CN110124018B

CN110124018B - 一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用

Info

Publication number: CN110124018B
Application number: CN201810135140.8A
Authority: CN
Inventors: 陈钧; 康婷; 黄宇坤; 朱倩倩; 陈雨
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN110124018A

Abstract

本发明属于疫苗领域，涉及一种仿生的纳米疫苗制剂，具体涉及一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙‑脂质纳米疫苗及其应用。所述疫苗内层的磷酸钙是高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。本纳米疫苗制剂能克服传统肿瘤疫苗的诸多局限，其核心优势在于高度的整合能力，将3种活性成分天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白(CM)，α螺旋修饰的热休克蛋白HSP70活性肽段(αHSP70p)，佐剂寡聚核苷酸(CpG)包载入磷酸钙纳米粒(CaP)，同时递送至抗原提呈细胞，从而激活固有免疫与适应性免疫。具有较高潜在应用价值与临床转化前景。

Description

一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用

技术领域

本发明属于疫苗领域，涉及一种仿生的纳米疫苗制剂，具体涉及一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，尤其是一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用。所述疫苗内层的磷酸钙是能够高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层的脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能够负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。

背景技术

资料显示，恶性肿瘤是威胁人类健康的头号杀手，常规的治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗，但实践显示所属的治疗方案均效果有限，其根本原因在于无法抑制肿瘤在体内的转移和复发，同时在治疗过程中具有多种毒副作用。有研究报道了免疫治疗作为一种新型的抗肿瘤治疗方式，能够刺激机体自身的免疫系统实现对肿瘤细胞的有效清除，为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。2011年以来，肿瘤的免疫治疗经过了一个快速发展的阶段，2013年Science杂志也将肿瘤的免疫疗法列为科技十大突破，免疫检查点抑制剂PD/PDL-1抗体针对恶性黑色素瘤的效果亦取得了令人瞩目的效果，显著提高了患者的生存时间；然而，免疫检查点抑制剂疗法面临了治疗响应率低的问题，其中很大部分原因是肿瘤微环境中肿瘤突变负荷不足导致的免疫细胞的浸润偏少，因此，借助于其他方式来构建新的综合治疗手段对于提高检查点阻断治疗的临床效果显得尤为重要。

肿瘤疫苗是目前检查点阻断治疗的协同治疗的首选方案。肿瘤疫苗通过直接刺激树突状免疫细胞，能够潜在地活化外周的CD4+/CD8+的T细胞等在肿瘤部位的浸润，从而在上游激活潜在的人体的免疫功能。理想状态下，疫苗激起的CD8+T细胞具有很好的活性，能够识别肿瘤细胞上的多肽-MHCⅠ类抗原肽复合物，针对肿瘤细胞的特异性标志物有更好的识别。但其设计是非常挑战的工作，包括三方面需要考虑的因素：(1)选择合适的肿瘤相关抗原，旨在引起特异性T细胞的应答；(2)选择一种合适的免疫刺激佐剂，旨在激活模式识别受体来增强固有免疫；(3)同时将抗原与佐剂高效递送进入同一个树突状细胞中。实践显示，单一抗原成分的肿瘤疫苗最容易实现临床转化，已有许多正在进行的临床试验，但因为肿瘤的高度异质性和免疫抵抗的影响，尚未实现突破；近年来研制的个性化肿瘤疫苗更多的关注肿瘤异质性和抗原的差异性，取得了一些良好的效果，例如Ott,P.A.等通过计算机算法及实验室高通量测序，筛选出了病人自身的20种新生抗原，以此制备的20种多肽及佐剂的混合物激发了病人强有力的免疫反应，初步证明了基于癌症的个性化肿瘤疫苗可行性；但该方法面临一些缺陷，例如制备过程比较繁琐，游离混合物成分入胞效率较低等。虽然肿瘤裂解物体外刺激树突状细胞肿瘤疫苗Provenge已经被批准用于前列腺癌的治疗，但是受限于肿瘤裂解物中复杂的成分以及免疫耐受问题，效果仍旧有待改进，所以肿瘤疫苗的研发是一个亟待解决的问题。

近年来研究逐渐揭示了肿瘤细胞的亚细胞成分具有各自的免疫原性，例如细胞核，细胞质以及细胞膜成分等；首先，某些肿瘤中，例如黑色素瘤，细胞膜中含有大量的肿瘤相关的抗原(TumorAssociatedAntigens，TAA)，可以利用其作为一种潜在有效的抗原材料，而来源于患者自身的肿瘤细胞膜可能是精准治疗的理想材料之一，但是天然的肿瘤细胞膜成分不足以有效激活树突状细胞，添加合适的免疫佐剂成分是发挥治疗作用的关键。有研究发现在低剂量的化疗、放疗以及环境的剧烈变化能够介导肿瘤细胞的坏死(necrosis)，从而释放出大量的具有强烈免疫原性的物质——危险信号分子(danger associatedmolecular patterns,DAMP)，例如热休克蛋白、GRP78BiP，以及钙网蛋白等，可以作为新的免疫佐剂材料。热休克蛋白HSP70是一类分子量在70kDa左右的热应激蛋白质，除了具有分子伴侣的功能外，已在多种肿瘤中发现其表达，并且诱导和增强机体抗肿瘤免疫反应；HSP70具有的特殊结构能够与多肽形成复合物，与抗原递呈细胞表面相关受体结合，同时激发固有免疫和特异性免疫；用于粒细胞性白血病治疗的相关临床试验正进行，但从病人体内分离出的天然HSP70多肽复合物技术复杂，提取效率低下，制备难度较高。

基于现有技术的现状；本申请的发明人拟提供一种“人工模拟的坏死肿瘤细胞”的纳米递药平台，具体涉及一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，所述纳米递药平台可同时将肿瘤细胞膜蛋白以及HSP70活性肽段递送至树突状细胞内，将潜在地更好地激活人体的固有免疫和适应性免疫。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状和基础，提供一种具有核壳结构的磷酸钙-脂质纳米颗粒，尤其是一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用。

本发明提供一种基于仿生学原理设计的“人工模拟的坏死肿瘤细胞”的纳米颗粒(αHSP70p-CM-CaP)，人工脂质材料中负载天然的多价肿瘤抗原蛋白以及HSP70活性肽段(佐剂)，以磷酸钙为材料制备纳米粒作为内核并包载另一种佐剂寡聚核苷酸CpG ODN：一方面利用肿瘤细胞膜蛋白中的新生抗原成分，引起抗肿瘤特异性免疫；另一方面利用寡聚核苷酸CpG和αHSP70p两种佐剂成分，激活人体的固有免疫功能，综合发挥抗肿瘤的作用。本发明的“人工模拟的坏死肿瘤细胞”(αHSP70p-CM-CaP)纳米颗粒将克服传统肿瘤疫苗面临的诸多局限，其核心优势在于高度的整合能力，将3种活性成分天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白(CM)，α螺旋修饰的热休克蛋白HSP70活性肽段(αHSP70p)，佐剂寡聚核苷酸(CpG)包载入磷酸钙纳米粒(CaP)，同时递送至抗原提呈细胞，从而激活固有免疫与适应性免疫。

具体的，本发明提供了一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，所述疫苗内层的磷酸钙是能够高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒；外层的脂质结构是高度模拟细胞膜流动性的材料，能够负载天然的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段；本发明中，将天然来源的肿瘤细胞膜蛋白和α螺旋修饰的HSP70活性肽段结合至一种人工构建的流动的脂质膜材料中，内部的磷酸钙纳米颗粒高效包载寡聚核苷酸CpG。

本发明所采用磷酸钙构建纳米粒内核，包载寡聚核苷酸类药物CpG具有较高的稳定性和包载效率；其制备方法为反相微乳法，该方法用于包载siRNA类，制备的纳米粒均匀分散至油相中，具有一定的缓释效果。

本发明所采用的佐剂成分非甲基化寡聚脱氧核苷酸(简称CpG ODN)，是一类人工合成的具有免疫刺激作用的含非甲基化的CpG寡聚核苷酸的DNA序列；CpG ODN通过与Toll样受体-9(TLR9)结合，可直接激活B细胞和树突细胞引起直接的Th1型免疫反应(CpG ODN作为疫苗的免疫佐剂获得了普遍的认可，将实现其商业化应用)，将其包载于上述纳米载体中，能够实现一定的缓释作用，还能够与αHSP70p活性肽段实现协同效应，共同被树突状细胞有效摄取。

本发明所采用的粒子构建方法具体如下：①以反相微乳法制备包载CpG ODN的磷酸钙纳米粒核心，反相微乳是由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚的环己烷油相溶液中制备得到；②体外培养的B16OVA肿瘤细胞经过超速离心获取肿瘤细胞膜，通过合适的去垢剂将细胞膜蛋白溶解分离，然后进一步超速离心获取细胞膜蛋白溶液；③薄膜水化法制备外层，将预先制备的磷酸钙纳米核心、脂质膜材料共同成膜后，加入膜蛋白和αHSP70p多肽混合液进行恒温水化；从而制得自组装的磷酸钙-脂质纳米颗粒。

本发明中，所述脂质材料包括一类胆碱磷酸结构的脂质和胆固醇，按照一定比例添加，即DPPC：DSPC：DOPC：胆固醇为5:1:3:1。

所述αHSP70活性多肽的序列为：

AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-TKDNNLLGRFELSG，添加一段α螺旋序列AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD能增强生物材料佐剂HSP70p活性肽段在人工脂质材料中的稳定性和载药量，可采用人工合成的方式构建。

本发明中，所述磷酸钙构建的纳米粒内核和脂质层通过疏水作用相结合，形成核壳结构的纳米级仿生粒子；

所述磷酸钙纳米内核平均粒径为30-40nm，粒子最终粒径为50nm左右，相比于微米尺度的细胞，比表面积较大，能更高效地发挥膜结构的作用。

本发明采用多种体内外技术和评价方法，以小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)为模型评价其体外诱导DC细胞的入胞特性和诱导其成熟功能，采用成像流式技术定量评价抗原-MHC复合物的表达情况，上述两种评价方法均为本领域公认且熟知。

本发明描述了该药物递释系统的制备方案，并提供了该系统体内外免疫激活的结果以及药效学评价。

本发明通过采用小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)作为模型，评价制剂在树突状细胞的摄取和诱导其成熟的功能，并且能够显著诱导体内Th1型细胞免疫；流式实验结果证明该制剂能够显著提高小鼠体内IFNγ+的特异性CD8+T细胞含量；肺转移模型裸鼠活体成像实验证明，该制剂能够特异性地蓄积至引流淋巴结；体内药效学评价监测显示，相比于游离混合物，该递药系统能够显著抑制转移病灶的形成；制剂免疫过后能够显著提升记忆性T细胞的含量；与PD-1抗体联合应用，显著抑制皮下瘤的进展，治疗结束后能够检测到大量效应型记忆T细胞的存在，综合结果证明，本发明所述的仿生的纳米疫苗制剂具有显著的抗肿瘤效果，并且有效防止肿瘤的复发。

本发明中，制备的αHSP70p-CM-CaP粒径在30nm左右，体外能够有效激活小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的成熟以及促进抗原的提呈；小动物活体成像试验显示，皮下注射的纳米颗粒在小鼠体内选择性蓄积于引流淋巴结内，维持时间超过24小时；致敏实验中，小鼠体内检测到识别多种抗原成分的T细胞以及杀伤性T细胞；肺转移以及皮下瘤药效模型评价结果显示了αHSP70p-CM-CaP与PD-1单抗联合治疗方案具有明显抑制效果，且治疗结束后一段时间持续监测到记忆性T细胞的存在。进一步，明所述疫苗可与PD-1抗体联合应用，并且具有较高的临床转化前景。

本发明所述的仿生粒子平台在抗肿瘤免疫治疗方面具有其独特的优势：

①富集细胞膜上具有高度免疫原性的肿瘤相关抗原，搭建精准治疗的纳米递药平台；②采用一种α螺旋肽融合技术构建αHSP70p，提高脂质膜结构对HSP70多肽的负载能力，从而实现对两种免疫佐剂的协同性Th1应答；③磷酸钙分子能够与CpG ODN的DNA骨架成分高度结合，提升了磷酸钙纳米颗粒对CpG ODN的包载能力；④纳米颗粒尺寸效应明显，平均50nm左右的粒径能够提高粒子在树突状细胞上的摄取效率，并且实现多种活性成分在同一个树突状细胞上的递送。

附图说明

图1.αHSP70p-CM-CaP的表征，其中，

(A)磷酸钙-脂质纳米颗粒(αHSP70p-CM-CaP)模式图，其中的人工脂质膜结构是一类胆碱磷酸结构的脂质和胆固醇，按照一定比例添加，即DPPC：DSPC：DOPC：胆固醇为5:1:3:1；

(B)四种纳米颗粒的透射电镜照片，其中(a)人工脂质膜包覆的磷酸钙纳米颗粒对照组(不含CM与αHSP70p)，称为LCP，(b)αHSP70p-CM-CaP，(c)包载了CM的人工脂质膜包覆的磷酸钙纳米颗粒对照组(CM-CaP)，(d)B16OVA肿瘤细胞膜囊泡对照组(CMV)；

(C)溶液中测定的四种纳米颗粒LCP，αHSP70p-CM-CaP，CM-CaP，CMV的粒径与zeta电势；

(D)处方优化实验，αHSP70p，CM，以及CpG按照不同比例添加到纳米制剂颗粒，以最终几种活性成分的包封率(％)作为评价指标(n＝3)，选择最优作为后续实验处方；

(E)考马斯亮蓝染色实验结果；

(F)几种关键的免疫激活分子的Westernblot结果。

图2.αHSP70p-CM-CaP诱导BMDC成熟以及促进抗原的提呈功能，其中，

(A)αHSP70p-CM-CaP对BMDC成熟的体外诱导效果；

(B)图A中的几类细胞的定量分析结果；

(C)αHSP70p-CM-CaP对于BMDC细胞的抗原呈递激活作用；

(D，E)图C中的BMDC表面的MHC-抗原肽复合物(SIINFEKL-H-2K_b，红色)的信号定量分析结果，图中所示为荧光图与半定量分析，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，具有显著性差异，***p<0.001。

图3.纳米颗粒在小鼠体内引流淋巴结内的选择性蓄积以及对于不同表型的T细胞的致敏作用，其中，

(A)小动物活体成像实验结果：(a)αHSP70p-CM-CaP-Cy5，(b)αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP；

(B)αHSP70p-CM-CaP纳米颗粒对于识别不同抗原表型的CD8⁺T细胞的激活作用；

(C)图B中CD8⁺T细胞的激活作用的定量分析结果，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，与注射αHSP70p-CM-CaP的小鼠相比，具有显著性差异，*p<0.05,***p<0.001。

图4.αHSP70p-CM-CaP介导C57BL/6小鼠体内适应性免疫系统的激活，其中，(A)αHSP70p-CM-CaP免疫过后的C57BL/6小鼠脾脏中的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞流式细胞图；

(B)图A中的OVA特异性的分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞测定定量结果；

(C)C57BL/6小鼠外周血中的细胞因子(IFN-γ,IL-4,IL-2,IL-10)的ELISA结果，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，与注射αHSP70p-CM-CaP的小鼠相比，具有显著性差异，**p<0.01,***p<0.001。

图5.αHSP70p-CM-CaP免疫后的小鼠体内抗肿瘤效果，其中，

(A)制剂在小鼠肺转移模型上的抑制实验结果；

(B)小鼠肺转移病灶的数量分析，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，与注射αHSP70p-CM-CaP的小鼠相比，具有显著性差异，**p<0.01,***p<0.001；

(C)图中所示为B16OVA小鼠皮下瘤模型的给药方案；

(D)治疗后的肿瘤生长曲线，数据以平均值±SD(n＝6)进行分析，与注射αHSP70p-CM-CaP+PD-1单抗的小鼠相比，具有显著性差异，***p<0.001,**p<0.01；

(E)免疫40天后的小鼠淋巴结内效应记忆性T细胞亚群(T_EM,CD3⁺CD8⁺CD62L^–CD44⁺)；

(F)图E中T_EM定量分析结果，与注射αHSP70p-CM-CaP+PD-1单抗的小鼠相比，具有显著性差异，**p<0.001。

具体实施方式

实施例1

按本发明权利要求书中的方法制备人工脂质膜包覆的磷酸钙纳米颗粒对照组(LCP)、αHSP70p-CM-CaP，包载了CM的人工脂质膜包覆的磷酸钙纳米颗粒对照组(CM-CaP)，B16OVA肿瘤细胞膜囊泡对照组(CMV)，采用马尔文粒径测定仪测定纳米粒的粒径，透射电子显微镜观察其形态；

结果显示：以包载CpG的磷酸钙纳米颗粒作为内核，外部包覆了嵌有αHSP70p多肽与细胞膜蛋白(CM)的“人工脂质膜”的纳米颗粒成功制备后分散于水溶液中，DLS结果显示LCP，αHSP70p-CM-CaP和CMV的平均粒径分别为18.7nm，31.4nm，24.7nm以及196.7nm。αHSP70p-CM-CaP与LCP相比，粒径稍有增加。LCP,αHSP70p-CM-CaP和CMV的电势为-17mV，-22mV，和-32.3mV。

电镜图显示聚合物纳米粒表面覆盖了一层脂质成分，表明αHSP70p-CM-CaP构建成功。四种纳米粒大小均一，形态圆整；

采用不同的染料NHS-荧光素，FITC，Cy5分别标记CM，αHSP70p以及CpG后，测定3种活性成分的包封率后，得到最优处方αHSP70p：CM：CpG为5:50:2重量比的时候三种活性成分包封率分别为31.4％,42.5％,35.6％；

将B16OVA肿瘤细胞、CMV，CM，以及αHSP70p-CM-CaP几组样品采用等量上样，电泳结束后采用考马斯亮蓝染色液进行处理，聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)显示几组样品的蛋白印迹基本一致，表明细胞膜蛋白成功转移到了纳米制剂表面；

Western blot结果显示，人恶性黑素瘤相关抗原(gp100),黑素细胞酪氨酸酶相关蛋白-2(Trp-2)，分子伴侣(GRP78BiP,钙网织蛋白)等关键免疫激活分子在B16OVA细胞上，CMV，CM，以及αHSP70p-CM-CaP几种样品上完整保留。

实施例2

小鼠体内提取未成熟的BMDC以1×10⁶细胞的密度接种于12孔板中37℃培养7天，并隔天换液。随后细胞培养液用含有100ng的αHSP70p，40ng/mL的CpG以及1μg/mL的CM混合溶液以及0.5μg/mL的LPS溶液分别作为阴性与阳性对照组，孵育时间分别为12,24以及48小时，37℃。随后，将BMDC在室温下孵育CD16抗体，随后在冰上孵育CD11c,CD80,CD86以及MHCII抗体，细胞用PBS洗一遍之后采用流式细胞实验对CD11c+CD80+,CD11c+CD86+,CD11c+MHCⅡ+细胞进行分析。为了进一步验证BMDC的抗原呈递功能，各组制剂孵育过后的BMDC用SIINFEKL/H-2K^b抗体孵育，采用同上的处理方案进行分析；

结果显示：图2A，与CM-CaP相比，孵育了αHSP70p-CM-CaP的BMDC表面CD80，CD86分子，MHCII分子的表达量显著提升，说明αHSP70p-CM-CaP能够显著性地提高BMDC细胞的成熟，在B中的定量结果也同样证明该结论。图B中所示，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，***代表p<0.001,**代表p<0.01,*代表p<0.05；

为了进一步证明OVA抗原成分是否被呈递，采用荧光单克隆抗体APC-25-D1.16标记SIINFEKL-H-2K^b复合物，图2C中所示为成像流式结果，BMDC与荧光素Fluorescein(绿色)标记的几组试剂αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP,CM_{(Fluorescein)}V以及游离的CM_{(Fluorescein)}+CpG孵育48小时之后，不同组分对于BMDC表面的MHC-抗原肽复合物(SIINFEKL-H-2K_b，红色)的表达诱导作用。孵育了αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP的试剂的BMDC细胞中Fluorescein和APC信号最强，2D中定量结果显示,与CM_{(Fluorescein)}-CaP,CM_{(Fluorescein)}V,以及游离的CM_{(Fluorescein)}+CpG成分相比，αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP诱导的BMDC复合物荧光强度使得各自提高了62.3％,128％,and 116％。说明由于活性成分的包载使得纳米制剂的摄取加强，且MHC-抗原肽复合物表达最高；

实验结果表明，模拟坏死肿瘤细胞的蛋白与多肽活性成分均能显著增强纳米颗粒的摄取与刺激BMDC的成熟。

实施例3

小动物活体成像试验中，C57BL/6小鼠随机分为两组，一组预先在C57BL/6小鼠尾部皮下进行接种纳米颗粒αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP(平均每只按照25ngαHSP70p,250ngCM,10ng CpG的量进行给药)，另外一组预先在小鼠尾部皮下进行接种纳米颗粒αHSP70p-CM-CaP-Cy5。在小动物活体成像系统中对荧光信号进行检测，对于体外研究，将小鼠淋巴结分离出，进行拍照；

结果显示：如图3所示,小鼠分别注射αHSP70p-CM_{(Fluorescein)}-CaP以及αHSP70p-CM-CaP-Cy56小时之后在引流淋巴结中出现信号，24小时之后信号明显增强，说明纳米颗粒可以显著延长CM与CpG活性成分在淋巴系统中的蓄积时间，而注射了游离活性成分的制剂组在两个时间段内均没有探测到明显信号。分别在6，24小时之后将淋巴结取出进行半定量分析，结果显示肿瘤抗原成分与CpG的荧光信号值在淋巴结内含量在24小时内显著高于6小时。

实施例4

T细胞体内致敏实验中，C57BL/6小鼠皮下接种等量的HSP70p-CM-CaP，游离CM+CpG,LCP,CM-CaP,CMV以及PBS 3次。取动物外周血用流式细胞仪结果分析PE-H-2K^b OVA和PE-H-2K^b Trp2四聚体标记的各种亚型的CD8α⁺T细胞数量；

结果显示：αHSP70p-CM-CaP以及CM-CaP免疫过后的小鼠体内的OVA和Trp2特异性的CD8⁺T细胞含量显著高于CMV组，LCP组和游离组免疫过后的小鼠，说明同时递送CM与CpG至淋巴系统能够激活适应性免疫，特异性T细胞含量增加，其中，免疫αHSP70p-CM-CaP后的小鼠体内OVA特异性的T细胞含量是游离组的5倍，而Trp-2特异性的T细胞含量是游离组的7.2倍，αHSP70p-CM-CaP大幅提高了DC细胞的抗原提呈功能，进而高效激活了后续的适应性免疫。

实施例5

OVA特异性杀伤性T细胞激活实验中，取出各组制剂免疫后的C57BL/6小鼠肾脏中的T细胞，按照1×10⁶个/孔的密度接种于孔板中，孵育20μM抗原OVA多肽24小时后，进一步用含有BFA的摄取抑制剂进行孵育6小时，之后使用CD3e-Percp-Cy5.5抗体进行标记，测定OVA特异性的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞含量(每只小鼠按照约25ng的αHSP70p,250ng的CM,10ng的CpG进行给药)。取同一只小鼠的血液，采用ELISA方法进行处理，检测IFN-γ,IL-4,IL-2,IL-10的含量；

结果显示：接种了αHSP70p-CM-CaP的C57BL/6小鼠体内直接测得分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞含量是游离CM+CpG溶液组,CM-CaP组和LCP组的5.51,0.37和10.29倍。说明T细胞分泌IFN-γ的能力在抗原、αHSP70p与CpG三者同时递送的情况下最为强烈，间接证明了αHSP70p的包载对于整体杀伤效果的激活存在一定的促进作用。下游杀伤性T细胞的活化离不开辅助型Th1与Th2型细胞，几种细胞因子分泌水平能够反映辅助型T细胞的激活水平，实验显示，αHSP70p-CM-CaP免疫过后的小鼠IL-2与IFN-γ水平分别是PBS组的3.9和123倍，而IL-10和IL-4水平与PBS组相比未有明显区别，说明该纳米颗粒是通过引发Th1型反应促进下游杀伤性T细胞的分化，CM-CaP免疫过后的小鼠体内IL-2与IFN-γ的分泌水平强于游离CM+CpG，表明CM与CpG的联合递送能够一定程度上诱发Th1型免疫反应。

实施例6

在肿瘤转移病灶模型上的评价试验中，20天内使用各组制剂免疫小鼠3次(每只小鼠按照约25ng的αHSP70p,250ng的CM,10ng的CpG进行给药)。20天后，每只小鼠按照5×10⁵个B16OVA细胞进行注射，建立小鼠肺转移模型中的转移病灶模型。再20天后取小鼠肺部进行观察，检测肺转移病灶的数量。为了评价疫苗与PD-1的联合治疗性效果，在小鼠皮下瘤抑制实验中，在第0天，预先皮下注射2×10⁵个B16OVA细胞，之后采用相同制剂和给药量分别在第10,17,23天免疫小鼠3次，每次免疫过后注射PD-1抗体(每只小鼠给予100μg)，隔天记录肿瘤的大小，采用游标卡尺测量，并且计算瘤体大小：

结果显示：如图5A所示，小鼠肺转移实验中，αHSP70p-CM-CaP与CM-CaP免疫过后的小鼠再次接受肿瘤细胞注射，仅有微量的转移病灶生成，而其他PBS组，游离制剂组，CMV组以及LCP组都有肉眼可见的转移灶，说明这两种制剂均可能能够抑制小鼠肺转移病灶的形成，通过人工计数后发现αHSP70p-CM-CaP效果更优于CM-CaP组，病灶数量降低了77％。说明αHSP70p的载带能够明显抑制最终转移病灶的形成，这种模拟坏死信号的思路为肿瘤的预防提供了新的途径，显示了治疗的优越性，本实验继续采用皮下瘤治疗模型小鼠衡量制剂的治疗性效果，如图5D所示，游离制剂组相比较于PBS组不能明显减缓肿瘤的增长，联合PD-1抗体进行治疗后，最终游离组+PD-1单抗组合能够降低46.2％的肿瘤生长，尤其是，αHSP70p-CM-CaP与PD-1单抗联合治疗后，肿瘤抑制率为89％。该结果很好的说明了该仿生纳米制剂对于黑色素瘤具有很强的抑制作用。

实施例7

记忆性T细胞生成的检测试验中，PD-1单抗联合治疗试验结束40天后，取小鼠淋巴结，细胞滤膜上轻轻研磨以去除结缔组织，PBS洗涤之后提取淋巴细胞，通过anti-CD3e-Percp-Cy5.5(eBioscience,48-0031-82),anti-CD8a-Alexa

647(Biolegend,100724),anti-CD44-FITC(ebioscience,11-0441-82)以及anti-CD62L(L-Selectin)-PE(ebioscience,12-0621-82)抗体进行孵育和标记，流式细胞仪上机检测；

结果显示：αHSP70p-CM-CaP免疫后的小鼠体内CD8⁺的两类记忆性T细胞含量情况有所不同，如图5E&F，效应型记忆T细胞(T_EM细胞,CD3⁺CD8⁺CD62L^–CD44⁺)含量最高，占淋巴结免疫细胞CD8⁺T细胞数量的40％，明显高于游离制剂组；中央型记忆T细胞(T_CM细胞,CD3⁺CD8⁺CD62L⁺CD44⁺)含量最低，该类细胞在长期保护功能中的作用并不如T_EM细胞重要，说明αHSP70p-CM-CaP具有长期保护作用，防止肿瘤的复发。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用

<130> 201802

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CpG ODN

<400> 1

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> α螺旋修饰的HSP70活性肽段(αHSP70)

<400> 2

Ala Cys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Lys Phe Trp Asp Gly Ser Gly Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Glu Leu Ser Gly

35

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> α螺旋序列(α helix sequence)

<400> 3

Ala Cys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Lys Phe Trp Asp

20

Claims

1.一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，为核壳结构的纳米级仿生粒子，其由磷酸钙构建成的纳米内核和人工合成的脂质双分子层外壳通过疏水作用相结合组成，所述的内核的磷酸钙是高效包载寡聚核苷酸类物质的疏水性纳米颗粒，外壳是高度模拟细胞膜流动性的人工脂质材料，负载天然的或基因工程改造的细胞膜蛋白和HSP70活性肽段。

2.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述外壳的人工脂质材料负载天然的多价肿瘤细胞膜抗原蛋白以及α螺旋修饰的HSP70活性肽段（αHSP70p）；所述内核以磷酸钙（CaP）为材料制备纳米粒并包载佐剂寡聚核苷酸CpG；

所述的疫苗采用寡聚核苷酸CpG和HSP70p作为佐剂成分。

3.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的磷酸钙内核所采用的佐剂成分非甲基化寡聚脱氧核苷酸（简称CpG ODN）是人工合成的具有免疫刺激作用的含非甲基化的CpG寡聚核苷酸的DNA序列，所述CpG ODN序列为CpG ODN1826 (5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)。

4.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的外壳的脂质中添加佐剂成分为α螺旋修饰的HSP70活性肽段（αHSP70p）。

5.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的细胞膜蛋白为多价肿瘤细胞膜蛋白成分，其选自小鼠来源的B16OVA细胞，为通过体外扩增和提取获得的基因工程改造的稳定表达OVA模型抗原的小鼠黑色素瘤细胞系。

6.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜材料是胆碱磷酸结构的脂质和胆固醇，包括DPPC，DSPC，DOPC和胆固醇。

7.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的内核包载核酸类药物，选自佐剂寡聚核苷酸CpG ODN，siRNA，DNA。

8.按权利要求3所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的佐剂成分CpG ODN，具有强烈的固有免疫刺激作用，由TLR9介导直接激活固有免疫系统以及激活多种免疫细胞引起B细胞分化和T细胞分化。

9.按权利要求4所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的α螺旋修饰的HSP70活性肽段（αHSP70），其序列为AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-TKDNNLLGRFELSG，通过脂质插入技术，在HSP70活性肽段TKDNNLLGRFELSG外添加α螺旋序列AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD制得。

10.按权利要求4所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述的α螺旋修饰的HSP70活性肽段（αHSP70）是热休克蛋白HSP70中的活性成分，能直接激活树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞上的CD49分子。

11.按权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗，其特征在于，所述核壳结构的纳米级仿生粒子，磷酸钙纳米内核平均粒径为30-40 nm，包被人工脂质膜之后最终粒径在50 nm左右。

12.权利要求1所述的模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗在制备用于抑制肿瘤在体内的生长和转移制剂中的用途，所述的制剂通过皮下给药途径，免疫小鼠后局部靶向至引流淋巴结中的树突状细胞，体内激活后产生系列下游的免疫激活作用，诱导Th1型细胞因子反应，杀伤性CD8+T细胞（CTL）的产生，以及辅助性CD4+细胞的产生。