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CN110221052B - Ppfibp1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

Ppfibp1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用 Download PDF

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CN110221052B
CN110221052B CN201910521939.5A CN201910521939A CN110221052B CN 110221052 B CN110221052 B CN 110221052B CN 201910521939 A CN201910521939 A CN 201910521939A CN 110221052 B CN110221052 B CN 110221052B
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Abstract

本发明提供了PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。本发明采用免疫组化方法检测PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量，以此判断肝癌患者术后生存期的长短。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控具有重要的指导意义。

Description

PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PPFIBP1蛋白的应用，具体涉及一种PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，在世界范围内每年新增病例50~10万，列恶性肿瘤发病率第五、死亡率第三。目前已经明确的肝癌致病因素包括嗜肝病毒感染、黄曲霉素、酒精、烟草、遗传代谢性肝病等。依附于不同人群暴露特点的差异，肝癌在各地的发病率也不尽相同。大多数高发地区（如亚、非两洲）病例主要源自乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染，在地理和人种上的分布与嗜肝病毒的流行病学特点相吻合。由于乙型肝炎的肆虐，全球肝癌病例有80％出现在亚洲，我国更是占据了其中大部分，每年新发病例超过35万，同期死亡病例达32万，高居男性癌症总体死亡率第2位、女性第3位，造成了极为沉重的疾病负担和经济压力。
随着诊断技术及治疗手段的进步，近二十年来疗效已经有了一定的提高，但肝癌的转移复发仍是影响长期疗效的重要阻碍。因此深入研究肝癌转移复发机制、探索有效预测肿瘤复发的分子标志物和积极的抗复发治疗措施是当前肝癌诊治中的重点和难点。
本发明首次将PPFIBP1引入了肝癌研究领域，发现PPFIBP1在肝癌中高表达，且其表达水平与肝癌临床病理特征及预后密切相关，提示PPFIBP1是一个新的肝癌预后标志物和术后预警蛋白。
发明内容
本发明的目的之一在于提供PPFIBP1蛋白的新应用，特别是PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于PPFIBP1蛋白表达量与肝癌复发转移的相关性，以PPFIBP1蛋白作为预后标志物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。
因此，本发明提供了PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以PPFIBP1蛋白作为分子标记，利用PPFIBP1抗体，结合免疫组化实验试剂，检测PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量，并根据PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量进行肝癌术后预后评估。
所述PPFIBP1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述应用中用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源PPFIBP1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。
进一步，所述人源PPFIBP1多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的PPFIBP1蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。
进一步，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、无水乙醇、H2O2去离子水溶液、封闭用正常山羊血清工作液、辣根过氧化物酶化二抗工作液、浓缩型DAB显色试剂、苏木素液、水溶性封片剂、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液抗原修复液以及PV9000聚合物增强剂。
利用本发明所述试剂盒进行肝癌术后预后评估的方法如下：
利用人源PPFIBP1多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，对肝癌组织切片进行免疫组化染色；
获取免疫组化染色后的肝癌组织切片的免疫组化图片；
利用生物图像处理软件分析所述免疫组化图片获得目标区域内平均光密度值，将平均光密度值换算为可用于评判所述肝癌组织切片中PPFIBP1蛋白相对表达量的染色评分；
根据所述染色评分评估肝癌患者术后的预后情况。
进一步，评分时扣除组织间隙，准确选择肝癌细胞为目标区域。
本发明具有以下有益效果：
本发明显示出PPFIBP1蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，因此以PPFIBP1蛋白作为预后标志物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供了一条全新途径，对肝癌患者的预后判断具有重要作用。
附图说明
图1为PPFIBP1蛋白在肝癌患者癌旁组织中弱表达；
图2为PPFIBP1蛋白在肝癌组织中高表达；
图3为肝癌组织中PPFIBP1低表达患者与高表达患者生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下面对本发明实施例的PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用以及利用所述试剂盒进行肝癌术后预后评估进行具体说明。
其中，所述试剂盒包括：人源PPFIBP1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。
所述人源PPFIBP1多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的PPFIBP1蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。
所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、无水乙醇、3% H2O2去离子水溶液，封闭用正常山羊血清工作液、辣根过氧化物酶化二抗工作液、浓缩型DAB显色试剂、苏木素液、水溶性封片剂、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液抗原修复液、PV9000聚合物增强剂。
其中，水溶性封片剂采用中性树胶封片剂。
利用上述试剂盒进行肝癌术后预后评估的具体步骤如下：
1、试剂配制
(1) 磷酸盐缓冲液：NaCl 80克，Na2HPO4·12H2O 28.8克，KCl 2克，KH2PO4 2.0 克，双蒸水充分溶解，pH调至7.4，定容至1000毫升，120℃高压蒸汽灭菌20分钟，4℃保存。
(2) 柠檬酸盐缓冲液抗原修复液：柠檬酸三钠3 克，柠檬酸0.4 克，双蒸水充分溶解，定容至1000毫升，pH为6.0，4℃保存。
2、染色
1) 烘片：制备肝癌组织石蜡切片，将石蜡切片置于65℃烤箱中2h。
2) 脱蜡：将烘热的切片趁热从65℃烤箱中拿出迅速放入二甲苯溶液中充分脱蜡，顺序为二甲苯Ⅰ10分钟，二甲苯Ⅱ10分钟，100%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，85%乙醇5分钟，75%乙醇5分钟，双蒸水5分钟，注意整个脱蜡过程中液体要完全没过组织。
3) 将切片取出，置于免疫组化湿盒上，磷酸盐缓冲液冲洗3遍，每遍5分钟。
4) 抗原修复：取适量双蒸水于高压锅内，提前5分钟预热。取适量的柠檬酸盐缓冲液抗原修复液（pH=6.0）于抗原修复盒中，将切片插入切片架，务必使修复液完全浸没组织，高温高压修复5分钟。修复完毕后将修复盒取出置于常温30分钟以上，待修复液冷却到室温以后，将切片取出置于湿盒上，磷酸盐缓冲液冲洗3遍，每遍5分钟。
5) 3%的过氧化氢（试剂1）灭活内源性过氧化物酶：将切片上多余的磷酸盐缓冲液擦干，滴加过氧化氢完全覆盖组织，室温孵育10分钟。孵育完毕后，磷酸盐缓冲液冲洗3遍，每遍5分钟。
6) 血清封闭：将切片上多余的液体擦干，每张切片滴加约50µL封闭用正常山羊血清工作液，确保液体完全覆盖组织，室温孵育20分钟。孵育完毕后，不用磷酸盐缓冲液冲洗，轻甩切片甩去液体。
7) 一抗孵育：按照抗体说明书推荐浓度和预实验结果用磷酸盐缓冲液稀释人源PPFIBP1多克隆抗体原液，混匀后得到一抗稀释液，每张切片滴加50µL一抗稀释液，确保抗体完全覆盖组织且湿盒内有适量液体以保证不会干片。4℃孵育过夜。
8) 复温：将湿盒从4℃取出，置于37℃恒温箱中复温45分钟。45分钟后将湿盒取出，磷酸盐缓冲液冲洗切片3遍，每遍5分钟。
9) 孵育PV9000聚合物增强剂：将切片上多余的液体擦干，每张切片滴加约50µLPV9000聚合物增强剂，确保液体完全覆盖组织，37℃恒温箱孵育30分钟。30分钟后将湿盒取出，磷酸盐缓冲液冲洗切片3遍，每遍5分钟。
10) 孵育二抗：将切片上多余的液体擦掉，每张切片滴加约50µL辣根过氧化物酶化二抗工作液，完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育30分钟。30分钟后取出湿盒，磷酸盐缓冲液冲洗切片3遍，每遍5分钟。
11) 二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色：按照每张切片50µL的量以底物稀释液：浓缩型DAB显色试剂=1: 20的比例配置DAB显色液，整个过程避光，在棕色EP（eppendorf）管中配置，现用现配。滴加显色液后于显微镜下观察并开始计时，注意完全覆盖组织不要干片，显色至理想效果后放入自来水中终止显色，整个显色过程不超过10分钟。
12) 苏木素染色：将切片重新插到切片架上，整架切片放入苏木素染液中染色2分钟，2分钟后将整架切片取出，自来水冲洗去除多余的苏木素染液。整架切片放入盐酸酒精中分化3秒，自来水冲洗干净，放入氨水中反蓝，自来水中冲洗干净。显微镜下观察显色效果，可重复上述步骤直至显色满意。
13) 脱水、透明、封片：将整架切片从自来水中取出，依次放入75%乙醇2分钟，85%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟，二甲苯Ⅰ3分钟，二甲苯Ⅱ3分钟，取出置于通风橱中晾干，取适量中性树胶封片。
3、染色评分
利用ImagePro Plus 6.0软件进行。该软件能够用于免疫组化图片的定量分析，通过测算光密度值反映目的蛋白表达量。其定量关联呈对数关系，符合朗伯比尔定律。评分时扣除纤维组织及肝窦等组织间隙，准确选择肝癌细胞为目标区域，通过灰度图片转换后测量其累计光密度及面积，计算目标区域内平均光密度值，取其对数值作为单张图片染色评分。每处组织最终染色评分为5张免疫组化图片的均值。生存及复发曲线利用Kaplan Meier法绘制，Log—rank检验用于层间及组间比较。
其中，免疫组化图片采用数码相机和成像装置对免疫组化染色后的肝癌组织切片进行拍摄获得。
实施例1
在本实施例中，收集363例接受肝癌根治术病人的肿瘤样本，利用上述免疫组织化学方法进行检测。本发明在363例肝癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示，其中：图1示出了PPFIBP1在癌旁组织中弱表达；图2示出了PPFIBP1在肝癌组织中高表达（图2）；图3示出了肝癌组织中PPFIBP1低表达患者与高表达患者生存曲线，通过Kaplan Meier生存曲线分析可知，PPFIBP1高表达的患者平均生存期显著低于PPFIBP1低表达的患者。
因此，PPFIBP1蛋白表达量与肝癌复发转移具有相关性，以PPFIBP1蛋白作为预后标志物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。
以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 昆山德诺瑞尔生物科技有限公司
<120> PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1011
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Met Ser Asp Ala Ser Asp Met Leu Ala Ala Ala Leu Glu Gln Met
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Ser Asn Gly Ile
20 25 30
Phe Asp Cys Gln Ser Pro Thr Ser Pro Phe Met Gly Ser Leu Arg Ala
35 40 45
Leu His Leu Val Glu Asp Leu Arg Gly Leu Leu Glu Met Met Glu Thr
50 55 60
Asp Glu Lys Glu Gly Leu Arg Cys Gln Ile Pro Asp Ser Thr Ala Glu
65 70 75 80
Thr Leu Val Glu Trp Leu Gln Ser Gln Met Thr Asn Gly His Leu Pro
85 90 95
Gly Asn Gly Asp Val Tyr Gln Glu Arg Leu Ala Arg Leu Glu Asn Asp
100 105 110
Lys Glu Ser Leu Val Leu Gln Val Ser Val Leu Thr Asp Gln Val Glu
115 120 125
Ala Gln Gly Glu Lys Ile Arg Asp Leu Glu Phe Cys Leu Glu Glu His
130 135 140
Arg Glu Lys Val Asn Ala Thr Glu Glu Met Leu Gln Gln Glu Leu Leu
145 150 155 160
Ser Arg Thr Ser Leu Glu Thr Gln Lys Leu Asp Leu Met Ala Glu Ile
165 170 175
Ser Asn Leu Lys Leu Lys Leu Thr Ala Val Glu Lys Asp Arg Leu Asp
180 185 190
Tyr Glu Asp Lys Phe Arg Asp Thr Glu Gly Leu Ile Gln Glu Ile Asn
195 200 205
Asp Leu Arg Leu Lys Val Ser Glu Met Asp Ser Glu Arg Leu Gln Tyr
210 215 220
Glu Lys Lys Leu Lys Ser Thr Lys Ser Leu Met Ala Lys Leu Ser Ser
225 230 235 240
Met Lys Ile Lys Val Gly Gln Met Gln Tyr Glu Lys Gln Arg Met Glu
245 250 255
Gln Lys Trp Glu Ser Leu Lys Asp Glu Leu Ala Ser Leu Lys Glu Gln
260 265 270
Leu Glu Glu Lys Glu Ser Glu Val Lys Arg Leu Gln Glu Lys Leu Val
275 280 285
Cys Lys Met Lys Gly Glu Gly Val Glu Ile Val Asp Arg Asp Ile Glu
290 295 300
Val Gln Lys Met Lys Lys Ala Val Glu Ser Leu Met Ala Ala Asn Glu
305 310 315 320
Glu Lys Asp Arg Lys Ile Glu Asp Leu Arg Gln Cys Leu Asn Arg Tyr
325 330 335
Lys Lys Met Gln Asp Thr Val Val Leu Ala Gln Gly Lys Asp Gly Glu
340 345 350
Tyr Glu Glu Leu Leu Asn Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Asp Ala
355 360 365
Gln Gly Phe Ser Asp Leu Glu Lys Ser Pro Ser Pro Thr Pro Val Met
370 375 380
Gly Ser Pro Ser Cys Asp Pro Phe Asn Thr Ser Val Pro Glu Glu Phe
385 390 395 400
His Thr Thr Ile Leu Gln Val Ser Ile Pro Ser Leu Leu Pro Ala Thr
405 410 415
Val Ser Met Glu Thr Ser Glu Lys Ser Lys Leu Thr Pro Lys Pro Glu
420 425 430
Thr Ser Phe Glu Glu Asn Asp Gly Asn Ile Ile Leu Gly Ala Thr Val
435 440 445
Asp Thr Gln Leu Cys Asp Lys Leu Leu Thr Ser Ser Leu Gln Lys Ser
450 455 460
Ser Ser Leu Gly Asn Leu Lys Lys Glu Thr Ser Asp Gly Glu Lys Glu
465 470 475 480
Thr Ile Gln Lys Thr Ser Glu Asp Arg Ala Pro Ala Glu Ser Arg Pro
485 490 495
Phe Gly Thr Leu Pro Pro Arg Pro Pro Gly Gln Asp Thr Ser Met Asp
500 505 510
Asp Asn Pro Phe Gly Thr Arg Lys Val Arg Ser Ser Phe Gly Arg Gly
515 520 525
Phe Phe Lys Ile Lys Ser Asn Lys Arg Thr Ala Ser Ala Pro Asn Leu
530 535 540
Ala Glu Thr Glu Lys Glu Thr Ala Glu His Leu Asp Leu Ala Gly Ala
545 550 555 560
Ser Ser Arg Pro Lys Asp Ser Gln Arg Asn Ser Pro Phe Gln Ile Pro
565 570 575
Pro Pro Ser Pro Asp Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gly Ile Met Lys Leu
580 585 590
Phe Gly Lys Leu Arg Arg Ser Gln Ser Thr Thr Phe Asn Pro Asp Asp
595 600 605
Met Ser Glu Pro Glu Phe Lys Arg Gly Gly Thr Arg Ala Thr Ala Gly
610 615 620
Pro Arg Leu Gly Trp Ser Arg Asp Leu Gly Gln Ser Asn Ser Asp Leu
625 630 635 640
Asp Met Pro Phe Ala Lys Trp Thr Lys Glu Gln Val Cys Asn Trp Leu
645 650 655
Met Glu Gln Gly Leu Gly Ser Tyr Leu Asn Ser Gly Lys His Trp Ile
660 665 670
Ala Ser Gly Gln Thr Leu Leu Gln Ala Ser Gln Gln Asp Leu Glu Lys
675 680 685
Glu Leu Gly Ile Lys His Ser Leu His Arg Lys Lys Leu Gln Leu Ala
690 695 700
Leu Gln Ala Leu Gly Ser Glu Glu Glu Thr Asn His Gly Lys Leu Asp
705 710 715 720
Phe Asn Trp Val Thr Arg Trp Leu Asp Asp Ile Gly Leu Pro Gln Tyr
725 730 735
Lys Thr Gln Phe Asp Glu Gly Arg Val Asp Gly Arg Met Leu His Tyr
740 745 750
Met Thr Val Asp Asp Leu Leu Ser Leu Lys Val Val Ser Val Leu His
755 760 765
His Leu Ser Ile Lys Arg Ala Ile Gln Val Leu Arg Ile Asn Asn Phe
770 775 780
Glu Pro Asn Cys Leu Arg Arg Arg Pro Ser Asp Glu Asn Thr Ile Ala
785 790 795 800
Pro Ser Glu Val Gln Lys Trp Thr Asn His Arg Val Met Glu Trp Leu
805 810 815
Arg Ser Val Asp Leu Ala Glu Tyr Ala Pro Asn Leu Arg Gly Ser Gly
820 825 830
Val His Gly Gly Leu Met Val Leu Glu Pro Arg Phe Asn Val Glu Thr
835 840 845
Met Ala Gln Leu Leu Asn Ile Pro Pro Asn Lys Thr Leu Leu Arg Arg
850 855 860
His Leu Ala Thr His Phe Asn Leu Leu Ile Gly Ala Glu Ala Gln His
865 870 875 880
Gln Lys Arg Asp Ala Met Glu Leu Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr Ala
885 890 895
Thr Ala Lys Val Lys Pro Lys Lys Leu Ala Phe Ser Asn Phe Gly Asn
900 905 910
Leu Arg Lys Lys Lys Gln Glu Asp Gly Glu Glu Tyr Val Cys Pro Met
915 920 925
Glu Leu Gly Gln Ala Ser Gly Ser Ala Ser Lys Lys Gly Phe Lys Pro
930 935 940
Gly Leu Asp Met Arg Leu Tyr Glu Glu Asp Asp Leu Asp Arg Leu Glu
945 950 955 960
Gln Met Glu Asp Ser Glu Gly Thr Val Arg Gln Ile Gly Ala Phe Ser
965 970 975
Glu Gly Ile Asn Asn Leu Thr His Met Leu Lys Glu Asp Asp Met Phe
980 985 990
Lys Asp Phe Ala Ala Arg Ser Pro Ser Ala Ser Ile Thr Asp Glu Asp
995 1000 1005
Ser Asn Val
1010

Claims (5)

1.PPFIBP1蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括人源PPFIBP1多克隆抗体、二甲苯、无水乙醇、H2O2去离子水溶液、封闭用正常山羊血清工作液、辣根过氧化物酶化二抗工作液、浓缩型DAB显色试剂、苏木素液、水溶性封片剂、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液抗原修复液以及PV9000聚合物增强剂；以PPFIBP1蛋白作为分子标记，利用所述试剂盒检测PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量，并根据PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量进行肝癌术后预后评估，其中PPFIBP1高表达的患者平均生存期显著低于PPFIBP1低表达的患者。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PPFIBP1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人源PPFIBP1多克隆抗体由序列为SEQID NO.1所示的PPFIBP1蛋白免疫兔子获得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述利用所述试剂盒检测PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量，并根据PPFIBP1蛋白在肝癌组织中的相对表达量进行肝癌术后预后评估的具体方法为：
利用所述试剂盒对肝癌组织切片进行免疫组化染色；
获取免疫组化染色后的肝癌组织切片的免疫组化图片；
利用生物图像处理软件分析所述免疫组化图片获得目标区域内平均光密度值，将平均光密度值换算为可用于评判所述肝癌组织切片中PPFIBP1蛋白相对表达量的染色评分；
根据所述染色评分评估肝癌患者术后的预后情况。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，评分时扣除组织间隙，准确选择肝癌细胞为目标区域。
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