亮丙瑞林(醋酸亮丙瑞林)，Xofigo(镭223二氯化物)，恩杂鲁胺(恩杂鲁胺)，诺雷德(醋酸戈舍瑞林)和阿比特龙(醋酸阿比特龙)。
在某些实施方式中，治疗对象(例如，具有携带一种或多种融合基因(例如MAN2A1-FER融合基因)的癌症的对象)的方法包括确定对象的样品中一种或多种融合基因的存在，如果在样品中检测到一种或多种融合基因，则进行冷冻疗法，放疗，化疗，激素疗法，生物疗法，双膦酸盐疗法，高强度聚焦超声，频繁监测，频繁前列腺特异性抗原(PSA)检查和根治性前列腺切除术中的一种或多种。生物治疗剂的非限制性实例是西普鲁塞-T(Sipuleucel-T)。双膦酸盐疗法包括但不限于氯膦酸盐或唑来膦酸盐。在某些实施方式中，这些方法可用于在对象中产生抗癌作用。在某些实施方式中，样品不是前列腺癌样品。
激素疗法可包括睾丸切除术，促黄体激素释放激素(LHRH)类似物和/或激动剂，LHRH拮抗剂，抗雄激素或雄激素抑制药物，雌激素，抗雌激素，孕激素，促性腺激素释放激素(GnRH)类似物和芳香酶抑制剂中的一种或多种。LHRH类似物和/或激动剂的非限制性实例包括亮丙瑞林，戈舍瑞林和布舍瑞林。LHRH拮抗剂的非限制性实例包括阿巴瑞克，西曲瑞克，加尼瑞克和地加瑞克。抗雄激素药物包括但不限于氟他胺，比卡鲁胺，恩杂鲁胺和尼鲁米特。雄激素抑制药物的非限制性实例包括雌激素，酮康唑和氨基戊二酰亚胺。频繁监测可以包括PSA血液测试，数字直肠检查，超声波和/或经直肠超声引导的前列腺活组织检查，其以规律的间隔，例如，以约3至约6个月的间隔进行，以监测前列腺癌的状态。根治性前列腺切除术是一种外科手术，包括切除整个前列腺和一些周围组织。前列腺切除术可以通过开放手术进行，也可以通过腹腔镜手术进行。
表1.融合基因连接序列和靶向融合基因连接的siRNA序列。
头部基因用斜体字体表示。靶序列带下划线并加粗。
5.6药物制剂
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了上文公开的用于治疗用途的抑制剂和/或药剂的药物制剂。在某些实施方式中，药物制剂包含对融合基因产物具有特异性的一种或多种试剂和药学上可接受的运载体。例如但非限制性地，药物制剂包含FER和/或EGFR抑制剂和药学上可接受的运载体，例如用于治疗患有携带MAN2A1-FER融合基因的癌症的对象。在一些实施方式中，癌症不是前列腺癌。药剂和/或抑制剂的非限制性实例在上文5.5节中公开。
本文所用的“药学上可接受的运载体”包括不干扰活性成分(例如抑制剂)的生物活性的有效性且对施用它的患者无毒的任何运载体。合适的药物运载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上可接受的运载体的其它非限制性实例可包括凝胶，生物可吸收的基质材料，含有抑制剂的植入元件和/或任何其它合适的载剂，递送或分配装置或材料。这些运载体可以通过常规方法配制，并且可以施用于对象。在某些实施方式中，药学上可接受的运载体可包括缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如但不限于十八烷基二甲基苄基氯化铵，六甲基氯化铵，苯扎氯铵，苄索氯铵，苯酚，丁基或苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。在某些实施方式中，合适的药学上可接受的运载体可包括水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，右旋糖，甘油，乙醇或其组合中的一种或多种。
在某些实施方式中，本发明的方法和制剂可用于减少，抑制，预防或逆转癌症和/或肿瘤生长。可以使用细胞内递送的标准方法(例如，通过脂质体递送)。这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。细胞内抑制剂的治疗性给药也可以使用基因疗法完成，例如通过使用shRNA。最终选择的给药途径将取决于许多因素，并且可由本领域技术人员确定。
在某些非限制性实施方式中，本发明的药物制剂可以使用本领域熟知的适于口服给药的药学上可接受的运载体来配制。这些运载体使得药物组合物能够配制成片剂，丸剂，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等，用于待治疗患者的口服或鼻腔摄入。在某些实施方式中，药物制剂可以是固体剂型。在某些实施方式中，片剂可以是速释片剂。或者或此外，片剂可以是延长或控释片剂。在某些实施方式中，固体剂型可包括立即释放部分和延长或控制释放部分。
在某些实施方式中，本发明的药物制剂可以使用本领域熟知的适于肠胃外给药的药学上可接受的运载体来配制。本文所用的术语“肠胃外给药”和“胃肠外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射给药，包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，皮下，关节内，包膜下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。例如但不限于，本发明的制剂可以在药学上可接受的运载体如生理盐水中静脉内给予患者。在某些实施方式中，本发明提供了包含FER和/或EGFR抑制剂的肠胃外制剂。
在某些实施方式中，适用于本发明的药物制剂可包括其中含有治疗有效量的活性成分例如FER和/或EGFR抑制剂的制剂。治疗有效量的活性成分可以根据活性成分，例如FER和/或EGFR抑制剂，使用的配方，癌症及其严重程度，以及待治疗的对象的年龄，体重等而变化。在某些实施方式中，患者可以在一种或多种制剂的一次或多次施用中接受治疗有效量的本文公开的抑制剂和/或药剂，其可以取决于患者所需和耐受的剂量和频率。
在某些非限制性实施方式中，上述抑制剂和/或试剂可以单独使用或与一种或多种抗癌剂组合使用。如上所述，“与......组合”是指将抑制剂和一种或多种抗癌剂作为治疗方案或计划的一部分给予对象。在某些实施方式中，组合使用不要求抑制剂和一种或多种抗癌剂在给药前物理合并或者在相同的时间范围内给药。因此，可以在施用一个或多个剂量的抑制剂之前，同时或之后施用第二抗癌剂。
在某些非限制性实施方式中，FER抑制剂可以与EGFR抑制剂组合使用。例如但非限制性地，本发明的药物制剂可包括一种或多种FER和/或一种或多种EGFR抑制剂。例如但非限制性地，本发明的药物制剂可包括治疗有效量的一种或多种FER抑制剂和治疗有效量的一种或多种EGFR抑制剂。在某些实施方式中，FER抑制剂是克唑替尼。在某些实施方式中，EGFR抑制剂是卡奈替尼。在某些实施方式中，本发明的药物制剂可包括克唑替尼和卡奈替尼。
在某些实施方式中，当抑制剂与抗癌剂组合使用时，在某些情况下，每种药剂的量可小于单独服用该药剂的治疗有效量，但是当两者都用于治疗时，实现有效性。
5.7试剂盒
本发明进一步提供了用于检测本文公开的一种或多种融合基因和/或用于实施上述检测和治疗方法中的任何一种的试剂盒。
试剂盒的类型包括但不限于，包装的融合基因特异性探针和引物组(例如，TaqMan探针/引物组)，阵列/微阵列，抗体，其进一步含有用于检测(例如，对象的一种或多种细胞，例如癌细胞中的)本发明的一种或多种融合基因的一种或多种探针，引物或其它试剂。在某些实施方式中，一种或多种癌细胞不是前列腺癌细胞。在某些实施方式中，一种或多种癌细胞不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌细胞。
在某些非限制性实施方式中，提供了试剂盒，其包含一种或多种核酸引物或探针和/或抗体探针，用于实施任何上述方法。所述探针可以可检测地标记，例如用生物素，比色，荧光或放射性标志物。核酸引物可以以一对的一部分形式提供，例如用于聚合酶链式反应。在某些非限制性实施方式中，核酸引物的长度可以是至少约10个核苷酸或至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸长度和/或至多约200个核苷酸或至多约150个核苷酸或至多约100个核苷酸或至多约75个核苷酸或至多约50个核苷酸。核酸探针可以是寡核苷酸探针和/或适用于FISH分析的探针。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1中至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种，十四种的引物和/或探针。在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包括用于确定对象样品(例如，来自对象的一种或多种癌细胞)中MAN2A1-FER存在的引物和/或探针。在某些实施方式中，一种或多种癌细胞不是前列腺癌细胞。在某些实施方式中，一种或多种癌细胞不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌细胞。
在某些非限制性实施方式中，核酸引物和/或探针可以固定在固体表面，底物或支持物上，例如固定在核酸微阵列上，其中与固体表面或支持物结合的每种引物和/或探针的位置是已知且可识别的。核酸引物和/或探针可以固定到基底上，例如玻璃，塑料，纸，尼龙或其它类型的膜，过滤器，芯片，珠子或任何其它合适的固体支持物。核酸引物和/或探针可以直接在基材上合成，或者与基材分开合成，然后固定在基材上。可以使用已知方法制备阵列。
在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于一种或多种融合基因的FISH分析的核酸探针，例如，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含用于MAN2A1-FER融合基因的FISH分析的核酸探针。在具体的非限制性实施方式中，可以提供用于检测融合基因的探针，使得分开的探针各自结合融合基因的两个组分，或探针可以结合包含剪接基因之间的边界的“连接片段”。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1中至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种或全部十四种的所述探针。在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含用于MAN2A1-FER融合基因的FISH分析的核酸探针，其结合MAN2A1-FER融合基因的“连接片段”，或包含结合MAN2A1基因的一种核酸探针和结合FER基因的第二核酸探针。
在非限制性实施方式中，试剂盒提供用于一种或多种融合基因的PCR分析的核酸引物，例如，所述融合基因选自下组：TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1。在具体的非限制性实施方式中，试剂盒包含用于分析TRMT11-GRIK2，SLC45A2-AMACR，MTOR-TP53BP1，LRRC59-FLJ60017，TMEM135-CCDC67，KDM4B-AC011523.2，MAN2A1-FER，PTEN-NOLC1，CCNH-C5orf30，ZMPSTE24-ZMYM4，CLTC-ETV1，ACPP-SEC13，DOCK7-OLR1和PCMTD1-SNTG1中至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种，十四种的所述引物。在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含用于MAN2A1-FER融合基因的PCR分析的核酸引物。
在某些实施方式中，试剂盒提供本文公开的药物组合物，例如，如5.6节中所公开的。例如但不限于，试剂盒可包含药物组合物，其包含对融合基因产物具有特异性的试剂和/或抑制剂。在某些实施方式中，试剂盒可包含药物组合物，其包含FER和/或EGFR抑制剂和药学上可接受的运载体，例如用于治疗具有携带MAN2A1-FER融合基因的一种或多种细胞的对象。在某些实施方式中，试剂盒可以在相同或不同的容器中包含克唑替尼和卡奈替尼。在某些非限制性实施方式中，试剂盒可以进一步包含一种或多种核酸引物或探针和/或抗体探针，用于检测一种或多种融合基因，如上所述。
提供以下实施例以更全面地说明本公开，但不应解释为限制其范围。
6实施例1：MAN2A1-FER在人类恶性肿瘤中的致癌活性。
6.1介绍
致癌融合基因是驱动人类癌症进展的基础机制之一。融合基因之一是甘露糖苷酶α2A类成员1(MAN2A1)的5'末端的外显子13与FER酪氨酸激酶(FER)的3'末端的最后6个外显子之间的融合。MAN2A1是将高甘露糖转化为复合型N-聚糖结构所需的高尔基酶，用于膜蛋白的成熟糖基化(Moremen和Robbins(1991)J Cell Biol 115:1521-1534；Misago等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92:11766-11770)。对它与人类恶性肿瘤的关系知之甚少。另一方面，酪氨酸激酶FER是充分证明的致癌基因(Hao等(1989)Mol Cell Biol 9:1587-1593)。嵌合MAN2A1-FER蛋白含有来自MAN2A1的N末端的703个氨基酸和来自FER的C末端的251个氨基酸。得到的嵌合蛋白失去MAN2A1的C末端的糖苷-水解酶结构域和FER的N末端的SH2结构域，同时使FER中的酪氨酸激酶结构域基本上完整。先前的分析显示，约80％的MAN2A1-FER阳性前列腺癌患者的临床结果较差。然而，在目前的研究之前，尚不清楚MAN2A1-FER融合是否也发生在其它类型的人类恶性肿瘤中。
在该实施例中，我们显示MAN2A1-FER融合基因存在于多种类型的人恶性肿瘤中。特别是，MAN2A1-FER存在于前列腺癌，肝癌，非小细胞肺癌，多形性胶质母细胞瘤，卵巢癌和食道腺癌中。MAN2A1-FER蛋白的表达导致体外和体内致癌作用，并且用酪氨酸激酶抑制剂治疗MAN2A1-FER阳性癌症导致异种移植了融合基因阳性癌的动物的存活率显著提高。MAN2A1-FER融合体的FER结构域从细胞质转移到高尔基体，导致EGFR的N-末端磷酸化和EGFR信号通路的激活。MAN2A1-FER的表达在体外和体内引起癌症生长和侵袭的显著增加，而通过敲除去除该融合体产生显著较低的生长和转移水平。MAN2A1-FER的存在增加了人类癌症在体外和体内对FER激酶抑制剂克唑替尼或EGFR激酶抑制剂卡奈替尼的敏感性。流体动力学尾静脉注射MAN2A1-FER基因导致体细胞Pten缺失的小鼠肝癌。总之，这些结果表明MAN2A1-FER融合基因是人类癌症发展的关键驱动因素之一。
6.2材料和方法
细胞系。所有细胞系，包括PC3(前列腺癌)，Du145(前列腺癌)，H23，HUH7和HEP3B购自美国细胞培养收藏中心(American Type Cell Culture，弗吉尼亚州马纳萨斯)。用补充有10％胎牛血清(InVitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的F12K培养基培养PC3细胞。用补充有10％胎牛血清(InVitrogen)的改良伊氏培养基培养DU145和HEP3B细胞。将A-172、NIH3T3和HUH7细胞与补充有10％胎牛血清的杜氏改良的伊氏培养基一起培养。用补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养H23细胞。通过PCR测试这些细胞系的基因组在基因组的八个不同基因座(CSF1PO，D13S317，D16S539，D5S818，D7S820，THO1，TPOX和vWA)上的短串联重复(STR)DNA谱，使用以下几组引物：
CSF1PO:AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC(SEQ ID
NO:76)/TTCCACACACCACTGGC CATCTTC(SEQ ID NO:77),
D13S317:ACAGAAGTCTGGGATGTGGA(SEQ ID
NO:78)/GCCCAAAAAGACAGACAGAA(SEQ ID NO:79),
D16S539:GATCCCAAGCTCTTCCTCTT(SEQ ID NO:80)/ACGTTTGTGTGTGCATCTGT(SEQID NO:81),
D5S818:GGGTGATTTTCCTCTTTGGT(SEQ ID NO:82)/TGATTCCAATCATAGCCACA(SEQ IDNO:83),
D7S820:TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG(SEQ ID
NO:84)/CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG(SEQ ID NO:85),
TH01:GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT(SEQ ID
NO:86)/ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG(SEQ ID NO:87),
TPOX:ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG(SEQ ID
NO:88)/GGAGGAACTGGGAACCAC ACAGGT(SEQ ID NO:89),
vWA:CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG(SEQ ID
NO:90)/GGACAGATGATAAAT ACATAGGATGGATGG(SEQ ID NO:91)。
这些细胞系经过鉴定，因为细胞系的短串联重复序列(STR)与ATCC公布的完美匹配。ABC试剂盒购自Vector Labs公司，俄亥俄州。ABC试剂盒购自Vector Labs公司(俄亥俄州扬斯敦)。除非另有说明，否则所有信号转导分析都在用四环素诱导MAN2A1-FER表达前24小时，在用MAN2A1-FER融合基因转化的细胞在无血清饥饿状态下进行。
组织样品。139例PCa样本，10例匹配血液样品和20例器官供体前列腺(OD)，102例非小细胞肺癌，61例卵巢癌，70例肝癌，156例多形性胶质母细胞瘤，27例食管腺癌和269例前列腺癌样品来自匹兹堡大学组织库，符合机构监管指南(表5-10)。先前描述了PCa样品的显微切割和DNA提取的操作3。组织采购和操作的协议由匹兹堡大学的机构审查委员会批准。
RNA提取，cDNA合成和Taqman RT-PCR。在FFPE样品的载玻片上进行显微切割以获得至少50％的癌细胞。用Trizol方法(InVitrogen，加利福尼亚州)从上皮细胞中提取总RNA。根据制造商的建议进行提取操作。在第一链cDNA合成中使用随机六聚体，其具有1μg总RNA和Superscript II TM(InVitrogen公司，加利福尼亚州)。然后使用引物TGGAAGTTCAAGTCAGCGCAG(SEQ ID NO:92)/GAAGTTTTATCCTTTAATGTGCCC(SEQ ID NO:93)和Taqman探针5'-/56-FAM/TCAGAA ACA(SEQ ID NO:94)/ZEN/GCC TAT GAG GGA AAT T(SEQID NO:95)/3IABkFQ/-3’在Eppendorf RealplexTM循环仪中进行Taqman PCR(94℃2分钟，然后94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒，50个循环)。使用β-肌动蛋白Taqman RT-PCR，采用引物GCATGGGTCAGAAGGATTCCT(SEQ ID NO:96)/GTGCTCGATGGGGTACTTCAG(SEQ ID NO:97)和Taqman探针5'-/56-FAM/CGA CGA GGC(SEQ ID NO:98)/ZEN/CCA GAG CAA GAG(SEQ ID NO:99)/3IABkFQ/-3’作为定量和定性对照。Ct小于36的样品被判定为MAN2A1-FER阳性。当样品显示β-肌动蛋白Ct高于35时，在此条件下进行MAN2A1-FER的巢式Taqman RT-PCR：94℃2分钟，然后94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒，25个循环，采用引物CTGCTTCAGGAAAACCTGTGG(SEQID NO:100)/TACATGTTTTAACAGCAACAGAAG(SEQ ID NO:101)。然后进行巢式PCR，使用引物TGGAAGTTCAAGTCAGCGCAG(SEQ ID NO：102)/GAAGTTTTATCCTTTAATGTGCCC(SEQ ID NO：103)和Taqman探针：5'-/56-FAM/TCA GAA ACA(SEQ ID NO:104)/ZEN/GCC TAT GAG GGA AAT T(SEQ ID NO:105)/3IABkFQ/-3’，在这种条件下：94℃2分钟，然后94℃30秒，61℃30秒，72℃30秒，40个循环。MAN2A1-FER检测的Ct阈值：福尔马林固定石蜡包埋组织30个循环，冷冻组织25个循环。无模板阴性对照和MAN2A1-FER cDNA模板分别用作每批中的阴性和阳性对照。
载体构建。使用AccuPrime Taq聚合酶(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，使用引物GACTCAGATGCTTAAGGAGACTAGGTGCGGAGCAAG(SEQ ID NO:106)/GTACTCACGTTCTAGATGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG(SEQ ID NO:107)从前列腺癌患者样品PRCA159T的cDNA文库获得MAN2A1-FER的全长cDNA，在以下条件下进行：94℃2分钟，然后40个循环：94℃1分钟，62℃1分钟，72℃5分钟。然后是72℃10分钟。然后用AflII和XbaI消化PCR产物，并连接到类似限制的pCDNA4-FLAG载体中以产生pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG。为了构建pGST-MAN2A1-FER，使用引物GACTCAGATGGGATCCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTC(SEQ ID NO:108)/GTACTCACGTGCGGCCGCTGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG(SEQ ID NO:109)在全长MAN2A1-FER cDNA模板上在与上述相同的条件下进行PCR。用BamHI和NotI限制酶切PCR产物，并连接到类似限制酶切的pGEX-5x-3载体中以产生pGST-MAN2A1-FER。为了产生pT3-MAN2A1-FER-FLAG，使用引物GACTCAGATGGTCGACGAGACTAGG TGCGGAGCAAG(SEQ ID NO:110)/GTACTCACGTGCGGCCGCTGTGAGTTTTCTCTTGATGATAGTG(SEQ ID NO:111)在全长MAN2A1-FER互补DNA模板上对pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG的模板进行PCR，于以下条件下进行：94℃2分钟，然后40个循环：94℃1分钟，62℃1分钟，72℃5分钟。用SalI和NotI限制酶切PCR产物，连接到类似限制酶切的pENTR载体中。随后通过使用载体转化系统重组将该载体重组为pT3-eF1α载体以产生pT3-MAN2A1-FER-FLAG。为了构建ΔMAN2A1-FER-FLAGK722A，使用来自Stratagene公司的QuikChange多重定点诱变试剂盒。诱变引物如下：pGCAACATGTAAAGAAGATCTTCCTCAGG(SEQID NO:112)/pAACAGCAACAGAA GTTTTATCCTTTAATG(SEQ ID NO:113)。为了构建pGST-ΔEGFRaa1-650，使用引物GACTCAGATGGCTAGCATGCGAC CCTCCGGGACGGC(SEQ ID NO:114)/GTACTCACGTAAGCTTTCATCCCAGTGGCGATGGACG(SEQ ID NO:115)对pCMV-EGFR DNA模板4进行PCR，在以下条件下进行：94℃2分钟，然后40个循环：94℃1分钟，62℃1分钟，72℃5分钟。然后是72℃10分钟。然后用NheI和HindIII限制酶切PCR产物，并连接到类似限制酶切的pGEX-5x-3中以产生pGST-ΔEGFRaa1-650。为了构建pCMV-EGFRaa1-650，使用引物GACTCAGATGAAGCTTTGACTCCGTCCAGTATTGATC(SEQ ID NO:116)/GTACTCACGTTTCTAGACATCCCAGTGGCGATGGACG(SEQ IDNO:117)在EGFR cDNA模板上在与上述相同的条件下进行PCR。用HindIII和XbaI限制酶切PCR产物，连接到类似限制酶切的pCMVscript载体以产生pCMV-EGFRaa1-650。
为了构建pMAN2A1int13-EGFP-FERint14，对来自HUH7细胞的1mg基因组DNA进行延伸长PCR，使用以下引物：GACTCAGATGGCGGCCGCGAACATCAGAACTGGGAGAGG(SEQ ID NO:134)/GTACTCACGTAAGCTTCAGGAGAATCACTTGAACCCG(SEQ ID NO:135)。然后用HindIII和Not1消化PCR产物，并连接到类似消化的pEGFP载体中以产生pMAN2A1int13-EGFP。将对应于MAN2A1内含子13/外显子14的剪接受体位点的合成序列(TAATGTTGGTTTTACCAAAAATATAAATGGTTTGCCTCTCAGTAGATAACATTTATCTTTAATAAATTCCCTTCCCTATCTTTTAAAGATCTCTTTTCGAGCACATAT(SEQ IDNO:136)/TAATATGTGCTCGAAAAGAGATCTTTAAAAGATAGGGAAGGGAATTTATTAAAGATAAATGTTATCTACTGAGAGGCAAACCATTTATATTTTTGGTAAAACCAACAT(SEQ ID NO:137))连接到ASE1限制酶切的pMAN2A1int13-EGFP。单独地，使用引物GACTCAGATGGAATTCAAGGTGGAACACAGAAGGAGG(SEQ IDNO:138)/GTACTCACGTGAATTCGATTACTTTAAATAACTCACTTGGCTTCTTGCAGAGGTAGAGCTGAGAGAAG(SEQ ID NO:139)对HUH7基因组DNA进行PCR以产生对应于FER的内含子14的1984-bp序列，包括对应于FER外显子15/内含子15的31-bp剪接供体位点序列。然后用EcoR1限制酶切PCR，并连接到类似限制酶切的pMAN2A1int13-EGFP中以产生pMAN2A1int13-EGFP-FERint14。对于向导RNA NickaseNinga载体，使用以下向导RNA对：ATAGCTAGAAGGTGGATCAC(SEQ ID NO:140)/TAGCATTAAGGGCCCCCTAA(SEQ ID NO:141)。构建操作遵循制造商提供的手册(DNA 2.0，加利福尼亚州门洛帕克)。
集落形成和基质胶横穿测定。集落形成测定与之前描述的相似5。pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TO转染的PC-3，DU145，NIH3T3，Hep3B，A-172和H23细胞用于评估添加MAN2A1-FER对集落形成的影响。使用具有MAN2A1-FER敲除的HUH7或载体对照来评估去除MAN2A1-FER对集落形成的影响。对于集落形成测定，在60-mm培养皿中培养5000个细胞或在35-mm培养皿中培养1000个细胞。对每个细胞克隆进行三重复实验。对于用pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6-TO转染的细胞，培养基将补充5μg/ml四环素以诱导MAN2A1-FER-FLAG的表达。培养基每4天更换一次。在第10天，将平板用1％结晶紫染色，并计数直径大于2mm的集落。
对于基质胶横穿测定6，将来自每个指定克隆的细胞悬浮于含有0.1％牛血清白蛋白的培养基中，以1×105个细胞/插入物加入上室(upper chamber)。通过在50μg/ml抗坏血酸存在下在补充有10％胎牛血清的DMEM中孵育NIH 3T3细胞24小时而获得的条件培养基作为化学引诱物置于侵入室(invasion chamber)的下隔室中。培养24小时后，用棉签擦拭插入物的上表面，并且插入物用苏木精和曙红(H&E)染色。每个实验进行两次，每个样品三个重复。在光学显微镜下计数通过基质胶和过滤器孔向下表面迁移的细胞，每个插入物有五个随机高功率场。
体外激酶测定：携带GST，GST-MAN2A1-FER和GST-FER的大肠杆菌在室温下生长过夜。用1mM IPTG诱导重组蛋白4小时。通过谷胱甘肽柱纯化GST，GST-MAN2A1-FER和GST-FER，并用制造商提供的1X激酶测定缓冲液(Cell Signaling公司，马萨诸塞州丹弗斯)稀释至1ng/μl。然后将25μl GST或GST-MAN2A1-FER或GST-FER与25μl底物(3μM多聚EY[4:1])组合。溶液在37℃下孵育60分钟。通过向每个反应孔添加25μl 2N的NaOH终止溶液来终止反应。使用来自Promega公司(威斯康星州麦迪逊)的ADP-GloTM激酶测定的试剂盒和方案定量激酶活性。
蔗糖梯度离心分离高尔基体。将诱导表达MAN2A1-FER-FLAG的HEP3B细胞(2×108)重悬于3ml HM缓冲液(0.25M蔗糖，10mM Tris Cl，pH7.4)中，并在Dounce匀浆器中匀浆。然后加入6ml 2.0M蔗糖梯度溶液(0.8，12，1.6，2.0M)。然后将样品用6ml的1.2M蔗糖梯度溶液和3ml的0.8M蔗糖溶液覆盖。随后通过注射器和金属套管用2ml的1.6M蔗糖梯度溶液覆盖该管。然后将样品在4℃以110,000×g离心2小时。然后从管底收集样品溶液的各部分。对于高尔基体分离实验，使用高尔基体分离试剂盒(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)。该操作遵循制造商提供的手册。
细胞周期分析。将PMF，DMF，NMF，HepMF，AMF，HMF，HEPΔK，NMFΔK，HUH7/KO和HUH7/HC细胞与“细胞系”部分中提到的培养基一起培养至40％-50％融合。用不含血清的培养基处理这些细胞24小时，使培养物与G0相同步。然后将培养物换成含有10％胎牛血清的BrdU标记培养基(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯)4小时。随后收获细胞并以500×g离心5分钟，并重悬于0.5ml PBS中。然后将细胞与抗BrdU抗体一起孵育12小时。然后用曲通X-100渗透缓冲液洗涤，并与在室温下用FITC标记的二抗孵育1小时。将细胞转移到另一个管中并在4.5ml 70％冷乙醇中保持2小时。或者，然后将细胞固定并用BD cytofix/cytoperm缓冲液透化。然后将细胞重悬于含有与异硫氰酸荧光素偶联的稀释的抗溴脱氧尿苷抗体的50mL BD cytofix/cytoperm缓冲液中，并在室温下孵育20分钟。细胞团在1ml 7-氨基放线菌素D/曲通X-100中染色，在室温下染色30分钟。使用FACSCalibur Automated Benchtop流式细胞仪(Becton Dickinson，马萨诸塞州)通过流式细胞术定量DNA含量和细胞数。通过Cell Quest程序或WinMDI软件对数据进行量化和分析。
MAN2A1，FER，MAN2A1-FER和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。在HUH7细胞中检查MAN2A1-FER表达。首先，细胞用PBS洗涤并用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，1％Nonidet P-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL抑肽酶，1μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制剂，和1mM Na3VO4)裂解。将裂解物超声处理并在12,000g，4℃下离心30分钟以除去不溶物质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在8.5％聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质，并将条带印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用Tris-吐温20缓冲液(0.1M Tris-HCl和0.1％吐温-20，pH7.4)中的5％脱脂奶粉在室温下封闭膜1小时，然后与一抗MAN2A1抗体(1:1000稀释，Santa Cruz)，抗FER抗体(1：1000稀释；Santa Cruz，加利福尼亚州)，或抗GAPDH抗体(1：500稀释；Santa Cruz)孵育2小时。然后将膜用Tris-吐温20缓冲液洗涤三次，并与对以下具有特异性的辣根过氧化物酶偶联的二抗：兔(抗-GAPDH，1:1000稀释)，小鼠(抗-MAN2A1，1:1000稀释)，或山羊(抗FER，1:1000稀释)在室温下孵育1小时。根据制造商的方案用ECL系统(Amersham Life Science)检测蛋白质表达。还对来自前列腺癌样品PRCa159T，PRCa23T，PRCa25T，PRCa20T，PRCa119T和肝癌细胞系HEP3B的蛋白质提取物进行了类似的免疫印迹。
肿瘤生长与自发转移。异种移植操作如前所述4-6,8。简言之，将悬浮在0.2mL汉氏(Hanks')平衡盐溶液(Krackeler Scientific公司，纽约州奥尔巴尼)中的大约5x106个活PMF，DMF，HEPMF，GMF，HMF，HUH7和HUH7/ko细胞皮下植入71只严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的腹侧，每只小鼠产生1个肿瘤。治疗组的细分如下：PMF细胞12只；DMF细胞12只；HEPMF细胞11只；GMF细胞12只，HMF细胞12只，HUH7细胞6只；和HUH7/ko细胞6只。每天给来自PMF，DMF，HEPMF，GMF和HMF组的6只小鼠喂食5mg/mL四环素水。每天观察小鼠，每周记录它们的体重和肿瘤大小。每周测量肿瘤大小直至异种移植后第六周结束。记录死亡率和转移率。
异种移植癌细胞的重症联合免疫缺陷小鼠的治疗。对于激酶抑制剂治疗实验，将PMF，GMF，HUH7和HUH7/ko细胞(2×107个细胞)异种移植到SCID小鼠的皮下区域。异种移植后两周，如图19所示，这些小鼠通过腹膜内给予，用二甲基亚砜，克唑替尼(12.5mg/kg)，卡奈替尼(10mg/kg)或这两种药物的组合处理，每周3次，如图19所示。7周后，将所有存活的小鼠处死，并进行尸检。对于用对照试剂处理的小鼠，当小鼠死于异种移植的癌症时进行尸检。收集福尔马林固定、石蜡包埋的肺，脑，肝，肾，椎骨和淋巴结标本的连续切片，用H&E染色，并用显微镜检查。
小鼠和流体动力学尾静脉注射。如前所述进行流体动力学尾静脉注射8。简而言之，首先将Pten基因外显子5侧接loxP位点的Ptentm1Hwu/J小鼠用腺相关病毒-cre(1×1010pfu)通过腹膜内注射处理以产生大多数肝细胞中的Pten敲除。接下来，将20μg pT3-MAN2A1-FER-FLAG与睡美人转座酶以25:1的比例稀释在2mL生理盐水(0.9％NaCl)中，通过0.22μm滤器(Millipore)过滤，并且在5-7秒内注入侧尾静脉。根据匹兹堡大学医学院的机构动物护理和使用委员会批准的方案对小鼠进行饲养，喂养和监测。
6.3结果：
MAN2A1-FER融合在人类恶性肿瘤中的表达。MAN2A1和FER的融合体导致MAN2A1的C末端的441个氨基酸和FER的N末端的571个氨基酸缺失。这产生蛋白质的主要结构改变(图13A)。为了研究哪种人类癌症类型含有MAN2A1-FER融合，我们使用Taqman定量RT-PCR检测了6种不同类型的人类癌症，包括前列腺癌，多形性胶质母细胞瘤，非小细胞肺癌，卵巢癌，食道腺癌和肝癌。发现所有6种类型的这些癌症均为MAN2A1-FER融合阳性，范围为2-25.9％(图13C和表5-10)。这包括16.8％(17/101)非小细胞肺癌，15.7％(11/70)肝癌(图22)，7.1％(11/156)GBM，25.9％(7/27)食管腺癌，5.2％(14/269)前列腺癌和1.7％(1/60)卵巢癌(图13C)。所有20个器官供体前列腺样品，10个肝脏供体样品和10个来自前列腺癌患者的血液样品对MAN2A1-FER融合均为阴性。嵌合MAN2A1-FER蛋白含有954个氨基酸，而MAN2A1含有1144个，FER含有822个氨基酸。因此，预测MAN2A1-FER嵌合蛋白的蛋白质分子量为114kd，而MAN2A1的分子量为137kd，FER为99kd。
为了检查MAN2A1-FER融合基因是否产生稳定的嵌合蛋白，我们筛选了来自几种不同类型癌症的15种人癌细胞系。发现HUH7是一种肝细胞癌细胞系，表达高水平的MAN2A1-FER转录物。通过对MAN2A1-FER(PRCA159T)呈阳性的前列腺癌的全基因组测序，发现染色体断裂点位于MAN2A1的内含子13和FER的内含子14中(图13B)。在HUH7细胞系中发现单独的MAN2A1-FER染色体断裂点(图13B)。此断点与前列腺癌样品中的断点只相隔32bp。当使用对MAN2A1或FER特异性抗体进行免疫印迹时，分子量114kd的蛋白质条带被MAN2A1和FER特异性的两种抗体识别。在MAN2A1-FER转录物阴性HCC细胞系HEP3B中不存在该蛋白质条带(图13D)。这表明MAN2A1-FER融合基因产生稳定的嵌合蛋白。为了测试MAN2A1-FER蛋白是否也在原发癌样品中表达，对MAN2A1-FER融合阳性的前列腺癌进行类似的免疫印迹。如图13D所示，对于MAN2A1-FER转录物呈阳性的样品(PCA159T，PRCA23T，HCC#1，HCC#2和HCC#5)含有分子量为114kd的额外蛋白质条带，其被MAN2A1和FER特异性抗体识别，而对于MAN2A1-FER阴性的样品(PRCA25T，PRCA20T，PRCA119T，HCC#10，HCC#37，正常肝脏#71和正常肝脏#72)不含这样的蛋白质。这些实验表明，当存在融合转录物时，MAN2A1-FER蛋白稳定表达。
MAN2A1-FER位于高尔基体中。FER蛋白含有FCH结构域，其是FER蛋白微管的结合位点。在MAN2A1-FER融合体中，该域丢失。相反，MAN2A1-FER保留了来自MAN2A1的高尔基体位置的信号肽。结果，FER的激酶结构域可能易位至高尔基体。为了测试该假设，用pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6转染NIH3T3和HEP3B细胞。选择稳定的四环素诱导型MAN2A1-FER-FLAG表达克隆(NMF和HEPMF，图14A)。使用对FLAG具有特异性的抗体和驻留的高尔基体蛋白N-乙酰半乳糖胺基转移酶的共免疫染色显示MAN2A1-FER-FLAG和N-乙酰半乳糖胺基转移酶共定位于高尔基体中(图14B)。用MAN2A1-FER-FLAG转化的HEP3B细胞的组分的蔗糖梯度离心分离显示MAN2A1-FER-FLAG位于高尔基体组分中，与在细胞质部分中发现的野生型FER蛋白明显不同(图14C)。最后，通过高尔基分离方法也证实了来自HUH7和NMF细胞的MAN2A1-FER的高尔基定位(图14D)。
MAN2A1-FER激酶激活EGFR。FER是一种酪氨酸激酶，在信号转导中起重要作用。为了测试MAN2A1-FER是否保留其酪氨酸激酶活性，将MAN2A1-FER连接到pGEX-5x-3载体中以产生pGST-MAN2A1-FER，使得融合蛋白在大肠杆菌中表达为GST-MAN2A1-FER嵌合蛋白。如图15A所示，当多聚(EY4:1)用作底物时，GST-MAN2A1-FER显示高水平的酪氨酸激酶活性。此外，GST-MAN2A1-FER显示出比GST-FER高4倍的激酶活性，表明从FER中去除SH2结构域抑制增加了融合蛋白的酪氨酸激酶活性。有趣的是，MAN2A1-FER的激酶活性对克唑替尼敏感，克唑替尼是最初为ALK和FER/FEZ开发的酪氨酸激酶抑制剂，IC50约为29nM(图15B；表3)。
由于MAN2A1-FER融合导致FER激酶易位至高尔基体，因此可能改变FER激酶的靶标。已证明表皮生长因子受体(EGFR)信号转导激活是驱动人类癌症进展的主要机制之一7，并且只有EGFR的N末端暴露在高尔基体的管腔中。我们假设EGFR N末端是MAN2A1-FER激酶的底物。为了验证这一假设，我们使用EGFR的N-末端(HisTAG-EGFRaa1-650)作为我们激酶测定的底物。如图15C所示，GST-MAN2A1-FER以ATP剂量依赖性方式磷酸化重组HisTAG-EGFRaa1-650。为了研究哪个酪氨酸残基被GST-MAN2A1-FER磷酸化，化学合成对应于EGFR的N-末端中的每个酪氨酸残基的合成肽，并通过GST-MAN2A1-FER测定磷酸化。结果显示，只有对应于EGFR中FLKTIQEVAGYVLIALNTVER(肽3)的序列被GST-MAN2A1-FER磷酸化。该肽在EGFR的aa88处含有酪氨酸残基。为了验证EGFR中的Y88是否确实被GST-MAN2A1-FER磷酸化，测定含有该酪氨酸突变(Y88A)的肽的GST-MAN2A1-FER的蛋白激酶活性。结果表明突变肽未被融合蛋白磷酸化。为了验证GST-MAN2A1-FER融合体对HisTAG-EGFRaa1-650的磷酸化是否是Y88磷酸化的结果，通过过量的肽3进行HisTAG-ΔEGFRaa1-650磷酸化。如图15C(泳道7-8)所示，肽3，但不是突变对应物，部分阻断了GST-MAN2A1-FER对EGFR N末端的磷酸化。当Y88在EGFR N末端突变为丙氨酸时未发现磷酸化(图15C)。因此，Y88是EGFR N末端中唯一的GST-MAN3A1-FER磷酸化位点(图23)。
为了研究MAN2A1-FER激酶导致EGFR的N-末端磷酸化在体内是否发生，用四环素诱导HEPMF细胞表达MAN2A1-FER-FLAG。EGFR被凝血酶或羟胺部分片段化。然后用对EGFR的N-末端具有特异性的抗体对消化的肽进行免疫沉淀。结果显示MAN2A1-FER表达导致EGFR N末端的磷酸化，而未诱导的对照对N末端EGFR磷酸化是阴性的(图15D)。MAN2A1-FER的表达导致EGFR的酪氨酸激酶活性的激活，如激酶结构域中Y1068和Y848的自身磷酸化的显著增加所证明(图15E)。为了研究EGFR的N-末端磷酸化对于MAN2A1-FER介导的EGFR活化是否是必需的，产生了EGFR的氨基酸88中具有点突变(Y88A)的突变体。将该突变体转染到HEPMF细胞中并诱导表达MAN2A1-FER-FLAG。如图15F所示，当诱导表达MAN2A1-FER时，EGFR的酪氨酸88的突变消除了EGFR的酪氨酸激酶活化，如通过阴性自身磷酸化和二聚化所证明。也在前列腺癌样品中发现EGFR的激活，发现该样品为MAN2A1-FER融合阳性(图15G)，但在阴性样品中未发现该情况，表明由MAN2A1-FER诱导的EGFR活化具有显著的临床相关性。
通过MAN2A1-FER激活EGFR的激酶活性可导致癌细胞中促生长信号转导的级联。为了检查MAN2A1-FER的表达是否激活EGFR信号转导途径，检查了EGFR-B-raf-MEK和EGFR-Akt途径。如图16所示，MAN2A1在不同来源的4种细胞系(PC3-前列腺癌，HEP3B-肝癌，NIH3T3-小鼠永生化成纤维细胞和A-172，多形性胶质母细胞瘤)中的表达导致激活B-raf，MEK和Akt激酶，而MAN2A1-FER的激酶阴性突变体未能激活这些激酶中的任一种。为了检查EGFR是否是这些激酶的主要激活剂，将其激酶结构域缺失的EGFR的显性负性突变体(ΔEGFRaa1-650)转染到这些细胞系中。结果表明ΔEGFRaa1-650的存在大幅消除了这些激酶的活化。结果表明ΔEGFRaa1-650的存在大幅消除了这些激酶的活化(图16B)。MAN2A1-FER的激酶阴性突变体未能激活任何这些激酶(图16C)。使用CRISPR系统，中断HUH7细胞中MAN2A1-FER的基因组，使得细胞系中不存在MAN2A-FER表达(图16D，泳道25-26)。敲除MAN2A1-FER的HUH7细胞显示EGFR，B-raf，MEK和Akt的磷酸化显著降低，表明HUH7细胞中这些激酶的过度活化很大程度上依赖于MAN2A1-FER融合。
MAN2A1-FER可加速细胞生长和侵袭。为了检查MAN2A1-FER诱导的促生长信号转导途径的活化的结果，在4个不同来源的细胞系(PC3和DU145前列腺癌，HEP3B肝癌，A-172-胶质母细胞瘤，H23-肺癌)和NIH3T3(用MAN2A1-FER-FLAG转化)上进行细胞周期分析。如图17A所示，通过四环素诱导MAN2A1-FER的表达显著增加了这些细胞系的S期：PC3为2.1倍，DU145为52％，HEP3B为42倍，H23为40倍，A-172为3.9倍，NIH3T3细胞为2倍。然而，当将MAN2A1-FER-FLAG的激酶阴性突变体引入这些细胞时，这些促生长影响完全消失(图17A)。显性负性突变体ΔEGFRaa1-650的表达也显著减弱了MAN2A1-FER-FLAG在HEP3B细胞中诱导的S期的增加。HUH7细胞中MAN2A1-FER的基因组中断导致S期和M期细胞的显著减少。
与这些细胞周期分析平行，当用MAN2A1-FER-FLAG诱导时，用MAN2A1-FER-FLAG转化的细胞的集落形成分析显示集落90％至2.7倍的增加(图17B)。当使用MAN2A1-FER激酶突变体或显性负性EGFR突变体时，MAN2A1-FER-FLAG对集落形成的影响消失。基因组HUH7细胞中MAN2A1-FER的中断导致这些细胞的集落形成减少55％。MAN2A1-FER的表达也导致更高水平的侵袭性(图17C)。为了检测体内MAN2A1-FER表达的影响，将用MAN2A1-FER转化的PC3，DU145，HEP3B，A-172，H23细胞异种移植到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的皮下组织中。通过四环素水(5μg/ml)诱导MAN2A1-FER-FLAG。如图17D-F所示，MAN2A1-FER-FLAG的表达对于PC3和DU145肿瘤产生2.3倍大的肿瘤，HEP3B为2.6倍，A-172肿瘤为2.4倍。当MAN2A1-FER在HUH7细胞中中断时，肿瘤体积下降55％。在表达MAN2A1-FER的肿瘤中也观察到更高水平的转移：对于MAN2A1-FER阴性肿瘤为3/36，对比MAN2A1-FER阳性为19/35(p<0.0001，表11和图24)。不含MAN2A1-FER的83％(30/36)的SCID小鼠存活6周，而只有28.6％(10/35)的含MAN2A1-FER小鼠存活6周(p＝4.5×10-7)。
MAN2A1-FER阳性癌症对克唑替尼和卡奈替尼敏感。由于MAN2A1-FER和EGFR激活的激酶活性是MAN2A1-FER致癌活性的驱动因素，因此有必要研究抑制MAN2A1-FER或EGFR的激酶活性是否会中断MAN2A1-FER的致癌活性以及肿瘤的生长。为了研究这一假设，选择了一种MAN2A1-FER激酶抑制剂克唑替尼和一种EGFR激酶抑制剂卡奈替尼来处理有或没有MAN2A1-FER的PC3，A-172或HUH7。结果表明，MAN2A1-FER的存在增加了癌细胞对克唑替尼的敏感性，范围为1.8-2.1倍，这取决于细胞系(图18，表3)。有趣的是，这些癌细胞系似乎对卡奈替尼更敏感：全部显示低于15nM的IC50值(50％抑制浓度)(表3)。MAN2A1-FER的存在使敏感性提高了2.1至2.5倍。
为了研究具有MAN2A1-FER的恶性细胞系对这些激酶抑制剂的敏感性增加是否转化为用这些药物治疗的癌症的更好结果，将具有或不具有MAN2A1-FER的PC3，A-172和HUH7细胞异种移植到SCID小鼠的皮下区域中。使肿瘤生长2周至平均大小183mm3。然后，这些小鼠通过腹膜注射，用克唑替尼(12.5mg/kg)，卡奈替尼(10mg/kg)或这两种药物的组合处理，每周3次。当存在MAN2A1-FER时，对于PC3细胞，与DMSO对照相比，克唑替尼的处理使最终肿瘤大小平均减少78.6％(p<0.001)，对于A-172为67.6％(p<0.001)，对于HUH7细胞为80.7％(p<0.001)。当MAN2A1-FER不存在时，克唑替尼的效果要差得多：PC3肿瘤大小平均减少27.1％，A-172减少4％，HUH7细胞减少27.6％。当用卡奈替尼治疗SCID小鼠时，获得了类似的结果：当存在MAN2A1-FER时，PC3细胞的肿瘤大小减少85.0％(p<0.001)，A-172为73.2％(p<0.001)，HUH7为81.7％(p<0.001)(图19A)。这优于没有MAN2A1-FER的细胞：PC3减少32.0％，A-172减少19.2％，HUH7细胞减少40.2％。最好的结果来自克唑替尼和卡奈替尼的组合。克唑替尼和卡奈替尼的组合显著减少肿瘤大小：当存在MAN2A1-FER时，PC3的肿瘤大小减少92.2％(p<0.001)，A-172为89.0％(p<0.001)，HUH7为86.0％(p<0.001)。没有MAN2A1-FER时，PC3的效果降低至46.5％，HUH7细胞的效果降低至43.2％。如果不存在MAN2A1-FER，则克唑替尼和卡奈替尼的组合对A-172肿瘤无效(肿瘤大小增加19.4％)。当存在MAN2A1-FER时用克唑替尼或卡奈替尼或这两种药物的组合处理完全消除了所有肿瘤(PC3，A-172和HUH7,0％，0/18)对比对照组的转移(61％，11/18)(p<0.001)(图19B)。然而，这些药物对MAN2A1-FER阴性细胞的影响在很大程度上是微不足道的：对于克唑替尼或卡奈替尼处理为2/18，对比对照组为1/18。这些结果可能反映了去除MAN2A1-FER后这些恶性细胞的普遍低转移率。克唑替尼，卡奈替尼或这两种药物的组合的处理完全消除了异种移植MAN2A1-FER阳性肿瘤的小鼠的死亡率(图19C)。然而，当它们施加于MAN2A1-FER阴性的肿瘤时，没有观察到这些药物的死亡率改善效果。这些结果清楚地表明MAN2A1-FER是癌症进展的驱动因素。MAN2A1-FER的存在驱动EGFR信号转导，使癌细胞对该途径特异性的药物敏感。
表3.克唑替尼和卡奈替尼的IC50。
MAN2A1-FER产生自发性肝癌。在MAN2A1-FER阳性的10个人类肝癌样品中，6个显示Pten缺失，表明在癌症发展的2个事件之间可能存在关联。为了研究Pten缺失和MAN2A1-FER融合是否足以产生癌症，开发了小鼠体细胞癌模型以模拟人类癌症中的体细胞突变。在该模型中，首先将Pten基因外显子5侧接loxP位点的Ptentm1Hwu/J小鼠用腺相关病毒-Cre(1×1010PFU)通过腹膜内注射处理以产生大多数肝细胞中的Pten敲除。然后进行pT3-MAN2A1-FER-FLAG的尾静脉流体动力学注射8，从而用载体转染1-2％肝细胞(图20A)。允许这些小鼠存活12/14周或自然死于肝癌。注射了pT3-MAN2A1-FER-FLAG的所有小鼠均发展成肝细胞癌(图20B)。这些小鼠都具有扩大的肝脏，肝脏与身体的比率超过对照的172％(图20C)。在这些小鼠中发现了EGFR/Akt途径的超活化(图20D)。早在通过尾静脉引入pT3-MAN2A1-FER-FLAG后4周，观察到清晰的形态学癌细胞(图20E)。癌症胰岛在8周内迅速扩增，使得大多数肝实质在12周末被癌细胞取代。这些癌细胞含有大的细胞核和核仁，富含脂肪空泡，并且具有明显更高数量的Ki-67阳性细胞(图21)。谷氨酰胺合成酶染色图案在癌症中丧失(图21)。这些特征是高级别肝癌的特征。实际上，在引入pT3-MAN2A1-FER-FLAG后14周内没有小鼠存活。相反，AAV-cre/pT3处理的小鼠在同一时期没有显示出可检测的病理表型。总而言之，不受特定理论的限制，这些分析表明MAN2A1-FER是人类癌症进展的关键驱动因素之一。
表4.用于磷酸化测定的合成肽(分别为SEQ ID NO:118-133)。
6.4讨论
融合基因的存在是人类恶性肿瘤的关键特征之一。MAN2A1-FER融合是5号染色体长臂重组的结果。MAN2A1-FER在6种不同的人类恶性肿瘤(例如肝癌和食道腺癌)中的显著存在表明这种融合可能在人类癌症的发展中起重要作用。检索17种人类癌症的癌症基因组阿特拉斯(The Cancer Genome Atlas)转录组测序数据未能检测到MAN2A1-FER融合。这种差异可能归因于位于癌症基因组阿特拉斯数据中位于MAN2A1和FER基因50个末端处的映射读数的比例显著较小(图25)，因为MAN2A1和FER的信使RNA的50末端的大量读数是MAN2A1-FER检测所需的。据我们所知，MAN2A1-FER是组成型活化的酪氨酸激酶易位至高尔基体的第一个例子，其所采用的形式导致EGFR信号转导途径的致癌活化。不受特定理论的限制，似乎该激活过程中的关键环节是EGFR胞外结构域中酪氨酸残基88的磷酸化。不受特定理论的限制，似乎酪氨酸88是由MAN2A1-FER磷酸化的EGFR的唯一酪氨酸残基，并且该残基的磷酸化对于MAN2A1-FER介导的EGFR活化和二聚化是必需的。酪氨酸88位于EGFR的结构域I/II的界面中。该区域可能参与EGFR二聚化的起始。已报道该区域的突变并且已显示其具有致癌性9，可能归因于二聚化的结构域构象的改变10。酪氨酸88的磷酸化可能类似地改变EGFR二聚化结构域的构象并导致受体的致癌活化。尽管EGFR活化和二聚化明显增强，但MAN2A1-FER似乎不影响EGFR从高尔基体转运至质膜的速度(图26)。
FER是一种酪氨酸激酶，是一种有据可查的致癌基因11。一些研究表明，FER通过磷酸化AR12中的Tyr223激活雄激素受体(AR)。一些研究表明，FER是干细胞酪氨酸激酶1(STK1)13，肥大细胞生长因子受体(kit)14信号转导和c-met19信号转导的必需组分。FER的过度表达与乳腺癌15，肾细胞癌16，非小细胞肺癌17和肝细胞癌18的不良临床结果相关。FER的激酶活性明显得到维持，并且可能由于去除FER蛋白中的SH2结构域而在MAN2A1-FER融合体中过度活化。微管结合所需的FCH结构域的缺失可能使MAN2A1-FER激酶不为其大多数生理底物可及。因此，底物模式的总体改变可以在体内发生。在人类癌症中检测到的一些FER过表达实际上可能是与FER相关的融合基因。
该分析表明FER激酶的组成型激活和向高尔基体易位导致EGFR信号转导的过度激活。这种活化的后果不仅导致癌症的过度生长，而且使癌细胞沿EGFR信号转导途径易感于激酶抑制剂。实际上，通过靶向FER和EGFR的激酶，我们发现该方法在体外和体内对于MAN2A1-FER阳性的不同类型的人类癌症始终有效。如果从癌细胞中除去MAN2A1-FER蛋白，即使天然FER蛋白仍然存在，这些抑制剂的有效性也基本上被废除。不受特定理论的限制，这些发现清楚地表明，MAN2A1-FER融合体而非原生FER，是人类癌症的驱动因素。克唑替尼和卡奈替尼对MAN2A1-FER阳性人类恶性肿瘤的有效性具有重要的临床意义：可以在这些人类癌症中筛选MAN2A1-FER融合体的存在。MAN2A1-FER融合阳性的患者可以用这些药物治疗，以获得更好的临床结果，特别是那些转移患者和不适合手术或放疗的患者。目前的研究仅提供了MAN2A1-FER融合基因阳性癌症的药物治疗实例。靶向MAN2A1-FER或EGFR信号转导途径的其它激酶抑制剂可能有效对抗该融合阳性的人类癌症。因此，MAN2A1-FER/EGFR靶向作为对该融合基因阳性的人类癌症(例如肝癌和其它恶性肿瘤)的有效疗法可能具有前景。
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本文引用了各种参考文献和登录号，其全部内容通过引用并入本文。
表5(非小细胞肺癌)
批次1
表6(肝癌)
表7(前列腺癌)
表8(卵巢癌)
表9(食管腺癌)
表10(胶质母细胞瘤)
表11
异种移植有表达MAN2A1-FER的癌细胞的SCID小鼠的转移
表11(续)

Claims (4)

1.一种或多种试剂在制备用于在治疗患癌对象的方法中使用的药物中的用途，其中所述对象没有前列腺癌的，其中获自所述对象的一个或多个细胞包含所述MAN2A1-FER融合基因；其中所述试剂抑制MAN2A1-FER融合基因的产物以产生抗肿瘤作用，其中所述试剂选自下组：克唑替尼、卡奈替尼及其组合，其中所述癌症是乳腺癌，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，胰腺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，多形性胶质母细胞瘤，结直肠癌，肉瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，或食道腺癌。
2.用于如权利要求1所述的用途，其中，所述癌症不是肺腺癌，多形性胶质母细胞瘤或肝细胞癌。
3.如权利要求1或2中任一项所述的用途，其中，所述MAN2A1-FER融合基因由FISH分析检测；和/或，其中，所述MAN2A1-FER融合基因由反转录聚合酶链式反应检测。
4.用于权利要求1-3中任一项所述的用途或用于检测获自对象的包含所述MAN2A1-FER融合基因的一个或多个细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包含适于通过FISH分析检测所述MAN2A1-FER融合基因的一种或多种探针；或，包含适于通过PCR分析检测所述MAN2A1-FER融合基因的一对或多对引物。
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