CN110152067A - 组织工程骨支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程骨支架及其制备方法，制备方法包括以下步骤：清洗步骤，将组织工程骨材料进行超临界流体清洗处理，以除去骨材料中的软组织，得到初始骨基体；灭菌步骤，将初始骨基体进行超临界流体灭菌处理，得到骨基体；复合步骤，通过超临界流体将细胞因子复合于骨基体的孔内部，得到骨支架。本发明提供的组织工程骨支架能够同时兼顾良好的力学性能和生物相容性。

Description

组织工程骨支架及其制备方法

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，尤其涉及一种组织工程骨支架及其制备方法。

背景技术

由于创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等病因而导致的骨缺损日益增多，且大多情况下的骨缺损难以自行愈合，其修复和治疗一直是临床难题之一。

组织工程学是综合应用工程学和生命科学的原理与技术，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，达到修复组织缺损和重建组织功能的目的。组织工程学的研究成果促进了骨组织工程的发展，这为骨缺损的治疗提供了新的技术手段。为了实现将组织工程骨最终应用于临床骨缺损治疗，要求组织工程骨具有良好的力学性能和生物相容性。

基于此，本发明提供一种组织工程骨支架及其制备方法。

发明内容

本发明实施例提供了一种组织工程骨支架及其制备方法，旨在使组织工程骨支架同时兼顾良好的力学性能和生物相容性。

本发明实施例一方面提供一种组织工程骨支架的制备方法，方法包括以下步骤：

清洗步骤，将组织工程骨材料进行超临界流体清洗处理，以除去骨材料中的软组织，得到初始骨基体；

灭菌步骤，将初始骨基体进行超临界流体灭菌处理，得到骨基体；

复合步骤，通过超临界流体将细胞因子复合于骨基体的孔内部，得到骨支架。

本发明实施例另一方面提供一种根据上述制备方法的组织工程骨支架，骨支架包括具有多孔结构的骨基体及负载于骨基体的孔内部的细胞因子。

相对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：

本发明实施例提供的组织工程骨支架及其制备方法，采用超临界流体对组织工程骨材料进行清洗得到初始骨基体，之后采用超临界流体对初始骨基体进行灭菌，能够有效降低组织工程骨材料中的免疫原性、杀灭组织工程骨材料所携带的病原微生物，从而使组织工程骨支架具有较高的生物相容性，降低宿主对植入骨支架的免疫排斥作用。之后通过超临界流体将细胞因子复合于骨基体的孔内部，超临界流体清洗、灭菌及复合处理对组织工程骨材料的胶原、骨基质等的破坏显著减小，不会破坏骨材料的三维多孔结构，能够为细胞生长提供优良的所需微环境，有利于细胞的生长、增殖及再分化，促进骨缺损的修复；并保存骨材料的力学性能，使得组织工程骨支架具有良好的生物力学性能，能够更好地维持植入后骨支架的力学稳定性，更长久地给予力学支撑，适用于大段骨缺损的修复。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。

图1为实施例1的骨材料在超临界流体清洗处理之前(A)及之后(B)的图像。

图2为骨基体皮下植入一周、两周、四周后的苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，简称HE)图像。

图3为体外细胞迁移实验结晶紫染色图像。

图4为根据实施例1制备的超临界清洗灭菌骨基体植入兔桡骨缺损区1个月后X拍片。

图5为根据实施例3制备的骨支架植入兔桡骨缺损区1个月后X拍片。

具体实施方式

为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。

为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两种以上。

本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

本发明实施例提供一种组织工程骨支架的制备方法，方法包括清洗步骤S100、灭菌步骤S200及复合步骤S300。

S100，将组织工程骨材料进行超临界流体清洗处理，以除去骨材料中的软组织，得到初始骨基体。

S200，将初始骨基体进行超临界流体灭菌处理，得到骨基体。

S300，通过超临界流体将细胞因子复合于骨基体的孔内部，得到骨支架。

本发明实施例提供的组织工程骨支架的制备方法，采用超临界流体对组织工程骨材料进行清洗得到初始骨基体，之后采用超临界流体对初始骨基体进行灭菌，能够有效降低组织工程骨材料中的免疫原性、杀灭组织工程骨材料所携带的病原微生物，从而使组织工程骨支架具有较高的生物相容性，降低宿主对植入骨支架的免疫排斥作用。

之后通过超临界流体将细胞因子复合于骨基体的孔内部，超临界流体清洗、灭菌及复合处理对组织工程骨材料的骨胶原、骨基质等的破坏显著减小，保持生物大分子的完整性，且不会破坏骨材料的三维多孔结构，能够为细胞生长提供优良的所需微环境，有利于细胞的生长、增殖及再分化，促进骨缺损的修复；并能够保存骨材料的力学性能，使得组织工程骨支架具有良好的生物力学性能，能够更好地维持植入后骨支架的力学稳定性，更长久地给予力学支撑，适用于大段骨缺损、骨不连的修复与重建。

此外，超临界流体对细胞因子具有较强的溶解能力及扩散能力，通过超临界流体能够运载细胞因子深入渗透骨基质中，使细胞因子均匀分布于骨基体，能够达到增加细胞因子的释放时间、减小细胞因子到功能作用区的距离、使细胞因子在骨支架内部呈时空释放等有利因素，可局部缓慢释放出细胞因子，实现局部调节成破骨活性，在恰当的位置、恰当的时间激活骨再生中的多信号通路实现更佳的骨组织再生，促进植入骨支架与宿主骨的整合、以及骨缺损的再生修复，还降低了细胞因子的使用剂量和副作用。

根据本发明实施例提供的组织工程骨支架制备方法，得到的组织工程骨支架表现出较高的骨诱导活性，显著促进早期骨生成和后期骨整合，使新建骨组织具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能，具有极好的应用潜力。

根据本发明实施例提供的组织工程骨支架制备方法，得到的组织工程骨支架可降解吸收，降解产物对机体无毒副作用，降解速率和新骨形成的速率相匹配。

上述组织工程骨材料可以为同种异体松质骨、异种松质骨及自体松质骨中的一种或多种。获取同种异体松质骨的个体与待修复骨缺损的个体不同、但属于同一物种，同种异体骨生物力学特性和结构与自体骨相似，且具有来源广泛等特点，是良好的可用于替代自体骨的骨缺损修复材料。获取异种松质骨的个体与待修复骨缺损的个体不属于同一物种，例如待修复骨缺损的个体为人，获取异种松质骨的个体可以是动物，如猪、牛、羊等。

上述细胞因子可以为重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant humanbonemorphogenetic protein 2，简称rhBMP-2)、转化生长因子(transforming growthfactor-β，简称TGF-β)、转化生长因子-β家族(TGF-β家族)及血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，简称VEGF)中的一种或多种。其中rhBMP-2属于TGF-α家族，其由成骨细胞分泌，并作用于成骨细胞，rhBMP-2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用，在肢体生长、骨折时表达、以及在骨骼生长发育和再生修复起重要作用。

根据本发明实施例提供的组织工程骨支架制备方法，能够有效防止组织工程骨支架中的生长因子因新陈代谢过程、生理环境变化、或与酶的作用而变性，并让细胞因子按一定浓度逐渐缓释，既能达到长期的局部较小有效药物刺激浓度，又能抑制细胞因子过量的潜在并发症，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说提供良好的治疗效果，并且提高成骨质量、降低炎症反应及其他风险。

超临界流体是处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体，兼有气体液体的双重性质和优点，溶解性强、扩散性能好、且易于控制，并具有稳定、无毒、易分离、环保的特点。在清洗步骤S100、灭菌步骤S200及复合步骤S300，超临界流体各自独立地选自超临界二氧化碳、超临界水、超临界醇及超临界烷烃中的一种或多种。超临界醇例如是超临界甲醇、超临界乙醇。超临界烷烃例如是超临界态的C1～C12烷烃。

在一些实施方式中，清洗步骤S100包括：将骨材料置于超临界流体环境中，使软组织溶解于超临界流体中而除去，其中超临界流体环境的压力为9MPa～15MPa，超临界流体环境的温度为37℃～45℃，优选为38℃～42℃。清洗的时间可以为10h～20h，例如14h～18h，如16h。

在上述操作条件下，能够降低骨材料中的免疫原性，使组织工程骨支架具有较高的生物相容性。此外，上述操作条件对骨材料的骨胶原、骨基质等破坏小，生物大分子的完整性良好，并且骨材料的三维多孔结构及力学性能能够被较好地保持住。

在清洗步骤S100，清洗之后的泄压速率可以是0.1MPa/min～1MPa/min，例如0.5MPa/min。

清洗步骤S100可以在Nova2200型超临界二氧化碳设备中进行，它包括二氧化碳钢瓶、冷却器、高压泵、恒温预热器、可控电加热系统、通路阀、釜前阀、反应球釜、压力表、泄压阀及电脑控制系统顺次相连。它可通过主屏幕设置参数并控制反应容器内部压力和温度，以及运行时间及泄压速率等。

进一步地，在清洗步骤S100，超临界流体中还可以含有第一添加剂，第一添加剂例如为过氧化氢溶液。添加第一添加剂的超临界流体可以进一步提高对骨材料氧化脱脂及灭菌的效果，清洗效果更好。

在一些优选的实施方式中，第一添加剂过氧化氢溶液中过氧化氢的质量百分含量为1％～5％，例如为2％～4％，如3％。

进一步地，过氧化氢溶液与超临界流体的体积比为1:1000～1:2000，例如为1:1200～1:1500，如1:1250。

在一些实施方式中，在清洗步骤S100之前，还可以包括初步清洗步骤S400：采用洗涤液将骨材料进行超声波离心清洗和/或高压水枪冲洗，以除去骨材料中的骨髓、脂肪及残余血中的一种或多种，洗涤液为水、醇类及酮类中的一种或多种。

通过初步清洗步骤S400可以有效去除骨材料内部大部分骨髓、脂肪及残余血，在清洗步骤S100，超临界流体更容易经孔隙进入骨组织内部，有利于萃取分离微孔内的油脂，能够减少清洗步骤S100的处理时间、提高清洗效果，提高骨支架的生物相容性。

在一些实施方式中，在初步清洗步骤S400之前，还可以包括预处理步骤S500。预处理步骤S500包括：

S510，将骨材料进行机械清理以除去骨材料表面的软组织。

在步骤S510，可以采用刀具剔除骨材料表面的肌肉、肌腱、筋膜等软组织。

S520，将骨材料经磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，简称PBS)清洗处理。

上述PBS可以采用本领域已知的磷酸缓冲盐溶液，作为示例，可以采用8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1000mL蒸馏水中的PBS，其pH值例如为7.4。

作为示例，可以采用PBS将骨材料清洗1～6次，例如2～5次，如3次。每次清洗的时间可以是2min～10min，例如3min～8min，如5min。清洗的方式可以是静置浸泡、振荡浸泡、冲洗、离心清洗等。

在步骤S520，通过PBS清洗处理能够除去骨材料中大部分的红细胞，降低骨材料的免疫原性，提高骨支架的生物相容性。

S530，将清洗处理后的骨材料在-10℃～-50℃条件下冷冻10h～48h，之后在-50℃～-100℃条件下冷冻10h～48h。

在可选的实施方式中，将清洗处理后的骨材料在-20℃条件下冷冻24h，之后转移至-80℃冷冻24h。

通过步骤S530的处理，能够初步降低骨材料的免疫原性，提高后续清洗效率，且不会破坏骨材料中的骨胶原、骨基质等，并保存骨材料的生物力学性能。

在一些实施方式中，在步骤S520之前，还包括：

S540，将机械清理后的骨材料切割成具有预定体积的骨块。

在步骤S540，可以采用锯骨机进行切割骨材料。预定体积例如是(5～20)mm×(5～20)mm×(5～20)mm，如10mm×10mm×10mm。对骨块的形状没有特别的限制，可以根据实际需求进行选择，如长方体、正方体、圆柱体等。

在一些实施方式中，步骤S530处理后的骨材料可以直接进入下一步骤，或者将其放入-20℃的环境中保存备用。

在一些实施方式中，在灭菌步骤S200包括：使超临界流体渗透进入初始骨基体内部对初始骨基体进行灭菌处理。

灭菌步骤S200可以在Nova2200型超临界二氧化碳设备中进行，将初始骨基体置于超临界流体中，超临界流体的压力可以为12MPa～15MPa，超临界流体渗透进入初始骨基体内部对初始骨基体进行灭菌处理。灭菌处理的温度可以为37℃～45℃，优选为38℃～42℃。灭菌处理的时间可以为0.5h～3h，例如0.8h～1.2h，如1h。

在上述操作条件下，能够有效降低骨材料中的免疫原性、杀灭组织工程骨材料所携带的病原微生物，使组织工程骨支架具有较高的生物相容性。此外，上述操作条件对骨材料的骨胶原、骨基质等破坏小，生物大分子的完整性良好，并且骨材料的三维多孔结构及力学性能能够被较好地保持住。

在灭菌步骤S200，灭菌之后的泄压速率可以是0.1MPa/min～1MPa/min，例如0.5MPa/min。

进一步地，在灭菌步骤S200，超临界流体中可以含有第二添加剂，第二添加剂为过氧乙酸溶液及过氧化氢溶液中的一种或多种。添加第二添加剂的超临界流体可以更好地提高对骨材料的灭菌效果。

用于第二添加剂的过氧乙酸溶液中，过氧乙酸的质量百分含量例如为5％～20％，再例如为10％～20％，如18％。用于第二添加剂的过氧化氢溶液中，过氧化氢的质量百分含量为1％～5％，例如为2％～4％，如3％。

在一些优选的实施方式中，第二添加剂为过氧乙酸溶液和过氧化氢溶液的混合液，混合液中过氧乙酸溶液与过氧化氢溶液的体积比优选为1:9～9:1，例如2:1～6:1，如78:22。

进一步地，在灭菌步骤S200，过氧乙酸溶液、过氧化氢溶液及超临界流体的体积比优选为3～4:1:70000～100000，如3.5～3.6:1:80000～95000。

在一些实施方式中，在灭菌步骤S200之后、复合步骤S300之前，还可以包括洗涤步骤S600：采用磷酸缓冲盐溶液PBS对灭菌处理后的骨基体进行洗涤，并干燥。磷酸缓冲盐溶液PBS可以采用前文所述的PBS。

在一些实施方式中，复合步骤S300包括：将骨基体和细胞因子置于超临界流体环境中，通过超临界流体将细胞因子运载于骨基体的孔内部并复合，得到骨支架。其中，超临界流体环境的压力可以为8MPa～12MPa，如9.9MPa；超临界流体环境的温度为37℃～45℃，优选为38℃～42℃；处理的时间可以为0.5h～4h，例如1h～3h，如2h。

在上述操作条件下，超临界流体能够运载细胞因子深入渗透骨基质中，使细胞因子均匀分布于骨基体，更好地达到增加细胞因子的释放时间、减小细胞因子到功能作用区的距离、使细胞因子在骨支架内部呈时空释放等有利因素，可局部缓慢释放出细胞因子，实现局部调节成破骨活性，在恰当的位置、恰当的时间激活骨再生中的多信号通路实现更佳的骨组织再生，更佳地促进植入骨支架与宿主骨的整合、以及骨缺损的再生修复，还降低了细胞因子的使用剂量和副作用。

在复合步骤S300，复合之后的泄压速率可以是0.1MPa/min～1MPa/min，例如0.5MPa/min。

在复合步骤S300，细胞因子的负载浓度或量可以通过计算骨基体的体积而定量负载。

在一些实施方式中，复合步骤S300包括：

S310，在温度低于25℃且无菌的环境中，将细胞因子负载于骨基体，得到复合物。

S320，将复合物置于超临界流体中，通过超临界流体将细胞因子运载于骨基体的孔内部并复合，得到骨支架。

步骤S320可以在Nova2200型超临界二氧化碳设备中进行，将复合物装于Tyvek-Poly小袋进行复合，有利于使细胞因子更高效地渗透进入骨基体内部。之后改变超临界流体的状态以去除，得到骨支架。

制备得到的骨支架无菌包装，可以置于-20℃～4℃且无菌的环境中保存备用。

本发明实施例还提供一种组织工程骨支架，其是通过上述的制备方法制备得到。骨支架包括：骨基体，具有多孔结构；细胞因子，负载于骨基体的孔内部。

本发明实施例的组织工程骨支架，具有较高的生物相容性，降低宿主对植入骨支架的免疫排斥作用。并且，骨支架保存了组织工程骨材料的原始骨胶原、骨基质等，生物大分子的完整性好，还保存了骨材料的三维多孔结构，能够为细胞生长提供优良的所需微环境，有利于细胞的生长、增殖及再分化，促进骨缺损的修复；并保存了骨材料的力学性能，具有良好的生物力学性能，能够更好地维持植入后骨支架的力学稳定性，更长久地给予力学支撑，适用于大段骨缺损、骨不连的修复与重建。

此外，细胞因子深入渗透骨基体中，并均匀分布于骨基体，能够达到增加细胞因子的释放时间、减小细胞因子到功能作用区的距离、使细胞因子在骨支架内部呈时空释放等有利因素，可局部缓慢释放出细胞因子，实现局部调节成破骨活性，在恰当的位置、恰当的时间激活骨再生中的多信号通路实现更佳的骨组织再生，促进植入骨支架与宿主骨的整合、以及骨缺损的再生修复，还降低了细胞因子的使用剂量和副作用。

根据本发明实施例的组织工程骨支架表现出较高的骨诱导活性，显著促进早期骨生成和后期骨整合，使新建骨组织具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能，具有极好的应用潜力。

根据本发明实施例的组织工程骨支架可降解吸收，降解产物对机体无毒副作用，降解速率和新骨形成的速率相匹配。

实施例

下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。

在以下实施例中，超临界二氧化碳的纯度为95％～99％；PBS溶液为8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄溶于1000mL蒸馏水中的PBS溶液。

实施例1

1)将猪股骨松质骨剔除骨材料表面的肌肉、肌腱、筋膜等软组织，锯成10mm×10mm×10mm左右的正方体骨块，放入PBS溶液中清洗3次，每次5min，之后放入-20℃的冷库中，冷冻24h后转移至-80℃冻存24h，以抑制破坏成骨相关的酶活性，之后将骨块放入-20℃冷柜储存备用，其中储存时间可达3个月以上。

2)将上述备用骨块进行去离子水加压冲洗，去除骨块中的骨髓、脂肪及血渍，放入Nova2200型超临界二氧化碳设备萃取清洗，在温度为40℃、压力为9.9MPa的超临界二氧化碳环境下萃取清洗16h，第一添加剂为16mL质量浓度为3％的H₂O₂溶液，H₂O₂溶液与超临界二氧化碳的体积比为1:1250。

图1(A)示出了去离子水加压冲洗之后的骨块图像，图1(B)示出了超临界二氧化碳清洗之后的骨块图像。由图1中A和B的对比可以看出，超临界二氧化碳清洗有效去除了骨块中残留的软组织及细胞，从而能够有效降低组织工程骨材料的免疫原性，从而能够使组织工程骨支架具有较高的生物相容性。

3)将清洗后的骨块经超临界二氧化碳灭菌处理，灭菌温度为40℃、压力为12MPa，超临界二氧化碳的体积为20000mL，第二添加剂为0.78mL质量浓度为18％过氧乙酸溶液和0.22mL质量浓度为3％的H₂O₂溶液，灭菌时间为1h。之后于无菌超净台内严格按照无菌要求，利用1mL枪头吸取PBS液反复冲洗，冲洗后用无菌纱布擦干，获得超临界清洗后的骨基体，待用。

测试方法

(1)骨块的抗压强度：每组样本制备为统一规格(10mm×10mm×10mm)，然后给予力学试验机测试，200N预压3次后进行正式测试，测试速率为3mm/min，其在骨组织出现变形时结束，获得力-位移曲线，然后利用Origin8.5软件求得应力-应变曲线，获得骨块最大抗压强度及压缩弹性模量。

(2)骨块的孔隙率：采用无水乙醇置换的方法来测定骨块的孔隙率(Porosity)。选用一带有刻度的10ml注射器，装入一定量的无水乙醇，得初始乙醇体积V₁；骨块制成5mm×5mm×5mm的长方体，放入注射器内并且使乙醇完全浸透骨块，得浸透骨块后的乙醇体积V₂；取出乙醇浸透的骨块，剩余乙醇的体积计为V₃，测试三个样本取平均值。根据公式计算：

孔隙率(ε)＝(V₁–V₃)/(V₂–V₃)×100％

(3)骨块的孔径：采用日本日立(Hitachi)公司的S-4800型扫描电子显微镜，利用粒径分析软件Nano Measurer1.2测量骨块的孔径。

表1示出了去离子水加压冲洗之后的骨块(对比例1-1～1-2)及超临界二氧化碳清洗灭菌之后的骨块(实施例1-1～1-4)的抗压强度及孔结构测定结果，其中实施例1-1～1-4为取自不同猪股骨的骨块，对比例1-1与实施例1-1为取自同一猪股骨的骨块，对比例1-2与实施例1-2为取自同一猪股骨的骨块。由表1的数据可以看出，对骨材料进行超临界流体处理，骨材料的三维多孔结构及力学性能能够被较好地保持住。

表1

对比例1

1)将猪股骨松质剔除骨表面肌肉、肌腱、筋膜等软组织，锯成10mm×10mm×10mm左右的正方体骨块，放入PBS溶液中清洗3次，每次5min，之后放入-20℃的冷库中，冷冻24h后转移至-80℃冻存24h，以抑制破坏成骨相关的酶活性，之后将骨块放入-20℃冷柜储存备用。

2)将步骤1)所得骨块采用1:1甲醇/氯仿在40℃的条件下进行浸泡脱脂清洗，时间为24h，之后取出骨块采用甲醇清洗2h。

3)将步骤2)所得骨块用质量浓度为75％的医用酒精浸泡2小时，进行灭菌。

4)用去离子水清洗步骤3)骨块5次，每次15min，之后在60℃的烘干机内烘干，得到骨基体。骨基体在-20℃条件下储存待用，但是传统甲醇/氯仿清洗的骨块仍有有较强的免疫原性，有中等毒副作用。

实施例2

健康SD大鼠12只，体重约200g，麻醉后备皮，常规消毒铺巾，背部切口1.5cm，皮下游离，分别将相同体积大小超临界二氧化碳清洗灭菌骨基体(制备方法如实施例1所述)和常规甲醇/氯仿清洗灭菌骨基体(制备方法如对比例1所述)，植入皮下，左右各一，手术缝线缝合切口，分别于术后1周、2周、4周处死大鼠，4％多聚甲醛固定48h，常规脱水、包埋、切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察。

植入1周、2周、4周的组织学分析分别如图2所示，其中C、E、G为常规甲醇/氯仿清洗灭菌骨基体大鼠皮下包埋1周、2周、4周后的HE染色，D、F、H为超临界二氧化碳清洗灭菌骨基体大鼠皮下包埋1周、2周、4周后的HE染色。由图可以看出，在1周时两组均有炎症细胞密集浸润，但植入超临界二氧化碳清洗灭菌骨基体的大鼠炎症细胞明显减少；术后2周两组的炎症细胞数量均明显减少，但植入常规清洗灭菌骨基体的大鼠炎症细胞仍较多，而植入超临界二氧化碳清洗灭菌骨基体的大鼠已未见明显炎症细胞；术后4周两组的骨基体周围炎症细胞进一步减少，但常规清洗灭菌骨基体周围仍可见少量炎症细胞浸润，而植入超临界二氧化碳清洗灭菌骨基体周围未见明显炎症细胞。本实施例结果表明超临界二氧化碳清洗及灭菌技术可减轻植入骨材料的炎症反应，能够使组织工程骨支架具有较高的生物相容性。

实施例3

1)取实施例1获得的骨基体，体积为1cm³。

2)将细胞因子重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)和/或重组人源血管内皮生长因子(rhVEGF-165)分散于PBS溶液中，得到细胞因子悬浊液，其中细胞因子的浓度为50μg/mL，根据体积比V(细胞因子悬液):V(骨材料体积)＝100μL:1cm³负载，使得本实施例的骨支架负载rhBMP-2和/或rhVEGF-165的量为5μg。

3)将负载有细胞因子的骨基体通过超临界二氧化碳运载技术将细胞因子运送于骨基体的孔内部，其中超临界温度为40℃，压力为9.9MPa，时间为2h，获得负载细胞因子的组织工程骨支架。骨支架于-20℃保存，储存时间可达3月，细胞因子仍具有活性，且骨支架的力学性能无明显下降。

对比例2

1)将猪股骨松质剔除骨材料表面的肌肉、肌腱、筋膜等软组织，锯成10mm×10mm×10mm左右的正方体骨块，放入PBS溶液中清洗3次，每次5min，之后放入-20℃的冷库中，冷冻24h后转移至-80℃冻存24h，以抑制破坏成骨相关的酶活性，之后将骨块放入-20℃冷柜储存备用。

2)将步骤1)制备骨块置于冷冻干燥机内，-60℃下冷冻干燥24h，使骨组织内的剩余水分降低到质量百分含量为5％以下，获得骨基体。

3)将骨基体浸入含rhBMP-2浓度为50ug/mL的PBS中，待液体完全浸入后，将骨块置于冷冻干燥机内在-60℃下冷冻干燥4h，去除骨基体表面剩余水分，让细胞生长因子固定于骨基体上，得到骨支架，在-20℃条件下储存待用。储存时间可达3月，细胞因子仍具有活性，但是骨支架的压缩力学性能明显下降，受压易碎。

实施例4

为了评估负载细胞因子rhBMP-2的骨组织对骨髓间充质干细胞的迁移能力的影响，本实施例使用Transwell趋化迁移系统进行体外评估。

3-4周龄新西兰大白兔2只，麻醉备皮、常规消毒铺巾、于髂骨最高处骨穿抽取骨髓，肝素化后，密度梯度离心获取骨髓间充质干细胞，加入带有血清的DMEM培养液重悬，置于37℃、5％体积分数CO₂培养箱培养，取P3代细胞进行实验。

将1×10⁴个兔骨髓间充质干细胞接种在美国Corning公司的24孔Transwell板(孔径：8μm)的上室中，并将负载细胞因子rhBMP-2的骨支架(制备方法如实施例3所述)置于下室中。

培养24小时后，首先用棉签刮擦Transwell膜的上表面以除去粘附细胞，然后从插入物上分离。

迁移到膜下侧的细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，并用0.1％结晶紫染色8分钟。

利用200倍显微镜观察膜下表面上的细胞生长情况。图3为体外细胞迁移实验结晶紫染色图像，其中深色部分表示骨髓间充质干细胞。I为空白对照，J为未负载细胞因子的骨基体组(制备方法如实施例1所述)，K为负载细胞因子rhBMP-2的骨支架组(制备方法如实施例3所述)，与对照组及未负载细胞因子组比较可见，根据本申请实施例的负载细胞因子rhBMP-2的骨支架有明显的细胞迁移作用。本实施例表明经超临界二氧化碳负载细胞因子的骨支架具有良好的促进骨髓间充质干细胞迁移的作用。

实施例5

1)3-4周龄新西兰大白兔，腹卧位，置于动物实验台上，四肢外展固定于操作台两侧。

2)兔双前肢备皮消毒，铺好无菌单，取双前肢桡骨正中切口，长约2cm，逐层切开皮肤皮下组织、深筋膜和分离开肌肉，用骨膜剥离器剥离骨膜，线锯切取兔桡骨长度约1.2cm～1.5cm，造成缺损。

3)分别植入实施例1制备的骨基体与实施例3制备的负载细胞生长因子rhBMP-2的骨支架，缝合骨膜，逐层缝合至皮肤，术后肌注抗生素3天。

图4为超临界清洗灭菌骨基体(制备方法如实施例1所述)植入兔桡骨缺损区1个月后X拍片，图5为负载细胞因子rhBMP-2的骨支架(制备方法如实施例3所述)植入兔桡骨缺损区1个月后X拍片。从X拍片分析可见，图4和图5的骨缺损四周有梭形骨痂阴影，负载细胞因子rhBMP-2的骨支架植入后有明显骨痂形成，且骨痂形成较多。本实施例表明负载细胞因子的组织工程骨支架可很好地促进骨缺损的再生与修复。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (14)

1.一种组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

清洗步骤，将组织工程骨材料进行超临界流体清洗处理，以除去所述骨材料中的软组织，得到初始骨基体；

灭菌步骤，将所述初始骨基体进行超临界流体灭菌处理，得到骨基体；

复合步骤，通过超临界流体将细胞因子复合于所述骨基体的孔内部，得到所述骨支架。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗步骤包括：

将所述骨材料置于超临界流体环境中，使所述软组织溶解于所述超临界流体中而除去，其中所述超临界流体环境的压力为9 MPa～15 MPa，所述超临界流体环境的温度为37℃～45℃，优选为38℃～42℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述清洗步骤包括：

所述超临界流体中含有第一添加剂，所述第一添加剂为过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液中过氧化氢的质量百分含量为1％～5％，优选的为3％；

进一步地，所述过氧化氢溶液与所述超临界流体的体积比为1:1000～1:2000，优选为1:1250。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述清洗步骤之前，还包括初步清洗步骤：

采用洗涤液将所述骨材料进行超声波离心清洗和/或高压水枪冲洗，所述洗涤液为水、醇类及酮类中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述初步清洗步骤之前，还包括预处理步骤：

将所述骨材料进行机械清理以除去所述骨材料表面的所述软组织；

将所述骨块经磷酸缓冲盐溶液清洗处理；

将清洗处理后的骨材料在-10℃～-50℃下冷冻10h～48h，之后在-50℃～-100℃下冷冻10h～48h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述将所述骨块经磷酸缓冲盐溶液清洗处理之前，还包括：

将机械清理后的所述骨材料切割成具有预定体积的骨块。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭菌步骤包括：

使超临界流体渗透进入所述初始骨基体内部对所述初始骨基体进行灭菌处理，所述灭菌处理的压力为12 MPa～15 MPa，所述灭菌处理的温度为37℃～45℃，优选为38℃～42℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述灭菌步骤中，所述超临界流体中含有第二添加剂，所述第二添加剂为过氧乙酸溶液及过氧化氢溶液中的一种或多种；

所述过氧乙酸溶液中过氧乙酸的质量百分含量为5％～20％，优选的为18％；

所述过氧化氢溶液中所述过氧化氢的质量百分含量为1％～5％，优选的为3％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二添加剂为过氧乙酸溶液和过氧化氢溶液的混合液，所述混合液中所述过氧乙酸溶液与所述过氧化氢溶液的体积比为1:9～9:1，优选为2:1～6:1；

进一步地，所述过氧乙酸溶液、所述过氧化氢溶液及所述超临界流体的体积比为3～4:1:70000～100000。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合步骤包括：

将所述骨基体和细胞因子置于超临界流体环境中，通过超临界流体将所述细胞因子运载于所述骨基体的孔内部并复合，得到所述骨支架；

其中，所述超临界流体环境的压力为8 MPa～12 MPa，优选为9.9MPa；所述超临界流体环境的温度为37℃～45℃，优选为38℃～42℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述复合步骤包括：

在温度低于25℃且无菌的环境中，将所述细胞因子负载于所述骨基体，得到复合物；

将所述复合物置于超临界流体中，通过所述超临界流体将所述细胞因子运载于所述骨基体的孔内部并复合，得到所述骨支架。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗步骤、所述灭菌步骤及所述复合步骤中，超临界流体各自独立地选自超临界二氧化碳、超临界水、超临界醇及超临界烷烃中的一种或多种；和/或，

所述清洗步骤中，所述骨材料为同种异体松质骨、异种松质骨及自体松质骨中的一种或多种；和/或，

所述复合步骤中，所述细胞因子为rhBMP-2、TGF-β、转化生长因子-β家族及VEGF中的一种或多种。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述灭菌步骤之后还包括洗涤步骤：

采用磷酸缓冲盐溶液对灭菌处理后的所述初始骨基体进行洗涤，并干燥。

14.一种根据权利要求1至13所述的方法制备的组织工程骨支架，所述骨支架包括具有多孔结构的骨基体及负载于所述骨基体的孔内部的细胞因子。