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CN110093285B - 一株耐酸发酵乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株耐酸发酵乳杆菌及其应用 Download PDF

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CN110093285B CN201910148417.5A CN201910148417A CN110093285B CN 110093285 B CN110093285 B CN 110093285B CN 201910148417 A CN201910148417 A CN 201910148417A CN 110093285 B CN110093285 B CN 110093285B
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Abstract

本发明公开了一株耐酸发酵乳杆菌及其应用，属于发酵工程技术领域。该菌株于2016年9月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为12934。该菌株对酸具有很好的耐受性，在pH为3.85～4.40的条件下生长良好，经液态发酵培养，该菌株可代谢糖类物质产生乳酸，其乳酸总量达到27.37g/L；在酿醋过程的封醅阶段添加该菌株，可提高食醋中乳酸含量，改善食醋的口感和风味。

Description

一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株耐酸发酵乳杆菌以及使用该菌株将糖类物质转化为乳酸的方法。
背景技术
乳酸是许多传统发酵食品的重要呈味物质，如食醋、白酒、泡菜等。对于食醋而言，乳酸是其中含量最高的不挥发性酸，部分食醋还将不挥发酸含量作为划分食醋等级的一个重要指标。因此，提高乳酸的含量对于柔和食醋的酸味、降低醋酸的刺激感和提高食醋等级等具有重要作用，同时它也是调节食醋pH、延长其保质期的关键物质之一。
食醋中的乳酸主要由醋酸发酵过程中的乳酸菌代谢生成，其中以乳酸杆菌属(Lactobacillus)为主，包括瑞士乳酸杆菌(L.helveticus)、哈氏乳酸杆菌(L.hamsteri)、桥乳酸杆菌(L.pontis)和面包乳酸杆菌(L.panis)等。在醋酸发酵前期，乳酸菌在酿醋微生物群落中占主导，但由于体系中乳酸、乙酸等代谢产物的积累，醋醅中总酸含量升高，大多数乳酸菌由于不耐受高酸而逐渐消亡，醋酸菌逐渐成为体系中的优势菌群，由于发酵后期碳源不足，乳酸会被部分微生物消耗掉，这是造成食醋中主要的不挥发酸乳酸含量降低的主要原因之一。因此，筛选可以发酵糖产乳酸，且具有良好耐酸性能(尤其是醋酸)的乳酸菌菌株，对于生产中提高食醋乳酸含量具有重要的实际意义。目前未见报道采用本发明所述的耐酸发酵乳杆菌用于食醋生产中强化乳酸产量。
发明内容
鉴于上述生产中的技术问题，本发明旨在通过筛选一株耐酸乳酸菌，并将其利用在食醋酿造过程中，提高食醋中不挥发酸在总酸中的占比，改善食醋的口感、风味与品质。
本发明首先提供了一株耐酸发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，该菌株于2016年9 月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12934，分类命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LFE02。
获取所述菌株的16S rRNA基因序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rRNA基因序列全长为1541bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillusfermentum(GenBank登录号：KF030758.1)，16S rRNA基因序列见SEQ ID NO：l。
所述菌株可利用的主要糖类物质包括D-葡萄糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和蔗糖。
所述菌株在厌氧条件下，静置培养可代谢糖类物质产生乳酸。
所述发酵生产乳酸的工艺为：
种子/液态发酵培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温80 2mL/L，pH 3.85～4.40，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L， 121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合；
种子培养方法：50mL三角瓶装液量10mL，36℃厌氧静置培养4天；
发酵培养方法：以1～8％接种量将种子液接入发酵培养基，250mL三角瓶装液量100mL，厌氧条件下，35～37℃静置培养。
本发明提供了一种所述菌株的应用，采用上述发酵工艺，该菌株生产的乳酸含量可达 9.04±0.11g/L。
本发明的一种实施方式中，增加培养基中葡萄糖含量，该菌株发酵的乳酸产量可提高至 27.37±0.13g/L。
本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖含量为50g/L。
本发明还提供了一种所述菌株的应用，在固态食醋酿造的封醅阶段加入所述发酵乳杆菌，同时补加醋醅质量2～5％的蔗糖，可提高食醋中乳酸的含量和不挥发酸比例，使食醋口感更加柔和。
本发明还提供了一种所述菌株的应用，在液态白米醋酿造过程中，醋酸菌发酵结束后，补加醋液质量2～5％的蔗糖，加入所述发酵乳杆菌，可提高白米醋中乳酸含量，改善白米醋的口感和风味。
本发明从醋醅中筛选得到一株具有较好耐酸能力的产乳酸菌株，经鉴定为发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)。该菌株可在pH 3.85～4.40的条件下良好生长，同时可代谢糖类物质产生乳酸，其乳酸产量可达到27.37±0.13g/L。在食醋酿造过程的封醅阶段添加该菌株，可提高食醋中乳酸产量，改善食醋的口感和风味。
具体实施方式
实施例1：产乳酸和耐酸菌株的筛选
从镇江香醋醋醅中取10g样品装入混有玻璃珠和90mL无菌水的500mL三角瓶中，在36℃摇床上以115rpm振荡30min，然后取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-3～10-6梯度稀释样涂布分离培养基平板，36℃厌氧静置培养7～14天；将平板上丰厚的菌落经分离纯化后接入斜面培养基，36℃培养7天，4℃保藏；同时将菌落接入液体培养基中，36℃培养7天后，采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中乳酸的含量，从而筛选得到耐酸的产乳酸菌株。
分离/斜面培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温80 2mL/L，琼脂粉40g/L，pH 3.6～6.6，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合后制得分离/斜面培养基。
液体培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38 g/L，吐温80 2mL/L，pH 3.6～6.6，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合后制得液体培养基。
HPLC测定具体方法如下：
①样品的预处理方法
准确量取2mL发酵上清液，将培养液离心(12000rpm，5min)获得上清液，分别加入800μL硫酸锌(300g/L)和800μL亚铁氰化钾(106g/L)，振荡混匀，离心。取上清液用0.22 μm水系微孔滤膜过滤后为待测样品。与此同时，以乳酸标准品为外标绘制乳酸的标准曲线。
②HPLC测定条件如表1所示。
表1 HPLC测定乳酸的条件
Figure BDA0001980769940000031
根据HPLC结果，得到一株耐酸(pH 3.85)且同时产乳酸的菌株，乳酸产量为9.04±0.11 g/L，于4℃置于斜面培养基中保藏以备进一步分析。
实施例2：产乳酸和耐酸菌株的分子鉴定
纯化筛选得到的菌株，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0/P6扩增其16S rRNA基因全长序列，具体如下：
P0:5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’
P6:5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’
①反应体系(50μL)
Figure BDA0001980769940000041
②反应程序
Figure BDA0001980769940000042
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11V/cm，电泳时间20min。
PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。
获得的细菌16S rRNA基因序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rRNA基因序列全长为1541bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillusfermentum (GenBank登录号：KF030758.1)，16S rRNA基因序列见SEQ ID NO：l。
该菌株于2016年9月5日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为12934。
实施例3：菌株CGMCC 12934的生理生化特性
将CGMCC 12934接种于分离培养基，36℃厌氧培养4天后，通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)和扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope，SEM)观察该菌株的细胞形态。将CGMCC 12934接种于液态培养基，通过测定培养液OD600，检测该菌株适宜生长的温度以及其对乙酸的耐受范围；通过BIOLOG(AN微孔板)试验分析该菌株可利用的碳源。菌株CGMCC 12934的上述特征如表2所示。
表2菌株CGMCC 12934的生理生化特性
Figure BDA0001980769940000051
实施例4：不同糖浓度下菌株CGMCC 12934产乳酸实验
将菌株CGMCC 12934以1％接种量接种于含有10mL的种子培养基中，36℃厌氧条件下静置培养4天后，将其以4％接种量转接于液态发酵培养基中，厌氧条件下静置培养7天后，通过HPLC测定其发酵液中乳酸含量。
种子培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38 g/L，吐温80 2mL/L，pH 3.85，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合；
液态发酵培养基：①葡萄糖40g/L，胰蛋白胨20g/L，牛肉膏20g/L，酵母粉10g/L，乙酸钠10g/L，柠檬酸氢二铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，七水合硫酸镁1.16g/L，一水合硫酸锰0.38g/L，吐温80 2mL/L，pH 3.85，121℃下灭菌20min；②L-半胱氨酸盐酸盐1g/L，121℃下灭菌20min。①与②在无菌条件下等体积混合。其中，设定不同的葡萄糖含量，其终浓度分别为20、30、40和50g/L。
按照上述实施例1中所述的HPLC检测方法，测定该菌株在不同糖浓度下发酵液中乳酸的产量，结果显示随着糖浓度增加，乳酸产量增加，依次为9.04±0.11g/L、13.41±0.09g/L、19.35±0.06g/L和27.37±0.13g/L。
实施例5：添加CGMCC 12934提高固态食醋乳酸含量
为避免乳酸被醋酸菌所利用，我们选择镇江香醋醋酸发酵阶段结束后，在其封醅阶段添加CGMCC 12934。
对照组：按照传统酿醋工艺发酵生产的镇江香醋。
处理组：将CGMCC 12934培养至对数期，菌浓达到约3×108cfu/mL。封醅前按照醋醅质量5％的接种量进行接种，同时补加醋醅质量3％的蔗糖，然后封醅陈酿。
采用高效液相色谱法测定镇江香醋中乳酸的含量，具体方法与实施例1相同。分析结果显示，与对照组相比，处理组成品食醋中乳酸含量提高至1.76g/100mL，增加了27.5％；总酸中不挥发酸的比例从26.2％提高至29.7％，增加了13.0％，使得醋的口感更加柔和，整体品质也有所提高。
表3添加菌株CGMCC 12934前后固态食醋的理化特征
Figure BDA0001980769940000061
SEQUENCE LISTING
<110> Jiangnan University
<120> 一株耐酸发酵乳杆菌及其应用
<130> 2019.02.26
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1541
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 1
gagagtttga tcctggctca ggatgaacgc cggcggtgtg cctaatacat gcaagtcgaa 60
cgcgttggcc caattgattg atggtgcttg cacttgatag attttggtcg ccaacgagtg 120
gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct gcccagaagc gggggacaac atttggaaac 180
agatgctaat accgcataac aacgttgttc gcatgaacaa cgcttaaaag atggcttctc 240
gctatcactt ctggatggac ctgcggtgca ttagcttgtt ggtggggtaa tggcttacca 300
aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatgggact gagacacggc 360
ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa gcctgatgga 420
gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt aaagaagaac 480
acgtatgaga gtaactgttc atacgttgac ggtatttaac cagaaagtca cggctaacta 540
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa 600
agagagtgca ggcggttttc taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac cggagaagtg 660
catcggaaac tggataactt gagtgcagaa gagggtagtg gaactccatg tgtagcggtg 720
gaatgcgtag atatatggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctacctggt ctgcaactga 780
cgctgagact cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 840
aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccggagc taacgcatta 900
agcactccgc ctggggagta cgaccgcagg gttaaactca aaggaattga cgggggcccg 960
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg 1020
acatcttgcg ccaaccctag agatagggcg tttccttcgg gaacgcaatg acaggtggtg 1080
catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1140
cttgttacta gttgccagca ttaagttggg cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg 1200
gaggaaggtg gggacgacgt cagatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1260
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tctcagttcg gactgcaggc tgcaactcgc ctgcacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1380
ggatcatcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1440
gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg taacctttta ggagccagcc gcctaaggtg 1500
ggacagatga ttagggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta g 1541

Claims (1)

1.一株耐酸发酵乳杆菌，其特征为，该菌株于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12934，分类命名为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。
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