CN110195122A

CN110195122A - 一种用于检测玉米植物t抗-4的核酸序列及其检测方法

Info

Publication number: CN110195122A
Application number: CN201910374144.6A
Authority: CN
Inventors: 余桂容; 杜文平; 宋军; 徐利远; 陈谦; 邓自圆; 张敏; 林杨
Original assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2019-09-03
Also published as: CN110881367A; CN110184276A

Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米植物T抗‑4的核酸序列及其检测方法，所述玉米植物的核酸序列包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列。所述的检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件T抗‑4的DNA分子。

Description

一种用于检测玉米植物T抗-4的核酸序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测玉米植物T抗-4的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件T抗-4的核酸序列及其检测方法。

背景技术

田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。据联合国粮食与农业组织统计，全球因杂草导致的粮食生产损失每年高达950亿美元，相当于损失了3.8亿吨小麦，约合2009年全球小麦产量的半数以上。在950亿美元的经济损失中，贫困的发展中国家承受了大约700亿美元(FAO.The lurking menace of weeds[J/OL].(http：//www.fao.org/news/story/en/item/29402/icode/)，2009-08-11.)。因此，有效地控制田间杂草是促进粮食增产的重要措施之一。在我国，危害玉米的杂草种类有40多种，其中危害较大的杂草有10多种。在一般年份杂草可使玉米减产10-20％，严重时更高达30-50％。另外，随着我国农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草甘膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐该类灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题。在玉米生长期喷施1-2次就能有效解决杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。因此，耐除草剂转基因玉米具有非常广阔的应用价值和市场潜力。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。

能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含于侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

发明内容

所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增法中以产生扩增子，所述扩增子的检测诊断生物样品中转基因玉米事件T抗-4或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因玉米事件T抗-4或其后代的存在。

为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，包括：

使待检测样品与至少两种引物在核酸扩增反应中接触；

进行核酸扩增反应；

检测扩增产物的存在；

所述扩增产物包括SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列；

所述扩增产物源自转基因玉米事件T抗-4。

在上述技术方案中，所述扩增产物还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、和/或SEQID NO：7或其互补序列。

具体地，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO：1或其互补序列、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10；所述第二引物选自SEQ ID NO：2或其互补序列、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。

使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ IDNO：2或其互补序列，所述探针源自转基因玉米事件T抗-4；

使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；

检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。

所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

进一步地，所述探针还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ ID NO：7或其互补序列。

可选择地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。

使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列，所述标记物核酸分子源自转基因玉米事件T抗-4；

使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；

检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。

进一步地，所述标记物核酸分子还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ IDNO：7或其互补序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列，其可以作为对于转基因玉米事件T抗-4或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；所述DNA分子源自转基因玉米事件T抗-4。

进一步地，所述DNA分子作为探针时还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQID NO：7或其互补序列。

在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组侧翼区”或“基因组5’侧翼序列”等。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组侧翼区”或“基因组3’侧翼序列”等。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

本发明提供了称为T抗-4的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件T抗-4即为玉米植物T抗-4，其包括转基因玉米事件T抗-4的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件T抗-4的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物T抗-4的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

本发明转基因玉米事件T抗-4包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件T抗-4获得对草甘膦除草剂的耐受性。所述DNA构建体包含一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，所述EPSPS蛋白的核酸序列对草甘膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、泛素蛋白(Ubiquitin)启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)启动子、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(Patatin)启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(GST)启动子、E9启动子、GOS启动子、alcA/alcR启动子、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)RolD启动子和拟南芥属(Arabidopsis thaliana)Suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、来源于蛋白酶抑制剂II(PIN II)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活因子、CaMV35S增强子和FMV35S增强子。所述信号肽/转运肽可以引导EPSPS蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网。

所述5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因可以是从土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp.)CP4菌株中或从荧光假单胞菌属(pseudomonasfluorescens)G2菌株中分离得到的，且可以通过优化密码子或者以其它方式改变编码EPSPS基因的多核苷酸，以达到增加转化细胞中转录物的稳定性和可利用性的目的。所述5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因也可以作为选择性标记基因。

所述“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐，用“草甘膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草甘膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂处理包含了来源于转基因玉米事件T抗-4的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于转基因玉米事件T抗-4的植物材料的生长或产量。

所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。

所述基因枪转化法即为用包含外源DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的生物弹击转化)。

所述花粉管通道转化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又名花粉管引导组织)，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊。

转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还指转化体和含有异源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于转化体亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化体的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA的亲本系(例如原始转化体和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。

本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

培养对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件T抗-4，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件T抗-4及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件T抗-4及其后代是通过利用本发明的对草甘膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对草甘膦除草剂具有耐受性；然后选择对草甘膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使草甘膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用草甘膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件T抗-4中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植物。

还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件T抗-4基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件T抗-4或种子还是来源于转基因玉米事件T抗-4的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件T抗-4的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件T抗-4的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。

本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件T抗-4通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件T抗-4，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件T抗-4，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件T抗-4的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件T抗-4也是诊断性的。

扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。PCR扩增方法已经发展到可扩增22kb的基因组DNA和42kb的噬菌体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的外源DNA序列和来自转基因玉米事件T抗-4的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件T抗-4的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。

基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO：5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，其扩增与转基因玉米事件T抗-4的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO：1。用作DNA引物的其它DNA分子可选自SEQ ID NO：5。

这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是GeneticBit Analysis，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

另一种方法是Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。

荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法(Chen X，Levine L，and Kwok PY.Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis[J].Genome Res，1999，9(5)：492-8.)。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件T抗-4的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

也可应用分子标记对序列进行检测(Tyagi S and Kramer F R.Molecularbeacons：probes that fluoresce upon hybridization[J].Nat Biotechnol，1996，14(3)：303-8.)。设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。

可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件T抗-4的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件T抗-4的DNA的玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO：1、2、3、4或5的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在图1和表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的DNA结构包含：位于转基因插入序列5’末端的玉米T抗-4左侧翼基因组区域，来自农杆菌的左侧边界区域(LB)的一部分插入序列，第一个表达盒由玉米泛素蛋白基因启动子(ubiquitin promoter)，可操作地连接到豌豆rbcS叶绿体转运肽序列(SP)上，可操作地连接到荧光假单胞杆菌属G2菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(2mG2-epsps)上，并可操作地连接到胭脂碱合成酶基因终止子(nosterminator)上而组成，来自农杆菌的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的玉米植物T抗-4右侧翼基因组区域(SEQ ID NO：5)。在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件T抗-4中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件T抗-4中侧翼玉米基因组的DNA区域的任何部分。

转基因玉米事件T抗-4可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草铵膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件T抗-4一起育种，可以提供抗抗虫并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。

本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法，转基因玉米事件T抗-4是耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用。该性状的玉米植株表达荧光假单胞杆菌属菌株G2的草甘膦抗性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白，其赋予植物对草甘膦的耐受性。同时本发明检测方法中SEQ ID NO：1或其互补序列、SEQ ID NO：2或其互补序列、SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ ID NO：7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因玉米事件T抗-4或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件T抗-4的植物材料的存在。

序列简述：

SEQ ID NO：1转基因玉米事件T抗-4中5’转基因插入位点左侧翼玉米基因组DNA和转基因片段左边界的各11个核苷酸序列；

SEQ ID NO：2转基因玉米事件T抗-4中3’转基因插入位点转基因片段右边界和右侧翼玉米基因组DNA的各11个核苷酸序列；

SEQ ID NO：3转基因玉米事件T抗-4中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为448个核苷酸的序列；

SEQ ID NO：4转基因玉米事件T抗-4中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为611个核苷酸的序列；

SEQ ID NO：55’左侧翼玉米基因组序列、整个T-DNA序列和3’右侧翼玉米基因组序列；

SEQ ID NO：6位于SEQ ID NO：3内部的序列，跨越了5’左侧翼玉米基因组序列、2mG2-epsps-pC3301构建体左边界DNA序列和ubiquitin启动子序列；

SEQ ID NO：7位于SEQ ID NO：4内部的序列，跨越了nos转录终止序列、2mG2-epsps-pC3301构建体右边界DNA序列和3’右侧翼玉米基因组序列；

SEQ ID NO：8扩增SEQ ID NO：6的第一引物；

SEQ ID NO：9扩增SEQ ID NO：6的第二引物；

SEQ ID NO：10扩增SEQ ID NO：7的第一引物；

SEQ ID NO：11扩增SEQ ID NO：7的第二引物；

SEQ ID NO：12PCR检测2mG2-epsps的第一引物；

SEQ ID NO：13PCR检测2mG2-epsps的第二引物；

SEQ ID NO：14获得右边界侧翼序列的引物；

SEQ ID NO：15获得右边界侧翼序列的引物；

SEQ ID NO：16获得右边界侧翼序列的引物；

SEQ ID NO：17获得右边界侧翼序列的引物；

SEQ ID NO：18Southern杂交检测中的探针；

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图1转基因插入序列与玉米基因组结合部立的结构示意图。

附图2重组表达载体2mG2-epsps-pC3301的物理图谱。各元件英文及缩写含义列举如下：

T-Border(left) 农杆菌C58的T-DNA左边界序列。

ubiquitin promoter 玉米泛素基因的启动子。

SP 豌豆中的rbcS叶绿体转运肽。

2mG2-epsps 来源于G2菌株的草甘膦耐性基因。

nos terminator 胭脂碱合成酶基因的终止子。

T-Border(right) 农杆菌C58的T-DNA右边界序列。

PVS1 sta pVS1质粒的质粒稳定位点。

PVS1 rep pVS1质粒的复制起始位点。

PBR322 bom pBR322质粒的bom位点。

PBR322 ori pBR322质粒的复制起始位点。

kanamycin(R) 编码氨基糖苷磷酸转移酶蛋白，赋予细菌卡那霉素抗性。

附图3 T抗-4外源基因插入拷贝数的Southern印记杂交图。A：SacI酶切；B：BstEII酶切；C：T-DNA区酶切位点和探针位置示意图，数字表示酶切后的条带大小，单位kb，所用的探针位置标注在下部。泳道1：DNA Marker III，DIG-labeled(Roche)，条带大小标注在旁，单位kb；泳道2：空白；泳道3：2mG2-epsps-pC3301质粒和受体18599基因组DNA混合物；泳道4：受体18599基因组DNA；泳道5：T抗-4 T₆代基因组DNA；泳道6：T抗-4 T₇代基因组DNA。

附图4喷施草甘膦4周后转化事件T抗-4的田间表现。A：受体18599不喷施草甘膦；B：受体18599喷施草甘膦；C：转化事件T抗-4不喷施草甘膦；D：转化事件T抗-4喷施草甘膦。

附图5转化事件T抗-4的检测结果。A：左边界检测，目标条带预期大小353bp；B：右边界检测，目标条带预期大小414bp；M：分子量标准，从上到下依次为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；1：水；2：玉米材料0151；3：玉米材料成单30；4：玉米材料T抗-4-0151；5：玉米材料16-1。

具体实施方式

本申请涉及的转化事件T抗-4是指以玉米自交系18599为受体经过遗传转化得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的玉米植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有附图1所示的物理图谱，所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO：5的第293-4277位核苷酸所示序列。转化事件T抗-4可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体转化其他受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件T抗-4还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

实施例1转化载体的构建

(1)根据在植物中表达基因功能的需要，在2mG2-epsps基因编码区5’端增加了一段叶绿体导肽SP序列，以保证翻译出的EPSPS蛋白运送到芳香族氨基酸的合成场所叶绿体内。(2)合成2mG2-epsps序列，并在序列两端分别引入BamHI和SacI酶切位点；克隆SP序列，并在序列两端分别引入PstI和BamHI酶切位点。

(3)BamHI+SacI处理2mG2-epsps序列和PUC19载体并连接，获得2mG2-epsps-PUC19载体。PstI+BamHI处理SP序列和2mG2-epsps-PUC19载体并连接，获得SP-2mG2-epsps-PUC19载体。

(4)HindIII+PstI酶切PAH17载体获得ubiquitin启动子并将其连入用HindIII+PstI处理的SP-2mG2-epsps-PUC19载体，获得Pubi-SP-2mG2-epsps-PUC19载体。

(5)AseI+BstEII处理pCABIA3301载体和左端为AseI+HindIII、右端为SacI+BstEII的DNA片段，连接后获得改造后的pCAMBIA3301载体。

(6)HindIII+SacI酶切Pubi-SP-2mG2-epsps-PUC19载体和改造后的pCAMBIA3301载体，将Pubi-SP-am79 epsps接入pCAMBIA3301载体，获得命名为2mG2-epsps-pC3301的载体。

所得载体大小为10.261kb，载体物理图谱见附图1。

实施例2玉米遗传转化

转化玉米所用的方法是农杆菌介导法，其操作程序如下：

(1)选取授粉10-13天的玉米雌穗，从中剥离大小适中的幼胚(1.5-2.0mm)：

(2)用接种环从19℃生长三天的YEP平板上挑取农杆菌(含表达载体)，悬浮在侵染培养液中，室温，75rpm，2-4h，至OD550＝0.3-0.5，侵染剥离的幼胚；

(3)侵染完的幼胚转移到共培养基上，20℃暗中培养3天；

(4)3天后将幼胚转移到恢复培养基中，28℃暗中培养7天；

(5)恢复培养后将幼胚转移到筛选培养基中，每两周转换一次，从中选择生长迅速的愈伤组织；

(6)选择出来的愈伤组织光下萌发，长成再生植株后分子检测确定转基因植株；

实施例3转化体的筛选

(1)对转化获得的810个T0代转化苗进行目的基因分子检测。根据基因序列设计PCR引物对，引物序列分别为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。取转化苗叶片提取基因组DNA，按照以下PCR参数进行扩增：

反应体系：

反应程序：

阳性转化体的目的基因扩增片段大小与阳性质粒对照PCR的扩增片段大小一致，均为499bp，收获13个阳性单株的T1种子。

(2)在温室中对T1-T3代植株经除草剂筛选，分离比考察等筛选得到编号为T抗-1、T抗-2、T抗-3、T抗-4、T抗-5、T抗-6的6个株系。

(3)在温室中对T₄-T₆代植株进一步考察农艺性状筛选得到转化体T抗-4。

产量性状方面，T抗-4具有锥型穗、硬粒型、黄粒色和白色轴，这些都与18599一致。T抗-4和18599在穗长、突尖、穗粗、穗行数、行粒数、百粒重和产量方面均无显著差异(p＞0.05)(表2)。

表2 T抗-4产量及考种性状调查结果

同列数据采用LSD法检验差异显著性(α＝0.05)。

实施例4转化事件T抗-4外源序列的侧翼序列及玉米基因组插入位置

设计侧翼序列分离的引物(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17)，利用Tail-PCR扩增并测序的方法获得了转化体T抗-4的右侧翼序列(SEQ ID NO：5第4278-4601位)，并根据基因组序列通过PCR扩增测序(引物序列为SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9)得到左侧翼序列(SEQ ID NO：5第1-292位)。在PlantGDB数据库(http：//www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.p1)中用BLASTN工具将侧翼序列与玉米基因组序列进行同源比对分析，以B73 RefGen_V2为参考序列。分析可知转化体T抗-4插入玉米基因组Chr01：227594470位置处。

Tail-PCR的操作步骤如下：

1)提取玉米基因组DNA。

2)以植物基因组DNA作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下：

反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；62℃，2min；72℃，2.5min)×5cycles；94℃，30sec；25℃，3min；72℃(32％ramp)，3min；(94℃，30sec；62℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；62℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；45℃，1min；72℃，2.5min)×15cycles；72℃，7min；20℃，10min。

3)以步骤2)中相应的PCR产物(母液)为模板进行第二轮PCR扩增。反应体系如下：

反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；45℃，1min；72℃，2.5min)×20cycles；72℃，7min；20℃，10min。

4)以步骤3)中相应的PCR产物(稀释30信)为模板进行第三轮PCR扩增。反应体系如下：

5)取步骤4)中第三轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收符合目的大小的DNA片段。

6)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接。

7)转化6)的连接产物。

8)扩增7)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇菌提质粒。

9)送质粒进行测序。

进一步通过重叠PCR分段扩增并测序T抗-4的全长插入序列。转化体T抗-4实际插入序列和左右侧翼玉米基因组序列如SEQ ID NO：5所示。

表3侧翼序列分离所用引物信息

N＝A/T/C/G；V＝G/C/A；1：单位bp。

实施例5转化事件T抗-4的拷贝数检测

采用Southern印记杂交的方法确定外源基因插入的拷贝数。2mG2-epsps基因片段的插入拷贝数杂交检测选取SacI和BstEII两种限制性内切酶分别酶切阳性对照2mG2-epsps-pC3301质粒与野生型18599基因组DNA的混合物、阴性对照野生型18599基因组DNA和T₆、T₇代T抗-4转化体基因组DNA。跑胶转膜后用2mG2-epsps基因探针标记。杂交结果见附图4A、B所示。目的基因2mG2-epsps的探针位置及限制性内切酶SacI和BstEII的酶切位点如附图4C所示。

SacI在T-DNA区的酶切位点只有一个，位于2mG2-epsps基因探针的右侧，经过酶切的T抗-4基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括3.6kb的T-DNA序列及其左侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于3.6kb，实验中标记出单一的杂交条带，大小约为15kb(附图4A泳道5、6)，符合预期。

BstEII在T-DNA区有两个酶切位点，都位于2mG2-epsps基因探针的右侧，经过酶切的T抗-4转化体基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括2.6kb的T-DNA序列及其左侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于2.6kb，实验中标记出单一的杂交条带，大小约为2.7kb(附图4B泳道5、6)，符合预期。

同时，空白对照和阴性对照受体18599用SacI和BstEII两种限制性内切酶酶切标记后都没有看到条带(泳道2、4)；阳性对照2mG2-epsps-pC3301质粒和受体18599基因组DNA混合物用SacI和BstEII两种限制性内切酶酶切标记后杂交出的条带与质粒大小10.3kb或10.1kb吻合(泳道3)，这些都表明了杂交探针的特异性。

以上实验结果表明，T抗-4的T-DNA区含有单拷贝的2mG2-epsps基因片段，且T-DNA区单位点插入玉米基因组。不同世代间外源插入片段可通过有性生殖稳定遗传。

实施例6转化事件T抗-4对靶标除草剂的耐受性

在田间自然环境下，通过人工喷施除草剂的方法测定T抗-4转化体对除草剂草甘膦的耐受性，以明确转化体耐除草剂目标性状的有效性。所用除草剂为农达，由孟山都远东公司生产，活性成分草甘膦异丙胺盐的含量为41％，剂型为水剂。其田间推荐剂量为150-250mL/亩，取200mL/亩(活性成分含量为82g/亩)，兑水30L/亩喷施。

试验处理设置4个处理：

(1)转基因玉米不喷施除草剂；

(2)转基因玉米喷施目标除草剂；

(3)对应的非转基因玉米不喷施除草剂；

(4)对应的非转基因玉米喷施目标除草剂；

除草剂喷施剂量分别为喷施清水(0×)及田间推荐剂量中量的1倍(1×，活性成分含量82g/亩)、2倍(2×，活性成分含量164g/亩)和4倍(4×，活性成分含量328g/亩)。

性状调查：分别在用药后1周、2周和4周调查和记录成苗率、植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)。

(1)如果药害能被计数或测量，则用绝对数值表示，例如植株数(喷药株数、死亡株数)或植株高度(选取最高的5株)。

(2)用药1周后，按表4给每个处理药害定级。

表4除草剂药害症状分级表

除草剂受害率按公式(1)计算。

式中：

X-受害率，单位为百分率(％)；

N-同级受害株数；

S-级别数；

T-总株数；

M-最高级别。

在喷施0倍草甘膦溶液1周后，转化体和非转基因受体对照都可以生长存活，但杂草丛生，玉米长势很差(附图4A、C)。而在喷施1倍田间推荐剂量中量的草甘膦溶液1周后，非转基因受体对照玉米连同杂草全部干枯、死亡(附图4B)，转化体的植株能够正常生长，而且由于杂草全部杀死，玉米比不喷施除草剂时长势更好(附图4D)。随着时间的推移，在喷施草甘膦溶液4周后，喷施不同剂量草甘膦的转化体植株依然能够正常生长，而且不同剂量下的外观表现一样。

药害调查结果如表5所示，在对照受体18599在除草剂1倍剂量喷施下植株死亡，没有成活苗。转化事件T抗-4在喷施1周后调查没有植株全部成活，且受害率为0％，株高在清水处理和除草剂处理间没有显著性差异；药后2周和4周均没有药害和植株死亡现象出现，植株生长未受到抑制。

表5 T抗-4对草甘膦的耐受性表现

用药剂量以推荐剂量中量的倍数表示。数值以3次生物学重复的平均值±标准差表示，同列不同喷施剂量间数据采用LSD法检验差异显著性(α＝0.05)。

这些结果表明，转化事件T抗-4具有较强的草甘膦耐受性。在推荐剂量中量4倍处理时，药害率仍为0，其耐受等级达到优秀。因此，转化事件T抗-4可以保护玉米免受由除草剂引起的损伤。通过种植转化事件T抗-4并喷施适当剂量的除草剂可以控制玉米田中的杂草。

实施例7利用转化事件T抗-4产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法

通过前期试验发现T抗-4的抗性及其他农艺性状都很优良，故用该事件转育改良西南地区生产上应用非常广的骨干亲本0151、08-641、G533等，以提高这些骨干亲本的除草剂抗性。2010年开始做杂交一代，然后与受体亲本回交3代，再自交4代以上，材料就基本稳定了。通过四川省、海南省两地穿梭育种，每年种植两代。每一代就目标性状——抗除草剂草甘膦在高浓度(草甘膦推荐剂量的4倍)下进行选择，再结合其他农艺性状选择优良单株和穗行留种，直至性状稳定纯化。

此外，T抗-4转育稳定的自交系也可以组配杂交组合。转基因玉米新组合16-1是以骨干自交系P9325为母本与以骨干亲本0151为背景并包含转化事件T抗-4的亲本为父本于2015年选配而成；玉米新组合16-1参加2016年玉米新组合品比试验，平均产量570.68kg/亩，较对照成单30增产9.2％。

利用本发明提供的方法不仅可以在亲本改良和杂交组合组配过程中对T抗-4进行检测，以为品种的选育提供分子辅助手段，也可以用来鉴定玉米品种中是否含有T抗-4转化事件。以下方法为鉴定T抗-4的具体实例。

对亲本0151改良获得的自交系T抗-4-0151和转基因玉米新组合16-1进行分子检测，以确认这两个材料中包含转化事件T抗-4。根据基因序列设计PCR引物对，通过检测转化事件左右两个边界的存在以确定转化事件T抗-4的存在。其中左边界检测的引物序列分别为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，左边界检测的引物序列分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。取玉米植株叶片提取基因组DNA，按照以下PCR参数进行扩增：

PCR反应体系：

反应程序为：

94℃，5min；(94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1.0min)×35循环；72℃，7min；4℃，5min。

取PCR产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测。

结果见附图5。T抗-4-0151和16-1的样品能够扩增出相应的目标条带，而具有同样背景但不含有T抗-4事件的玉米样品却不能扩增出条带，这证明T抗-4事件已成功转育到亲本0151中，用其配制的杂交组合16-1也包括T抗-4事件。

对T抗-4-0151和16-1的除草剂耐受性进行鉴定，鉴定方法参照实施例7，鉴定结果见表6。除草剂不会对T抗-4-0151和16-1材料造成伤害，但是会导致不含T抗-4的对照材料0151和成单30死亡，可表明利用转化事件T抗-4可以产生对草甘膦除草剂具有耐受性的玉米植株。

表6 T抗-4-0151和16-1对草甘膦的耐受性表现

用药剂量为推荐剂量中量的4倍。数值以3次生物学重复的平均值±标准差表示，同列数据采用LSD法检验差异显著性(α＝0.05)。

实施例8转化事件T抗-4的检测方法

可由转基因玉米事件T抗-4生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的表达量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因玉米事件T抗-4材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的转基因玉米事件T抗-4核苷酸序列，其中探针序列或引物序列选自如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中所示的序列，以诊断转基因玉米事件T抗-4的存在。

综上所述，本发明转基因玉米事件T抗-4对草甘膦除草剂具有较高的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件T抗-4的DNA分子。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，包括：

使待检测样品与至少两种引物在核酸扩增反应中接触；

进行核酸扩增反应；

检测扩增产物的存在；

所述扩增产物源自转基因玉米事件T抗-4。

2.根据权利要求1所述检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，所述扩增产物还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、和/或SEQ ID NO：7或其互补序列。

3.根据权利要求1或2所述检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO：1或其互补序列、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10；所述第二引物选自SEQ ID NO：2或其互补序列、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。

4.一种检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，包括：

使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列，所述探针源自转基因玉米事件T抗-4；

使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；

检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。

5.根据权利要求4所述检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ ID NO：7或其互补序列。

6.根据权利要求4或5所述检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。

7.一种检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述检测样品中转基因玉米事件T抗-4的DNA存在的方法，其特征在于，所述标记物核酸分子还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ ID NO：7或其互补序列。

9.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ IDNO：1或其互补序列、或者SEQ ID NO：2或其互补序列，其可以作为对于转基因玉米事件T抗-4或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；所述DNA分子源自转基因玉米事件T抗-4。

10.根据权利要求9所述DNA检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子作为探针时还包括SEQ ID NO：6或其互补序列、或者SEQ ID NO：7或其互补序列。