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CN110150458A - 一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法 - Google Patents

一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法 Download PDF

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CN110150458A
CN110150458A CN201910436161.8A CN201910436161A CN110150458A CN 110150458 A CN110150458 A CN 110150458A CN 201910436161 A CN201910436161 A CN 201910436161A CN 110150458 A CN110150458 A CN 110150458A
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black soldier
soldier flies
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fermentation
protein
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Application number
CN201910436161.8A
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叶明强
邝哲师
周鹏飞
黄静
潘木水
丘银清
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Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Original Assignee
Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
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Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，包括如下步骤，a用打浆机将新鲜黑水虻6龄活幼虫打浆均匀；b取黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕混合得发酵原料，所述的混合发酵原料混合均匀后调整湿度至含水量40％～50％；c取菌种接种到步骤b中混合发酵原料中，再加入碳源、氮源和无机盐按质量比2:1:0.1混合制成的菌种活化营养素，在28～32℃中发酵培养48～72小时，然后干燥、粉碎得到黑水虻发酵蛋白饲料。该方法进一步促进豆粕、黑水虻在畜牧水产业上的有效利用，使其成为解决我国目前蛋白质饲料资源短缺的途径之一。

Description

一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白饲料技术领域，具体为一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法。
背景技术
饲料原料尤其是蛋白质饲料资源紧缺的世界性问题。饲用蛋白源的缺乏业已成为制约我国饲料工业及畜牧、水产业发展的重要因素。因此只有通过开发新型蛋白源产品，改变饲料行业对几种蛋白饲料过分依赖的现状，进一步拓展蛋白饲料的来源，改善现有蛋白饲料中限制性因素，才能维系养殖业的稳定、健康和可持续发展。因此，复合蛋白饲料的优质化必将成为未来饲料行业发展的一大趋势，而微生物混合发酵恰恰为改变蛋白原料的单一性、粗放性提供了一种科学、可行的方法。
目前，我国在微生物固体发酵动植物蛋白方面研究的越来越多，昆虫蛋白饲料也有零星报道，而针对黑水虻发酵蛋白饲料研究在国内外也鲜有相关报道。微生物固态发酵的研究主要集中在上世纪90年代，重点在筛选高效脱毒菌株及工艺优化方面。随着科技的发展，微生物固态发酵饲料的营养价值和经济效益在试验中不断得到证实，避免了化学添加剂和物理法处理复合蛋白饲料所带来的弊端，如对蛋白功能性质以及适口性的影响。微生物发酵产生的各种消化酶、氨基酸、维生素等也大大提高了昆虫蛋白饲料的营养价值，同时微生物发酵复合蛋白饲料还可得到具有生理活性的抗菌肽、提高保健物质的生物活性，采用适当的加工工艺，能使得发酵产物中存有一定数量的益生菌，用于改善动物肠道微生态环境，对动物自身的健康和营养有很大作用。
豆粕是我国畜牧业中来源最广泛的蛋白饲料资源，限制其应用的原因是其含有的抗营养因子，黑水虻蛋白的限制性因素主要是本身的异味和几丁质，它会影响饲料本身的适口性及消化率，从而降低动物的采食量，如何将黑水虻幼虫和豆粕进行微生物固体发酵法以高营养、低毒素、低抗营养因子、无异味等优点制成蛋白饲料是一个具有研究价值的方法，为此我们提出一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.用打浆机将新鲜黑水虻6龄活幼虫打浆均匀；
b.取黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕混合得发酵原料，所述的混合发酵原料混合均匀后调整湿度至含水量40％～50％；
c.取菌种接种到步骤b中混合发酵原料中，再加入碳源、氮源和无机盐混合均匀，在28～32℃中发酵培养48～72小时，然后干燥、粉碎得到黑水虻发酵蛋白饲料。
优选的一种实施案例，步骤b中，所述黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕的重量比在10﹕9～11﹕8范围内,其中黑水虻6龄幼虫虫浆的含水率为65％～70％，豆粕的蛋白含量为46％、含水率为10％左右。
优选的一种实施案例，步骤c中，所述菌种采用枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌和乳酸菌的混合，并以菌种液形式接种至混合发酵原料中，所述发酵培养采用需氧发酵方式。
优选的一种实施案例，所述菌种液为含有枯草芽孢杆菌的培养液、含有啤酒酵母菌的培养液和含有乳酸菌的培养液按重量比1﹕1﹕2～2﹕1﹕2混合，且菌种液的接种量为混合发酵原料总重量的5～8％。
优选的一种实施案例，所述含有枯草芽孢杆菌的培养液通过以下步骤来制备：取枯草芽孢杆菌菌种接种到LB种子培养基中，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养16～24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；在液体扩大LB培养基中以液体扩大LB培养基总重量的1～5％的接种量接种种子液，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养20～28小时；所述的LB培养基和液体扩大LB培养基均按重量百分比含有：0.5％～1％氯化钠、1％葡萄糖、1％蛋白胨和0.5％酵母膏，自然pH，经过120～125℃湿热灭菌25min；所述的枯草芽孢杆菌菌种的接种量为3株。
优选的一种实施案例，所述含有啤酒酵母菌的培养液通过以下步骤来制备：取啤酒酵母菌菌种接种到麦芽汁种子培养基中，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养16～24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；在麦芽汁培养基中以接种量为麦芽汁培养基总重量的1～5％接种种子液，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养20－28小时；所述的麦芽汁培养基含有10％的麦芽膏粉、1.5％的琼脂和0.01％的氯霉素；所述的啤酒酵母菌菌种接种量为1株。
优选的一种实施案例，所述含有乳酸菌的培养液通过以下步骤来制备：从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于30℃～35℃温度下静止培养40～48小时，作为种子液；在液体扩大乳酸菌属培养基中以接种量为液体扩大乳酸菌属培养基总重量的1～5％接种种子液，于30℃～35℃温度下静止培养48小时；所述的乳酸菌属培养基和液体扩大乳酸菌属培养基均含有0.2％～0.4％的胰蛋白胨、0.3％～0.5％的NaCl、0.2％～0.4％的葡萄糖、0.3％的KH2PO4、0.3％的K2HPO4、0.02％的CaCl2、0.005％的MgSO4和0.2％的淀粉，PH6.5，在121℃下高压灭菌20分钟；所述的乳酸菌菌种接种量为1株。
优选的一种实施案例，步骤c中，所述碳源采用糖蜜、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和脱脂奶粉中的一种或多种，所述氮源采用酵母浸粉、蛋白胨、氨基酸粉、硫酸铵和蛋白酶中的一种或多种，所述无机盐采用磷酸氢二钠，磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、丁酸钠和腐殖酸钠中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、以豆粕和黑水虻6龄幼虫的混合物作为发酵原料，利用微生物发酵即微生物的生长代谢活动及代谢过程中产生的各种酶类对豆粕、黑水虻幼虫的营养特性进行改善。经过发酵，利用产蛋白酶的细菌或霉菌，得到具有良好功能性与营养特性的肽；
2、通过多菌种混合发酵，可以有效的去除幼虫腥味，提高饲料的适口性，复合蛋白饲料成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6～9个月，便于使用；
3、采用微生物发酵处理原料，豆粕和黑水虻幼虫的混合物，得到发酵昆虫蛋白饲料，避免了化学添加剂和物理法对蛋白功能性质的影响，发酵过程中产生的各种消化酶、中小分子蛋白、氨基酸、维生素、益生菌等也大大提高了发酵昆虫蛋白的营养价值，发酵后蛋白饲料中豆粕的抗营养因子基本得到消除，胰蛋白酶抑制因子和脲酶完全失活；
4、通过发酵处理豆粕和黑水虻幼虫的混合物，得到昆虫蛋白发酵饲料的方法，这对于解决我国畜牧水产业发展中优质蛋白质源紧缺的问题提供了重要的理论依据和技术支持。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)由5g氯化钠、10g葡萄糖、10g蛋白胨和5g酵母膏加水定容至1L，自然PH，经过120～125℃湿热灭菌25min后制成的LB液体培养基，倒入无菌三角瓶中，制成枯草芽孢杆菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由2g的胰蛋白胨、5g的NaCl、2g的葡萄糖、3g的KH2PO4、3g的K2HPO4、0.2g的CaCl2、0.05g的MgSO4和2g的淀粉混合加水定容至1L，PH6.5，在121℃下高压灭菌20分钟后制成的乳酸菌属培养基，倒入无菌三角瓶中，制成乳酸菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由100克麦芽膏粉、15g琼脂和0.1克氯霉素混合加水定容至1L，PH6.0，125℃下高压灭菌20分钟后制成的麦芽汁培养基，倒入无菌三角瓶中，制成酵母菌种子液体培养基和液体扩大培养基；
(2)取原始出发菌种枯草杆菌属枯草芽孢杆菌3株和酵母菌属啤酒酵母菌1株，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，分别于37℃和30℃温度下，170rpm摇床培养16小时和24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；从原始出发菌种乳酸菌属乳酸菌1株，接种到乳酸菌属培养基中，于35℃温度下静止培养48小时，作为种子液；
(3)在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中分别以重量为培养基总重量的5％的接种量接种种子液，分别于37℃和30℃温度下，170rpm，分别摇床培养20和28小时得枯草芽孢杆菌发酵培养液和啤酒酵母菌发酵培养液；在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以重量为培养基总重量的5％的接种量接种种子液，于35℃温度下静止发酵培养48小时得乳酸菌发酵培养液；将枯草芽孢杆菌发酵培养液、啤酒酵母菌发酵培养液、乳酸菌的菌株发酵培养液按1﹕1﹕2比例混合均匀，作为发酵用的菌种液；
(4)用打浆机将新鲜黑水虻6龄活幼虫打浆均匀，取黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕按重量比10﹕9混合得发酵原料，将混合发酵原料混合均匀后调整湿度至含水量45％～50％，将步骤(3)中发酵用的菌种液以重量为混合发酵原料总重量5％的接种量接种混合发酵原料中，再以重量为混合发酵原料总重量1％的糖蜜、0.5％的硫酸铵、0.05％的磷酸二氢钾混合制成的菌种活化营养素加入混合发酵原料中，并混合均匀(初始pH值为6.0)，于35℃温度下需氧发酵72小时，然后于60℃下干燥、粉碎制样；
(5)对发酵前后复合蛋白进行营养成分分析。
常规营养成分分析
由下表1可以看出：发酵混合原料经过发酵后，粗蛋白提高了5.36％，无氮浸出物降低了16.62％，水溶性蛋白质提高了2.55倍，中小分子蛋白提高了5.50倍。
表1昆虫蛋白饲料发酵前后常规营养成分含量
抗营养因子
由表2可以看出，胰蛋白酶抑制因子和脲酶完全被降解，植酸磷含量也降低了48.84％，发酵物样的腥味完全消失。
表2黑水虻蛋白饲料发酵前后各因素含量
氨基酸分析
由表3可得出：经过发酵以后的昆虫蛋白饲料，总氨基酸提高了4.65％，各种氨基酸都有不同程度的提高。
表3黑水虻蛋白饲料发酵前后氨基酸含量变化
(6)发酵黑水虻幼虫蛋白饲料成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6～9个月，可作为猪、鸡、鱼等的饲料、
实施例二
本发明提供一种技术方案：一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)由5g氯化钠、10g葡萄糖、10g蛋白胨和5g酵母膏加水定容至1L，自然PH，经过120～125℃湿热灭菌25min后制成的LB液体培养基，倒入无菌三角瓶中，制成枯草芽孢杆菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由2g的胰蛋白胨、5g的NaCl、2g的葡萄糖、3g的KH2PO4、3g的K2HPO4、0.2g的CaCl2、0.05g的MgSO4和2g的淀粉混合加水定容至1L，PH6.5，在121℃下高压灭菌20分钟后制成的乳酸菌属培养基，倒入无菌三角瓶中，制成乳酸菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由100克麦芽膏粉、15g琼脂和0.1克氯霉素混合加水定容至1L，PH6.0，125℃下高压灭菌20分钟后制成的麦芽汁培养基，倒入无菌三角瓶中，制成酵母菌种子液体培养基和液体扩大培养基；
(2)取原始出发菌种枯草杆菌属枯草芽孢杆菌3株和酵母菌属啤酒酵母菌1株，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，分别于37℃和30℃温度下，170rpm摇床培养16小时和24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；从原始出发菌种乳酸菌属乳酸菌1株，接种到乳酸菌属培养基中，于35℃温度下静止培养48小时，作为种子液；
(3)在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中分别以重量为培养基总重量的5％的接种量接种种子液，分别于37℃和30℃温度下，170rpm，分别摇床培养20和28小时得枯草芽孢杆菌发酵培养液和啤酒酵母菌发酵培养液；在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以重量为培养基总重量的5％的接种量接种种子液，于35℃温度下静止发酵培养48小时得乳酸菌发酵培养液；将枯草芽孢杆菌发酵培养液、啤酒酵母菌发酵培养液、乳酸菌的菌株发酵培养液按2﹕1﹕2比例混合均匀，作为发酵用的菌种液；
(4)用打浆机将新鲜黑水虻6龄活幼虫打浆均匀，取黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕按重量比11﹕8混合得发酵原料，将混合发酵原料混合均匀后调整湿度至含水量45％～50％，将步骤(3)中发酵用的菌种液以重量为混合发酵原料总重量5％的接种量接种混合发酵原料中，碳源、氮源和无机盐分别为糖蜜、硫酸铵和磷酸二氢钾，并以重量为混合发酵原料总重量1％的糖蜜、0.5％的硫酸铵、0.05％的磷酸二氢钾混合制成的菌种活化营养素加入混合发酵原料中，并混合均匀(初始pH值为6.0)，于35℃温度下需氧发酵72小时，然后于60℃下干燥、粉碎制样；
(5)将发酵黑水虻幼虫蛋白饲料成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6～9个月，可作为猪、鸡、鱼等的饲料
混合原料经过发酵后，粗蛋白提高了6.32％，无氮浸出物降低了17.32％，水溶性蛋白质提高了4.21倍，中小分子蛋白提高了6.32倍。胰蛋白酶抑制因子和脲酶完全被降解，植酸磷含量也降低了55.23％，腥味也完全消失。经过发酵以后的昆虫蛋白饲料，总氨基酸提高了7.68％，所有检测出的氨基酸都有不同程度的提高。复合原料发酵后，蛋白质得到了有效的降解，还含有丰富的维生素、益生菌及未知生长因子，营养价值大大得到了提高。
以发酵黑水虻幼虫蛋白为原料，进行了笋壳鱼饲料的研制，并开展了其代替冰鲜杂鱼对笋壳鱼生长性能及成本的研究，选择10克左右的笋壳鱼育苗600尾开展试验，共进行了5组试验，每组3个重复，试验鱼暂养7天，待鱼体适应环境后，将其分组随机放入预先放有网箱的池塘中，每天下午17:00按鱼体重的约5％各投饵1次，根据天气变化和鱼的采食情况适当调整投饵量。预试期7天，正式期90天，试验期开始、30天、60天和结束时各称重一次，统计平均日增重、相对增重率、特定生长率、蛋白质效率、饲料系数、成活率等。
结果(见表4)表明：添加特种鱼饲料后相对增重率均得到提高，幅度为2.88％-17.31％，且随着替代冰鲜杂鱼量的增加而增大。以上结果表明用发酵黑水虻蛋白制备特种鱼饲料用于笋壳鱼的养殖可显著降低其生产成本，提高经济效益。
表4发酵黑水虻蛋白饲料对笋壳鱼生长性能的影响
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.用打浆机将新鲜黑水虻6龄活幼虫打浆均匀；
b.取黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕混合得发酵原料，所述的混合发酵原料混合均匀后调整湿度至含水量40％～50％；
c.取菌种接种到步骤b中混合发酵原料中，再加入碳源、氮源和无机盐按质量比2:1:0.1混合制成的菌种活化营养素，在28～32℃中发酵培养48～72小时，然后干燥、粉碎得到黑水虻发酵蛋白饲料。
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：步骤b中，所述黑水虻6龄幼虫虫浆和豆粕的重量比在10﹕9～11﹕8范围内,其中黑水虻6龄幼虫虫浆的含水率为65％～70％，豆粕的蛋白含量为46％、含水率为10％左右。
3.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：步骤c中，所述菌种采用枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌和乳酸菌的混合，并以菌种液形式接种至混合发酵原料中，所述发酵培养采用需氧发酵方式。
4.根据权利要求3所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：所述菌种液为含有枯草芽孢杆菌的培养液、含有啤酒酵母菌的培养液和含有乳酸菌的培养液按重量比1﹕1﹕2～2﹕1﹕2混合，且菌种液的接种量为混合发酵原料总重量的5～8％。
5.根据权利要求4所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：所述含有枯草芽孢杆菌的培养液通过以下步骤来制备：取枯草芽孢杆菌菌种接种到LB种子培养基中，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养16～24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；在液体扩大LB培养基中以液体扩大LB培养基总重量的1～5％的接种量接种种子液，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养20～28小时；所述的LB培养基和液体扩大LB培养基均按重量百分比含有：0.5％～1％氯化钠、1％葡萄糖、1％蛋白胨和0.5％酵母膏，自然pH，经过120～125℃湿热灭菌25min；所述的枯草芽孢杆菌菌种的接种量为3株。
6.根据权利要求4所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：所述含有啤酒酵母菌的培养液通过以下步骤来制备：取啤酒酵母菌菌种接种到麦芽汁种子培养基中，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养16～24小时后，直到OD600＝0.7～0.9，停止培养，作为种子液；在麦芽汁培养基中以接种量为麦芽汁培养基总重量的1～5％接种种子液，于30℃～37℃温度下，150～170rpm，摇床培养20－28小时；所述的麦芽汁培养基含有10％的麦芽膏粉、1.5％的琼脂和0.01％的氯霉素；所述的啤酒酵母菌菌种接种量为1株。
7.根据权利要求4所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：所述含有乳酸菌的培养液通过以下步骤来制备：从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于30℃～35℃温度下静止培养40～48小时，作为种子液；在液体扩大乳酸菌属培养基中以接种量为液体扩大乳酸菌属培养基总重量的1～5％接种种子液，于30℃～35℃温度下静止培养48小时；所述的乳酸菌属培养基和液体扩大乳酸菌属培养基均含有0.2％～0.4％的胰蛋白胨、0.3％～0.5％的NaCl、0.2％～0.4％的葡萄糖、0.3％的KH2PO4、0.3％的K2HPO4、0.02％的CaCl2、0.005％的MgSO4和0.2％的淀粉，PH6.5，在121℃下高压灭菌20分钟；所述的乳酸菌菌种接种量为1株。
8.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法，其特征在于：步骤c中，所述碳源采用糖蜜、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和脱脂奶粉中的一种或多种，所述氮源采用酵母浸粉、蛋白胨、氨基酸粉、硫酸铵和蛋白酶中的一种或多种，所述无机盐采用磷酸氢二钠，磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、丁酸钠和腐殖酸钠中的一种或多种。
CN201910436161.8A 2019-05-23 2019-05-23 一种利用微生物发酵黑水虻幼虫制备饲料蛋白的方法 Pending CN110150458A (zh)

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