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CN110078834B - 一种类短肽、辅助透膜剂及其应用 - Google Patents

一种类短肽、辅助透膜剂及其应用 Download PDF

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CN110078834B CN201910367417.4A CN201910367417A CN110078834B CN 110078834 B CN110078834 B CN 110078834B CN 201910367417 A CN201910367417 A CN 201910367417A CN 110078834 B CN110078834 B CN 110078834B
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Abstract

本发明公开了一种类短肽、辅助透膜剂及其应用。所述类短肽为多条偶联的正电性短肽，所述正电性短肽包括具有正电荷基团修饰的赖氨酸残基和穿膜肽段；优选所述类短肽为2条偶联的正电性肽段。所述辅助透膜剂包括所述类短肽。所述辅助透膜剂应用于介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送，使用简单，只需要共孵育操作，成本低；透膜效果良好，作用时间短，能有效减小操作时间。

Description

一种类短肽、辅助透膜剂及其应用
技术领域
本发明属于荧光成像领域，更具体地，涉及一种类短肽、辅助透膜剂及其应用。
背景技术
目前用于活细胞内部生物大分子荧光标记并进行显微成像的策略有两大类：第一，荧光蛋白标记。具体的是通过质粒转染方式在目标位点表达特定荧光蛋白，虽然这种方式具有很好的活细胞相容性，但通常需要克服外源荧光蛋白体积过大、量子产率低、光稳定性差等问题。
随着超分辨率显微成像技术的发展，对活细胞内基本结构的研究也向着超高分辨率的方向发展。而在目前已有的超分辨成像策略中，基于光调制的超分辨率显微成像策略要求荧光分子具有高亮度和抗光漂白等性质，以得到更好的时间和空间分辨率；基于这样的成像要求，荧光蛋白常常不能满足，这就需要用到第二种标记策略：通过小分子有机荧光染料。有机荧光染料相比于荧光蛋白具有更高的亮度和更好的稳定性，其标记的靶向性是通过与特异性识别基团共价连接形成有机荧光探针来实现的。但是小分子有机荧光染料在应用中仍存在一个问题：大部分具有优异荧光性能的染料自身并不能透过细胞膜，有些自身可以透膜的染料与具有靶向性的识别基团结合后就失去其透膜性，都不能很好的穿过细胞膜屏障，只能用于死细胞或者活细胞膜外结构标记而无法用于活细胞内结构标记。
目前解决透膜性问题主要有以下几种途径：第一，在荧光染料分子上进行化学修饰改造或从头设计合成新的荧光染料，但该方法耗时耗力，且成功率低。第二，应用电穿孔的方法，通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，这时细胞孵育液中不透膜的荧光探针在电泳力的作用下与细胞膜接触，并扩散至胞质内。但这种方式需要昂贵的仪器(电穿孔仪)，且外加场强会不可逆转地伤害细胞膜而使一部分细胞裂解，所以此方法对细胞的损害较大，且一次性标记细胞数量少。第三，应用一种将穿膜肽和靶向识别分子、荧光染料共价结合在一起的肽类探针实现小分子荧光染料的透膜。但该种方法存在着一定局限性，仅针对活细胞内一部分结构，当更换结构时需从头设计。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种类短肽、辅助透膜剂及其应用，其目的在于通过对类短肽的分子结构和电性进行恰当设计使得其具备引发细胞内吞逃逸机制，辅助小分子荧光探针等试剂实现透膜进入细胞内部，由此解决现有的分子探针难以穿过细胞膜或者荧光标记效果不佳的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种类短肽，所述类短肽分子为多条偶联的正电性短肽，所述正电性短肽包括具有正电荷基团修饰的赖氨酸残基和穿膜肽段；优选所述类短肽为2条偶联的正电性肽段。
优选地，所述类短肽，其所述多条正电性短肽通过二硫键偶联。
优选地，所述类短肽，其所述类短肽分子具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000021
其中，K为赖氨酸；C为半胱氨酸；R1为正电荷基团；CPP为细胞穿膜肽段。
优选地，所述类短肽，其所述正电荷基团为罗丹明类基团，优选为罗丹明B或罗丹明6G。
优选地，所述类短肽，其所述穿膜肽段为一级结构穿膜肽，含有4至40个氨基酸残基，带有正电荷。
优选地，所述类短肽，其所述穿膜肽段TAT和/或(rR)3R2。
按照本发明的另一个方面，提供了一种辅助透膜剂，其包括所述类短肽，所述类短肽浓度优选在200μM至2mM之间。
优选地，所述辅助透膜剂，其包括穿膜肽，所述穿膜肽与所述类短肽混合比例为10-60:2。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述辅助透膜剂的应用，其特征在于，应用于介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送；所述介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送，为介导一种小分子有机荧光探针或介导多种小分子有机荧光探针的混合物的活细胞胞内投送。
优选地，所述辅助透膜剂的应用，其将所述辅助透膜剂与小分子有机荧光探针与活细胞共孵育，优选使得所述类短肽浓度在2μM至10μM之间。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的类短肽，作为辅助透膜剂，能引发细胞内吞逃逸机制，从而辅助小分子透过细胞膜，其使用简单，只需要共孵育操作，成本低；透膜效果良好，作用时间短，能有效减小操作时间。
本发明提供的类短肽本身毒性较低，所以在投送探针的同时可以最小程度的降低对细胞的毒性，成像时获得较好的细胞活力。
其应用于辅助小分子荧光探针透膜对活细胞内部微观结构进行超分辨率成像时，使得探针设计更为简单无需考虑中间链接穿膜肽，最小程度降低探针的非靶向标记；同时，由于本发明的辅助透膜剂的迅速高效的探针投送，采用本发明的辅助透膜剂来辅助荧光探针透膜标记时，具有更高的标记效率，还可以实现同时将多种非透膜有机荧光探针带入到活细胞中实现多色标记。
优选技术方案，将本发明提供的类短肽和穿膜肽混合作为辅助透膜剂，可进一步提高对非透膜有机荧光探针的投送效率。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的类短肽PV-1的MS质谱图；
图2是本发明实施例1提供的类短肽PV-1作为辅助透膜剂荧光标记效果图；
图3是本发明实施例2提供的类短肽PV-2的MS质谱图；
图4是本发明实施例2提供的类短肽PV-2作为辅助透膜剂荧光标记效果图；
图5是本发明实施例3提供的类短肽PV-3的MS质谱图；
图6是本发明实施例3提供的类短肽PV-3作为辅助透膜剂荧光标记效果图；
图7是本发明实施例4提供的类短肽PV-6作为辅助透膜剂荧光标记效果图；
图8是本发明实施例5提供的单链PV-1作为辅助透膜剂荧光标记效果图；
图9是本发明实施例9中PV-1作为辅助透膜剂投送不同的荧光探针的进行细胞内荧光标记效果图；
图10是本发明实施例1提供的类短肽PV-1作为辅助透膜剂荧光探针多西他赛-Alexa647标记效果图；
图11是本发明实施例1提供的类短肽PV-1作为辅助透膜剂同时投送多种探针进行三色成像的标记效果图；
图12是本发明实施例1提供的类短肽PV-1和穿膜肽混合物作为辅助透膜剂投送有机荧光探针多西他赛-atto488荧光标记效果图；
图13是本发明实施例1提供的类短肽PV-1和穿膜肽混合物作为辅助透膜剂投送有机荧光探针SNAP-549荧光标记效果图；
图14是实施例11细胞活力测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的类短肽，所述类短肽分子为多条偶联的正电性短肽，所述短肽包括具有正电荷基团修饰的赖氨酸残基和穿膜肽段；(只能是赖氨酸)
优选地，所述类短肽分子为2条偶联的正电性肽段。
优选地，所述多条正电性短肽通过二硫键偶联。
优选地，所述类短肽分子具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000051
其中，K为赖氨酸；C为半胱氨酸；R1为正电荷基团；CPP为细胞穿膜肽段。当2条正电性短肽通过半胱氨酸形成的二硫键偶联在一起时，会增加穿膜肽的正电荷数量促进其通过胞饮进入到细胞内，且进入细胞后穿膜肽可以降低囊泡膜的稳定性从而促进囊泡破裂导致其内的探针释放出来。
所述正电荷基团优选为罗丹明类基团。所述正电荷基团，一方面带有正电荷数量可与细胞膜外侧相互作用，另一方面通过共价键和穿膜肽连接在一起从而增加了穿膜肽所携带的正电荷数量，其结果导致穿膜肽所带正电荷数量更多更共容易被內吞到细胞内。优选地，所述多条正电性短肽所携带的正电荷基团相同。
本发明提供的以引发胞吞现象为作用原理的辅助透膜剂，其设计难点在于平衡投送效率和细胞毒性，为提高投送效率需尽量提高分子表面正电荷修饰基团的电荷数量，然而细胞毒性也随之提高，为了解决这个问题，本发明采用二硫键偶联正电性短肽，同时优化每条正电性短肽的分子结构，通过胞吞作用进入细胞后，首先与溶酶体囊泡结合，迅速降解，从而在保证投送效率的前提下降低细胞毒性，成像时获得较好的细胞活力，获得更加接近细胞正常生活状态下的超高分辨率荧光成像。
所述穿膜肽段，含有4至40个氨基酸残基，带有正电荷。所述穿膜肽段与细胞莫外侧相互作用，引发胞吞作用，从而介导透膜过程。所述穿膜肽段优选TAT和/或(rR)3R2，具有较高的投送效率和较低的毒性。优选地，所述多条正电性短肽所携带的穿膜肽相同。
本发明提供了一种辅助透膜剂，其包括本发明提供的类短肽，优选所述类短肽浓度优选在200μM至2mM之间。优选方案，所述辅助透膜剂，还包括穿膜肽；所述穿膜肽与所述类短肽摩尔浓度比为10-60:2，其中所述类短肽的浓度在2μM至10μM之间，优选地100ul辅助透膜剂中含有30 μM穿膜肽和2μM PV-1。所述穿膜肽优选L17E(Akishiba,Misao,et al.Cytosolic antibody delivery by lipid-sensitive endosomolytic peptide.Naturechemistry 9,2017)。
所述类短肽可通过固相肽合成法合成。
本发明提供的辅助透膜剂，应用于介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送。
所述介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送，为介导一种小分子有机荧光探针或介导多种小分子有机荧光探针的混合物的活细胞胞内投送。
具体操作如下：
将本发明提供的辅助透膜剂与小分子有机荧光探针与活细胞共孵育；使得细胞培养液中所述类短肽浓度为2μM至10μM之间，优选3μM至5μM，优选所述类短肽为实施例1提供的PV-1，浓度优选为4μM；或者
使得所述穿膜肽与所述类短肽摩尔浓度比为10-60:2，其中所述类短肽的浓度在2μM至10μM之间，较佳的使用量为100μL孵育液中含有30 μM L17E和2μM PV-1。
优选地，采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1至 3小时；
共孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1以上小时，有利于探针从囊泡中释放出来增加标记效率。
以下为实施例：
实施例1
一种辅助透膜剂，其为类短肽PV-1，所述类短肽PV-1具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000071
其中，RKKRRQRRRG为穿膜肽TAT即穿膜肽段CPP，K为外加的赖氨酸， R1为
Figure BDA0002048656940000072
C为半胱氨酸。
通过固相肽合成的方法得到，其MS质谱检测报告如图1所示，结构如下：
PV-1
Figure BDA0002048656940000073
将本实施例提供的PV-1和有机荧光探针多西他赛-FITC采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度分别为2μM、4μM、8μM、以及10μM，探针浓度为5 μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光成像。结果如图2所示。
与不加该短肽的对照组(Control)相比，本实施例提供的PV-1作为辅助透膜剂和有机荧光探针共孵育细胞时，探针能进入到细胞中并很好的结合到微管上去。
具体步骤如下：
细胞准备：生长状态良好的U2OS细胞(1.5×104cells/well)溶液200uL 接种于无菌的玻底培养皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养约40小时，至细胞重新贴壁且密度适中。
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液，多西他赛 -FITC也用PBS溶液配成200μM的母液。分别取2μL上述PV-1溶液， 2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于95.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。再取2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于97.5μL 不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成对照组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的 McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收。
多西他赛-FITC标记细胞后转盘共聚焦成像的结果见附图2。图2显示在孵育液中不含实施例1中的短肽时，多西他赛-FITC不能穿透细胞膜标记上微管，而在加入4μM的短肽PV-1后细胞内可见明显的丝状微管。
实施例2
一种辅助透膜剂，其为类短肽PV-2，所述类短肽PV-2具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000091
其中，RKKRRQRRRG为穿膜肽TAT即穿膜肽段CPP，K为外加的赖氨酸， R1为罗丹明6G，C为半胱氨酸。
通过固相肽合成的方法得到，其MS质谱检测报告如图3所示，结构如下：
PV-2
Figure BDA0002048656940000092
将本实施例提供的PV-2和有机荧光探针多西他赛-FITC(5μM)采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度分别为4μM、8μM、以及10μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光成像。结果如图4所示。
与不加该短肽的对照组(Control)相比，本实施例提供的PV-2作为辅助透膜剂和有机荧光探针共孵育细胞时，探针能进入到细胞中并很好的结合到微管上去。
具体步骤如下；
准备生长状态良好的U2OS细胞(准备方法如实施例1)。
将实施例2中提供的PV-2用PBS溶液配成200μM的母液，多西他赛 -FITC也用PBS溶液配成200μM的母液。分别取2μL上述PV-2溶液， 2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于95.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。再取2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于97.5μL 不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成对照组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200uL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的 McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收。
多西他赛-FITC标记细胞后转盘共聚焦成像的结果见附图4。图4显示在孵育液中不含实施例3中的短肽时，多西他赛-FITC不能穿透细胞膜标记上微管，而在加入4μM的短肽PV-2后细胞内可见明显的丝状微管。
实施例3
一种辅助透膜剂，其为类短肽PV-4，所述类短肽PV-4具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000101
其中，rRrRrRRR为穿膜肽段CPP，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸，K为外加的赖氨酸，R1为
Figure BDA0002048656940000111
C为半胱氨酸。
通过固相肽合成的方法得到，其MS质谱检测报告如图5所示，结构下：
PV-4
Figure BDA0002048656940000112
将本实施例提供的PV-4和有机荧光探针多西他赛-FITC(5μM)采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度分别为4μM、8μM、以及10μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光成像。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收。多西他赛-FITC标记细胞后转盘共聚焦成像的结果如图6所示。
与不加该短肽的对照组(Control)相比，本实施例提供的PV-4作为辅助透膜剂和有机荧光探针共孵育细胞时，探针能进入到细胞中并很好的结合到微管上去。
具体方法如下：
准备生长状态良好的U2OS细胞(准备方法如实施例1)。
将实施例2中提供的PV-4用PBS溶液配成200μM的母液，多西他赛 -FITC也用PBS溶液配成200μM的母液。分别取2μL上述PV-4溶液， 2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于95.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。再取2.5μL上述多西他赛-FITC溶液于97.5μL 不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成对照组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的 McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收。
多西他赛-FITC标记细胞后转盘共聚焦成像的结果见附图6。图6显示在孵育液中不含实施例2中的短肽时，多西他赛-FITC不能穿透细胞膜标记上微管，而在加入4μM的短肽PV-4后细胞内可见明显的丝状微管。
实施例4：
一种辅助透膜剂，其为类短肽PV-6，所述类短肽PV-6具有如下结构：
Figure BDA0002048656940000131
其中，RKKRRQRRRG为穿膜肽TAT，K为外加的赖氨酸，连接的阳离子基团为TMR，中间采用非二硫键方式连接，导致被內吞到细胞中后不易断开，降解效率低。
将本实施例提供的PV-6和有机荧光探针多西他赛-FITC采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为5μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光成像。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收；PV-6在560nm激发，在570-590nm接收。成像结果如图7所示。
与不加该短肽的对照组(Control)相比，本实施例提供的PV-6作为辅助透膜剂和有机荧光探针共孵育细胞时，探针无法高效进入到细胞中并结合到微管上去。
成像结果显示说绿色通道无荧光信号说明探针没有被投到细胞内，红色通道荧光信号强烈，说明PV-6将探针高效的投送到了细胞内部，这个结果就是证明如果不是通过二硫键连接，就无法将探针高效的投送到细胞中
实施例5对照例：
用TCEP处理PV-1半小时使PV-1中间的二硫键断裂，获得单链的PV- 1。
将本实施例提供的单链PV-1和有机荧光探针多西他赛-FITC(5μM) 采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述单链类短肽浓度为8μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光成像。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。FITC在488nm 激发，在510-530nm接收；单链PV-1在560nm激发，在570-590nm接收。结果如图8所示。
与不用TCEP处理的对照组(Control)相比，本实施例提供的单链PV- 1作为辅助透膜剂和有机荧光探针共孵育细胞时，单链PV-1无法将探针高效投送到细胞中。
实施例6
将实施例1提供的PV-1和分别与有机荧光探针多西他赛-atto488、多西他赛-atto565、多西他赛-Alexa647、Hoechst-alexa647、Hoechst- alexa488、SNAP-Alexa488采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为4μM,探针浓度为5μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行SIM超分辨成像。
成像条件：通过结构光照明超分辨显微镜(Nikon N-SIM)成像。超分辨成像结果如图9所示。
靶向微管及细胞核的探针：
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液，探针多西他赛-atto488，多西他赛-atto565，多西他赛-Alexa647，Hoechst-alexa647， Hoechst-alexa488分别用PBS溶液配成200μM的母液。分别取2.5μL上述探针溶液于95.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中，再分别加入2 uL上述dfTAT(RhB)溶液，配成孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A 培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过SIM超分辨显微镜(Nikon,N-SIM)观察。
靶向内质网的探针：
细胞准备：生长状态良好的U2OS细胞(1.5×104cells/well)溶液400 μL接种于无菌的24孔板中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养过夜，至细胞重新贴壁且铺满率80％-90％。按照转染试剂 LipofectamineTM2000(Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)的标准步骤，将质粒 SNAP-sec61β转入细胞中。6个小时后去掉上清，加入新鲜的含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基，37℃、5％CO2培养过夜。用含0.25％EDTA的胰酶消化细胞，并以1.5×104cells/well接种于无菌的玻底培养皿(glass bottom Φ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养约40小时，至细胞重新贴壁且密度适中。
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液，探针SNAP- Alexa488用DMSO配成1mM的母液。分别取2μL上述PV-1溶液，0.5μL 上述SNAP-Alexa488溶液于97.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200uL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过结构光照明(SIM)超分辨显微镜(Nikon,N-SIM)观察。
各探针标记细胞后SIM成像的结果见附图9。
实施例7
将实施例1提供的PV-1和与有机荧光探针多西他赛-Alexa647采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为4μM，多西他赛-Alexa647 5μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行随机光学重构(STORM_超分辨成像)。
成像条件：通过STORM超分辨显微镜(Nikon,N-STORM)观察， 10ms/frame,5000frames重建超分辨图像。超分辨成像结果如图10所示。
具体步骤如下：
准备生长状态良好的U2OS细胞(准备方法如实施例1)。
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液，多西他赛 -Alexa 647也用PBS溶液配成200μM的母液。分别取2μL上述PV-1溶液，2.5μL上述多西他赛-Alexa647溶液于95.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。再取2.5μL上述多西他赛-Alexa 647溶液于97.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成对照组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的 McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育 1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍，成像结果如图10所示。
实施例8
将实施例1提供的PV-1和与有机荧光探针或多种有机探针的组合采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为4μM,有机荧光探针为5μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行转盘共聚焦显微镜成像或SIM超分辨成像。
成像条件：双色图为通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)成像。结果如图11所示。三色图为通过SIM超分辨显微镜(Nikon N-SIM)成像，超分辨成像结果如图11所示。
具体步骤如下：
准备生长状态良好的U2OS细胞(准备方法如实施例1)。
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液。分别将指定组合的探针和PV-1在无血清McCoy’s 5A培养基中配制成指定的浓度，实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育 1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍，超分辨成像结果如图11所示。
实施例6至实施例8的结果显示实施例1提供的PV-1作为辅助透膜剂和对不同的有机荧光探针均具有良好的透膜效果和标记活性，成像分辨率高。
实施例9将实施例1提供的PV-1、L17E组成的辅助透膜剂和与有机荧光探针多西他赛-atto488采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为2μM，L17E 30 μM，多西他赛-atto488(5μM)。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光共聚焦显微镜成像。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。Attlo 488在 488nm激发，在510-530nm。结果如图12所示。
具体步骤如下：
细胞准备：生长状态良好的U2OS细胞(1.5×104cells/well)溶液200uL 接种于无菌的玻底培养皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养约40小时，至细胞重新贴壁且密度适中。
将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200μM的母液，L17E用 PBS配成1mM的母液,多西他赛-Atto 488也用PBS溶液配成200μM的母液。分别取1μL上述PV-1溶液，3μL上述L17E溶液和2.5μL上述多西他赛-atto 488溶液于93.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200uL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。
实施例10
将实施例1提供的PV-1、L17E组成的辅助透膜剂和与有机荧光探针 SNAP-549采用无血清培养基37℃、5％CO2条件下和表达SNAPtag-sec61β (Sec61β为内质网标记物)的活细胞共孵育1小时，带入标记细胞中。其中所述类短肽浓度为2μM，L17E 30μM，SNAP-549 5μM。
孵育后去除孵育液加入新鲜的含有血清的培养基在37℃、5％CO2条件培养细胞1小时,进行荧光共聚焦显微镜成像。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。SNAP-549 在560nm激发，在570-590nm接收。结果如图12所示。
具体步骤如下：
细胞准备：生长状态良好的U2OS细胞(1.5×104cells/well)溶液200uL 接种于无菌的玻底培养皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养约12小时后转染SNAP-tag-Sec61β质粒。
转染质粒24-36小时后将实施例1中提供的PV-1用PBS溶液配成200 μM的母液，L17E用PBS配成1mM的母液,SNAP-549也用PBS溶液配成200 μM的母液。分别取1μL上述PV-1溶液，3μL上述L17E溶液和2.5μL上述SNAP-549溶液于93.5μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中配成实验组孵育液。实验前，取出细胞，吸去原有培养基，分别用200μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的探针孵育液分别加入到玻底培养皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉探针溶液，用不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面残留的探针溶液2次。加入含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。上镜检查前用含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基再清洗一遍。
成像条件：通过转盘共聚焦显微镜(Olympus IX83)观察。
实施例11实施例1、实施例2、实施例3提供的多肽的毒性试验。
细胞准备：生长状态良好的U2OS细胞(3000-5000cells/well)溶液100 uL接种于无菌的96孔板中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养过夜，至细胞重新贴壁。
将PV-1、PV-2、PV-4用PBS溶液配成200μM的母液，分别用不含胎牛血清的McCoy’s5A培养配成4μM、4μM和8μM的孵育液。再取25 μL不含胎牛血清的McCoy’s 5A培养基于另一个EP管中配成空白对照的孵育液。实验前，取出96孔板，吸去原有培养基，分别用100μL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A培养基清洗细胞表面的血清。将配好的实验组和空白对照的孵育液分别加入到96孔板中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育1小时。去掉孵育液，分别用100uL PBS溶液和不含血清的McCoy’s 5A 培养基清洗细胞表面残留的孵育液。
每孔中加入80μL含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基及20μL MTS 溶液(公司)，另选择一个没有细胞的孔作为blank，也加入80μL含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基及20μL MTS溶液。于37℃、5％CO2环境中避光孵育3小时后置于酶标仪上，于490nm处测得各个孔的吸光值。最后实验组的5个平行中去掉一个最大值，去掉一个最小值后求平均值，细胞活力按下式计算：
Figure BDA0002048656940000201
结果如图14所示，由柱状图可看出，细胞经历多肽孵育后，三个小时内活力值在85％，50％和93％，均在可接受范围内，对细胞的基本生命活动没有较大影响。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种类短肽，其特征在于，所述类短肽分子为2条偶联的正电性短肽，所述正电性短肽包括具有正电荷基团修饰的赖氨酸残基和穿膜肽段；所述多条正电性短肽通过二硫键偶联；所述类短肽分子具有如下结构：
Figure 593419DEST_PATH_IMAGE001
其中，K为赖氨酸；C为半胱氨酸；R1为正电荷基团；CPP为细胞穿膜肽段；所述正电荷基团为罗丹明类基团；所述穿膜肽段为TAT或(rR)3R2。
2.如权利要求1所述的类短肽分子，其特征在于，所述正电荷基团为罗丹明B或罗丹明6G。
3.一种辅助透膜剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的类短肽。
4.如权利要求3所述的辅助透膜剂，其特征在于，所述类短肽浓度在200μM至2mM之间。
5.如权利要求3所述的辅助透膜剂，其特征在于，包括穿膜肽，所述穿膜肽与所述类短肽混合比例为10-60:2。
6.一种如权利要求3至5任意一项所述的辅助透膜剂的应用，其特征在于，应用于介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送。
7.如权利要求6所述的辅助透膜剂的应用，其特征在于，所述介导小分子有机荧光探针的活细胞胞内投送为介导一种小分子有机荧光探针或介导多种小分子有机荧光探针的混合物的活细胞胞内投送。
8.如权利要求7所述的辅助透膜剂的应用，其特征在于，将如权利要求3至5任意一项所述的辅助透膜剂与小分子有机荧光探针与活细胞共孵育。
9.如权利要求8所述的辅助透膜剂的应用，其特征在于，使得所述类短肽浓度在2μM至10μM之间。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395180A (zh) * 2005-12-30 2009-03-25 赢创罗姆有限责任公司 用作细胞穿膜肽的肽
CN103172701A (zh) * 2013-03-18 2013-06-26 中国科学院过程工程研究所 一种新型穿膜肽及其应用
CN106800592A (zh) * 2017-01-20 2017-06-06 肽泽（武汉）生物科技有限公司 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用
WO2017143042A3 (en) * 2016-02-16 2017-10-19 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CN107417793A (zh) * 2017-04-28 2017-12-01 华中科技大学 一种短肽、荧光探针及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395180A (zh) * 2005-12-30 2009-03-25 赢创罗姆有限责任公司 用作细胞穿膜肽的肽
CN103172701A (zh) * 2013-03-18 2013-06-26 中国科学院过程工程研究所 一种新型穿膜肽及其应用
WO2017143042A3 (en) * 2016-02-16 2017-10-19 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CN106800592A (zh) * 2017-01-20 2017-06-06 肽泽（武汉）生物科技有限公司 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用
CN107417793A (zh) * 2017-04-28 2017-12-01 华中科技大学 一种短肽、荧光探针及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
细胞穿膜肽的研究进展;严世荣等;《生物技术通讯》;20060930;第17卷(第5期);第796页第2段，第797页第1段 *

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