CN110075357A

CN110075357A - 一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法

Info

Publication number: CN110075357A
Application number: CN201910260014.XA
Authority: CN
Inventors: 杨明英; 卢磊浩; 王都临
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明公开了一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，包括茧壳进行脱胶后制成丝素溶液，将丝素溶液进行冷冻干燥，并且复溶于六氟异丙醇内，形成质量分数为6％‑8％的溶液体系等步骤，本发明具有更好的沉积效果，使羟基磷灰石不再是单纯的块状沉积，使羟基磷灰石更均匀地沉积并包裹于三维的纳米丝素纤维上，本发明构建了脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料，可以在不加诱导液的情况下使附着的脂肪干细胞进行成骨分化。

Description

一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨修复材料的制备方法，具体地说，涉及一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法。

背景技术

人骨髓间充质干细胞的诱导成骨分化在骨组织工程中得到了较大的应用，但是骨髓间充质干细胞数量相对较少，传代能力较弱，而人脂肪干细胞也有成骨分化能力，且来源容易，细胞数量多，增殖能力较普通骨髓干细胞强，且取用对生物体损伤较小，因此脂肪干细胞的成骨分化也成为了一个研究新热点。但是脂肪干细胞成骨能力相对较弱限制了其在成骨方向上的应用，能促进脂肪干细胞成骨分化的复合材料在应用上将有广泛的前景。

蚕丝及其丝素蛋白具有良好的生物相容性以及一定的降解性，又因其来源丰富，被大量用于生物组织工程中；另一方面，动物体内以羟基磷灰石为主要化学成分的纳米级针状晶体均匀地分布在胶原蛋白基质中,与胶原纤维、细胞一起构成了骨骼及其组织。因此丝素蛋白膜/羟基磷灰石这种复合材料被用于骨组织工程中。

静电纺丝技术是制备丝素蛋白纤维的一种重要方法，当溶液在高压电场下所受到的电场作用力远大于溶液的表面张力时,其将形成带电的喷射流,且在高压电场下快速拉伸并使溶剂快速挥发,最后形成纤维收集于接收装置上以形成电纺膜。相比于普通丝素蛋白溶液，由静电纺丝技术制成的丝素蛋白膜具有更高的比表面率、空间三维结构和生物相容性，更利于细胞的附着与生长。

电化学沉积技术是在含Ca、P的电解液中，控制适宜的实验条件，在电解作用下增大阴极电极附近的电解液pH值，当溶液中Ca²⁺和PO₄ ³-浓度超过磷酸钙盐临界过饱和度时，沉积得到磷酸钙盐涂层。利用三电极电化学矿化法，引入参比电极，准确测定工作电位。

因此，本技术将脂肪干细胞接种于纳米丝素复合材料，脂肪干细胞具有良好的附着能力与生长能力，培养后骨钙蛋白与骨形成蛋白量增加，碱性磷酸酶活性增强，可以促进脂肪干细胞的成骨分化。

发明内容

本发明利用静电纺丝技术生成纳米丝素纤维，利用三电极电化学矿矿化站在纳米丝素纤维上均匀地包裹上一层羟基磷灰石涂层，形成性能更为优良的纳米丝素纤维复合材料，脂肪干细胞接种于复合材料上，骨钙蛋白以及骨形成蛋白等相关成骨因子表达增加，可以进行成骨分化。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

本发明公开了一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，具体制备步骤如下：

1)、茧壳进行脱胶后制成丝素溶液；

2)、将丝素溶液进行冷冻干燥，并且复溶于六氟异丙醇内，形成质量分数为6％-8％的溶液体系；

3)、利用电纺丝技术制备纳米纤维；

4)、晾干、酒精处理后利用电化学矿化仪器进行矿化制成纳米丝素复合材料；

5)、将脂肪干细胞接种在步骤4)所述的复合材料上培养7-28天；

6)、在7-9天检测脂肪干细胞的碱性磷酸酶表达量；

7)、在9-14天检测成骨相关基因测定；

8)、在14-28天检测骨钙蛋白、骨形成蛋白的表达情况，脂肪干细胞能进行成骨分化；

作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)中纳米纤维是家蚕或柞蚕纳米丝素3D膜。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)中矿化过程为利用三电极的电化学工作站，引入参比电极测量电位，使羟基磷灰石均匀致密地包裹在丝素3D膜的纤维上。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤8)中复合材料在不加诱导液的情况下促进脂肪干细胞的成骨分化。

本发明涉及一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，该复合材料可以使附着其上的脂肪干细胞进行成骨分化，是促进干细胞成骨分化材料的其中一种，属于骨组织工程领域，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)由于利用静电纺丝构成具有三维结构的纳米纤维，本发明具有更好的沉积效果，使羟基磷灰石不再是单纯的块状沉积，使羟基磷灰石更均匀地沉积并包裹于三维的纳米丝素纤维上；

(2)本发明构建的纳米纤维更符合真实的细胞外基质纳米级环境，有利于脂肪干细胞贴附增殖与分化。

(3)本发明构建了脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料，可以在不加诱导液的情况下使附着的脂肪干细胞进行成骨分化。

具体实施方式

调节相关参数，利用电化学矿化和静电纺丝将羟基磷灰石包裹在纳米丝素纤维表面，构建脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料，脂肪干细胞在具有三维结构的复合材料上进行黏附和生长，经过14天的培养后骨形成蛋白、骨钙蛋白、碱性磷酸酶等表达量升高显著，可以进行成骨分化。

1)、茧壳进行脱胶后制成丝素溶液；

3)、利用电纺丝技术制备纳米纤维；纳米纤维是家蚕或柞蚕纳米丝素3D膜；

4)、晾干、酒精处理后利用电化学矿化仪器进行矿化制成纳米丝素复合材料；矿化过程为利用三电极的电化学工作站，引入参比电极测量电位，使羟基磷灰石均匀致密地包裹在丝素3D膜的纤维上；

6)、在7-9天检测脂肪干细胞的碱性磷酸酶表达量；

7)、在9-14天检测成骨相关基因测定；

8)、在14-28天检测骨钙蛋白、骨形成蛋白的表达情况，脂肪干细胞能进行成骨分化；复合材料在不加诱导液的情况下促进脂肪干细胞的成骨分化。

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地说明：

实施例1

茧壳脱胶后制成丝素溶液溶液，透析后进行冷冻干燥，复溶于六氟异丙醇形成质量分数为6％的溶液；利用静电纺丝技术将制备好的丝素3D膜置于电化学矿化仪器内。实验结束后使用电镜观察，发现有均匀明显的矿化结果，将脂肪干细胞接种于该复合材料上培养7天，测量碱性磷酸酶的表达量，显著高于对照组，具有成骨分化的效应。

实施例2

茧壳脱胶后制成丝素溶液溶液，透析后进行冷冻干燥，复溶于六氟异丙醇形成质量分数为7％的溶液；利用静电纺丝技术将制备好的丝素3D膜置于电化学矿化仪器内，实验结束后使用电镜观察，发现有均匀明显的矿化结果，将脂肪干细胞接种于该复合材料上培养14天，利用q-pcr技术测量OPN,OCN,COL-I，BMP-2等成骨相关基因表达量显著增高。

实施例3

茧壳脱胶后制成丝素溶液溶液，透析后进行冷冻干燥，复溶于六氟异丙醇形成质量分数为8％的溶液；利用静电纺丝技术将制备好的丝素3D膜置于电化学矿化仪器内，实验结束后使用电镜观察，发现有均匀明显的矿化结果，将脂肪干细胞接种于该复合材料上培养21天，荧光共聚焦显微镜观察细胞骨形成的蛋白、骨钙蛋白表达量增加，脂肪干细胞可以成骨分化。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的3个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

1)、茧壳进行脱胶后制成丝素溶液；

3)、利用电纺丝技术制备纳米纤维；

6)、在7-9天检测脂肪干细胞的碱性磷酸酶表达量；

7)、在9-14天检测成骨相关基因测定；

8)、在14-28天检测骨钙蛋白、骨形成蛋白的表达情况，脂肪干细胞能进行成骨分化。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)中纳米纤维是家蚕或柞蚕纳米丝素3D膜。

3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中矿化过程为利用三电极的电化学工作站，引入参比电极测量电位，使羟基磷灰石均匀致密地包裹在丝素3D膜的纤维上。

4.根据权利要求1或2或3所述的脂肪干细胞与纳米丝素复合的骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤8)中复合材料在不加诱导液的情况下促进脂肪干细胞的成骨分化。