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CN110218746A - 发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水 - Google Patents

发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水 Download PDF

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CN110218746A
CN110218746A CN201810169684.6A CN201810169684A CN110218746A CN 110218746 A CN110218746 A CN 110218746A CN 201810169684 A CN201810169684 A CN 201810169684A CN 110218746 A CN110218746 A CN 110218746A
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fermentation
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biatomic acid
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杨晨
秦兵兵
李乃强
刘修才
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Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
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Abstract

本发明公开了发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水。本发明的发酵方法控制发酵液中盐含量为20％以下。本发明提供的发酵生产长链二元酸的方法，能有效减少发酵过程中的碱用量和后续长链二元酸提取时的酸用量，从而减少整个长链二元酸生产过程中盐的用量，同时还具有缩短发酵时间、提高产酸量、减少培养基用量、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。

Description

发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水
技术领域
本发明涉及发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水。
背景技术
长链二元酸(LCDA)的通式为(HOOC(CH2)nCOOH，n≥7)，有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃为底物，通过微生物转化得到，其生产过程常温、常压，可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。
生物法生产长链二元酸已经被研究了很多年。学者最早从油田中筛选到能生产长链二元酸的菌株，对菌株进行诱变来提高长链二元酸的产率。有的学者也研究了长链二元酸合成过程中的关键酶。国外研究长链二元酸的文献大多是对菌株进行基因改造，通过阻断或者弱化脂肪酸β氧化的相关酶系，强化脂肪酸α-ω氧化的酶系来提高产品的产率。公开的专利如CN 1071951A、CN 1067725C、CN 1259424C、200410018255.7、200610029784.6等都提供了微生物发酵生产长链二元酸的方法，这些方法都存在以下问题：在发酵过程中需要投入大量的碱，而之后得到长链二元酸产品则需要大量的酸。碱和酸的投入，一方面，增加了生产成本，另一方面，酸碱成盐，盐的存在增加了后处理工艺的人力和物力成本，且除盐工艺复杂度很高，处理不当则对环境有很不利的影响。
因此，如何在保证产酸量和产酸速度的前体下，尽可能的减少发酵液中的盐含量，为后续处理工艺带来方便且不增加环保压力。是现有技术亟待解决的非常有现实意义的问题。
发明内容
生产长链二元酸的工艺中会产生大量的无机盐，主要是：发酵工艺中需要投入较多的碱，以及长链二元酸结晶过程中需要投入大量的酸，酸碱成盐导致。
对于发酵工艺而言，为了使长链二元酸以溶解于水的二元酸的盐形式存在，发酵过程中保持良好的传质，现有常规的发酵生产长链二元酸方法都要求发酵在碱性条件下进行。同时，在发酵过程中，随着长链二元酸的积累量增加，需要添加大量的碱来中和生成的长链二元酸，以保证发酵体系的平衡。
长链二元酸结晶过程中需要投入大量的酸，因为在发酵完毕的发酵液中，长链二元酸以盐的形式存在于发酵液中，在提取纯化二元酸的过程中则需要加大量的酸将体系中长链二元酸的盐转化为长链二元酸产品。
上述碱和酸的投入，造成发酵处理液体系中盐的浓度高达50000-70000ug/ml(50000-70000ppm)，这些高盐废水难以处理，对环境来说是非常重要的挑战，严重影响了生物法长链二元酸产业的发展。
为克服现有长链二元酸生产过程中存在的缺陷，本发明提供发酵生产长链二元酸的方法、其发酵液、发酵处理液、以及发酵生产长链二元酸的方法中得到的废水。
本发明的目的之一，一种发酵生产长链二元酸的方法，所述发酵的发酵液中盐含 量为20％以下，优选15％以下，更优选10％以下；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元 酸总量的质量百分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵液中盐含量可以为20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
本发明中，发酵液中盐的来源可以是发酵中培养基中的盐，或者，进行pH调节时产生的盐。
本发明的生产方法中，所述发酵过程包括菌体生长期和转化期(产酸期)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的菌体生长期的pH为3.0以上，优选3.5～6.5。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的转化期的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
本发明的一个优选的技术方案，在所述发酵过程中，当菌体光密度(OD620)为0.5以上(稀释30倍)时，控制所述发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
本发明中，使发酵在酸性条件下进行，从而大量减少了发酵过程中碱的加入量，使发酵液、发酵处理液和废水中盐含量大量降低。同时，本发明还能保证在上述pH值条件下，具有良好的发酵转化率和较高的产酸量。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的温度为28～32℃。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的风量为0.3～0.7vvm。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的压力为0.05～0.14MPa。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵转化过程中溶氧不低于15％。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵起始添加0％～3％烷烃。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的接种量为10％～30％。
本发明的一个优选的技术方案，所述菌株培养至菌体光密度(OD620)为0.5以上(稀释30倍)时，加入底物进行发酵转化。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的菌种包括热带假丝酵母(CandidaTropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)，优选热带假丝酵母(Candida Tropicalis)(保藏号为CCTCC M203052)，或者热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013(保藏号为CCTCCM2011486)，或者热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CAT H1614(保藏号为CCTCC M2013143)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4012(保藏号为CCTCC M2011485)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430(保藏号为CCTCC M2011489)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。
其中，所述碳源包括：葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；所述碳源的添加量优选1％～10％(w/v)。
其中，所述氮源包括：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；所述氮源的总添加量优选0.1％～3％(w/v)。
其中，所述无机盐包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；所述无机盐的总添加量优选0.1％～1.5％(w/v)。
其中，所述营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；所述营养因子的总添加量优选0～1％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基还包括以下成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程可以补加二次碳源，二次碳源补加的方式可以批次补加，也可以连续流加。所述二次碳源为蔗糖或葡萄糖。所述二次碳源的浓度为10％～70％。通过补加二次碳源，控制发酵转化体系中的糖浓度为0.1％～1％(w/v)。
按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
本发明的目的之二，一种长链二元酸发酵液，所述发酵液中的盐含量为20％以下， 优选15％以下，更优选10％以下；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量 百分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵液中盐含量可以为20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
根据本领域常识，此处发酵生成的长链二元酸总量包括长链二元酸晶体；或者还有可能包括以无定型态析出的长链二元酸；或者还有可能包括极少数的以盐的形式析出的长链二元酸，或者还有可能包括极少数的存在于溶液中的以盐的形式呈溶解状态的长链二元酸。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸发酵液为在酸性条件下发酵转化得到的长链二元酸发酵液。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸发酵液为在pH7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5条件下进行发酵转化，得到的长链二元酸发酵液。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵液中的盐包括无机盐和二元酸的盐。其中，无机盐占绝大部分，二元酸的盐占量极少。二元酸的盐一般以二元酸的钠盐的形式存在。
本发明的目的之三，一种长链二元酸发酵处理液，所述发酵处理液中的盐含量为 12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液为所述发酵液去除了固形物后得到的混合溶液。所述固形物包括长链二元酸颗粒；或者所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。所述长链二元酸颗粒包括大量长链二元酸晶体、无定型态长链二元酸，也可能有极少部分的以盐形式存在的长链二元酸固体等。
其中所述酸化的pH优选2.5～5，优选3～4，可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0。所述酸化优选使用硫酸酸化。所述固形物的方法为离心或过滤。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸发酵处理液中的盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。所述长链二元酸发酵液中的盐包括无机盐，也可能包括极少量的可溶性的长链二元酸的盐。
具体而言，所述发酵处理液中的盐含量可以为：12000ppm，11000ppm，10000ppm，9000ppm，8000ppm，7000ppm，6000ppm，5000ppm，4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液中的盐含量为7000ppm以下。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液中所述盐包括无机盐。所述无机盐占盐总量的绝大多数。所述发酵液中所述盐还可能包括二元酸的盐。所述二元酸的盐占盐总量的极少数。
本发明的目的之四，一种发酵生产长链二元酸的方法中产生的废水，所述废水中 的盐含量为12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占废水的质量百万分比。
所述废水为上述长链二元酸发酵液去除菌体和长链二元酸后得到的进入污水处理系统的液体。
按照本领域常识，所述废水一般由以下方法得到：将所述发酵液酸化，去除固形物，得到发酵处理液；发酵处理液进入污水处理系统，或者按照本领域常规操作处理后，进入污水处理系统，或者与其他生产长链二元酸的过程中产生的其他废水合并，进入污水处理系统；该进入污水处理系统的液体，称为废水。
本发明的一个优选的技术方案，所述废水中的盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。所述长链二元酸发酵液中的盐包括无机盐，也可能包括极少量的可溶性的长链二元酸的盐。
具体而言，所述盐含量可以为：12000ppm，11000ppm，10000ppm，9000ppm，8000ppm，7000ppm，6000ppm，5000ppm，4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm。
本发明的一个优选的技术方案，所述废水中的所述无机离子的总量为7000ppm以下。
本发明的目的之五，一种长链二元酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照如上所述的发酵生产长链二元酸的方法，得到长链二元酸发酵液；
(2)步骤(1)得到的发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得固形物，再将固形 物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将清液结晶，得长链二元酸产品。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液为所述发酵液去除了固形物后得到的混合溶液。所述固形物包括长链二元酸颗粒；或者所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。
本发明的一个优选的技术方案，通过酸化控制所述发酵处理液的盐含量为12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸发酵处理液中的盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。所述长链二元酸发酵液中的盐包括无机盐，也可能包括极少量的可溶性的长链二元酸的盐。
具体而言，所述发酵处理液中的盐含量可以为：12000ppm，11000ppm，10000ppm，9000ppm，8000ppm，7000ppm，6000ppm，5000ppm，4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液中的盐含量为7000ppm以下。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵处理液中所述盐包括无机盐。所述无机盐占盐总量的绝大多数。所述发酵液中所述盐还可能包括二元酸的盐。所述二元酸的盐占盐总量的极少数。
本发明的一个优选的技术方案，所述酸化的pH优选2.5～5，更优选3～4，可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0。
本发明的一个优选的技术方案，所述酸化为使用硫酸和/或盐酸酸化。
本发明的一个优选的技术方案，所述分离的方法为离心或过滤。
本发明的一个优选的技术方案，所述有机溶剂包括：醇、酸、酮类和酯的一种多种。其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种。所述酸包括乙酸。所述酮包括丙酮。所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。
本发明的一个优选的技术方案，所述溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液。所述脱色的方法可以为活性炭脱色。所述活性炭的添加量为不超过清液体积5％。所述脱色的温度为85～100℃。所述脱色的时间为15～165min。
本发明的一个优选的技术方案，所述结晶为降温结晶。所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶。
本发明的一个优选的技术方案，所述结晶后，分离，得二元酸产品。所述分离的方法为离心分离。
本发明提供的长链二元酸生产方法，能有效减少发酵过程中碱液的用量，还能明显减少后续长链二元酸提取时酸的用量，从而减少长链二元酸生产过程中产生的污水总盐含量。另外，本发明的生产方法还具有缩短发酵时间、提高产酸量、减少培养基用量、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。
具体实施方式
一种发酵生产长链二元酸的方法，发酵的发酵液中盐含量为20％以下，优选15％以下，更优选10％以下，具体而言可以为：20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％；百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比；盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、硫酸根盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。
本发明的发酵生产长链二元酸的方法中，发酵过程包括菌体生长期和转化期(产酸期)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，发酵的菌体生长期的pH为3.0以上，优选3.5～6.5；具体可以为：3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的转化期的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5；具体可以为：3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，在发酵过程中，当菌体光密度(OD620)为0.5以上(稀释30倍)时，控制发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
本发明对pH值的调节或控制方式没有特别限制，可以是恒控某一pH值、不控制pH值、不低于某pH值、不高于某pH值、上调pH值、下调pH值、从范围外控制进入或自然进入pH值范围内的方式中的一种或多种的组合。本发明对于pH值的调控方法亦不做限定，可采用发酵领域的常用手段，如加入适当浓度的碱液。
本发明中，使发酵在酸性条件下进行，从而大量减少了发酵过程中碱的加入量，使发酵液、发酵处理液和废水中盐含量大量降低。同时，本发明还能保证在上述pH值条件下，具有良好的发酵转化率和较高的产酸量。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的温度为28～32℃。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的风量为0.3～0.7vvm。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的压力为0.05～0.14MPa。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵转化过程中溶氧不低于15％。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵起始添加0％～3％烷烃。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的接种量为10％～30％。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，菌株培养至菌体光密度(OD620)为0.5以上(稀释30倍)时，加入底物进行发酵转化。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的菌种包括热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)，优选热带假丝酵母(Candida Tropicalis)(保藏号为CCTCC M203052)，或者热带假丝酵母(CandidaTropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013(保藏号为CCTCC M2011486)，或者热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CATH1614(保藏号为CCTCC M 2013143)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4012(保藏号为CCTCCM2011485)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430(保藏号为CCTCC M2011489)。
发酵培养基中的成分可包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等。其中，碳源可以为假丝酵母可发酵性糖，包括：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等的一种或多种；氮源可以为有机氮和/或无机氮，有机氮包括：酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或多种，无机氮包括：尿素、硫酸铵、硝酸钾中的一种或多种；无机盐包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种。
本发明的生产方法使用的“YPD培养基”包含如下成分：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％。
本发明的生产方法使用的“种子培养基”是制备微生物种子所需要的培养基，微生物菌种接种于种子培养基，在一定的条件下进行培养，培养成熟后，可以作为进一步扩大培养、发酵所需要的种子。本发明实施例使用的种子培养基是一种水溶液培养基，包含如下成分：蔗糖1％～3％、玉米浆0.15％～1％、酵母膏0.2％～1.5％、KH2PO4 0.4％～1.5％、尿素0.05％～0.5％(w/v)。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，可选用一种水溶液培养基(以下简称“发酵培养基1”)，其包括以下成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。发酵培养基1可以适用于从几十毫升的摇瓶到几百吨发酵罐规模的发酵生产。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，可选用低营养物浓度的水溶液培养基(以下简称“发酵培养基2”)，其包括以下成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。发酵培养基减少了一些复杂的成分如玉米浆、酵母膏等，培养基的成分更明确，可以更好地控制发酵指标和产品质量。其可用水配制，在121℃下灭菌20min，冷却到合适温度，作为发酵培养使用。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个实施方式中，发酵转化过程中还可以通过补加糖水溶液作为碳源进一步提升发酵转化率。糖水溶液补加的方式可以为批次补加，也可以为连续流加。糖可以是常见的蔗糖或葡萄糖，补加糖水溶液的浓度可以为10％～70％(w/v)。通过补加糖水溶液，可控制发酵转化体系的糖浓度0.1％～1％(w/v)。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。
在根据本发明的发酵生产长链二元酸的方法的一个优选实施方式中，长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
本发明还提供上述发酵方法得到的长链二元酸发酵液，发酵液中盐含量为20％以下，优选15％以下，更优选10％以下。具体而言可以为：20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％；百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
该发酵液为在酸性条件下发酵得到的发酵液。发酵过程中或发酵结束后，大多数长链二元酸以晶体形式或者长链二元酸无定型态析出，极少量以长链二元酸盐的形式析出，还有极少量长链二元酸以其盐的形式溶解在发酵液中。
上述发酵液去除固形物后，得到发酵处理液。去除固形物的方式可以为酸化。
本发明的固形物包括长链二元酸颗粒；或者包括长链二元酸颗粒和菌体。也就是说：发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。本发明的长链二元酸颗粒包括大量长链二元酸晶体、无定型态长链二元酸，也可能有极少部分的以盐形式存在的长链二元酸固体等。
本发明的发酵处理液，其中，盐含量为12000ppm以下，百万分比为盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。长链二元酸发酵处理液中的盐包括无机盐，也可能包括极少量的可溶性的长链二元酸的盐。
具体而言，盐含量可以为：12000ppm，11000ppm，10000ppm，9000ppm，8000ppm，7000ppm，6000ppm，5000ppm，4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，发酵处理液中的无机离子的总量为7000ppm以下。
本发明还提供一种发酵生产长链二元酸的方法中产生的废水，其中，盐含量为12000ppm以下，百万分比为无机盐占废水的质量百万分比，该废水为上述长链二元酸发酵液去除固形物后得到的进入污水处理系统的液体，具体而言：将发酵液酸化，得固形物和发酵处理液；固形物包括长链二元酸颗粒，也可以还包括菌体；也就是说：发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。发酵处理液进入污水处理系统，或者按照本领域常规操作处理后，进入污水处理系统，该进入污水处理系统的液体，称为废水。
具体而言，无机盐含量可以为：12000ppm，11000ppm，10000ppm，9000ppm，8000ppm，7000ppm，6000ppm，5000ppm，4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，废水中的无机离子的总量为7000ppm以下。
本发明还提供长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照如上的发酵生产长链二元酸的方法，得到长链二元酸发酵液；
(2)步骤(1)得到的发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将清液结晶，得长链二元酸产品。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，通过酸化控制发酵处理液的盐含量为12000ppm以下，百万分比为盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，发酵处理液为发酵液去除了固形物后得到的混合溶液。固形物包括长链二元酸颗粒；或者固形物包括长链二元酸颗粒和菌体。发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，酸化的pH优选2.5～5，更优选3～4，可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，酸化为使用硫酸和/或盐酸酸化。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，分离的方法为离心或过滤。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，有机溶剂包括：醇、酸、酮类和酯的一种多种。其中，醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种。酸包括乙酸。酮包括丙酮。酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液。脱色的方法可以为活性炭脱色。活性炭的添加量为不超过清液体积5％。脱色的温度为85～100℃。脱色的时间为15～165min。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，结晶为降温结晶。降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶。
在根据本发明的长链二元酸的制备方法的一个优选实施方式中，结晶后，分离，得二元酸产品。分离的方法为离心分离。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，长链二元酸的生产过程可包含以下工艺过程：
种子瓶培养工艺：
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。
种子罐培养工艺：
取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％，接种后发酵体系的起始pH值为6.0～6.8，28～32℃下，通风量0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO不低于10％，培养15～30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为大于0.5，更优为OD620为0.5～1.0。
发酵工艺：
将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4～6L，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0～10％(v/v，相对发酵起始体积，下同)的烷烃，发酵过程控制温度28～32℃，通风量约为0.3～0.7vvm，罐压(表压)约为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制发酵液的pH值，发酵起始pH约为5.0～6.8，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为4.0～6.8，优选5.0～6.5，直至发酵结束。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％，总发酵周期约为100～180小时。可选地，发酵过程中通过补加糖水溶液控制发酵液糖浓度在0.1％～1％(w/v)。
提取工艺：
将发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将清液结晶，得长链二元酸产品。
本发明的长链二元酸包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7；优选地，20≥n≥7；更优选地，16≥n≥7。本发明的LCDA的实例包括：：壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、十一碳二元酸(HOOC(CH2)9COOH，1,9-九碳二羧酸或1,11-十一碳二元酸，本发明中标记为“DC11”)、十二碳二元酸(HOOC(CH2)10COOH，1,10-十碳二羧酸或1,12-十二碳二元酸，本发明中标记为“DC12”)、十三碳二元酸(HOOC(CH2)11COOH，1,11-十一碳二羧酸或1,13-十三碳二元酸，本发明中标记为“DC13”)、十四碳二元酸(HOOC(CH2)12COOH，1,12-十二碳二羧酸或1,14-十四碳二元酸，本发明中标记为“DC14”)、十五碳二元酸(HOOC(CH2)13COOH，1,13-十三碳二羧酸或1,15-十五碳二元酸、本发明中标记为“DC15”)、十六碳二元酸(HOOC(CH2)14COOH，1,14-十四碳二羧酸或1,16-十六碳二元酸，本发明中标记为“DC16”)、十七碳二元酸(HOOC(CH2)15COOH，1,15-十五碳二羧酸或1,17-十七碳二元酸，本发明中标记为“DC17”)、十八碳二元酸(HOOC(CH2)16COOH，1,16-十六碳二羧酸或1,18-十八碳二元酸，本发明中标记为“DC18”)等。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在10L发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少110mg/g的十一碳二元酸、至少150mg/g的十二碳二元酸、至少130mg/g的十三碳二元酸、至少150mg/g的十四碳二元酸、至少140mg/g的十五碳二元酸、或至少130mg/g的十六碳二元酸。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在10L发酵罐发酵工艺中，与传统工艺相比，可节约至少60％碱用量；另一些实施例中，可以节约90％左右的碱用量。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，发酵处理液盐含量可降至6000ppm。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在200M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少150mg/g的十二碳二元酸，且达到92％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，可以通过补加二次碳源来提高发酵转化率，可以达到95％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在200M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少140mg/g的十三碳二元酸，且达到85％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在450M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少150mg/g的十二碳二元酸，且达到90％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
本发明实施例采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利ZL95117436.3公开的测定方法测定发酵液中的二元酸浓度，具体测定过程为：用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末，将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
本发明实施例的发酵液中盐含量的检测方法：将发酵液离心或者过滤，得上清液，将上清液置于烘干恒重后的玻璃蒸发皿中，水浴蒸干。如果残渣有颜色，滴加过氧化氢至气泡消失，再水浴蒸干，反复处理几次，直至颜色变白或颜色稳定不变为止。将蒸干的蒸发皿烘干至恒重，称重。计算盐含量。
本发明实施例的发酵处理液中盐含量的检测方法：将发酵处理液置于烘干恒重后的玻璃蒸发皿中，水浴蒸干。如果残渣有颜色，滴加过氧化氢至气泡消失，再水浴蒸干，反复处理几次，直至颜色变白或颜色稳定不变为止。将蒸干的蒸发皿烘干至恒重，称重。计算盐含量。
本发明实施例的污水中盐含量的检测方法：将污水样品液置于烘干恒重后的玻璃蒸发皿中，水浴蒸干。如果残渣有颜色，滴加过氧化氢至气泡消失，再水浴蒸干，反复处理几次，直至颜色变白或颜色稳定不变为止。将蒸干的蒸发皿烘干至恒重，称重。计算盐含量。
实施例1～6在10L热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614在10L发酵罐中发酵生产不同二元酸
取热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有30mlYPD液体培养基(葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％)的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm摇床培养1天。取摇瓶种子接入装有5L种子培养基(蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风量0.4vvm，罐压0.08MPa，培养18h，培养过程中pH自然下降至3，OD620长至0.7时接种到含有6L发酵培养基1(葡萄糖4％、玉米浆0.5％、酵母膏0.4％、硝酸钾1％、磷酸二氢钾0.1％、尿素0.12％、硫酸铵0.06％以及氯化钠0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为5L，接种量20％，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.12MPa，控制溶氧不低于20％。补加30％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为5.0，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。
实施例1～6分别为：按上述发酵工艺将十一碳烷烃(实施例1)、十二碳烷烃(实施例2)、十三碳烷烃(实施例3)、十四碳烷烃(实施例4)、十五碳烷烃(实施例5)、十六碳烷烃(实施例6)进行发酵制得相应的长链二元酸。
得到的发酵液，按照本领域常规方法，酸化结晶去除菌体和长链二元酸，得到发酵处理液。
不同长链二元酸产酸结果及其发酵液和发酵处理液中盐含量如表1所示。
表1不同长链二元酸产酸结果及其发酵液和发酵处理液中盐含量
其中发酵液中盐含量为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
发酵处理液中盐含量为盐相对于长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
由表1结果可知，本发明在酸性条件下发酵长链烷烃制备相应的长链二元酸，产量高，且发酵液和发酵处理液中盐含量低。
实施例7热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸
利用本发明工艺发酵DC12：取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有25mL YPD液体培养基(葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％)的种子瓶中，pH自然，30℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有6L种子培养基(蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％)的10L种子罐中，接种量为20％，接种后体系的起始pH值为6.2，30℃下，通风量0.5vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.6时接种到含有发酵培养基1(葡萄糖2％、玉米浆0.2％、酵母膏0.2％、硝酸钾0.08％、磷酸二氢钾0.3％、尿素0.2％、硫酸铵0.1％以及氯化钠0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量15％，发酵起始添加6％的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.11MPa，控制溶氧不低于20％，补加32％的液碱控制发酵液的pH值。发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.6，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH 5.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。
对比例1热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614使用传统工艺在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸
采用原传统工艺发酵DC12：取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有25mLYPD培养基的种子瓶中，pH自然，30℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有6L种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的10L种子罐中，接种量为20％，接种后体系的起始pH值为6.2，30℃下，通风量0.5vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.6时接种到含发酵培养基(葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.5％、酵母膏0.2％、玉米浆0.15％、尿素0.25％、氯化钠0.2％、硝酸钾0.7％)的发酵罐中，C12烷烃和补料糖分消。于29℃通气量0.5vvm、罐压0.1Mpa条件下培养。发酵前20小时pH自然，以菌体生长为主，当菌体生长光密度(OD620)大于0.6，开始批式补加C12烷烃，此后每8小时补加一次，控制发酵液中烷烃浓度维持在5％(V:V)左右，同时调节pH至6.5，48小时以后，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.0，48～72小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.5，72～120小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.8，120小时至放罐，每4小时用NaOH溶液调节pH至8.0。发酵至24、48、72小时批式补加1％(W:V)的葡萄糖。
表2在不同工艺下的发酵结果
组别 工艺 产酸mg/g 周期/h 转化率 加碱量/mL
实施例7 本发明工艺 165 135 92％ 95
对比例1 传统工艺 118 170 75％ 954
取实施例7和对比例1的发酵液，按照本领域常规方法，酸化结晶去除菌体和长链二元酸，得到发酵处理液。按照如上所述检测方法，发酵液和发酵处理液中盐含量如表3所示。
表3不同工艺下发酵的发酵液和发酵处理液中的盐含量
工艺 发酵液中盐含量(％) 发酵处理液中盐含量(ppm)
实施例7 8.8 6500
对比例1 / 68750
实施例7中，发酵液中的盐主要是无机盐，其相对于长链二元酸的含量很低；对比例1中，发酵液中的盐主要是长链二元酸的盐，其相对于长链二元酸的量为大于100％，需要得到长链二元酸，必须进行酸化结晶，因此需要加入大量无机盐，导致发酵处理液中盐含量远大于本发明的发酵处理液中盐含量。发酵液中盐含量为相对于长链二元酸的质量百分比。
发酵处理液中盐含量为盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
由表3结果可知，本发明在酸性条件下发酵，所得发酵液和发酵处理液中中盐含量有非常明显的下降，可显著减轻后续的纯化工艺，由此带来生产成本和环境压力的降低。
实施例8热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614在200M3发酵罐中发酵DC12
取菌株甘油管菌种接种于装有种子培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.3，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖4％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸铵0.1％以及硫酸镁0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量22％，发酵起始添加4％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.7，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.0，开始流加浓度为25％的糖溶液，控制发酵液糖浓度0.5％。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期122h，产酸182.3mg/g，二元酸对烷烃重量转化率100.4％，加碱量2.5吨。
按照如上所述的检测方法检测，发酵液中盐含量6.59％，发酵处理液盐含量6800ppm。
实施例9热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614在200M3发酵罐中发酵DC13
取菌株甘油管菌种接种于装有种子培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.5，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.8％、硝酸钾0.12％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸铵0.12％以及硫酸镁0.12％)的发酵罐中，接种量25％，发酵起始添加4％(v/v，相对发酵起始体积)的十三碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为30％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.6，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期132h，产酸147.3mg/g，二元酸对烷烃重量转化率85.4％，加碱量3.7吨。
按照如上所述的检测方法检测，发酵液中盐含量8.1％，发酵处理液盐含量6500ppm。
实施例10热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614在450M3发酵罐中发酵DC12
取甘油管菌种接种于装有种子培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.2，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.3％、硝酸钾0.15％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸铵0.15％以及硫酸镁0.15％)的发酵罐中，接种量23％，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.2，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期142h，产酸160.8mg/g，二元酸对烷烃重量转化率90.8％，加碱量5吨。
按照如上所述的检测方法检测，发酵液中盐含量7.1％，发酵处理液盐含量6500ppm。
实施例11清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430在450M3发酵罐中发酵DC12
取甘油管菌种接种于装有种子培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.2，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.3％、硝酸钾0.15％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸铵0.15％以及硫酸镁0.15％)的发酵罐中，接种量23％，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.2，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期132h，产酸152mg/g，二元酸对烷烃重量转化率90.2％，加碱量5吨。
按照如上所述的检测方法检测，发酵液中盐含量8％，发酵处理液盐含量6000ppm。
实施例12
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例9制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3，进行酸化，得固形物和发酵处理液，离心分离得固形物，其中，固形物中绝大多数为长链二元酸颗粒；再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在90℃条件下脱色60min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1.5h，再降温至30℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
实施例13
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例10制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3.5，进行酸化，得固形物和发酵处理液，离心分离得固形物，其中，固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体；再将固形物溶解在乙醇中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在95℃条件下脱色75min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
实施例14
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例11制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3.2，进行酸化，得固形物和发酵处理液，过滤得固形物，其中，固形物中包括长链二元酸颗粒和菌体；再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在85℃条件下脱色70min，过滤分离得清液，将清液降温至65℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
基于前述实施例可知，相对于现有发酵工艺，本发明提供的假丝酵母菌用于长链二元酸发酵时，发酵时间短，碱消耗量少，二元酸产量高，而且可直接发酵得到大量二元酸，省去了繁琐的提取步骤，减少了生产环节和物料消耗，能从整体上大幅降低长链二元酸的生产成本，且环境友好。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可对其进行各种修改和变动，上述各项技术特征之间的组合及根据上述内容所完成的其它技术方案改变均属本发明范围。

Claims (12)

1.发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：控制发酵液中盐含量为20％以下，优选15％以下，更优选10％以下；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述盐包括但不仅限于：钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、盐酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的菌体生长期的pH为3.0以上，优选3.5～6.5；和/或，所述发酵的转化期的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述发酵过程中，当稀释30倍的菌体光密度OD620为0.5以上时，控制所述发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为28～32℃；和/或，所述发酵的风量为0.3～0.7vvm；和/或，所述发酵的压力为0.05～0.14MPa；和/或，所述发酵转化过程中溶氧不低于15％；所述发酵的接种量为10％～30％。
6.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵的菌种包括热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)；
和/或，所述发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃；
和/或，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C22的长链二元酸，更优选包括C9～C18的长链二元酸，最优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
7.一种长链二元酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照如权利要求1～7任一项所述的发酵生产长链二元酸的方法，得到长链二元酸发酵液；
(2)步骤(1)得到的发酵液酸化，得固形物和发酵处理液，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，将清液结晶，得长链二元酸产品；
优选的，通过酸化控制所述发酵处理液的盐含量为12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比；
优选的，所述固形物包括长链二元酸颗粒；或者，所述固形物包括长链二元酸颗粒和菌体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述酸化的pH优选2.5～5，更优选3～4；
和/或，所述分离的方法为离心或过滤；
和/或，所述有机溶剂包括：醇、酸、酮类和酯的一种多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；
和/或，所述溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液；所述脱色的方法优选活性炭脱色；所述活性炭的添加量为不超过清液体积5％；所述脱色的温度为85～100℃；所述脱色的时间为15～165min；
和/或，所述结晶为降温结晶；所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶；
和/或，所述结晶后，分离，得二元酸产品；所述分离的方法为离心分离。
9.一种长链二元酸发酵液，其特征在于：所述长链二元酸发酵液中盐含量20％以下，优选15％以下，更优选10％以下；所述百分比为相对于发酵生成的长链二元酸总量的质量百分比。
10.如权利要求9所述的长链二元酸发酵液，其特征在于：所述长链二元酸发酵液为在酸性条件下发酵转化得到的长链二元酸发酵液。
优选的，所述长链二元酸发酵液为在pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5条件下进行发酵转化，得到的长链二元酸发酵液。
11.一种长链二元酸发酵处理液，其特征在于：所述发酵处理液中，盐含量为12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比；所述发酵处理液为如权利要求8或9所述长链二元酸发酵液，去除固形物后得到；所述固形物包括长链二元酸颗粒。
12.一种发酵生产长链二元酸的方法中产生的废水，其特征在于：所述废水中盐含量为12000ppm以下，所述百万分比为所述盐占废水的质量百万分比；所述废水为如权利要求9或10所述长链二元酸发酵液去除固形物后得到的进入污水处理系统的液体。
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