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CN110049780A - 异喹啉并苯并二氮杂卓(iqb)-1(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体 - Google Patents

异喹啉并苯并二氮杂卓(iqb)-1(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体 Download PDF

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CN110049780A
CN110049780A CN201780076266.6A CN201780076266A CN110049780A CN 110049780 A CN110049780 A CN 110049780A CN 201780076266 A CN201780076266 A CN 201780076266A CN 110049780 A CN110049780 A CN 110049780A
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CN
China
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antibody
compound
acid
cancer
drug conjugates
Prior art date
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Pending
Application number
CN201780076266.6A
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English (en)
Inventor
杰格塔·R·祖奴图拉
肖恩·W·史密斯
德米特里·珀金
西尔维娅·戴格瑞杜
山哲梵尼·高恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellerant Therapeutics Inc
Original Assignee
Cellerant Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellerant Therapeutics Inc filed Critical Cellerant Therapeutics Inc
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Abstract

本文提供了异喹啉并苯并二氮杂卓(IQB)‑1(氯甲基)‑2,3‑二氢‑1H‑苯并[e]吲哚(CBI)二聚体、包含该二聚体的抗体‑药物偶联物和用于杀伤细胞和治疗疾病的应用方法。

Description

异喹啉并苯并二氮杂卓(IQB)-1(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并 [E]吲哚(CBI)二聚体
关于联邦政府资助的研究的声明
无
相关申请的引用
本申请是要求于2016年10月10日提交的题为“异喹啉并-倍癌霉素二聚体(ISOQUINOLIDINO-DUOCARMYCIN DIMERS)”的美国临时申请第62/406,077号和于2017年1月27日提交的题为“异喹啉并(ISOQUINOLIDINO)苯并二氮杂卓(IQB)-1(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[E]吲哚(CBI)二聚体”的美国临时申请第62/451,658号的申请日的权益的国际申请，为了所有目的将它们的全部内容通过引用并入本文。
背景
苯并二氮卓类已用作治疗剂。苯并二氮卓衍生物包括吡咯并苯并二氮杂卓。吡咯并苯并二氮杂卓二聚体作为DNA交联剂起作用，例如通过在DNA分子的小沟中结合来实现。它们中的某些已被建议作为治疗癌症的抗增殖剂。
倍癌霉素(Duocarmycin)也已用作治疗剂。倍癌霉素结合DNA的小沟。它们在N3位置烷基化腺嘌呤。倍癌霉素的一般结构有两个关键组分-DNA烷基化单元，如1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)，和非共价结合DNA的吲哚-2羰基单元。
概述
本发明提供了异喹啉并苯并二氮杂卓-1(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(“IQB-CBI”)化合物及其使用方法。在一个方面，本文提供具有通式I的化合物：
其中：
·在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间显示的点状键独立地为单键或双键；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在双键时，–C(Ra)-是烯属的并具有取代基Ra，并且-N(Rb)-中的Rb不存在；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在单键时，–C(Ra)-为饱和的并除了Ra取代基之外还具有氢取代基，并且-N(Rb)-中的Rb存在；
·Ra独立地为H或OH；
·如果存在，则Rb为H、L-Rx或–L-Sc；
·-L-Rx是与反应性部分Rx连接的连接基L，以及-L-Sc是与物质Sc连接的连接基L；其中L，当其自身时或当其与Rx或Sc组合时，是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地引入醚、氧代、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、支链、环状、不饱和、杂环、芳族或杂芳族部分；Rx是反应性部分；Sc是选自蛋白质、蛋白质的一部分、肽或核酸的靶标结合剂；
·R2选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基；
·R3、R3’、R4、R4’、R6和R6’各自独立地选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，或者如果Y为N，则不存在；
·R5或R5’中的每一个独立地为NH2、CO2H、H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-L-Rx或-L-Sc，或者如果Y为N，则不存在；
·R7为H；
·G’-Rb’选自OH、O-L、O-L-Rx、O-L-Sc、NH2、NH-L、NH-L-Rx或NH-L-Sc；
·每个Y独立地为N或C；
·每个D独立地为(CH2)n，其中n＝0-4，前提是至少一个D为(CH2)n，其中n＝1-4；
·X1为如下所列式中的任一个：
表I
在通式I中与C和Cl键合的碳的C-C键可以以R或S形式存在，或者该组合物可以是外消旋混合物的一部分。在优选的实施方案中，IQB-CBI化合物具有S,S构型，并且优选地是立体异构体(stereoismetrically)纯的。
在另一方面，本文提供了具有通式II结构的抗体-药物偶联物：
其中：
是抗体或抗体片段；
W-RM是由W和Rx形成的连接部分，其中W是连接抗体/抗体片段的天然或非天然氨基酸残基的部分，Rx是琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、环辛炔基、氨基氧基、二磺酰基、磺酰基或异硫氰酸酯部分，使得W-RM是二硫化物、硫醇化的琥珀酰亚胺基、氨基取代的琥珀酰亚胺基、(环辛基)-1,4-三唑基、肟取代的N-聚糖、肟、取代的双-磺丙基、磺酰胺基、酰胺或硫代氨基甲酸酯部分；
L是连接基；
IQB-CBI是具有通式I结构的化合物：
其中：
·在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间显示的点状键独立地为单键或双键；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在双键时，–C(Ra)-是烯属的并具有取代基Ra，并且-N(Rb)-中的Rb不存在；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在单键时，–C(Ra)-为饱和的并除了Ra取代基之外还具有氢取代基，并且-N(Rb)-中的Rb存在；
·Ra独立地为H或OH；
·如果存在，则Rb为H或-L-；
·-L-是连接基L，其中L是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地引入醚、氧代、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、支链、环状、杂环、芳族或杂芳族部分；
·R2选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基；
·R3、R3’、R4、R4’、R6和R6’各自独立地选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，或者如果Y为N，则不存在；
·R5或R5’中的每一个独立地为NH2、CO2H、H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-L-、-L-Rx或-L-Sc，或者如果Y为N，则不存在；
·R7为H；
·G’-Rb’选自OH、O-L、O-L-Rx、O-L-Sc、NH2、NH-L、NH-L-Rx或NH-L-Sc；
·每个Y独立地为N或C；
·每个D独立地为(CH2)n，其中n＝0-4，前提是至少一个D为(CH2)n，其中n＝1-4；
·X1为选自下列式的间隔基团：
Rb、R5、R5’和G’-Rb’中的至少一个包含–L–。
在优选的实施方案中，通式II的抗体-药物偶联物具有以下结构：
其中：
是抗体或抗体片段；
W-RM是由W和Rx形成的连接部分，其中W是连接抗体/抗体片段的天然或非天然氨基酸残基的部分，Rx是琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、环辛炔基、氨基氧基、二磺酰基、磺酰基或异硫氰酸酯部分，使得W-RM是二硫化物、硫醇化的琥珀酰亚胺基、氨基取代的琥珀酰亚胺基、(环辛基)-1,4-三唑基、肟取代的N-聚糖、肟、取代的双-磺丙基、磺酰胺基、酰胺或硫代氨基甲酸酯部分；
L是连接基L；其中连接基L是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地引入醚、氧代、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、氨基酸、杂环、芳族或杂芳族部分；
IQB-CBI是具有通式I结构的化合物：
其中：
·在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间显示的点状键独立地为单键或双键；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在双键时，–C(Ra)-是烯属的并具有取代基Ra，并且-N(Rb)-中的Rb不存在；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在单键时，–C(Ra)-为饱和的并除了Ra取代基之外还具有氢取代基，并且-N(Rb)-中的Rb存在；
·Ra独立地为H或OH；
·如果存在，则Rb为H或为与连接基L连接的键；
·R2选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基；
·R3、R3’、R4、R4’、R6和R6’各自独立地选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，或者如果Y为N，则不存在；
·R5或R5’中的每一个独立地为NH2、CO2H、H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，为与连接基L连接的键，或者如果Y为N，则不存在；
·R7为H；
·G’-Rb’选自OH、O-L、NH2或NH-L，其中L是连接基L；
·每个Y独立地为N或C；
·每个D独立地为(CH2)n，其中n＝0-4，前提是至少一个D为(CH2)n，其中n＝1-4；
·X1为选自下列的间隔基：
其中Rb、R5、R5’和G-Rb’中的至少一个是与连接基L连接的键或包含连接基L。
在优选的实施方案中，通式I的IQB-CBI化合物具有如下的S,S立体化学：
其中上述IQB-CBI化合物的所有取代基如上文所定义。类似地，在优选的实施方案中，通式II的抗体-药物偶联物的IQB-CBI部分也具有S,S立体化学。
附图说明
图1显示了IQB-酸11a-e的合成。
图2显示了氨基CBI部分的合成和IQB-氨基CBI二聚体的最终组装。
图3显示羟基CBI部分的合成和D811、D813、D815和D817的最终组装。
图4显示了IQB-氨基-CBI二聚体化合物和IQB-羟基-CBI二聚体化合物的结构。
图5显示了IQB-酸11的合成，其中间隔基团X1选自例如表I中公开的X1间隔基。
图6显示CBI部分的合成和IQB-CBI二聚体变体的组装，其中X1间隔基选自例如表I中公开的X1间隔基。
图7显示了连接基L的合成。
图8显示碳酸酯D816的合成。
图9显示氨基甲酸酯D818的合成。
图10显示醚衍生物(D820和D820b)的合成。
图11显示了连接基L的合成。
图12显示CBI部分的合成。
图13显示了IQB部分的合成和最终组装(第1部分)。
图14显示了IQB部分的合成和最终组装(第2部分)。
图15显示IL1RAP-IQB-CBI二聚体(D816-D820)-ADC的结合测定的结果。
图16显示IL1RAP-IQB-CBI二聚体(D822,D824,D826,D828)-ADC的结合测定的结果。
图17显示抗-IL1RAP-D816ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
图18显示抗-IL1RAP-D818ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
图19显示抗-IL1RAP-D820ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
图20显示抗-IL1RAP-D822ADC的靶标依赖性细胞杀伤
图21显示抗-IL1RAP-D824ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
图22显示抗-IL1RAP-D826ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
图23显示抗-IL1RAP-D828ADC的靶标依赖性细胞杀伤。
详细说明
I.化合物
本公开提供了通式I的异喹啉并苯并二氮杂卓-1(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(“IQB-CBI”)化合物、通式II的抗体-药物偶联物以及使用通式I化合物和通式II的抗体-药物偶联物的方法。在一个方面，通式I的IQB-CBI化合物具有如本文所述的以下结构：
另一方面，通式II的抗体-药物偶联物具有如本文所述的以下结构：
II.定义
如本文所提及的，“烷基”意指具有所规定的碳原子数(即，C1-C6表示1-6个碳原子)的饱和的、支链或直链或环状的单价烃基，其衍生自从母体烷烃的单个碳原子上除去一个氢原子。典型的烷基包括但不限于甲基；乙基；丙基，例如丙-1-基、丙-2-基、环丙-1-基；丁基，例如丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基、环丁-1-基；等等。在一些实施方案中，“烷基”意指具有所规定的碳原子数(即，C1-C6表示1-6个碳原子)的饱和的、支链或直链单价烃基，其衍生自从母体烷烃的单个碳原子上除去一个氢原子。典型的烷基包括但不限于甲基；乙基；丙基，例如丙-1-基、丙-2-基；丁基，例如丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基；等等。
如本文所提及的，“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的不饱和的支链、直链或环状烃基，其衍生自从母体烯烃的单个碳原子上除去一个氢原子。该基团关于双键可以是顺式或反式构象。典型的烯基包括但不限于乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯-1基；环丙-2-烯-1-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1,3-二烯-1-基等；等等。如本文所用，“低级烯基”意指(C2-C8)烯基。在一些实施方案中，“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的不饱和的支链、直链烃基，其衍生自从母体烯烃的单个碳原子上除去一个氢原子。该基团关于双键可以是顺式或反式构象。典型的烯基包括但不限于乙烯基；丙烯基，例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等；等等。如本文所用，“低级烯基”意指(C2-C8)烯基。
如本文所提及的，“炔基”意指具有至少一个碳-碳叁键的不饱和的支链、直链或环状烃基，其衍生自从母体炔烃的单个碳原子上除去一个氢原子。典型的炔基包括但不限于乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。如本文所用，“低级炔基”意指(C2-C8)炔基。在一些实施方案中，“炔基”意指具有至少一个碳-碳叁键的不饱和的支链、直链烃基，其衍生自从母体炔烃的单个碳原子上除去一个氢原子。典型的炔基包括但不限于乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。如本文所用，“低级炔基”是指(C2-C8)炔基。
环状的烷基、烯基和炔基也由术语“环烃基”定义，其意指含有3至12个环原子或所指明的原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥联环或多环的集合。环烃基可包括任何数量的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。饱和的单环环烃基环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的双环和多环环烃基环包括，例如，降莰烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢化萘和金刚烷。环烃基也可以是部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或叄键。代表性的部分不饱和的环烃基包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烃基是饱和的单环C3-8环烃基时，示例性的基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烃基是饱和的单环C3-6环烃基时，示例性的基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烃基可以是取代的或未取代的。
如本文所提及，“亚烷基”意指二价烷基部分。
如本文所提及的，“烷氧基”意指具有连接烷基与连接点的氧原子的烷基：烷基-O-。至于烷基，烷氧基可具有任何合适数目的碳原子，例如C1-6。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以被本文所述的各种取代基进一步取代。烷氧基可以是取代的或未取代的。
如本文所提及的，“卤化物”表示氟、氯、溴或碘。
如本文所提及，“羧酰胺”意指具有式–C(＝O)NH2的单价部分。在一些实施方案中，酰胺氢中的一个或两个可以被除氢之外的取代基替代。
如本文所提及的“羧酰胺基”意指具有式–C(＝O)N(H)-的二价部分。在一些实施方案中，酰胺氢可以被其它取代基替代。
如本文所提及的，“氧代”意指具有式的部分，其与碳连接。
如本文所提及的，“羧基”意指具有式-C(O)OH或–C(O)O-的部分。
如本文所提及的，“杂烷基”意指任何合适长度的并且具有1至3个诸如N、O和S的杂原子的烷基。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基可包括醚、硫醚和烷基胺。杂烷基的杂原子部分可以替代烷基的氢以形成羟基、巯基或氨基。或者，杂原子部分可以是连接原子，或插入两个碳原子之间。
如本文所提及的，“杂环的”或“杂环基”意指具有杂原子取代替换环碳的饱和或部分不饱和的非芳族的单环或多环烃基环状部分的部分。本发明的杂环可含有3至20个环原子，其中1至5个或更多个环原子是杂原子，例如N、O或S。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于，B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂环基团可包括任何数目的环原子，例如3至6个、4至6个、5至6个、3至8个、4至8个、5至8个、6至8个、3至9个、3至10个、3至11个或3至12个环成员。杂环基团中可包含任何合适数量的杂原子，例如1、2、3、4或5、或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5。杂环基团可具有3至8个环成员和1至4个杂原子，或3至8个环成员和1至3个杂原子，或3至6个环成员和1至4个杂原子，或3至6个环成员和1至3个杂原子。多环杂环部分可具有稠合环。典型的杂环基团包括但不限于四氢呋喃基(例如，四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基等)、哌啶基(例如，哌啶-1-基、哌啶-2-基等)、吗啉基(例如，吗啉-3-基、吗啉-4-基等)、哌嗪基(例如，哌嗪-1-基、哌嗪-2-基等)等。
如本文所提及的，“芳族”或“芳基”意指具有所规定的碳原子数(即，C6-C14表示6-14个碳原子)的单价芳族烃基，其衍生自从母体芳族环系的单个碳原子上除去一个氢原子。典型的芳基包括但不限于衍生自以下的基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊环、苯、、六苯并苯、荧蒽、芴、并六苯、萘并四并苯、己烯(hexylene)、不对称-引达省、对称-引达省、茚满、茚、萘、并八苯、octaphene、octalene、卵苯、并五苯、并环戊二烯、五苯、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽、玉红省、苯并菲、三萘等，以及它们的各种氢化异构体(hydroisomers)。具体的示例性芳基包括苯基和萘基。
如本文所提及的，“杂芳族”或“杂芳基”意指含有5至16个环原子的单环或稠合双环或三环的芳族环集合，其中1至5个环原子是杂原子，例如N、O或S。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂芳基可包括任何数目的环原子，例如5至6个、5至8个、6至8个、5至9个、5至10个、5至11个或5至12个环成员。杂芳基中可包括任何合适数目的杂原子，例如1、2、3、4或5个、或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5个。杂芳基可具有5至8个环成员和1至4个杂原子，或5至8个环成员和1至3个杂原子，或5至6个环成员和1至4个杂原子，或5至6个环成员和1至3个杂原子。杂芳基可包括诸如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑的基团。杂芳基也可稠合到芳族环系统，例如苯环，以形成成员，所述成员包括但不限于苯并吡咯如吲哚和异吲哚、苯并吡啶如喹啉和异喹啉、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉))、苯并哒嗪如酞嗪和噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其它杂芳基包括通过键连接的杂芳基环，例如联吡啶。杂芳基可以是取代的或未取代的。
如本文所提及的，“C1-C12”意指所述基团中包括的碳原子数的范围。例如，C1-C12烷基具有1个碳原子至12个碳原子，并且可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳中的任何一个。C1烷基是甲基，C2烷基是乙基，等等。提及C1-C10意指1至10个碳，C1-C6意指1至6个碳，C1-C3意指1至3个碳，等等。
如本文所提及，“取代的”是指具有除去的氢基团和替代该氢基团的另一个非氢取代基的部分。只要遵守化学价的规则，可以在任何部分中引入一个以上的取代基。适用于烷基、烯基、炔基、芳族基团或杂环基团的取代基包括但不限于以下取代基：-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2、-CO2H、-CO2R、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NR2、卤化物、氧代和R，其中R是C1-C6烷基。
如本文所提及的，波浪键表示本发明的化合物的立体中心。本领域技术人员将理解，该键将决定分子的手性构型(R或S并最终的右旋或左旋效果)。切割键和楔形键用于表示特定的手性构型。本发明的IQB-CBI化合物，以及引入这类IQB-CBI化合物的抗体-药物偶联物可以具有例如下列立体化学：S,S；R,R；S,R和R,S。在通式I的IQB-CBI化合物中，以及在通式II的引入IQB-CBI化合物的抗体-药物偶联物中，优选S,S立体化学，并且进一步优选地通式I的IQB-CBI化合物是立体异构体纯的或对映体纯的(至少80％对映体纯、至少85％对映体纯、至少90％对映体纯、至少95％对映体纯、至少97％对映体纯、至少100％对映体纯)。
如本文所提及的，术语“核酸”是指通过核苷间键合而连接的核苷(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷或其类似物)的线性聚合物。核酸可包括术语“多核苷酸”以及“寡核苷酸”。线性聚合物可以由一系列字母表示，例如“ATGCCTG”，其中应被理解为核苷酸从左到右为5'至3'顺序，并且除非另有说明，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，以及“T”表示脱氧胸苷。另一种天然核苷酸是“U”，表示尿苷。字母A、C、G、T和U可用于指碱基本身、核苷或包含碱基的核苷酸，正如本领域中的标准。在天然存在的核酸中，核苷间键合通常是磷酸二酯键，并且亚单元被称为“核苷酸”。核酸还可以包括其它核苷间键合，例如硫代磷酸酯键等。不包括磷酸酯基团的这种核苷酸类似物被认为落入本文所用的术语“核苷酸”的范围内，并且包含一个或多个不是磷酸二酯键的核苷间键合的核酸仍被称为“多核苷酸”、“寡核苷酸”等
术语“氨基酸”是指二十种“经典的”或“天然的”氨基酸，以及“非经典的”氨基酸，也称为“非天然的”氨基酸，例如经修饰的或合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。经修饰的氨基酸包括例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐(酯)和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物可具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构的化学化合物，但其功能类似于天然存在的氨基酸。
连接基L是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地包含醚、氧代、羧基、羧酰胺、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、支链、环状、不饱和的、氨基酸、杂环的、芳族的或杂芳族的部分。连接基L可以是非支链的或支链的、柔性的或刚性的、短的或长的，并且可以包含被认为有用的部分的任意组合。在一些实施方案中，连接基L的至少一部分可具有聚环氧烷聚合物区域，其可增强通式I或通II化合物的溶解度。在一些实施方案中，连接基L可以具有乙二醇的重复单元，并且可以具有约1个至约25个或于其间的任何数目的重复的乙二醇单元。在一些实施方案中，L可包括约3至约20、约4至约15、约5至约12或约6至约10个乙二醇单元。在一些实施方案中，连接基L的至少一部分可以包括一个或多个氨基酸部分，所述氨基酸部分可以为通式I或通II的化合物提供增强的溶解度，或者可以提供氨基酸序列以增强靶标结合，增强与靶标结合剂的相容性，或增强靶标结合识别。在其他实施方案中，连接基L可包括一个或多个氨基酸部分，所述氨基酸部分为蛋白酶提供合适的底物基序。当将一组氨基酸部分引入连接基L中以提供对所选的蛋白酶特异的底物基序时，通式I或通II的细胞毒性药物化合物可以从靶标结合的偶联物中释放以提供局部的细胞毒性作用。此类底物基序是本领域已知的，并且可以根据需要被引入连接基L中以提供从靶标结合的偶联物中的选择性释放。该选择性可以基于偶联物药物的局部递送区域内已知的所需蛋白酶的存在。其它聚合物类型的部分可以被引入连接基L中，例如多酸、多糖或多胺。其它部分如取代的芳族或杂芳族部分可用于增强刚性或在其中的取代基上提供合成可及位点，用于连接至反应性部分或连接至通式I或通II化合物。
连接基L可包括多种基团或部分。例如，连接基L可包括间隔基(-YL-)、氨基酸序列(XAA)和聚乙二醇(PEG或-CH2CH2O-)部分。代表性的连接基可以具有以下结构：
-YL-XAA-PEG-。
氨基酸单元(-XAA-)，当其存在时，连接PEG单元(如果存在)或反应性部分至间隔基单元(如果间隔基单元存在)。XAA是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。XAA基团的每个氨基酸可以是精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或瓜氨酸(Cit)。本发明化合物的XAA单元可以被一种或多种酶(包括肿瘤相关的蛋白酶)酶促切割，以释放IQB-CBI单元。优选的XAA单元包括但不限于Ala-Val、Val-Ala和Val-Cit。
间隔基-YL-，当存在时，将氨基酸单元连接至IQB单元(当氨基酸单元存在时)。间隔基单元有两种一般类型：自毁的(self-immolative)和非自毁的(non-self-immolative)。非自毁的间隔基单元是从抗体-药物偶联物(ADC)中裂解(特别是酶促地)氨基酸单元之后，部分或全部的间隔基单元保持与IQB单元结合的单元。非自毁的间隔基单元的实例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔基单元和甘氨酸间隔基单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔基单元或甘氨酸间隔基单元的本发明化合物经由肿瘤细胞相关的蛋白酶、癌细胞相关的蛋白酶或淋巴细胞相关的蛋白酶经历酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物部分或甘氨酸-药物部分从L-Aa-Ww-中切割。在一个实施方案中，在靶细胞内发生独立的水解反应，裂解甘氨酸-药物单元键并释放药物。
在优选的实施方案中，-YL-是对氨基苯甲醇(PAB)单元：
在一个实施方案中，非自毁的间隔基单元(-YL-)是-Gly-Gly-。
在一个实施方案中，非自毁的间隔基单元(-YL-)是-Gly-。
在一个实施方案中，本发明提供了其中不存在间隔基单元的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
或者，含有自毁的间隔基单元的本发明化合物可以释放IQB或CBI单元而无需单独的水解步骤。在该实施方案中，-YL-是通过PAB基团的氨基氮原子与-XAA-连接的PAB基团，并通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接与IQB或CBI单元连接。
在一些实施方案中，–L-Rx具有结构：
其中：
T是自毁基团，例如上文描述的那些以及对氨基苄氧基羰基基团或对氨基苯甲醇(PAB)单元；
t为0或1；
Aa和每个Ab独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p为1、2、3或4；
q为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
n为1、2、3、4或5；
s为0或1；
Rx为
波浪线表示连接的位置，即连接的点。
自毁间隔基的其他实例包括但不限于与PAB基团电子相似的芳族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(参见Hay et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1999,9,2237)和邻位-或对位-氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔基，例如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues et al.,Chemistry Biology,1995,2,223)，适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Storm,et al.,J.Amer.Chem.Soc.,1972,94,5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry,et al.,J.Org.Chem.,1990,55,5867)。在甘氨酸的α-位取代的含胺药物的消除(Kingsbury,et al.,J.Med.Chem.,1984,27,1447)也是可用于本发明化合物的自毁间隔基的实例。
优选的间隔单元(-YL-)可以是：
例如，连接基L可包括乙二醇重复单元和氨基酸序列。在一些实施方案中，连接基L包括以下式：
-(CH2CH2O)1-50-XAA-
其中XAA为氨基酸序列。
可在本发明的连接基L中使用任何合适数目的乙二醇单元。例如，连接基L可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50或更多个乙二醇单元(包括1至40个乙二醇单元内的所有范围，包括下限和上限)。例如，连接基L可包括1至25个乙二醇单元，优选2至20个乙二醇单元，更优选2至15个，甚至更优选5至15个乙二醇单元。在一些实施方案中，连接基L可包括8个乙二醇单元。几种可商购的乙二醇基团(聚乙二醇，PEG)适用于连接基L中，例如具有有8个乙二醇重复单元的离散的(“d”)聚乙二醇的 8-C(O)OH。其它的离散的PEG单元是可商购的并且是本领域技术人员已知的，例如AdvancedChemTech。本领域技术人员认识到 8-C(O)OH具有下式：
因此，当 8-C(O)OH并入本发明的连接基L中时，它可以被写成-HN-dPEG8-C(O)-或-HN-dPEG8-CH2CH2-C(O)-。
在一些实施方案中，所述连接基L包括下式：
-HN-PEG-C(O)-XAA-
其中PEG具有1-50个乙二醇单元，并且XAA是氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述连接基L包括下式：
-HN-PEG-CH2CH2-C(O)-XAA-
其中PEG具有1-50个乙二醇单元，并且XAA是氨基酸序列。
如上所述，连接基L的氨基酸部分可包括任何合适数量的氨基酸部分。例如，氨基酸序列XAA可包括1至100个氨基酸部分，或1至10个氨基酸部分，或1至5个氨基酸部分。连接基L可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸部分。在一些实施方案中，连接基L包括2个氨基酸部分。在一些实施方案中，连接基L包括氨基酸序列Val-Ala。在一些实施方案中，连接基L包括下式：
-HN-PEG8-C(O)-Val-Ala-
其中PEG8具有8个乙二醇单元。
在一些实施方案中，所述连接基L包括下式：
-HN-PEG8-CH2CH2-C(O)-Val-Ala-
其中PEG8具有8个乙二醇单元。
连接基L还可以包括各种其它连接基团，该连接基团将乙二醇部分与氨基酸序列连接，或者将乙二醇或氨基酸序列与反应性部分Rx、物质Sc或通式I和II的化合物连接。例如，氨基酸序列可以通过4-氨基苄基羧酸酯基团与通式I和II的化合物连接。在一些实施方案中，乙二醇部分可以直接与反应性部分Rx或物质Sc连接。在一些实施方案中，连接基L具有下式：
连接基L还可以包括各种其他连接基团，该连接基团将乙二醇部分与氨基酸序列连接或者将乙二醇或氨基酸序列与反应性部分Rx、物质Sc或通式I和II的化合物连接。例如，氨基酸序列可以通过4-氨基苄基羧酸酯基团与通式I和II的化合物连接。在一些实施方案中，乙二醇部分可以直接与反应性部分Rx或物质Sc连接。在一些实施方案中，连接基L具有下式：
Rx是反应性部分。Rx可以是任何合适的反应性部分，只要其能够与物质Sc上存在的相应的反应性部分反应，物质Sc可以是如本文所述的靶标结合剂。在各种实施方案中，Sc是蛋白质或蛋白质的一部分，并且具有可接近的可偶联部分，例如：
硫醇/二硫化物。可与硫醇或二硫化物反应的反应性部分Rx包括马来酰亚胺、碘乙酰胺、叠氮化物、噻唑和吡啶并哒嗪。也可以通过使用双砜反应性部分来标记二硫化物。另外，马来酰亚胺反应性部分可与工程化的硒代半胱氨酸部分反应。
胺。可用于将IQB-CBI化合物的IQB单元或CBI单元与靶标结合剂Sc偶联的反应性部分Rx包括异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物、羧酸(在碳二亚胺偶联剂的存在下)、磺基琥珀酰亚胺酯、4-磺基四氟苯酯、四氟苯酯和磺基二氯苯酚酯。该列表决不是限制性的，可以使用能够与靶标结合剂Sc的胺反应的其他反应性部分Rx。
醛/酮。可将这些部分引入靶标结合剂Sc中，并随后与具有-L-Rx的通式I和II化合物反应，其中反应性部分Rx为肼、半酰肼、碳酰肼或羟胺。该列表决不是限制性的，可以使用能够与靶标结合剂Sc的醛反应的其他反应性部分Rx。
可用于通式I和II化合物中的其他反应性部分Rx包括叠氮化物、膦或炔烃，其可用于施陶丁格反应、Pictet-Spengler反应和/或点击型化学(含铜或不含铜)以选择性标记包括抗体及其片段的蛋白质。这是用于与靶标结合剂Sc上的工程化位点反应的反应性部分Rx的非限制性列表。
在一些实施方案中，Rx可以是马来酰亚胺、双砜、碘乙酰胺、叠氮化物、异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物、羧酸、半酰肼、碳酰肼、羟胺、膦或炔烃。
L-Rx是连接至反应性部分Rx的连接基L。-L-Rx可以用于通式I或II的化合物中以形成带有IQB-CBI化合物的试剂，所述IQB-CBI化合物可以与物质Sc连接，物质Sc可以是如本文所述的靶标结合剂。本文所述的连接基L和反应性部分Rx的任何组合可用于通式I或II的化合物中。参见图7，其示出了一些示例性-L-Rx。
已知许多其他化学物质用于将化合物与抗体连接。美国专利第7,595,292号(Brocchini等人)提到了与抗体的二硫键中的硫形成硫酯的连接基。美国专利第7,985,783号(Carico等人)提到将醛残基引入抗体内，其用于将化合物偶联至该抗体。
Sc是选自蛋白质、蛋白质的一部分、肽或核酸的靶标结合剂。在一些实施方案中，为蛋白质的靶标结合剂可包括抗体、抗体片段或抗体单链片段变量(“scFV”)。靶标结合剂可以与肿瘤相关抗原、癌症-干细胞相关抗原或病毒抗原结合。
在各种实施方案中，靶标结合剂Sc可结合选自如下的靶标：急性髓系白血病(AMLM4)细胞、急性早幼粒细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞(acute lymphoblasticleukemia cell)、急性淋巴细胞白血病细胞(acute lymphocytic leukemia cell)、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓系白血病细胞、慢性T-细胞淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征细胞、多发性骨髓瘤细胞、前列腺癌细胞、肾细胞腺癌细胞、胰腺腺癌细胞、肺癌细胞或胃腺癌细胞、胃腺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、黑素瘤细胞、甲状腺癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、头颈癌细胞、食道癌细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、间皮瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、神经内分泌肿瘤细胞、神经纤维瘤病1型(NF1)细胞、神经纤维瘤病2型(NF2))或骨肉瘤细胞。
在一些其他实施方案中，靶标结合剂Sc可结合选自如下的靶标：CLL-1、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、GPR114、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体-α、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、路易斯Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4、内皮唾液酸蛋白/CD248。
在其他实施方案中，靶标结合剂Sc可以是双特异性抗体/抗体片段。在一些实施方案中，双特异性抗体/抗体片段结合选自如下的一个或两个靶标：CLL-1、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、GPR114、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPV E6、HPVE7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、路易斯Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4、内皮唾液酸蛋白/CD248、Ly6e(RIG-e)、CD79a、CD274(PD-L1)、CD38、DLL4、CD319(SLAM7)。
III.偶联物
可以使用各种已知的交联剂将靶标结合部分连接至本公开的IQB-CBI化合物。用于将部分与多肽共价或非共价连接的方法是本领域熟知的。此类方法可包括但不限于使用化学交联剂、光活化交联剂和/或双功能交联剂。交联分子的示例性方法公开在美国专利第5,603,872号和美国专利第5,401,511号中。交联剂的非限制性实例包括戊二醛、双官能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚、碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或二环己基碳二亚胺、双酰亚胺酯、二硝基苯、辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、二甲基-3,3'-二硫代-双丙酰亚胺酯、叠氮基乙二醛、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯和4-(溴代氨基乙基)-2-硝基苯基叠氮化物。
在一些实施方案中，靶标结合部分包含抗体。术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其片段(“抗体片段”)，其特异性结合并识别抗原。通常，“可变区”包含抗体的抗原结合区(或其功能等同物)，并且在结合的特异性和亲和性方面是最关键的。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD).
“同种型”是由重链恒定区限定的一类抗体。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其又分别定义同种型类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以作为完整的免疫球蛋白或作为包括特异性抗原结合活性的许多充分表征的片段中的任何一种存在，例如F(ab)′2或Fab′单体。
“单克隆抗体”是指对抗原上的给定表位具有单一结合特异性和亲和性的抗体的克隆制剂。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生的但具有不同的结合特异性和亲和性的抗体制剂。“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区、CDR或其部分)与不同或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区连接，或赋予该嵌合抗体新的特性的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR和框架区)改变、替换或交换。
“人源化抗体”是指免疫球蛋白分子抗体，其中将从非人抗体的VH和VL区获得的抗原结合环(即CDR)移植到人框架序列上。人源化，即用非人CDR序列代替人抗体的相应序列可以按照在如下中描述的方法进行：例如美国专利第5,545,806；5,569,825；5,633,425；5,661,016号；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)。转基因小鼠或其他生物体如其他哺乳动物也可用于表达人源化或人抗体，如美国专利第6,673,986号中所公开的。.
如本文所用的术语“半胱氨酸取代的抗体”是指包含至少一个已被半胱氨酸取代的非天然存在的恒定区免疫球蛋白氨基酸残基的抗体。非天然存在的取代是非同种型的取代。在一个实施方案中，取代的残基是重链恒定区。半胱氨酸取代的抗体的非限制性实例包括取代S156C和S239C。
术语“抗原”、“抗体靶标”等术语是指被抗体识别的，即可以被抗体特异性结合的分子、化合物或复合物。抗体与抗原上的“表位”结合。
术语“对……特异性”、“特异性结合”和类似术语是指具有比非靶标化合物至少2倍高的亲和性、例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍高的亲和性中的任何一个亲和性的与靶标结合的分子(例如，抗体或抗体片段)。例如，特异性结合第一抗体的抗体通常以比非第一抗体靶标(例如，来自不同物种或不同同种型的抗体，或者非抗体靶标)至少2倍高的亲和性结合第一抗体。
关于抗体靶标(例如，抗原、分析物、免疫复合物)的术语“捕获”通常表明抗体结合在纯群体中的大多数抗体靶标(假设适当的摩尔比)。例如，结合给定抗体靶标的抗体通常结合溶液中的至少2/3的抗体靶标(例如，至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％中的任一个)。技术人员将认识到，取决于测定结合的方法和/或阈值，将引起一些可变性。
如上所述，抗体或其片段可以具有官能团，所述官能团可以是具有-L-Rx的通式I或II化合物对于偶联的有吸引力的靶标。引入-L-Rx的其中马来酰亚胺是反应性部分的化合物可以与半胱氨酸残基的硫醇或由两个半胱氨酸侧链形成的二硫化物反应，其中可以在抗体或其片段上获得。或者，与通式I或II化合物的连接基连接的叠氮基或碘乙酰胺基反应性部分也可以与半胱氨酸残基的硫醇或分子内形成的二硫化物形成偶联物。通过使用具有-L-Rx的其中反应性部分是双砜的通式I或II化合物可以特异性地靶向二硫化物，其可以立即连接至两个侧链。
抗体或其片段的赖氨酸侧链可以与具有-L-Rx的通式I或II的化合物偶联，其中选择反应性部分但不限于异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物、羧酸、磺基琥珀酰亚胺酯、4-磺基四氟苯酯、四氟苯酯和磺基二氯苯酚酯。当羧酸是反应性部分时，与赖氨酸侧链氨基部分的连接反应在偶联剂如碳二亚胺的存在下进行，偶联剂原位活化羧酸。
谷氨酰胺侧链可以被具有-L-Rx的其中反应性部分是氨基烷基部分的IQB-CBI靶向。氨基部分可以是修饰的转谷氨酰胺酶的底物以提供谷氨酰胺酰基偶联的IQB-CBI。
可以通过氧化处理(通常是抗体的聚糖部分的氧化处理)在诸如抗体或其片段的靶标结合剂上产生醛或酮。高碘酸盐或其他氧化剂可用于产生这些含羰基的位点，其可被具有-L-Rx的通式I的IQB-CBI化合物靶向，其中反应性部分是肼、半酰肼、碳酰肼或羟胺。
诸如抗体或其片段的靶标结合剂上的工程化功能部分也可以被具有-L-Rx的通式I或II化合物偶联。硒代半胱氨酸可以被核糖体地引入工程抗体片段中，这可以提供与具有马来酰亚胺反应性部分的IQB或CBI单元进行高度辨别的偶联反应。
可以将叠氮基或环辛炔部分工程化至靶标结合剂内，其然后可以使用无铜点击化学允许具有-L-Rx的IQB的相反的反应性部分，环辛炔基或叠氮基反应性基团。
经由核糖体结合(ribosomal incorporation)的非天然氨基酸的引入可以将对乙酰基苯丙氨酸引入靶标结合剂中。乙酰基可以与具有-L-Rx的其中反应性部分是氨基氧基反应性基团的IQB或CBI偶联，提供靶标结合剂的肟偶联产物。通过此方法引入的另一种非天然氨基酸可以提供赖氨酸的叠氮基衍生物，其可以与具有-L-Rx的其中反应性部分是环辛炔的IQB或CBI反应，并且使用无铜点击化学。
这些实例决不是限制性的；通过使用具有-L-Rx的通式I的IQB-CBI化合物以形成具有-L-Sc的通式的偶联物，设想了用于诸如抗体或其片段的靶标结合剂的所限定的偶联的许多其他方法。
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物可具有如本文所定义的通式II的结构。
IV.药物组合物
含有本发明化合物作为活性成分的剂型可有利地用于治疗或预防增殖性疾病。剂型可以单独地或与其他药剂组合地给药或施用。制剂还可以与另一种药物活性剂(包括另一种化合物)联合地将本发明化合物递送给对象。
本公开的用于人类医疗应用的制剂包含活性成分以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗成分。在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无毒害的意义上，载体必须是“可接受的”。
术语“有效量”、“有效剂量”、“治疗有效量”等是指如本文所述的，足以改善病症的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的治疗效果的增加或减少。治疗功效也可表达为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可以比对照具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的效果。
可以制备用于向对象粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、口腔或直肠)、肠胃外(例如皮下、静脉内、肌内或动脉内注射、推注或输注)、口服或透皮给药的剂型。剂型的实例包括但不限于：分散体；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂)；糊剂；粉末；敷料；乳膏剂；硬膏剂；溶液；贴剂；气溶胶(例如，鼻腔喷雾剂或吸入剂)；凝胶；适用于向对象口服或粘膜给药的液体剂型，包括混悬剂(例如水性或非水性液体混悬剂，水包油乳剂或油包水液体乳剂)，溶液和酏剂；适用于向对象肠胃外给药的液体剂型；和灭菌固体制剂(例如，结晶的或无定形的固体)，其可以被重组以提供适合于向对象肠胃外给药的液体剂型。
可注射的(例如，静脉内)组合物可包含悬浮在可接受的载体(例如水性载体)中的本发明的IQB-CBI化合物或抗体-药物偶联物的溶液。可以使用多种水性载体中的任何一种，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％右旋糖等，并且可以包括用于增强稳定性的糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，将使用正常的缓冲盐水(135-150mM NaCl)。该组合物可含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等等。在一些实施方案中，该组合物可以配制在用于静脉内给药的试剂盒中。
适于肠胃外给药的制剂，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径，包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射溶液和悬浮液也可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。在本发明的实践中，组合物可以例如通过静脉内输注、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内给药。肠胃外给药和静脉内给药是优选的给药方法。本发明的IQB-CBI化合物或抗体-药物偶联物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。
本公开的药理活性化合物可用于制备药物组合物，所述药物组合物包含有效量的与适于肠内或肠胃外施用的赋形剂或载体结合或混合的药理活性化合物。优选的是片剂和明胶胶囊，其包含活性成分和一种或多种下列物质：(a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸等；(b)润滑剂，如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸的镁盐或钙盐、聚乙二醇等；对于片剂还；(c)粘合剂，如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮等；并且，如果需要，(d)崩解剂，如泡腾混合物等；(e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂等。
制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。所有方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，将产物成型为所需的制剂来制备制剂。
所述药物组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备，并含有约0.1至75％、优选约1至50％的活性成分。
制剂中的活性剂的浓度可以变化很大，并且取决于多种因素，包括待治疗的疾病或病况、活性剂的性质和活性、所需的效果、可能的不良反应、活性剂达到其预期靶标的能力和速度，以及在对象和医师的特定知识内的其他因素。制剂通常含有约0.5wt％至50wt％活性剂，优选约0.5wt％至5wt％活性剂，最佳约5wt％至20wt％活性剂。.
还可以配制本发明的IQB-CBI化合物或IQB-CBI抗体-药物偶联物以提供一种以上的活性化合物，例如另外的化学治疗剂或细胞毒素剂、细胞因子或生长抑制剂。活性成分也可以制备为缓释制剂(例如，固体疏水聚合物的半透性基质(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))或聚丙交酯。抗体和免疫偶联物可以被包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的纳米颗粒中，例如，分别在羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。
本公开内容的IQB-CBI或IQB-CBI抗体-药物偶联物可以采取药学上可接受的盐的形式，例如，为药学上可接受的并且具有所需的母体化合物的药理学活性的化合物的盐。这些盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸形成，如乙酸、丁酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、戊酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等，通过常规化学方法制备；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子或者被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替换，或者与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等配位时形成的盐，通过常规化学方法制备。
V.应用方法
A.增殖性疾病的治疗
本公开的化合物抑制细胞生长(增殖)，因此可用于药物组合物中以治疗对象，例如脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。IQB-CBI可以单独给药或作为抗体-药物偶联物给药，其中它们与细胞靶向剂例如抗体偶联。
“对象”、“患者”、“个体”和类似术语可互换使用，并且除非另有说明，否则指哺乳动物如人和非人灵长类动物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。该术语不一定表示对象已被诊断患有特定疾病，但通常“患者”是指在医疗监督下的个体。患者可以是寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。“癌症患者”可以指已经被诊断患有癌症、目前正在遵循治疗方案、或者处于复发风险(例如手术以切除肿瘤之后)的个体。在一些实施方案中，癌症患者已被诊断患有癌症并且是治疗的候选者。癌症患者可包括未接受治疗、目前正在接受治疗、已接受过手术以及已停止治疗的患者。
术语“疗法”、“治疗”和“改善”是指症状严重程度的任何降低。在治疗癌症的情况下，治疗可以指例如减小肿瘤大小、降低癌细胞数量、降低生长速率、降低转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减少恶心和其他化学疗法或放射疗法副作用等。在治疗炎性病况的情况下，治疗可以指例如降低炎性细胞因子的血液水平、减少疼痛、肿胀、免疫细胞的募集等。如本文所用，术语“治疗”和“预防”不旨在是绝对的术语。治疗和预防可以指发病的任何延迟、症状的改善、患者存活率的提高、存活时间或速度的增加等。治疗和预防可以是完全的(肿瘤细胞的不可检测的水平)或部分，使得与没有本发明的情况相比，在患者中发现更少的肿瘤细胞。可以将治疗效果与未接受治疗的个体或个体库或治疗之前的相同患者或治疗期间的不同时间的相同患者进行比较。在一些方面，与例如给药前的个体或未进行治疗的对照个体相比，疾病的严重程度降低至少10％。在某些方面，疾病的严重程度降低至少25％、50％、75％、80％或90％，或者在某些情况下，使用标准诊断技术不再可检测到。
本公开的组合物可用于治疗增殖性疾病，例如癌症。“癌症”、“肿瘤”、“转化的”和类似术语包括癌前细胞、肿瘤细胞、转化细胞和癌细胞，并且可以指实体瘤或非实体癌(参见，例如，Edge et al.AJCC Cancer Staging Manual(7th ed.2009)；Cibas and DucatmanCytology:Diagnostic principles and clinical correlates(3rd ed.2009))。癌症包括良性和恶性肿瘤(异常生长)。“转化”是指自发或诱导的表型变化，例如细胞的永生化、形态变化、异常细胞生长、减少的接触抑制和锚定和/或恶性肿瘤(参见，Freshney,Culture ofAnimal Cells a Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))。尽管转化可能由转化病毒的感染和新基因组DNA的引入或外源DNA的摄取引起，但它也可以自发出现或在暴露于致癌物质之后出现。
术语“癌症”可以指癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、实体癌和淋巴癌等。不同类型的癌症的实例包括但不限于肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(livercancer)(即、肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆管癌、胃肠道类癌、食道癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、血癌、成骨肉瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、单核细胞白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗癌症。
可被靶向的癌症包括例如白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓性白血病(CML))、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、妇科癌、脂肪肉瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所公开的公开内容的CAR内的靶标结合结构域能够结合任何广泛的靶标，包括但不限于GPR114、CLL-1、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、路易斯Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4、内皮唾液酸蛋白/CD248、Ly6e(RIG-e)、CD79a、CD274(PD-L1)、CD38、DLL4、CD319(SLAM7)和本领域技术人员已知的其他靶标。在一些实施方案中，癌症标志物是CLL-1。
“癌症靶标”或“癌症标志物”是在癌症中例如在癌细胞上或在癌症环境中差异性表达或加工的分子。示例性癌症靶标是细胞表面蛋白质，例如IL1RAP(还例如细胞粘附分子和受体)、细胞内受体、激素和分子，例如由细胞分泌到癌症环境中的蛋白酶。特定癌症的标志物是本领域已知的，例如结肠癌和结肠直肠癌上的MUC1表达，肺癌中的蛙皮素受体和前列腺癌上的前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
术语“过表达的”或“上调的”可互换地指蛋白质或核酸，通常是生物标志物，其以比对照水平可检测地更高水平转录或翻译。该术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如，细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性而导致的过表达。可以使用用于检测生物标志物，无论是mRNA(即RT-PCR，杂交)还是蛋白质(即，流式细胞术、成像、ELISA、免疫组织化学技术)的常规技术检测过表达。与正常细胞相比，过表达可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任何一种。
在一些实施方案中，癌症靶标可与某种类型的癌细胞相关，例如白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、AML、CML、非小细胞肺癌细胞、前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌或卵巢癌。细胞类型特异性靶标在该细胞类型中通常以比在参考细胞群中至少2倍高的水平表达。在一些实施方案中，细胞类型特异性标记物的存在水平比在参考群中的平均表达高至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或1000倍。因此，可以检测或测量靶标以将细胞类型或感兴趣的类型与其他细胞区分。在一些实施方案中，所治疗的癌症是白血病、淋巴瘤或实体瘤。
在一些实施方案中，所治疗的癌症是骨髓来源的癌症，其源自骨髓细胞。慢性骨髓增生性病症是由成熟的和未成熟的粒细胞、红细胞和血小板的数量增加表征的一系列病况。慢性骨髓增生性病症可以转变为该组内的其他形式，倾向于终止于急性髓性白血病。该组中的具体疾病包括骨髓来源的癌症、如AML(急性髓细胞性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性粒单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性髓细胞性或骨髓增生性白血病)。其他骨髓增生性病症包括真性红细胞增多症、肌原性髓性白血病、原发性血小板增多症、慢性髓性白血病和慢性中性粒细胞性白血病。在一些实施方案中，治疗的癌症是骨髓增生性癌症。在一些实施方案中，骨髓增生性癌症选自急性骨髓增生性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓增生性白血病、慢性粒单核细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。在一些实施方案中，所治疗的癌症是骨髓细胞来源的癌症。在一些实施方案中，骨髓细胞来源的癌症选自急性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病、慢性粒单核细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
该组中的具体疾病包括骨髓来源的癌症，例如AML(急性髓细胞性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性粒单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性髓细胞性或骨髓增生性白血病)。其他骨髓增生性病症包括真性红细胞增多症、肌原性髓性白血病、原发性血小板增多症、慢性髓性白血病和慢性中性粒细胞性白血病。在一些实施方案中，骨髓增生性癌症选自AML、CML、CMML、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
升高的CLL-1水平与癌症相关，特别是在造血CSC(例如，LSC)和骨髓增生性病症中，包括白血病、例如AML(急性髓细胞性或骨髓增生性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、CMML(慢性粒单核细胞白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和CML(慢性髓细胞性或骨髓增生性白血病)。参见Bakker et al.(2004)Cancer Res.64:8443；Van Rhenenet al.(2007)Blood 110:2659-66；Zhao et al.(2010)Haematologica(2010)95:71；VanRhenen et al.(2007)Leukemia 21:1700；和Herrmann et al.(2012)Haematologica 97:219。
癌症干细胞(CSC)是在肿瘤或血癌中发现的细胞，其可以产生构成大部分的癌症的细胞。CSC也可以自我更新，类似于正常(非癌症)干细胞。因此，CSC可以通过迁移到个体中的非肿瘤组织并开始“新”肿瘤来介导转移。取决于所检测的癌症的阶段，CSC占任何给定癌症的很小百分比。例如，认为AML细胞样品中CSC的平均频率约为1:10,000。造血CSC可以被鉴定为CD34+，类似于正常的造血干细胞(HSC)。其他CSC相关标志物包括CD44(乳腺)，CD133(胶质细胞癌)和Notch(例如，骨髓瘤和神经母细胞瘤)。
可以将本文所述的IQB-CBI引入抗体-药物偶联物中的癌症靶标的一个非限制性实例是C型凝集素样分子1(“CLL-1”)。CLL-1在AML母细胞和LSC上表达，但在正常的造血干细胞上不表达。CLL-1在骨髓和血室两者内的白血病细胞上表达。靶标抗原存在于所有AML法国美国英国(FAB)分类和细胞遗传学风险类别中，并且表达独立于FLT-3状态。靶标以从头和复发疾病状态表达。CLL-1抗原与多药耐药性(MDR)联合表达与疾病预后差和较大的复发概率有关。
除了在AML中表达外，CLL-1还在MDS和其他骨髓增生性病症(例如，真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和多发性骨髓纤维化)中表达。
C型凝集素样分子1(CLL-1)，也称为CLEC12A、DCAL-2和MICL，是II型膜蛋白(ITIM结构域-TM结构域-茎域-凝集素样结构域)。CLL-1的细胞外结构域是高度糖基化的，并且它仅在髓系细胞中表达。
CLL-1的核苷酸序列和蛋白质序列对于许多物种是已知的。例如，可以在Genbank登录号AF247788.1和Uniprot登录号Q5QGZ9中找到人序列。对于人CLL-1蛋白，细胞外结构域大约包含氨基酸65-265，跨膜结构域大约包含氨基酸44-64，并且细胞质结构域大约包含氨基酸1-43。人CLL-1的茎域跨越氨基酸65-139，并且C凝集素域跨越氨基酸140-249。技术人员将理解，CLL-1变体(例如，物种同源物、等位基因变体等)可以被最佳比对，例如用于鉴定保守残基和结构域。
术语“CLL-1特异性抗体”、“抗CLL-1抗体”、“CLL-1抗体”、“CLL-1ADC”和“抗CLL-1”在本文中同义地用于指特异性结合包括CLL-1的各种糖基化形式在内的CLL-1的抗体(或抗体偶联物、取决于背景)。本文所述的CLL-1抗体特异性结合例如在某些癌细胞(但不是HSC)的表面上表达的CLL-1多肽。如下文更详细讨论的，本发明的抗CLL-1抗体可以结合表达CLL-1的细胞，与其他AML-靶向抗体相比结合更大百分比的AML细胞，抑制AML细胞增殖，并介导它们的破坏。
“CLL-1相关病症”(或CLL-1相关的病症、CLL-1病症、CLL-1相关的病况或疾病等)是指与标准对照(例如，正常、非疾病、非癌细胞)中的CLL-1表达相比，与CLL-1的升高或降低的细胞表面表达相关的病况和疾病。升高的CLL-1水平与癌细胞相关，特别是白血病如AML(急性髓细胞性白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)和CML(慢性髓细胞性白血病)，以及造血CSC(例如LSC)中的癌细胞。
可用于靶向AML和所涉及谱系的癌症干细胞的抗体的一个非限制性实例是抗CLL-1抗体，更具体地，人源化的抗CLL1抗体。此类抗体描述于例如美国专利申请公开第2013/0295118号和PCT国际公开第WO2017/091615A1号中，两者均通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗CLL-1抗体任选地是称为“C6”的嵌合(例如人源化的)抗体并且分别包含轻链可变区：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRATQELSGYLSWLQQKPGKAIKRLIYAASTLDSGVPSRFSGNRAGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYAIYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:1)和重链可变区：EVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVRQAPGQGLEWIGFINPYNDGSKYAQKFQGRATLTSDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)。
在可用于靶向AML和所涉及谱系的癌症干细胞的抗体的另一个非限制性实例是抗IL1RAP抗体，更具体地，人源化的抗IL1RAP抗体。如本文所用的，“IL1-RAP”是指人白细胞介素1受体辅助蛋白。IL1-RAP的序列可以显示在Uniprot登录号Q9NPH3-1(同种型1)。IL1RAP表达在癌细胞(例如，本文所述的B细胞淋巴瘤、AML细胞和实体瘤细胞)；CSC(例如，髓样CSC)；和与本文提供的IL1RAP相关病症相关的细胞上升高。IL1RAP在正常造血干细胞(HSC)上没有显着表达。IL1RAP抗体描述于例如美国临时专利申请第62/425,970号和美国专利申请公开第2015/0315279号中，两者均通过引用并入本文。.
在一些实施方案中，抗IL1RAP抗体被称为“3G7”。在嵌合抗体中，3G7可以具有如下的轻链可变序列和重链可变序列(CDR以粗体突出显示)：
3G7轻链可变序列： 和
3G7重链可变区序列：
在一些实施方案中，3G7抗IL1RAP抗体是人源化抗体并包含：
轻链：
重链：CDRs和用于连接有效负载连接基的半胱氨酸取代以粗体和下划线表示。
在某些实施方案中，抗体可包括半胱氨酸残基代替另一残基。本公开的组合物可通过半胱氨酸残基与抗体连接。在一个实例中，156位的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S156C)。在另一个实例中，239位的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S239C)。可以将多于一种的IQB-CBI化合物引入如此修饰的抗体中。在一些实施方案中，与抗体连接的IQB-CBI化合物的数量可以是1至约10范围内的任何数，或其间的任何数，包括分数。在一些实施方案中，与抗体连接的IQB-CBI化合物的数量为1至约3。已发现引入本文所述的IQB-CBI的这种抗体在如下所述的体外和体内应用中是有效的。
B.剂量
化合物有效治疗或预防对象的增殖性病症的量将取决于病况的具体性质，并且可通过本领域已知的标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。任何特定个体的具体剂量水平将取决于多种因素，包括化合物的相对活性、年龄、体重、一般身体和精神健康、遗传因素、环境影响、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和所治疗的特定问题的严重程度。
术语“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。剂量是指在每次给药时给予个体的活性成分的量。对于本发明，剂量可以指抗体或相关组分的浓度。剂量将根据许多因素而变化，包括给药频率；个人的大小和耐受度；病况的严重程度；副作用的风险；给药途径；和可检测部分(如果存在)的成像模式。本领域技术人员将认识到可以根据上述因素或基于治疗进展来改变剂量。术语“剂型”是指药物的特定形式，并且取决于给药途径。例如，剂型可以在液体中，例如注射用的盐水溶液中。
“对照”样品或值是指用作与测试样品比较的参考(通常是已知的参考)的样品。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，在测试化合物的存在下取出，并与来自已知条件的样品比较，所述已知条件例如，在不存在测试化合物(阴性对照)的情况下，或在存在已知化合物(阳性对照)的情况下。对照还可以代表从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到可以设计对照以评估任何数量的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗措施(例如，收益和/或副作用的比较)来比较治疗益处。对照可以被设计用于体外应用。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于测定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中广泛地变化，则测试样本中的变异性将不会被视为显著的。
在某些实施方案中，本公开的化合物将与诸如抗体的靶标结合部分偶联。靶标结合部分可以对被靶向消除的细胞上的靶标特异，以治疗患有由这种细胞的存在而引起的病况的对象。靶标可以是靶细胞上的任何生物分子。靶细胞可包括癌细胞。因此，靶标可包括，例如，在癌细胞上表达的多肽，例如肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，靶标结合部分可以是嵌合抗原受体(“CAR”)，其可以结合包含在肿瘤相关抗原的细胞外结构域内的氨基酸的抗原决定簇、病毒抗原或病毒相关抗原或这种多肽的片段。
口服给药的合适剂量范围取决于特定化合物或化合物抗体偶联物的功效，但通常为每千克体重约0.001mg至约500mg药物，优选每千克体重约0.1mg至约200mg药物，以及更优选约1-约100mg/kg-体重每天。剂量范围可以通过本领域技术人员已知的方法容易地确定。可以例如与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的对象和特定的给药方式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg活性成分。
给药可以是周期性的。根据给药途径，可以例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或更长时间一次(例如，每2、3、4或6个月一次)施用剂量。在某些情况下，给药更频繁，例如每天2次或3次。如本领域技术人员将认识到的，可以监测对象以根据治疗进展和任何不良副作用调节给药的剂量和频率。
因此，在一些实施方案中，另外的给药取决于对象进展，例如，在给药之间监测对象。例如，在第一次给药或第一轮给药后，可以监测对象的肿瘤生长速率、复发(例如，在术后对象的情况下)或一般疾病相关症状，例如虚弱、疼痛、恶心等。
C.给药方法
包含IQB-CBI化合物或IQB-CBI抗体偶联物的组合物可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或推注，或通过上皮层或粘膜皮肤层(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收。给药可以是全身的或局部的。已知各种递送系统(例如，包封在脂质体、微粒、微囊、胶囊等中)，其可用于施用抗体偶联物组合物。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、鼻内和脑内。
有效治疗或预防对象的增殖性病症的化合物抗体偶联物的量将取决于病况的具体性质，并且可通过本领域已知的标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。对于任何特定个体的具体剂量水平将取决于多种因素，包括化合物抗体偶联物的相对活性、年龄、体重、一般身体和精神健康、遗传因素、环境影响、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和所治疗的特定问题的严重程度。
IQB-CBI偶联物或IQB-CBI抗体偶联物可通过经由任何合适的途径进行注射或输注来给药，所述合适的途径包括但不限于静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。施用药物组合物的实例包括将组合物以10mg/ml储存在无菌等渗盐水溶液中以在4℃下注射，并在施用于对象之前将其在100ml或200ml的0.9％氯化钠中稀释以用于注射。将该组合物通过静脉内输注在1小时的过程中以0.2mg/kg至10mg/kg的剂量给药。在其他实施方案中，将组合物通过静脉内输注施用15分钟至2小时。在其他实施方案中，给药程序是通过皮下推注。
因此，在一些实施方案中，另外的给药取决于对象的进展，例如，在给药之间监测对象。
D.试剂盒
本文还提供了包含含有本文提供的组合物的容器的试剂盒。在某些实施方案中，容器含有单位剂量的组合物。试剂盒可包含含有多个含组合物的容器的盒子。在其他实施方案中，试剂盒包含容器，例如袋或瓶，其含有本公开的组合物，所述组合物例如通过管与诸如针的插入装置连接，该管充当用于容器中的组合物的管道。
通过示例性说明而不是通过限制提供以下实施例。
实施例
实施例1：用于合成IQB-CBI二聚体的实验方案
通用方法：
在Varian Inova 300或500MHz NMR仪器上记录1H NMR光谱。使用MerckChromolith RP-18e分析型HPLC柱(整体的，50×2mm)和以下分析HPLC方法在Agilent 1200系列或1100系列LC/MS系统上测定色谱纯度：注射体积5μL；流速1mL/min；5％→95％的含0.05％AcOH的乙腈水溶液，历时5分钟；Agilent二极管阵列检测器，λ＝254、220或195nm；室温。
IQB-酸11a-e的合成(方案1)(参考图1)
4-苄氧基-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酸甲酯(2)
将4-苄氧基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯1(13.6g,50mmol)溶于乙酸酐(130mL)中。在30分钟内分小份加入三水合硝酸铜(15.1g,62.5mmol)。搅拌1小时后，将反应混合物倒在冰上并搅拌1小时。滤出沉淀物，用水洗涤并彻底干燥。将物质从乙酸乙酯中重结晶，得到9.1g的2(57％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.52(s,1H),7.36-7.46(m,5H),7.09(s,1H),5.22(s,2H),3.99(s,3H),3.91(s,3H).
LC/MS：保留时间3.18min.(ESI)C16H16NO6理论值[M+H]+318；实测值340(M+Na).
4-苄氧基-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酸(3)
将4-苄氧基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯(9.1g,29mmol)溶解在甲醇(145mL)中，并立即加入氢氧化钠(6M溶液,24mL)。将反应混合物在50度下搅拌1小时并蒸发甲醇。在搅拌下将浓盐酸(12mL)缓慢加入到残余物中。滤出所形成的沉淀物，用水洗涤并干燥，得到8.1g的3(92％收率)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.69(s,1H),7.36-7.47(m,5H),7.31(s,1H),5.24(s,2H),3.91(s,3H).
(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸甲酯(5)
将(S)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸4(10.6g,60mmol)溶于无水甲醇(86mL)中。逐滴加入亚硫酰氯(6.5mL,90mmol)并将反应混合物回流5小时。蒸发甲醇，将残余物在氯仿和饱和碳酸氢钠溶液中分配。用氯仿另外萃取水相，并将合并的有机物用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩至干，得到9.2g的5(81％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.16(br,3H),7.03(br,1H),4.13(br,2H),3.80(br,3H),3.05(br,2H),2.20(br,1H).
(S)-2-(4-苄氧基-5-甲氧基-2-硝基-苯甲酰基)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸甲酯(6)
将酸3(3.03g,10mmol)溶解在二氯甲烷(33mL)中，加入DIEA(2.6mL,15mmol)，然后加入HATU(4.93g,13mmol)。将混合物搅拌30分钟，并立即加入胺5(2.29g,12mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后用0.5M HCl、饱和NaHCO3洗涤并浓缩至干。将残余物在110g二氧化硅Teledyne Isco柱(0→35％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到2.73g的6(57％收率)。
LC/MS：保留时间3.31min.(ESI)C26H25N2O7理论值[M+H]+477；实测值477。
2-苄氧基-3-甲氧基-11,11a-二氢-6H,13H-5a,13-二氮杂-苯并[4,5]环庚并[1,2-b]萘-5,12-二酮(7)
将硝基衍生物6(2.71g,5.7mmol)、锌(7.41g,114mmol)和NH4Cl(12.2g,228mmol)置于具有搅拌棒的烧瓶中，并添加丙酮/水(125mL,1:4v/v)。将反应混合物搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤并浓缩。将残余物溶于甲醇(100mL)中并在室温下储存24小时。滤出所形成的沉淀物，用水彻底洗涤并干燥，得到2.18g的7(92％收率)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.46(m,2H),7.42(m,2H),7.36(m,1H),7.21-7.33(m,5H),6.80(s,1H),5.09(s,2H),4.86(d,J＝15.1Hz,1H),4.42(d,J＝15.1Hz,1H),4.21(t,J＝6.4Hz,1H),3.77(s,3H),3.27(m,1H),2.99(m,1H).
LC/MS：保留时间2.82min.(ESI)C25H23N2O4理论值[M+H]+415；实测值415.
2-苄氧基-3-甲氧基-13-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-11,11a-二氢-6H,13H-5a,13-二氮杂-苯并[4,5]环庚并[1,2-b]萘-5,12-二酮(8)
向酰胺7(2.20g,5.3mmol)的THF-DMF(40mL,3:1v/v)悬浮液中分小份加入在矿物油中的氢化钠(424mg,10.6mmol)。搅拌30分钟后，将反应混合物冷却至-78℃，并滴加SEMCl(2.34mL,13.3mmol)。将溶液升温至室温并搅拌过夜。减压除去THF，将残余物在氯仿-水中分配。另外用氯仿萃取水相，并将合并的有机物用无水MgSO4干燥，过滤，浓缩至干。将残余物在40g二氧化硅Teledyne Isco柱(0→50％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到2.55g的8(88％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.46(m,2H),7.37(m,2H),7.31(m,4H),7.25(m,3H),5.43(d,J＝9.8Hz,1H),5.21(s,2H),5.14(d,J＝15.1Hz,1H),4.49(d,J＝9.8Hz,1H),4.41(d,J＝15.1Hz,1H),4.27(t,J＝6.4Hz,1H),3.92(s,3H),3.70(m,1H),3.56(m,2H),2.99(m,1H),0.97(m,2H),0.05(s,9H).
LC/MS：保留时间3.92min.(ESI)C31H37N2O5Si理论值[M+H]+545；实测值545.
2-羟基-3-甲氧基-13-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-11,11a-二氢-6H,13H-5a,13-二氮杂-苯并[4,5]环庚并[1,2-b]萘-5,12-二酮(9)
用Ar冲洗8(2.55g,4.7mmol)的甲醇(47mL)溶液，并加入10％Pd/C(375mg)。将氢气(气球)鼓泡通过溶液2小时，然后通过硅藻土过滤反应混合物，浓缩并在24g二氧化硅Teledyne Isco柱(0→60％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到2.13g的9(99％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.32(m,2H),7.27(m,4H),6.06(br,1H),5.42(d,J＝9.8Hz,1H),5.15(d,J＝15.1Hz,1H),4.70(d,J＝9.8Hz,1H),4.41(d,J＝15.1Hz,1H),4.28(t,J＝6.4Hz,1H),3.93(s,3H),3.71(m,1H),3.62(m,2H),3.00(m,1H),0.99(m,2H),0.03(s,9H).
LC/MS：保留时间3.22min.(ESI)C24H31N2O5Si理论值[M+H]+455；实测值455.
SEM-保护的IQB-酸(10a)
向苯酚9(90mg,0.2mmol)、2-溴乙酸(83mg,0.6mmol)的DMF(0.8mL)溶液中加入碳酸铯(197mg,0.6mmol)，将混合物搅拌过夜。没有形成产物，加入MeOH(0.5mL)并将混合物再搅拌24小时，之后LC/MS显示100％转化。将反应混合物用水(10mL)稀释，并用固体NH4Cl饱和。在用DCM:MeOH(15mL,10:1v/v)萃取后，将有机物浓缩至干，并在12g二氧化硅TeledyneIsco柱(0→15％MeOH的含有0.1％AcOH的DCM溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到120mg的10a(>99％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:10.73(br,1H),7.32(s,1H),7.29(m,2H),7.24(m,2H),7.19(s,1H),5.43(d,J＝9.8Hz,1H),5.12(d,J＝15.1Hz,1H),4.65(d,J＝9.8Hz,1H),4.40(d,J＝15.1Hz,1H),4.27(t,J＝6.8Hz,2H),3.88(s,3H),3.67(m,2H),3.53(m,1H),3.10(m,2H),2.99(m,1H),0.96(m,2H),0.00(s,9H).
LC/MS：保留时间3.44min.(ESI)C26H33N2O7Si理论值[M+H]+513；实测值513.
SEM-保护的IQB-酸(10b)
向苯酚9(136mg,0.3mmol)、2-(2-溴乙基)-1,3-二氧戊环(108mg,0.6mmol)的DMF(0.6mL)溶液中加入碳酸铯(295mg,0.9mmol)，并搅拌混合物2小时。LC/MS显示100％转化。将反应混合物用水(10mL)稀释，用EtOAc(2×15mL)萃取，将有机物浓缩至干，并溶于THF(8mL)中。加入6M HCl(1mL)并将反应混合物在室温下搅拌24小时，最后浓缩至干，得到粗醛。
将粗醛溶于t-BuOH/2-甲基-2-丁烯/水(3/1/1v/v/v；10mL)，加入磷酸二氢钠(420mg,2.1mmol)，然后加入亚氯酸钠(244mg,2.7mmol)。剧烈搅拌反应混合物30分钟，LC/MS表明反应完成。分离有机层；用EtOAc(2×20mL)萃取水。将合并的有机物浓缩至干，并在制备型TLC板(己烷:EtOAc:AcOH,1:1:0.05)上纯化。刮掉含有硅胶的产物并用DCM:MeOH(15:1,v/v)洗涤，蒸发有机溶液，得到78mg的10b(49％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.31(br m,8H),5.49(br m,1H),5.12(br d,J＝15.1Hz,1H),4.69(br m,1H),4.42(br d,J＝15.1Hz,1H),4.28(br m,2H),3.54-3.93(br m,7H),2.99(br m,1H),0.96(br m,2H),0.00(br s,9H).
LC/MS：保留时间3.13min.(ESI)C27H35N2O7Si理论值[M+H]+527；实测值527.
SEM-保护的IQB-酸(10c)
向苯酚9(90mg,0.2mmol)、4-溴丁酸乙酯(117mg,0.6mmol)的DMF(0.4mL)溶液中加入碳酸铯(197mg,0.6mmol)，并搅拌混合物2小时。LC/MS显示100％转化。将反应混合物用水(10mL)稀释，用EtOAc(2×15mL)萃取，将有机部分浓缩至干，并溶于THF-MeOH-H2O(3-1-1,v/v/v,2mL)中。加入LiOH(32mg,1.3mmol)，将反应混合物搅拌3小时，然后浓缩至干。将残余物溶于DMSO(1mL)中，并直接加载到15.5g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到88mg的10c(81％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.31(s,1H),7.30(m,2H),7.27(m,2H),7.21(s,1H),5.49(d,J＝9.8Hz,1H),5.15(d,J＝15.1Hz,1H),4.69(d,J＝9.8Hz,1H),4.42(d,J＝15.1Hz,1H),4.28(t,J＝6.8Hz,2H),4.11(m,2H),3.88(s,3H),3.77(m,1H),3.67(m,1H),3.56(m,1H),3.01(m,1H),2.60(m,2H),2.19(m,2H),0.97(m,2H),0.00(s,9H).
LC/MS：保留时间3.29min.(ESI)C28H37N2O7Si理论值[M+H]+541；实测值541.
SEM-保护的IQB-酸(10d)
向苯酚9(100mg,0.22mmol)、5-溴戊酸甲酯(129mg,0.66mmol)的DMF(0.4mL)溶液中加入碳酸铯(215mg,0.66mmol)，并搅拌混合物16小时。LC/MS显示100％转化。将反应混合物用水(10mL)稀释，用EtOAc(2×15mL)萃取，将有机部分浓缩至干，并溶于THF-MeOH-H2O(3-1-1,v/v/v,2mL)中。加入LiOH(17mg,0.69mmol)，将反应混合物搅拌1小时，然后浓缩至干。将残余物溶于DMSO(1mL)中并直接加载到50g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，每个含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到107mg的10d(83％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.36–7.14(m,6H),5.50(d,J＝10.0Hz,1H),5.15(d,J＝15.3Hz,1H),4.67(d,J＝10.0Hz,1H),4.41(d,J＝15.3Hz,1H),4.28(dd,J＝7.4,6.4Hz,1H),4.15–4.00(m,2H),3.89(s,3H),3.79(td,J＝9.8,6.7Hz,1H),3.68(td,J＝9.7,6.7Hz,1H),3.56(dd,J＝15.4,7.5Hz,1H),3.00(dd,J＝15.5,6.4Hz,1H),2.47(t,J＝7.2Hz,2H),1.94(q,J＝7.4Hz,2H),1.86(q,J＝7.4Hz,2H),1.05–0.87(m,2H),0.03(s,9H).
LC/MS：保留时间3.34min.(ESI)C29H37N2O7Si理论值[M-H]-543；实测值543.
SEM-保护的IQB-酸(10e)
向苯酚9(227mg,0.5mmol)、6-溴己酸甲酯(313mg,1.5mmol)的DMF(1mL)溶液中加入碳酸铯(313mg,1.5mmol)，搅拌混合物2小时。LC/MS显示100％转化。将反应混合物用水(10mL)稀释，用乙醚(2×15mL)萃取，将有机物浓缩至干，并溶于THF-MeOH-H2O(3-1-1,v/v/v,4mL)中。加入LiOH(64mg,2.6mmol)，将反应混合物搅拌3小时，然后浓缩至干。将残余物溶解在ACN-H2O(1-1,v/v,2mL)中并直接加载到50g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，每个含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到260mg的10e(92％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.32(m,3H),7.27(m,2H),7.21(m,1H),5.51(d,J＝9.8Hz,1H),5.15(d,J＝15.1Hz,1H),4.68(d,J＝9.8Hz,1H),4.43(d,J＝15.1Hz,1H),4.30(t,J＝6.8Hz,1H),4.05(m,2H),3.89(s,3H),3.79(m,1H),3.69(m,1H),3.56(m,1H),3.0.1(m,1H),2.40(m,2H),1.90(m,2H),1.75(m,2H),1.55(m,2H),0.98(m,2H),0.00(s,9H).
LC/MS：保留时间3.42min.(ESI)C30H41N2O7Si理论值[M+H]+569；实测值569.
IQB-酸(11a)
将SEM保护的IQB-酸10a(102mg,0.2mmol)溶解在无水THF(4mL)中，并将混合物冷却至-78℃并滴加超氢化物溶液(0.5mL,1M于THF中,0.5mmol)。将溶液保持在该温度下90分钟，然后升温至室温，然后用MeOH(1mL)淬灭。在旋转蒸发仪上除去所有挥发物，将残余物溶解在DMSO中并直接加载到15.5g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到51mg的11a(70％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.57(s,1H),7.48(br,1H),7.32(m,5H),6.89(s,1H),5.02(d,J＝15.6Hz,1H),4.78(m,2H),4.48(d,J＝15.6Hz,1H),4.01(m,1H),3.98(s,3H),3.28(m,1H),3.16(m,1H).
LC/MS：保留时间2.10min.(ESI)C20H19N2O5理论值[M+H]+367；实测值367.
IQB-酸(11b)
采用对11a所述的程序。获得51mg的11b(60％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.54(s,1H),7.46(br,1H),7.32(m,5H),6.94(s,1H),5.02(d,J＝15.6Hz,1H),4.53(d,J＝15.6Hz,1H),4.35(m,2H),3.92(s,3H),3.27(m,1H),3.15(m,1H),2.90(m,2H).
LC/MS：保留时间2.10min.(ESI)C21H21N2O5理论值[M+H]+381；实测值381.
IQB-酸(11c)
采用对11a所述的程序。获得51mg的11c(61％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.53(s,1H),7.46(br,1H),7.34(m,5H),6.88(s,1H),5.02(d,J＝15.6Hz,1H),4.54(d,J＝15.6Hz,1H),4.11(m,2H),3.93(m,4H),3.27(m,1H),3.16(m,1H),2.58(m,2H),2.18(m,2H).
LC/MS：保留时间2.10min.(ESI)C22H23N2O5理论值[M+H]+395；实测值395.
IQB-酸(11d)
采用对11a所述的程序。获得56mg的11d(49％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53(s,1H),7.48(d,J＝5.1Hz,1H),7.43–7.28(m,4H),6.82(s,1H),5.01(d,J＝15.5Hz,1H),4.56(d,J＝15.5Hz,1H),4.18–4.02(m,3H),3.95(s,3H),3.28(dd,J＝15.5,5.6Hz,1H),3.16(dd,J＝15.5,4.1Hz,1H),2.46(t,J＝7.2Hz,2H),1.94(q,J＝7.0,6.4Hz,2H),1.86(q,J＝7.4Hz,2H).
LC/MS：保留时间2.18min.(ESI)C23H25N2O5理论值[M+H]+409；实测值409.
IQB-酸(11e)
采用对11a所述的程序。获得140mg的11e(72％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.54(s,1H),7.48(br,1H),7.32(m,5H),6.82(s,1H),5.02(d,J＝15.6Hz,1H),4.57(d,J＝15.6Hz,1H),4.01(m,2H),3.98(m,4H),3.28(m,1H),3.16(m,1H),2.39(m,2H),1.90(m,2H),1.73(m,2H),1.54(m,2H).
LC/MS：保留时间2.24min.(ESI)C24H27N2O5理论值[M+H]+423；实测值423.
IQB-氨基CBI二聚体-20a-e的合成(方案2，参见图2)
(3-叔丁氧基羰基氨基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(13)
向Ar-吹扫的1,3-二硝基-萘412)(20.0g,92.0mmol)的甲醇(400mL)溶液中加入10％Pd/C(2.0g)。将混合物脱气并用H2吹扫(3×)。将所得反应混合物在1atm的H2气下搅拌16小时，此时通过LC/MS判断反应完成。通过硅藻土过滤从反应混合物中除去催化剂。将反应真空浓缩，粗产物无需进一步纯化即可使用。
将Boc2O(116g,535mmol)加入到粗制的1,3-二氨基-萘的THF(400mL)溶液中。将所得混合物在Ar下在60℃下搅拌，直到通过TLC和LC/MS判断反应完成。将反应混合物真空浓缩。通过柱色谱法(0→30％EtOAc的己烷溶液)纯化所得到的残余物，得到20.0g的13(61％收率)。
LC/MS：保留时间3.55min.(ESI)理论值C12H10N2O4:[M-2tBu]+247；实测值247.
(4-叔丁氧基羰基氨基-1-碘-萘-2-基)-氨基甲酸叔丁酯(14)
在Ar下，将(3-叔丁氧基羰基氨基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(13)(20.0g,56.0mmol)在1:1THF/MeOH(150mL)中的脱气溶液冷却至-78℃。加入NIS(14.4g,64.2mmol)的THF(50mL)溶液，然后加入p-TsOH(21.3g,112mmol)的MeOH(50mL)溶液。将混合物在-78℃下搅拌直至通过LC/MS判断反应完成。然后将混合物升温至室温，用EtOAc(200mL)稀释，用H2O(2×100mL)洗涤，然后用盐水(2×100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化所得到的残余物，得到17.8g的12(66％收率)。
LC/MS：保留时间3.96min.(ESI)理论值C20H25IN2O4Na:[M+Na]+507；实测值507.
烯丙基-[3-(烯丙基-叔丁氧基羰基-氨基)-4-碘-萘-1-基]-氨基甲酸叔丁酯(15)
在Ar下，向冷却至0℃的(4-叔丁氧基羰基氨基-1-碘-萘-2-基)-氨基甲酸叔丁酯(14)(13.5g,27.9mmol)的DMF(100mL)溶液中加入NaH(60％，在矿物油中)(3.34g,83.6mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在5分钟内加入烯丙基溴(24.0mL,279mmol)。使所得混合物在2小时内升温至室温，此时判断反应完成。然后将反应用EtOAc(500mL)稀释并用NaHCO3(饱和水溶液)(2×100mL)、H2O(2×100mL)，然后盐水(2×100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化所得到的残余物，得到11.9g的15(76％收率)。
LC/MS：保留时间4.34min.(ESI)理论值C26H33IN2O4Na:[M+Na]+587；实测值587.
5-(烯丙基-叔丁氧基羰基-氨基)-1-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基氧基甲基)-1,2-二氢-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(16)
在Ar下，向(烯丙基-[3-(烯丙基-叔丁氧基羰基-氨基)-4-碘-萘-1-基]-氨基甲酸叔丁酯(15)(11.0g,19.5mmol)的苯(400mL)溶液中加入TEMPO(9.0g,58mmol)和Bu3SnH(5.3mL,19.5mmol)。将混合物在60℃下搅拌30分钟，然后加入另外当量的Bu3SnH(5.3mL,19.5mmol)。在另外的30分钟后，加入TEMPO(6.1g,39mmol)和Bu3SnH(5.3mL,19.5mmol)，将混合物再搅拌30分钟，此时加入更多的TEMPO(6.1g39mmol)。再过20分钟后，加入最后一部分Bu3SnH(5.3mL,19.5mmol)，将所得混合物在60℃下搅拌45分钟，将反应冷却至室温并真空浓缩。通过柱色谱法(0→10％EtOAc的己烷溶液，非常慢的梯度)纯化残余物，得到10.5g的16(91％收率)。
LC/MS：保留时间5.33min.(ESI)理论值C35H51N3O5:[M+H]+594；实测值594.
5-(烯丙基(叔丁氧基羰基)氨基)-1-(羟甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(17)
向5-(烯丙基-叔丁氧基羰基-氨基)-1-(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基氧基甲基)-1,2-二氢-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(16)(1.0g,1.68mmol)在THF(45mL)、HOAc(15mL)和H2O(15mL)中的溶液中加入Zn粉(8.81g,134.7mmol)。将所得混合物在70℃下搅拌16小时，此时通过LC/MS和TLC判断反应完成。然后将反应冷却至室温，将反应通过硅藻土垫过滤，并将固体残余物用DCM洗涤。将合并的滤液真空浓缩。通过与CHCl3(3×50mL)共沸除去剩余的水。通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化所得到的残余物，得到636mg的17(83％收率)。
LC/MS：保留时间3.71min.(ESI)理论值C26H34N2O5Na:[M+Na]+477；实测值477
5-(烯丙基(叔丁氧基羰基)氨基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(18)
在Ar下，向5-(烯丙基(叔丁氧基羰基)氨基)-1-(羟甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(17)(1.0g,1.40mmol)的DCM(5.6mL)溶液中加入PPh3(1.10g,4.20mmol)，然后加入CCl4(1.22mL,12.6mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌2小时，此时通过LC/MS和TLC判断反应完成。然后将反应真空浓缩，并将所得到的残余物通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到592mg的18(89％收率)。
LC/MS：保留时间4.42min.(ESI)理论值C26H33ClN2O4Na:[M+Na]+495；实测值495.
烯丙基保护的IQB-CBI(19a)
将TFA(5mL)预冷至0℃，然后加入到Boc保护的CBI(29mg,0.06mmol)中。将溶液在0℃保持过夜，然后浓缩至干。将残余物再溶于无水氯仿中，再次蒸发，并在饱和的NaHCO3和DCM之间分配。将有机相用MgSO4干燥并浓缩，得到苯胺的粗盐。将其溶于DMF(1.2mL)中，加入酸11a(25mg,0.068mmol)，然后加入EDC-HCl(30mg,0.16mmol)。将反应混合物搅拌3小时，然后直接加载到15.5g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到22mg的19a(58％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.77(s,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.59(s,1H).7.52(m,1H),7.46(m,1H),7.34(m,7H),6.87(m,1H),6.05(m,1H),5.37(d,J＝17.1Hz,1H),5.24(d,J＝10.3Hz,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.92(m,2H),4.55(d,J＝15.1Hz,1H),4.33(m,2H),4.07(m,1H),4.00(s,3H),3.95(m,3H).3.44(m,1H),3.26(m,1H),3.13(m,1H).
LC/MS：保留时间3.28min.(ESI)C36H34ClN4O4理论值[M+H]+622；实测值622.
烯丙基保护的IQB-CBI(19b)
采用对于19a所述的程序，得到21mg的19b(45％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.80(s,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.54(s,1H).7.49(m,3H),7.31(m,7H),6.94(s,1H),6.05(m,1H),5.39(d,J＝17.1Hz,1H),5.36(m,1H),5.24(d,J＝10.3Hz,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.55(d,J＝15.1Hz,1H),4.54(m,1H),4.31(m,2H),4.07(m,1H),3.98(m,3H),3.94(m,3H).3.41(m,1H),3.26(m,1H),3.18(m,2H),3.13(m,1H).
LC/MS：保留时间3.24min.(ESI)C37H36ClN4O4理论值[M+H]+635；实测值635.
烯丙基保护的IQB-CBI(19c)
采用对于19a所述的程序，得到20mg的19c(31％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.79(s,1H),7.65(d,J＝8.8Hz,1H),7.53(s,1H).7.47(m,3H),7.35(m,7H),6.87(s,1H),6.08(m,1H),5.38(d,J＝17.1Hz,1H),5.25(d,J＝9.1Hz,1H),5.01(d,J＝10.3Hz,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.53(d,J＝15.1Hz,1H),4.27(m,2H),4.00(m,2H),3.92(m,3H).3.38(m,1H),3.24(m,1H),3.16(m,1H),2.80(m,1H),2.72(m,1H),2.34(m,2H).
LC/MS：保留时间3.35min.(ESI)C38H38ClN4O4理论值[M+H]+649；实测值649.
烯丙基保护的IQB-CBI(19d)
采用对于19a所述的程序，得到14mg的19d(15％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.86–7.74(m,2H),7.66(d,J＝8.3Hz,1H),7.54–7.43(m,3H),7.41–7.28(m,5H),6.81(d,J＝1.1Hz,1H),6.07(ddt,J＝16.4,10.8,5.4Hz,1H),5.37(dq,J＝17.2,1.7Hz,1H),5.24(ddq,J＝10.3,2.5,1.4Hz,1H),5.01(dd,J＝15.6,1.3Hz,1H),4.55(d,J＝15.5Hz,1H),4.31–4.14(m,4H),4.02–3.96(m,4H),3.95–3.91(m,5H),3.38(td,J＝10.9,3.9Hz,1H),3.33–3.06(m,2H),2.78–2.65(m Hz,1H),2.63–2.46(m,1H),2.04–1.92(m,4H).
LC/MS：保留时间3.38min.(ESI)C39H40ClN4O4理论值[M+H]+663；实测值663.
烯丙基保护的IQB-CBI(19e)
采用对于19a所述的程序，得到6mg的19e(12％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.79(d,J＝8.5Hz,1H),7.66(d,J＝8.3Hz,1H),7.59–7.42(m,2H),7.41–7.28(m,6H),6.81(s,1H),6.07(ddd,J＝16.1,10.6,5.3Hz,1H),5.38(dq,J＝17.3,1.7Hz,1H),5.27–5.20(m,1H),5.01(d,J＝15.5Hz,1H),4.56(d,J＝15.5Hz,1H),4.39–4.16(m,2H),4.15–4.04(m,3H),4.02–3.96(m,3H),3.95–3.87(m,5H),3.38(t,J＝10.9Hz,1H),3.27(dd,J＝15.4,5.6Hz,1H),3.16(dd,J＝15.4,4.2Hz,1H),2.62(dt,J＝15.6,7.4Hz,1H),2.50(dt,J＝15.6,7.4Hz,1H),1.96(q,J＝7.2Hz,2H),1.85(q,J＝7.9Hz,2H),1.63(p,J＝7.9Hz,2H).
LC/MS：保留时间3.46min.(ESI)C40H42ClN4O4理论值[M+H]+677；实测值677.
D801(20a)的合成
将19a(22mg,0.04mmol)溶于无水DCM(0.8mL)中。加入樟脑磺酸(6.4mg,0.12mmol)和苯亚磺酸钠盐(16.4mg,0.1mmol)。用Ar冲洗小瓶，然后加入四(三苯基膦)钯(4.6mg,0.004mmol)。将反应混合物搅拌30分钟并浓缩至干。将残余物溶解在DMSO(0.5mL)中并直接加载到15.5g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到9mg的20a(39％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.88(s,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.59(s,1H).7.52(m,1H),7.46(m,1H),7.34(m,6H),6.87(m,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.92(m,2H),4.55(d,J＝15.1Hz,1H),4.33(m,2H),4.07(m,1H),4.00(s,3H),3.95(m,3H).3.44(m,1H),3.26(m,1H),3.13(m,1H).
LC/MS：保留时间2.93min.(ESI)C33H30ClN4O4理论值[M+H]+581；实测值581.
D807(20b)的合成
采用对于20a所述的程序，得到2.1mg的20b(11％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.93.(s,1H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.54(s,1H).7.49(m,2H),7.35(m,6H),6.94(m,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.56(d,J＝15.1Hz,1H),4.54(m,2H),4.30(m,3H),4.05(m,1H),3.95(m,5H).3.41(m,1H),3.25(m,1H),3.18(m,2H).3.11(m,1H).
LC/MS：保留时间2.90min.(ESI)C34H32ClN4O4理论值[M+H]+595；实测值595.
D803(20c)的合成
采用对于20a所述的程序，获得5.0mg的20c(26％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.94(d,J＝8.3Hz,1H),7.80(d,J＝8.8Hz,1H),7.67(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(m,4H),7.34(m,6H),6.87(m,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.56(d,J＝15.1Hz,1H),4.28(m,4H),4.05(m,1H),3.92(m,5H).3.39(m,1H),3.26(m,1H),3.14(m,1H).2.75(m,2H),2.34(m,2H).
LC/MS：保留时间2.98min.(ESI)C35H34ClN4O4理论值[M+H]+609；实测值609.
D809(20d)的合成
采用对于20a所述的程序，得到2.0mg的20d(15％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.92(s,1H),7.79(dd,J＝8.5,5.4Hz,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,1H),7.54–7.44(m,3H),7.42–7.28(m,5H),6.82(d,J＝1.5Hz,1H),5.01(dd,J＝15.5,2.4Hz,1H),4.56(d,J＝15.5Hz,1H),4.27(d,J＝10.1Hz,1H),4.19(dt,J＝13.3,7.5Hz,3H),4.12(t,J＝7.3Hz,2H),4.02(d,J＝9.8Hz,1H),3.97–3.82(m,5H),3.39(td,J＝10.9,3.5Hz,1H),3.27(dd,J＝15.4,5.6Hz,1H),3.15(dt,J＝15.4,3.7Hz,1H),2.71–2.62(m,1H),2.61–2.57(m,1H),2.11–1.91(m,J＝7.1,6.6Hz,4H).
LC/MS：保留时间3.03min.(ESI)C36H36ClN4O4理论值[M+H]+623；实测值623.
D805(20e)的合成
采用对于20a所述的程序，得到1.7mg的20e(30％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(s,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(d,J＝0.7Hz,1H),7.52–7.44(m,2H),7.41–7.29(m,5H),6.81(s,1H),5.01(d,J＝15.5Hz,1H),4.56(d,J＝15.5Hz,1H),4.27(d,J＝10.9Hz,2H),4.23–4.16(m,1H),4.15–4.05(m,1H),4.01(t,J＝9.4Hz,1H),3.97–3.87(m,5H),3.39(t,J＝10.9Hz,1H),3.27(dd,J＝15.4,5.6Hz,1H),3.16(dd,J＝15.4,4.2Hz,1H),2.68–2.55(m,1H),2.55–2.43(m,1H),1.97(p,J＝6.9Hz,2H),1.86(p,J＝7.4Hz,2H),1.63(p,J＝7.9Hz,2H).
LC/MS：保留时间3.10min.(ESI)C37H38ClN4O4理论值[M+H]+637；实测值637.
IQB-羟基CBI二聚体-33c；33c-S,S；33e和33e-S,S的合成(方案3，参考图3)
(4-((叔丁氧基羰基)氧基)萘-2-基)氨基甲酸叔丁酯(22)
将4-甲氧基萘-2-胺(5.7g,33mmol)溶于AcOH和48％的HBr水溶液(2-3,v/v,330mL)的混合物中。将混合物在Ar气氛下在100℃加热24小时，然后浓缩至干。将残余物在EtOAc和饱和NaHCO3中分配。分离有机层并浓缩至干。将残余物溶于二噁烷(66mL)中并加入Boc2O(8.6g,40mmol)。将混合物在Ar气氛下在100℃加热2小时，并加入额外量的Boc2O(4.3g,20mmol)。再过2小时后，将反应混合物浓缩至干，溶于少量DCM中，并在120g二氧化硅Teledyne Isco柱上(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化。蒸发含有产物的级分，得到6.5g的22(55％收率)。
LC/MS：保留时间3.87min.(ESI)C20H28NO6理论值[M+H2O+H]+378；实测值378.
(4-羟基萘-2-基)氨基甲酸叔丁酯(23)
将Diboc衍生物22(6.5g,18mmol)溶于THF-MeOH-H2O(3-1-1,v/v/v,180mL)中。加入LiOH(650mg,27mmol)，将反应混合物搅拌3小时，然后浓缩至干。在用饱和NH4Cl稀释后，用EtOAc(2×100mL)萃取产物。将有机层浓缩至干，溶于少量DCM中，并在80g二氧化硅Teledyne Isco柱上(0→20％EtOAc的己烷溶液)纯化。蒸发含有产物的级分，得到3.2g的23(67％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.07(d,J＝8.3Hz,1H),7.68(d,J＝8.3Hz,1H),7.44(t,J＝7.3Hz,1H),7.36(m,1H),7.29(s,1H),7.14(br,1H),6.60(br,1H),5.69(br,1H),1.56(s,9H).
LC/MS：保留时间2.96min.(ESI)C15H18NO3理论值[M+H]+260；实测值260.
(4-(苄氧基)萘-2-基)氨基甲酸叔丁酯(24)
向苯酚23(3.2g,12mmol)、BnBr(1.75mL,15mmol)的DMF(25mL)溶液中加入碳酸铯(8.1g,25mmol)，搅拌混合物30分钟。将反应混合物用水(100mL)稀释，并用乙醚(3×50mL)萃取，将合并的有机物浓缩至干，并在80g二氧化硅Teledyne Isco柱(0→10％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到3.2g的24(77％收率)。
LC/MS：保留时间3.98min.(ESI)C22H24NO3理论值[M+H]+350；实测值350.
(4-(苄氧基)-1-碘萘-2-基)氨基甲酸叔丁酯(25)
在-78℃(干冰/丙酮冷却浴)下，向24(3.2g,9.2mmol)和TsOH-H2O(50mg)的THF-MeOH(1-1,v/v,150mL)溶液中滴加NIS(2.23g,10mmol)的THF(5mL)溶液。将混合物在该温度下搅拌1小时，然后在旋转蒸发器上浓缩至干。将残余物在120g二氧化硅TeledyneIsco柱(0→10％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到3.2g的25(73％收率)。
LC/MS：保留时间4.57min.(ESI)C22H23INO3理论值[M+H]+476；实测值476.
烯丙基(4-(苄氧基)-1-碘萘-2-基)氨基甲酸叔丁酯(26)
向25(3.2g,6.7mmol)的DMF(13mL)溶液中分小份加入于矿物油中的氢化钠(536mg,13.4mmol)。搅拌5分钟后，滴加烯丙基溴(2.9mL,33mmol)。搅拌30分钟后，将反应混合物用水(100mL)稀释，用乙醚(3×50mL)萃取，将合并的有机物浓缩至干，并在80g二氧化硅Teledyne Isco柱(0→10％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到3.4g的26(98％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ比例为3:1的旋转异构体的混合物，主要的旋转异构体的信号报道如下：8.32(d,J＝8.3Hz,1H),8.22(d,J＝8.3Hz,1H),7.61(m,1H),7.36(m,1H),7.49(m,3H),7.42(m,3H),6.70(s,1H),5.93(m,1H),5.27(m,1H),5.04(m,2H),4.56(m,1H),3.82(m,1H),1.32(s,9H).
LC/MS：保留时间4.52min.(ESI)C25H26INO3Na理论值[M+Na]+538；实测值538.
5-(苄氧基)-1-(((2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基)甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(27)
在Ar下，向26(3.4g,6.6mmol)的苯(220mL)溶液中加入TEMPO(3.1g,20mmol)和Bu3SnH(1.8mL,6.6mmol)。将混合物在70℃下搅拌15分钟，然后加入额外量的Bu3SnH(1mL)和TEMPO(1g)。再过15分钟后，加入TEMPO(1g)和Bu3SnH(1mL)，将混合物再搅拌15分钟，此时加入更多的TEMPO(1g 39mmol)和Bu3SnH(1mL)。再过15分钟后，加入最后部分的Bu3SnH(1mL,19.5mmol)和TEMPO(1g)。将所得混合物在70℃下再搅拌30分钟并浓缩至干。通过柱色谱法(0→10％EtOAc的己烷溶液)纯化所得到的残余物，得到5g粗品27，其含有作为杂质的TEMPO。在下一步中按原样使用。
LC/MS：保留时间5.29min.(ESI)C34H45N2O4理论值[M+H]+545；实测值545.
5-(苄氧基)-1-(羟甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(28)
向粗品27(5g,6mmol)的AcOH-THF-H2O(3-1-1,v/v/v,120mL)溶液中分小份加入Zn粉(4.7g,72mmol)。将混合物在80℃下搅拌3小时，然后浓缩至干。小心地用饱和NaHCO3淬灭残余物，并用乙醚(2×100mL)萃取。将有机溶液浓缩至干，并在80g二氧化硅TeledyneIsco柱(0→60％EtOAc的己烷溶液)上纯化。蒸发含有产物的级分，得到1.69g的28(2步的收率63％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.30(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(br,1H),7.72(d,J＝8.3Hz,1H),7.55(m,2H),7.48(m,1H),7.44(m,2H),7.34(m,2H),5.28(br s,2H),4.23(m,1H),4.14(m,1H),3.96(m,1H),3.86(m,1H),3.79(m,1H),1.61(s,9H).
LC/MS：保留时间3.77min.(ESI)C25H28NO4理论值[M+H]+406；实测值406.
5-(苄氧基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(29)
将醇28(406mg,1mmol)溶解在无水DCM(10mL)中，并立即加入Ph3PCl2(500mg,1.5mmol)。搅拌1小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3淬灭并用氯仿萃取。将合并的有机物用MgSO4干燥并浓缩。将残余物在12g二氧化硅Teledyne Isco柱上(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化。蒸发含有产物的级分，得到230g的29(54％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.32(d,J＝8.79Hz,1H),7.90(br,1H),7.66(d,J＝8.30Hz,1H),7.55(m,3H),7.46(t,J＝7.57Hz,2H),7.37(m,2H),5.30(s,2H),4.28(br s,1H),4.15(t,J＝10.50Hz,1H),3.98(m,2H),3.46(t,J＝10.50Hz,1H),1.64(s,9H).
LC/MS：保留时间4.50min.(ESI)C25H27ClNO3理论值[M+H]+424；实测值424.
1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(30)和手性分离为(30-(S))
将含有29(232mg,0.55mmol)的EtOAc(6mL)溶液的烧瓶用Ar冲洗，并加入Pd(OH)2/C(10重量％,50mg)。将氢气(气球)鼓泡通过溶液24小时，然后通过硅藻土过滤反应混合物，浓缩并在12g二氧化硅Teledyne Isco柱上(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化。蒸发含有产物的级分，得到145mg的30(78％收率)。
将外消旋体30溶于5mL己烷-IPA(9-1,v/v,5mL)中，并以多个1mL份注射在具有OD-H柱(20×250mm，5μm)的手性HPLC上，25mL/min，在20分钟内0→5％IPA的己烷溶液。tr(30-(R))＝12min；tr(30-(S))＝14min(J.Am.Chem.Soc.1994,116,7996-8006)。合并含有所需对映异构体的级分并浓缩至干，得到51mg的30-(S)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ：8.22(d，J＝8.20Hz,1H),7.82(brs,1H),7.64(d,J＝8.20Hz,1H),7.50(m,1H),7.34(ddd,J＝8.34,6.88,1.17Hz,2H),4.26(m,1H),4.14(m,1H),3.96(m,2H),3.43(m,1H),1.61(m,9H).
LC/MS：保留时间3.55min.(ESI)C18H21ClNO3理论值[M+H]+334；实测值334.
D811(32c)的合成
(6aS)-3-(4-(1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-2-甲氧基-7,12-二氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-14(6aH)-酮(32c/D811)
将4M HCl的二噁烷溶液(1mL)加入到Boc保护的CBI外消旋体30(15mg,0.03mmol)中。将溶液在室温下保持2小时，然后浓缩至干，得到31的盐酸盐。将残余物再溶解于无水氯仿(2mL)中，再次蒸发，重复该工序两次。然后将其溶于DMF(0.8mL)中，加入酸11c(15mg,0.039mmol)，然后加入EDC-HCl(16mg,0.09mmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后直接加载到15.5g C18Aq Isco柱上并纯化(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％的AcOH)。将所需级分冻干，得到2.5mg的32c(12％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.26(d,J＝8.30Hz,1H),8.23(s,1H),8.17(s,1H),7.51(m,3H),7.33(m,5H),6.88(m,1H),4.98(d,J＝15.1Hz,1H),4.53(d,J＝15.1Hz,1H),4.28(m,4H),4.04(m,2H),3.95(m,2H),3.86(m,4H),3.41(m,1H),3.18(m,1H),3.07(m,1H),2.84(m,1H),2.40(m,2H).
LC/MS：保留时间3.07min.(ESI)C35H33ClN3O5理论值[M+H]+610；实测值610.
D813(32e)的合成
(6aS)-3-((6-(1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-2-甲氧基-7,12-二氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-14(6aH)-酮(32e/D813)
采用对于32c所述的程序，但以11e开始。获得3.0mg的32e(14％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.26(d,J＝8.30Hz,1H),7.65(m,1H),7.53(m,3H),7.33(m,5H),6.83(m,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.56(d,J＝15.1Hz,1H),4.30(m,2H),4.10(m,3H),3.90(m,4H),3.42(m,1H),3.25(m,1H),3.14(m,1H),3.07(m,1H),2.66(m,1H),2.59(m,1H),2.84(m,1H),1.99(m,2H),1.92(m,2H).
LC/MS：保留时间3.34min.(ESI)C37H37ClN3O5理论值[M+H]+638；实测值638.
D815(32c-S,S)的合成
(S)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-2-甲氧基-7,12-二氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-14(6aH)-酮(32c-(S,S))
采用对于32c所述的程序，但以11c和30-(S)开始。获得3.3mg(16％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.26(d,J＝8.30Hz,1H),8.20(s,1H),7.64(m,1H),7.51(m,3H),7.33(m,5H),6.87(s,1H),5.00(d,J＝15.1Hz,1H),4.54(d,J＝15.1Hz,1H),4.27(m,4H),4.02(m,1H),3.92(m,2H),3.86(m,3H),3.78(m,1H),3.71(m,1H),3.65(m,1H),3.39(m,1H),3.19(m,1H),3.08(m,1H),2.88(m,1H),2.78(m,1H),2.40(m,2H).
LC/MS：保留时间3.07min.(ESI)C35H33ClN3O5理论值[M+H]+610；实测值610.
D817(32e-S,S)的合成
(S)-3-((6-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-6-氧代己基)氧基)-2-甲氧基-7,12-二氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-14(6aH)-酮(32e-(S,S))
采用对于32c所述的程序，但以11e和30-(S)开始。获得2.5mg(12％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.26(d,J＝8.30Hz,1H),8.23(m,1H),7.65(m,1H),7.53(m,3H),7.33(m,5H),6.85(s,1H),5.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.57(d,J＝15.1Hz,1H),4.30(m,2H),4.14(m,2H),4.04(m,1H),3.90(m,6H),3.41(m,1H),3.26(m,1H),3.16(m,1H),2.66(m,1H),2.59(m,1H),1.99(m,2H),1.92(m,2H),1.65(m,2H).
LC/MS：保留时间3.34min.(ESI)C37H37ClN3O5理论值[M+H]+638；实测值638.
实施例2：用于合成具有各种连接基团的IQB-CBI的实验方案(方案5和6，参考图5和6)
可以修饰用于产生CLT-D801的合成方案以在IQB部分和CBI部分之间引入各种间隔基团。参考图5和图6，方案可以以相同的方式进行，在化合物9和化合物10之间的步骤中引入修饰。更具体地，使用如本文所述的引入羧酸的部分X1，而不是2-溴乙酸。
实施例3：IQB-氨基CBI二聚体和IQB-羟基CBI二聚体的细胞毒性
针对AML2和HL60细胞系测试D801、D803、D05、D807、D809、D811、D813、D815和D817的细胞毒性。结果显示在表1中。在用各种IQB-CBI二聚体孵育3天后进行细胞杀伤测定。
表1：
通用方法：
在Varian Inova 300或500MHz NMR仪器上记录1H NMR光谱。使用MerckChromolith RP-18e分析型HPLC柱(整体，50×2mm)和以下分析HPLC方法，在Agilent 1200系列、1100系列或6130系列LC/MS系统上测定色谱纯度：注射体积5μL；流速1mL/min；5→95％乙腈水溶液，含0.05％AcOH，历时5分钟；Agilent二极管阵列检测器，λ＝254、220或195nm；室温。
1.0连接基的合成(方案7)(参考图7)
1.1t-boc-N-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基-五氟苯基碳酸酯(3)
向Ar吹扫的t-boc-N-酰胺基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基-醇(1)(350mg,0.428mmol)的DMF(2.1mL)溶液中加入DIEA(149μL,0.856mmol)，然后加入双-(五氟苯基)-碳酸酯(253mg,0.643mmol)。然后将反应在22℃下搅拌45分钟。然后将所得反应混合物直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到呈黄色泡沫的(3)(347mg,79％收率,0.338mmol)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.69(bs,1H),7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),6.98(bs,1H),6.86(bs,1H),5.27(s,2H),5.02(bs,1H),4.70-4.64(m,1H),4.20(t,J＝5.9Hz,1H),3.86(td,J＝9.9,2.9Hz,1H),3.69-3.61(m,29H),3.53(t,J＝4.8Hz,2H),3.31(bd,J＝4.3Hz,2H),2.70-2.65(m,1H),2.49-2.45(m,1H),2.30(dq,J＝12.7,6.4Hz,1H),1.45(d,J＝11.5Hz,3H),1.44(s,9H),1.01(dd,J＝15.0,6.8Hz,6H).
LC/MS：保留时间2.98min.(ESI)C46H67F5N4O16Na:[M+Na]+1049；实测值1049.
1.2t-boc-N-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基-N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺氨基甲酸酯(5)
在Ar下，向N,N2--二甲基乙烷-1,2-二胺(4)(142μL,1.32mmol)的DMF(0.33mL)溶液中滴加(5)反应混合物(如上所述)(0.0661mmol)的0.33mL DMF的粗溶液。使用另外100μL的DMF洗涤转移烧瓶并加入到反应混合物中以确保(3)完全转移到反应混合物中。然后将所得混合物在22℃下搅拌1小时。将反应混合物用0.5mL H2O稀释，然后直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(5)，为灰白色泡沫(37.1mg,60％收率,0.0398mmol)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.56(bs,1H),7.68(d,J＝8.3Hz,2H),7.30(d,J＝8.3Hz,2H),6.95(bs,1H),6.81(bs,1H),5.04(s,2H),4.65(quintet,J＝7.4Hz,1H),4.20(t,J＝6.3Hz,1H),3.88-3.83(m,1H),3.70-3.59(m,29H),3.53(t,J＝5.0Hz,2H),3.43-3.37(m,2H),3.31-3.30(m,2H),2.94(s,3H),2.80-2.78(m,1H),2.73-2.71(m,1H),2.68-2.63(m,1H),2.50-2.45(m,4H),2.40(s,2H),2.29(dt,J＝7.1,6.3Hz,1H),1.45(d,J＝7.4Hz,3H),1.44(s,9H),1.00(dd,J＝15.1,6.9Hz,6H).
LC/MS：保留时间2.15min.(ESI)C44H79N6O15:[M+H]+932；实测值932.
2.0碳酸酯D816的合成(方案8)(参考图8)
2.1氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的t-boc-N-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基碳酸酯(7)
在Ar下，向(6aS)-3-(4-(1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-2-甲氧基-7,12-二氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-14(6aH)-酮(6)(20.3mg,0.333mmol)的DMF(1.1mL)溶液中加入t-boc-N-酰胺基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基-五氟苯基碳酸酯(3)(34.2mg,0.0333mmol)和DMAP(10.2mg,0.0833mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌1小时。然后将所得反应混合物直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(7)，为白色固体(29.6mg,61％收率,0.0204mmol)。
LC/MS：保留时间3.01min.(ESI)C75H99ClN7O20:[M+H]+1452；实测值1452.
2.2氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基碳酸酯(8)
在Ar下，向氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的t-boc-N-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基碳酸酯(7)(29.6mg,0.0204mmol)中加入10:1DCM/TFA溶液(1.0mL)。将所得混合物在22℃下搅拌30分钟。然后将所得反应混合物直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(8)，为白色固体(11.8mg,44％收率,0.00872mmol)。
LC/MS：保留时间min.(ESI)C70H91ClN7O18:[M+H]+1352；实测值1352.
2.3氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的马来酰亚胺基丙酸酯-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基碳酸酯(D816)(10)
在Ar下，向氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基碳酸酯(8)(11.8mg,0.00872mmol)的DCM(0.5mL)溶液中加入TEA(12.2μL,0.0872mmol)和马来酰亚胺基丙酸酯NHS酯(8)。将所得混合物在22℃下搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩，溶解在DMSO中并直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(10)，为白色固体(6.8mg,52％收率,0.00452mmol)。
LC/MS：保留时间2.74min.(ESI)C77H96ClN8O21:[M+H]+1503；实测值1503.
3.0氨基甲酸酯D818的合成(方案9)(参考图9)
3.1二甲基二胺和氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的t-boc-N-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基二氨基甲酸酯(12)
在Ar下，向(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(11)(83mg,0.25mmol)的ACN(1.3mL)溶液中加入对硝基苯氧基氯甲酸酯(55mg,0.28mmol)和DIEA(0.112mL,0.65mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌1小时并加入5(200mg,0.21mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(12)，为白色固体(161mg,58％收率)。
LC/MS：保留时间3.79min.(ESI)C63H98ClN7O20:[M+H2O+H]+1308；实测值1308.
3.2二甲基二胺和氧代倍癌霉素-IQB-3C间隔基的马来酰亚胺基丙酸酯-酰氨基- 8-Val-Ala-4-氨基苄基二氨基甲酸酯(13)
在Ar下，向12(161mg,0.125mmol)中加入10:1DCM/TFA溶液(1.0mL)。将所得混合物在22℃下搅拌30分钟。然后将所得反应混合物直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到游离胺中间体。
在Ar下，向脱保护的胺(42mg,0.0382mmol)的DCM(1.5mL)溶液中加入DIEA(13μL,0.076mmol)和马来酰亚胺基丙酸酯NHS酯(15mg,0.057mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩，溶解在DMSO中并直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(13)，为白色固体(38mg,81％收率)。
LC/MS：保留时间2.87min.(ESI)C60H86ClN8O18:[M+H]+1241；实测值1241.
3.3(S)-1-(氯甲基)-3-(4-(((S)-2-甲氧基-14-氧代-6a,7,12,14-四氢苯并[5,6]-[1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-3-基)氧基)丁酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基(4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂正三十七烷酰氨基)苄基)乙烷-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(D818)(15)
向无水DMF(0.1mL)中的13(11mg,0.009mmol)加入(14)(4.3mg,0.011mmol)，向反应中加入pTsOH(1mg,0.005mmol)和EDC·HCl(6.2mg,0.032mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌10分钟，然后直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将含有产物的级分冻干，然后在EZ Prep上纯化(Gemini 30x 150mm柱)(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)，得到(15)，为白色固体(1.6mg,11％收率)。
LC/MS：保留时间2.64min.(ESI)C82H106ClN10O22:[M+H]+1618；实测值1618.
4.0醚连接的衍生物的合成(方案10)(参考图10)
4.1a(S)-1-(氯甲基)-5-((4-硝基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(16a)
在Ar下，向(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(11)(200mg,0.599mmol)的无水DMF(1.20mL)溶液中加入4-硝基溴苄(518mg,2.40mmol)和K2CO3(585mg,1.80mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌2小时。然后将反应混合物在EtOAc和H2O之间分配，并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机物用H2O(4×20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(0→10％EtOAc的己烷溶液)纯化粗残余物，得到期望的产物(16a)，为黄色固体(208mg,74％收率,0.443mmol)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.29(t,J＝7.5Hz,3H),7.86(bs,1H),7.73(d,J＝7.9Hz,2H),7.67(d,J＝8.6Hz,1H),7.54(t,J＝7.4Hz,1H),7.40-7.37(m,1H),5.39(s,2H),4.26(bd,J＝10.3Hz,1H),4.14(t,J＝10.0Hz,1H),3.99(t,J＝9.8Hz,1H),3.94(d,J＝9.6Hz,1H),3.45(t,J＝10.6Hz,1H),1.60(s,9H).
LC/MS：保留时间3.93min.(ESI)C25H26ClN2O5:[M+H]+469；实测值469.
4.1b(S)-1-(氯甲基)-5-((3-甲氧基-4-硝基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(16b)
根据与16a相同的程序合成氧代倍癌霉素16b，但以3-甲氧基-4-硝基溴苄开始。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.29(d,J＝7.5Hz,1H),7.92(d,J＝7.9Hz,2H),7.68(d,J＝8.6Hz,1H),7.55(t,J＝7.4Hz,1H),7.40-7.37(m,1H),7.30(s,1H),7.22(d,J＝7.5Hz,1H),5.34(s,2H),4.26(bd,J＝10.3Hz,1H),4.15(t,J＝10.0Hz,1H),4.02(s,3H),3.96(t,J＝9.8Hz,1H),3.93(d,J＝9.6Hz,1H),3.46(t,J＝10.6Hz,1H),1.61(s,9H).
LC/MS：保留时间3.93min.(ESI)C26H27ClN2O6Na:[M+Na]+521；实测值521.
4.2a(S)-1-(氯甲基)-5-((4-氨基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(17a)
在Ar下，向(S)-1-(氯甲基)-5-((4-硝基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(16a)(208mg,0.443mmol)的THF/丙酮(分别为11.1mL/8.9mL)溶液中加入H2O(4.5mL)、Zn粉(868mg,13.3mmol)和NH4Cl(1.42mg,26.6mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌45分钟。然后将反应混合物通过垫过滤并用DCM(20mL)洗涤。浓缩滤液，然后在DCM和H2O之间分配。然后将有机物用MgSO4干燥，过滤并浓缩。将分离的粗残余物视为纯的所需产物(17a)，为黄色泡沫(191mg,98％收率,0.435mmol)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.25(d,J＝8.2Hz,1H),7.85(bs,1H),7.63(d,J＝8.2Hz,1H),7.50-7.47(m,1H),7.32-7.30(m,3H),6.73(d,J＝8.2Hz,2H),5.13(s,2H),4.25(bs,1H),4.12(t,J＝10.0Hz,1H),3.95(q,J＝9.9Hz,2H),3.73(s,2H),3.43(t,J＝10.3Hz,1H),1.61(s,9H).
LC/MS：保留时间3.44min.(ESI)C25H27ClN2O3Na:[M+Na]+461；实测值461.
4.2b(S)-1-(氯甲基)-5-((3-甲氧基-4-氨基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(17b)
根据与17a相同的程序合成氧代倍癌霉素17b，但以(S)-1-(氯甲基)-5-((3-甲氧基-4-硝基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯17a开始。
LC/MS：保留时间3.44min.(ESI)C26H30ClN2O4:[M+H]+469；实测值469.
4.3a(S)-1-(氯甲基)-5-((4-((34S,37S)-34-异丙基-2,2,37-三甲基-4,32,35-三氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-5,33,36-三氮杂三十八烷-38-酰氨基)苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(18a)
在Ar下，向(S)-1-(氯甲基)-5-((4-氨基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(17a)(51.5mg,0.117mmol)和HOAlaValPeg8NHBoc(91.9mg,0.129mmol)的10:1DCM/MeOH(550μL)溶液中加入EEDQ(55.0mg,0.222mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌3.5小时。然后将反应混合物浓缩，溶解在DMSO中并直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到(18a)，为白色固体(49.2mg,38％收率,0.00439mmol)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.59(bs,1H),8.25(d,J＝8.7Hz,1H),7.86(bs,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),7.51-7.46(m,3H),7.32(t,J＝7.2Hz,1H),6.96(s,1H),6.82(s,1H),5.20(s,2H),5.02(bs,1H),4.67(t,J＝7.0Hz,1H),4.28-4.21(m,2H),4.13(t,J＝10.5Hz,1H),3.95(q,J＝10.6Hz,2H),3.88(dt,J＝10.6,5.2Hz,1H),3.71-3.61(m,28H),3.53(t,J＝4.7Hz,2H),3.43(t,J＝10.4Hz,2H),3.30(bs,2H),2.67(t,J＝13.3Hz,1H),2.50-2.47(m,1H),2.31-2.30(m,1H),1.61(s,9H),1.47(d,J＝7.2Hz,3H),1.44(s,9H),1.01(dd,J＝15.0,6.9Hz,6H).
LC/MS：保留时间3.44min.(ESI)C57H86ClN5O16Na:[M+Na]+1154；实测值1154.
4.3b(S)-1-(氯甲基)-5-((4-((34S,37S)-34-异丙基-2,2,37-三甲基-4,32,35-三氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-5,33,36-三氮杂三十八烷-38-酰氨基)-3-甲氧基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚3-羧酸叔丁酯(18b)
根据与18a相同的程序合成氧代倍癌霉素18b，但以(S)-1-(氯甲基)-5-((3-甲氧基-4-氨基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯17b开始。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.37(bs,1H),8.34(d,J＝8.7Hz,1H)8.25(d,J＝8.7Hz,1H),7.86(bs,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.33(t,J＝7.2Hz,1H),7.12(d,J＝8.0Hz,1H),7.07(s,1H),6.94(d,J＝8.0Hz,1H),6.84(br,1H),5.22(s,2H),5.07(bs,1H),4.65(t,J＝7.0Hz,1H),4.35-4.24(m,2H),4.13(t,J＝10.5Hz,1H),3.95(m,2H),3.92(s,3H),3.77(m,2H),3.71-3.61(m,28H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.43(t,J＝10.4Hz,1H),3.31(m,2H),2.55(m,1H),2..21(m,1H),1.81(br,3H),1.61(s,9H),1.48(d,J＝7.2Hz,3H),1.45(s,9H),0.98(dd,J＝15.0,6.9Hz,6H).
LC/MS：保留时间3.46min.(ESI)C58H88ClN5O17:[M+Na]+1184；实测值1184.
4.4a N-((S)-1-(((S)-1-((4-((((S)-1-(氯甲基)-3-(4-(((S)-2-甲氧基-14-氧代-6a,7,12,14-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-3-基)氧基)丁酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(19a)(D820b)
在20mL小瓶中向冷却至0℃的(S)-1-(氯甲基)-5-((4-((34S,37S)-34-异丙基-2,2,37-三甲基-4,32,35-三氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-5,33,36-三氮杂三十八烷-38-酰氨基)苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(18a)加入2:1DCM/TFA(0.75mL,预冷至-20℃)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，此时通过LC/MS判断反应完成。将反应真空浓缩，然后与CHCl3(4×5mL)共沸并在高真空下放置16小时。然后将残余物溶于DCM(1mL)中，然后加入TEA(6μL,0.0422mmol)。加入另外2μL的TEA使反应碱化至pH～8，然后加入马来酰亚胺NHS酯(9)(9.8mg,0.0369mmol)，将所得混合物在22℃下搅拌15分钟，此时通过LC/MS判断反应完成。然后浓缩反应混合物并与CHCl3(3×5mL)共沸并在高真空下放置1小时。然后将残余物溶于无水DMF(1mL)中，并将IQB酸(14)(20.8mg,0.0528mmol)、pTsOH(10mg,0.053mmol)和EDC·HCl(30.3mg,0.158mmol)加入到反应中。将所得混合物在22℃下搅拌10分钟，然后直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将含有产物的级分冻干，然后在EZ Prep上再纯化(Gemini 30x 150mm柱)(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)，得到(19a)，为白色固体(1.7mg,3步收率5.5％，0.00116mmol)。
LC/MS：保留时间2.73min.(ESI)C76H96ClN8O19:[M+H]+1459；实测值1459.
4.4b N-((S)-1-(((S)-1-((4-((((S)-1-(氯甲基)-3-(4-(((S)-2-甲氧基-14-氧代-6a,7,12,14-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-3-基)氧基)丁酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)氧基)甲基)-2-甲氧基苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰胺(19b)(D820))
根据与19a相同的程序合成氧代倍癌霉素19b，但以(S)-1-(氯甲基)-5-((4-((34S,37S)-34-异丙基-2,2,37-三甲基)-4,32,35-三氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-5,33,36-三氮杂三十八烷-38-酰氨基)-3-甲氧基苄基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯18b开始。
LC/MS：保留时间2.77min.(ESI)C77H98ClN8O20:[M+H]+1491；实测值1491.
实施例4：用于合成IQB-氧代倍癌霉素类似物D822、D824、D826和D828的通用实验方案
一般方法：
在Varian Inova 300或500MHz NMR仪器上记录1H NMR光谱。使用MerckChromolith RP-18e分析型HPLC柱(整体，50×2mm)和以下分析型HPLC方法，在Agilent1200系列、1100系列或6130系列LC/MS系统上测定色谱纯度：注射体积5μL；流速1mL/min；5→95％乙腈水溶液，含0.05％AcOH，历时5分钟；Agilent二极管阵列检测器，λ＝254、220或195nm；室温。
1.0连接基的合成(方案11)(参考图11)
1.1((烯丙基氧基)羰基)-L-缬氨酰-L-丙氨酸(2)
向NH2-Val-Ala-OH(941mg,5mmol)的DMF(10mL)溶液中加入DIEA(1.73mL,10mmol)和N-(烯丙基氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(1.15mL,7.5mmol)。将反应混合物搅拌3小时，用水(3mL)淬灭并搅拌过夜。真空除去溶剂，残余物用HCl水溶液(40mL,0.25M)稀释。超声处理后，滤出沉淀物并彻底干燥，得到2(600mg,44％收率)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.48(bs,1H),8.18(d,J＝7.0Hz,1H),7.16(d,J＝9.4Hz,1H),5.95-5.83(m,1H),5.28(d,J＝15.8Hz,1H),5.17(d,J＝10.5Hz,1H),4.47(m,2H),4.18(m,1H),3.87(m,1H),1.94(m,1H),1.26(d,J＝7.6Hz,3H),0.86(dd,J＝14.6,6.7Hz,6H).
LC/MS：保留时间0.25min.(ESI)C12H21N2O5:[M+H]+273；实测值273.
1.2((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(3)
在Ar下，向((烯丙氧基)羰基)-L-缬氨酰-L-丙氨酸(2)(3.00g,11.0mmol)和对氨基苯甲醇(1.56g,12.7mmol)在DCM(110mL)和MeOH(55mL)中的溶液中加入EEDQ(5.12g,20.7mmol)。将反应混合物在22℃下搅拌19小时，然后浓缩并通过柱色谱法(0→10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到3(2.48g,60％收率)。
1H NMR(500MHz；CD3OD):δ7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(d,J＝8.3Hz,2H),6.00-5.92(m,1H),5.33(d,J＝17.4Hz,1H),5.20(d,J＝10.5Hz,1H),4.57(s,2H),4.51(q,J＝7.1Hz,1H),3.97(d,J＝6.6Hz,1H),3.37(s,2H),2.11(dq,J＝13.7,6.8Hz,1H),1.46(d,J＝7.1Hz,3H),0.99(dd,J＝17.8,6.8Hz,6H).
LC/MS：保留时间2.02min.(ESI)C19H28N4O5:[M+H]+378；实测值378.
1.3((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-((((全氟苯氧基)羰基)-氧基)-甲基)-苯基)-氨基)-丙烷-2-基)-氨基)-丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(4)
在Ar下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷2-基)氨基甲酸烯丙酯(3)(417mg,1.10mmol)的DMF(5.5mL)溶液中加入DIEA(383μL,2.20mmol)和双(五氟苯基)碳酸酯(653mg,1.66mmol)。将反应在22℃下搅拌1小时，然后加入另外的DIEA(190ml,1.10mmol)和双(五氟苯基)碳酸酯(433mg,1.10mmol)，并将混合物再搅拌1小时。然后将混合物直接加载并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到4(442mg,68％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3):δ8.51(s,1H),7.65(d,J＝7.8Hz,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),6.34(d,J＝7.3Hz,1H),5.98-5.89(m,1H),5.36-5.25(m,2H),5.30(s,2H),5.19-5.18(m,1H),4.67(t,J＝7.1Hz,1H),4.62(d,J＝4.9Hz,2H),4.01(t,J＝6.4Hz,1H),2.27-2.20(m,1H),1.52(d,J＝7.1Hz,3H),1.00(dd,J＝23.2,6.9Hz,6H).
LC/MS：保留时间3.44min.(ESI)C26H27F5N3O7:[M+H]+588；实测值588.
2.0 CBI部分的合成(方案12)(参考图12)
2.1(S)-5-((双烯丙氧基)磷酰基)氧基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(6a)
在Ar下，向5(67mg,0.2mmol)的THF(1mL)溶液中加入四嗪(0.9mL,0.45M的CAN溶液)和二烯丙氧基磷酰胺(0.11mL,0.4mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌2小时，然后立即加入过氧化氢(0.045mL,50％水溶液)。搅拌45分钟后，将混合物浓缩至干，溶于1mL DMSO中，并通过反相柱色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化，并将所需级分冻干，得到6a(72mg,73％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):8.13(d,J＝8.3Hz,1H),7.69(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(t,J＝7.6Hz,1H),7.40(t,J＝7.6Hz,1H),5.96(m,2H),5.39(d,J＝17.1Hz,1H),5.26(m,2H),4.71(m,4H),4.30(m,1H),4.14(m,1H),3.99(m,1H),3.91(d,J＝10.7Hz,1H),3.46(t,J＝10.7Hz,1H),1.62(bs,9H).
LC/MS：保留时间3.75min.(ESI)C24H29ClNO6PNa:[M+Na]+516；实测值516.
2.2(S)-1-(氯甲基)-5-((甲氧基羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(6b)
在Ar下，向5(67mg,0.2mmol)的DCM(2mL)溶液中加入吡啶(0.081mL,1mmol)和氯甲酸甲酯(0.046mL,0.6mmol)溶液。30分钟后，将反应混合物浓缩至干，溶于少量DCM上，并加载到12g二氧化硅Isco柱(0→50％EtOAc的己烷溶液)上。浓缩所需的级分，得到6b(71mg,91％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):8.16(bs,1H),7.93(d,J＝8.8Hz,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,1H),7.54(m,1H),7.40(m,1H),4.30(bs,1H),4.16(m,1H),4.03(m,1H),3.97(m,4H),3.49(t,J＝11.0Hz,1H),1.61(s,9H).
LC/MS：保留时间3.72min.(ESI)C20H22ClNO5Na:[M+Na]+414；实测值414.
2.3(S)-1-(氯甲基)-5-((4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-羧酸叔丁酯(6c)
在Ar下，向5(100mg,0.3mmol)的DCM(2mL)溶液中加入吡啶(0.073mL,0.90mmol)和4-甲基哌嗪-1-碳酰氯(0.061mL,0.45mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩至干燥，溶于1mLDMSO，经反相柱色谱纯化(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)，将所需级分冻干，得到6c(133mg,97％收率)。
1H-NMR(500MHz；CDCl3):δ8.09(bs,1H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.72(d,J＝8.5Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),7.39(t,J＝7.7Hz,1H),4.28(bs,1H),4.16(t,J＝10.2Hz,1H),4.05-4.01(m,1H),3.97-3.95(m,1H),3.87(bs,2H),3.66(bs,2H),3.49(t,J＝10.8Hz,1H),2.54(bd,J＝16.6Hz,4H),2.41(s,3H),1.61(s,9H).
LC/MS：保留时间2.31min.(ESI)C24H31ClN3O4:[M+H]+460；实测值460.
2.4去除Boc基团的通用程序(7a-c)
将6a、6b或6c(0.05mmol)溶解在无水DCM(1.6mL)中，并立即加入三氟化硼醚合物(0.031mL,0.25mmol)。搅拌40分钟后，将反应混合物浓缩至干，并在下一步骤之前在高真空下彻底干燥。无需纯化，材料照原样用于后续步骤中。
3.0 IQB部分的合成和最终组装(方案13)(参考图13和14)
3.1 4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(9)
将4-苄氧基-5-甲氧基-苯甲酸甲酯(9.1g,29mmol)溶解在甲醇(145mL)中，并立即加入氢氧化钠(6M溶液，24mL)。将反应混合物在50℃下搅拌1小时，然后蒸发甲醇。在搅拌下将浓盐酸(12mL)缓慢加入到残余物中。滤出所形成的沉淀物，用水洗涤并干燥，得到8.1g的3(92％收率)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.69(s,1H),7.36-7.47(m,5H),7.31(s,1H),5.24(s,2H),3.91(s,3H).
LC/MS：保留时间2.40min(ESI)C15H13NO6Na:[M+Na]+326；实测值326.
3.2(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(3-(羟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲酮(10)
向4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(9)(10.0g,33.0mmol)的DCM(100mL)溶液中加入HATU(16.3g,42.9mmol)和DIEA(8.61mL,49.5mmol)。将混合物在22℃下搅拌15分钟，然后加入(S)-(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-基)甲醇(6.46g,39.6mmol)。在Ar下，将所得混合物在22℃下搅拌2小时，然后加入MeOH(50mL)，过滤所得到的沉淀物并用DCM(100mL)洗涤。浓缩所得滤液，并通过柱色谱法(25→85％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到不纯的10(15.3g34.1mmol)，为黄色泡沫。
1H NMR(500MHz；CDCl3)(含有旋转异构体和杂质):δ8.67(d,J＝4.6Hz,0.3H),8.43(d,J＝8.5Hz,0.3H),7.85-7.82(m,2H),7.79(s,0.3H),7.50(t,J＝5.4Hz,5H),7.46-7.43(m,4H),7.40-7.38(m,2H),7.26-7.22(m,2H),7.19-7.16(m,1H),7.11-7.06(m,0.3H),6.87(d,J＝7.0Hz,1H),6.75(dd,J＝1.8,0.5Hz,0.3H),6.67(s,1H),5.62-5.52(m,1H),5.26(s,2H),5.25-5.25(m,1H),5.11(s,0.3H),4.98-4.96(m,1H),4.46-4.41(m,1H),4.34(d,J＝15.4Hz,1H),4.28-4.23(m,1H),4.03(s,2H),3.97(s,3H),3.93-3.91(m,3H),3.80-3.75(m,1H),3.68-3.62(m,1H),3.49-3.48(m,1H),3.28-3.22(m,0.3H),3.19-3.10(m,1H),3.08-3.03(m,1H),2.82(s,14H).
LC/MS：保留时间3.15min.(ESI)C25H25N2O6:[M+H]+449；实测值449.
3.3(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲酮(11))
在Ar下，向(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(3-(羟甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲酮(10)(15.3g,34.1mmol)的DCM(155mL)溶液中加入咪唑(4.64g,68.2mmol)，然后加入TBSCl(7.71g,51.2mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌15分钟，然后用H2O(100mL)淬灭，用DCM(3×150mL)萃取，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到11(14.0g,76％收率)，为黄色泡沫。
1H NMR(500MHz；CDCl3)(包含旋转异构体的混合物):δ7.85(s,0.4H),7.82-7.81(m,0.6H),7.50-7.49(m,2H),7.45-7.42(m,2H),7.41-7.36(m,1H),7.24-7.20(m,3H),7.16-7.12(m,1H),6.91(s,0.3H),6.85-6.82(m,1H),6.75(bs,0.3H),6.67(s,0.3H),5.42-5.37(m,0.3H),5.26(s,2H),5.10(bs,0.2H),5.01(bs,0.3H),4.43(d,J＝17.1Hz,0.5H),4.32(d,J＝15.3Hz,0.6H),4.24-4.19(m,0.5H),4.00(d,J＝12.1Hz,2H),3.91(s,1H),3.85(s,0.4H),3.78-3.74(m,0.6H),3.68-3.64(m,0.4H),3.50(bs,0.6H),3.38(s,0.3H),3.21(bd,J＝16.5Hz,0.5H),3.10(dd,J＝16.8,5.9Hz,0.4),2.99(d,J＝17.3Hz,0.6H),2.77(bd,J＝15.0Hz,0.2),0.92(s,2H),0.87(d,J＝7.6Hz,3H),0.81-0.76(m,4H),0.04(dd,J＝22.9,12.2Hz,3H),-0.11--0.18(m,2H).
LC/MS：保留时间4.47min.(ESI)C31H39N2O6Si:[M+H]+563；实测值563.
3.4(S)-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)(4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯基)甲酮(12)
向用Ar(3x)真空吹扫的(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲酮(11)(14.0g,24.9mmol)的EtOAc(500mL)溶液中加入Pd(OH)2/C(710mg)。然后将反应混合物用Ar(3X)真空吹扫，然后用H2(3x)吹扫。将混合物在22℃和H2下搅拌2.5小时，同时剧烈搅拌。然后将混合物用Ar真空吹扫，并将混合物通过过滤，用EtOAc洗涤，浓缩滤液。通过柱色谱法(10→100％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到12(11.3g,97％收率)，为黄色泡沫，含有～6％的过度还原(苯胺)杂质。
1H NMR(500MHz；CDCl3)(含有旋转异构体和苯胺杂质)：δ7.86-7.81(m,1H),7.24-7.21(m,2H),7.17-7.11(m,0.7H),6.93-6.89(m,0.2H),6.86-6.85(m,0.7H),6.82(dt,J＝1.8,0.8Hz,0.2H),6.69(t,J＝0.9Hz,0.2H),5.90(s,1H),5.43(bs,0.4H),5.09(s,0.3H),5.05-5.00(m,0.3H),4.42(dd,J＝17.1,0.7Hz,0.5H),4.32(t,J＝13.2Hz,0.5H),4.25-4.21(m,0.6H),4.05(dd,J＝2.1,1.5Hz,0.8H),4.02(s,1.7H),3.95(d,J＝0.5Hz,1H),3.90-3.83(m,0.8H),3.77-3.66(m,1H),3.55-3.48(m,0.4H),3.41-3.38(m,0.1H),3.22(d,J＝16.1Hz,0.5H),3.13-2.99(m,0.8H),0.92(s,2H),0.87(d,J＝7.0Hz,4H),0.81(s,4H),0.07-0.03(m,4H),-0.10(s,3H).
LC/MS：保留时间4.42min.(ESI)C24H33N2O6Si:[M+H]+473；实测值473.
3.5(S)-4-(4-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸乙酯(13)
向(S)-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)(4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯基)甲酮(12)(2.57g,5.44mmol)和Cs2CO3(5.32g,16.3mmol)的DMF(27mL)溶液中加入4-溴丁酸乙酯(2.34mL 16.3mmol)。将反应混合物在22℃下搅拌2.5小时，然后用H2O(100mL)淬灭并用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机物用H2O(3×50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(0→50％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到13(2.68g,84％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3)(含有旋转异构体):δ7.79-7.74(m,1H),7.25-7.20(m,2H),7.14(dtd,J＝4.5,1.9,0.9Hz,0.5H),6.89-6.84(m,0.6H),6.80(d,J＝0.9Hz,0.1H),6.66(s,0.2H),5.42-5.39(m,0.3H),5.10(bs,0.2H),5.01(bs,0.3H),4.44-4.40(m,0.5H),4.34-4.29(m,0.6H),4.22-4.18(m,5H),3.99-3.96(m,2H),3.89(s,1H),3.78-3.74(m,0.5H),3.66(bs,0.2H),3.51-3.48(m,0.4H),3.38(bs,0.2H),3.22(dd,J＝17.0,1.8Hz,0.5H),3.13-3.09(m,0.3H),3.01-2.98(m,0.6H),2.79(bt,J＝2.1Hz,0.2H),2.60-2.57(m,2H),2.26-2.23(m,2H),1.29(dd,J＝14.3,9.9Hz,3H),0.92(s,2H),0.86(s,3H),0.81-0.78(m,4H),0.05(t,J＝8.5Hz,3H),-0.11(bs,2H).
LC/MS：保留时间4.24min.(ESI)C30H43N2O8Si:[M+H]+587；实测值587.
3.6(S)-4-(5-氨基-4-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(14)
向(S)-4-(4-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸乙酯(13)(2.68g,4.57mmol)的THF(91mL)和H2O(9.1mL)溶液中加入NH4Cl(4.89g,91.4mmol)和Zn粉(2.99g,45.7mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌2.5小时，然后通过过滤，用EtOAc洗涤，浓缩滤液。通过柱色谱法(0→75％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到14(2.14g,84％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3):δ7.21-7.16(m,4H),7.09-7.07(m,1H),6.79(s,1H),6.33(s,1H),4.49(bs,1H),4.18(q,J＝7.1Hz,2H),4.07(t,J＝6.3Hz,2H),3.79(s,3H),3.68(bs,2H),3.18(dd,J＝16.2,5.9Hz,1H),2.86-2.82(m,1H),2.56(t,J＝7.3Hz,2H),2.21-2.16(m,2H),1.57(bs,3H)1.29(t,J＝7.1Hz,3H),0.87(s,9H),0.01(s,6H).
LC/MS：保留时间3.94min.(ESI)C30H45N2O6Si:[M+H]+557；实测值557.
3.7 4-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-丙酰氨基)-苄基)-氧基)-羰基)-氨基)-4-((S)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(15)
向(S)-4-(5-氨基-4-(3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(14)(545mg,0.978mmol)的THF(1.5mL)溶液中加入((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-(((全氟苯氧基)羰基)-氧基)-甲基)-苯基)-氨基)-丙烷-2-基)-氨基)-丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(4)(442mg,0.752mmol)的THF(0.5mL)溶液。用Ar吹扫反应容器，密封，并将反应混合物在22℃下搅拌4天。然后浓缩混合物，并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％AcOH)纯化残余物。将所需级分冻干，通过柱色谱法(0→100％EtOAc的己烷溶液)纯化不纯产物，得到15(520mg,72％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3,50℃):δ8.25-8.23(m,2H),7.81(bs,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.3Hz,2H),7.19-7.18(m,2H),7.14(ddd,J＝4.4,2.2,1.0Hz,1H),7.07-7.04(m,1H),6.82(s,1H),6.29(d,J＝7.8Hz,1H),5.94-5.88(m,1H),5.31(d,J＝17.7Hz,1H),5.22(d,J＝10.5Hz,1H),5.14-5.04(m,3H),4.62(dt,J＝16.7,7.6Hz,3H),4.38(d,J＝16.9Hz,1H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),4.11(t,J＝6.0Hz,2H),3.98(t,J＝6.5Hz,1H),3.81(s,3H),3.65(bs,2H),3.11(dd,J＝16.1,6.4Hz,1H),2.82(bd,J＝15.1Hz,1H),2.53(t,J＝7.5Hz,2H),2.18(dq,J＝13.0,6.2Hz,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H),0.97(dd,J＝18.8,6.8Hz,6H),0.82(s,9H),-0.03(d,J＝4.7Hz,6H).
LC/MS：保留时间4.27min.(ESI)C50H69N5O12SiNa:[M+Na]+982；实测值982.
3.8 4-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-丙酰氨基)-苄基)-氧基)-羰基)-氨基)-4-((S)-3-(羟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(16)
在Ar下，向4-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-丙酰氨基)-苄基)-氧基)-羰基)-氨基)-4-((S)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(15)(457mg,0.476mmol)的无水THF(4.2mL)溶液中加入AcOH(55μL,0.952mmol)，然后加入TBAF(0.83mL的1.0M THF溶液，0.83mmol)，并将反应在22℃下搅拌22小时。将反应混合物用EtOAc(10mL)稀释，并将有机物用H2O、NaHCO3(饱和的)和盐水(各自，1×5mL)洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(20→100％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到16(385mg,96％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3):δ8.42(bs,1H),8.05(bs,1H),7.67(bs,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.19(t,J＝3.2Hz,2H),7.14(bs,1H),7.04(bs,1H),6.76(s,1H),6.46(bs,1H),5.90(bs,1H),5.31(d,J＝17.5Hz,1H),5.23(d,J＝10.7Hz,2H),5.08(s,2H),4.65-4.56(m,3H),4.36(d,J＝16.4Hz,1H),4.15(q,J＝7.1Hz,2H),4.10(s,2H),3.99(t,J＝6.3Hz,1H),3.79(s,3H),3.63(t,J＝8.8Hz,1H),3.17-3.12(m,1H),2.72(bs,1H),2.53(t,J＝7.4Hz,2H),2.17(t,J＝6.3Hz,3H),1.45(d,J＝6.9Hz,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H),0.95(dd,J＝22.0,6.8Hz,6H).
LC/MS：保留时间3.05min.(ESI)C44H56N5O12:[M+H]+846；实测值846.
3.10 4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-乙氧基-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(17)
在Ar下，向4-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-丙酰氨基)-苄基)-氧基)-羰基)-氨基)-4-((S)-3-(羟甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-2-甲氧基苯氧基)丁酸乙酯(16)(253mg,0.299mmol)的DCM(3.0mL)溶液中加入Dess-Martin periodinane(戴斯马丁氧化剂)(190mg,0.449mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌3小时，然后用3mL的0.5M Na2S2O3淬灭，用DCM(5mL)稀释。将混合物搅拌5分钟，然后加入3mL的NaHCO3水溶液(饱和的)并再搅拌5分钟，然后用DCM(3×5mL)萃取。将合并的有机物用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(0→10％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到17(222mg,88％收率)。
1H NMR(500MHz；CDCl3):δ8.48(bs,1H),7.55-7.53(m,2H),7.28(s,3H),7.19-7.18(m,3H),6.82-6.79(m,1H),6.32(bs,1H),5.90(bs,1H),5.41(d,J＝10.9Hz,1H),5.33-5.19(m,4H),4.83(d,J＝15.7Hz,1H),4.69-4.59(m,3H),4.55(d,J＝15.9Hz,2H),4.15(q,J＝7.1Hz,2H),4.02(dd,J＝6.6,5.9Hz,1H),3.87(s,3H),3.73-3.70(m,2H),3.32(bs,1H),3.16(dd,J＝15.1,2.6Hz,1H),3.07(dd,J＝15.0,5.4Hz,1H),2.44-2.38(m,2H),2.24-2.20(m,1H),1.97(bs,2H),1.46(d,J＝6.8Hz,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H),0.98(dd,J＝27.7,6.8Hz,6H).
LC/MS：保留时间2.97min.(ESI)C44H54N5O12:[M+H]+844；实测值844.
3.11 4-(((6aS)-5-(((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-丙酰氨基)-苄基)-氧基)-羰基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-5,6,6a,7,12,14-六氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-3-基)氧基)丁酸(18)
向4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-乙氧基-4-氧代丁氧基)6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(17)(222mg,0.263mmol)的3:1:1THF/MeOH/H2O(2.2mL)溶液中加入LiOH(31.6mg,1.32mmol)。将所得混合物在22℃下搅拌1小时，然后用5％柠檬酸(水溶液)(5mL)淬灭，并用2-MeTHF(3×5mL)萃取。将合并的有机物浓缩并通过柱色谱法(0→10％MeOH，含有0.1％HOAc，在DCM中)纯化，得到18(162mg,76％收率)。
1H NMR(500MHz；CD3OD):δ7.49(d,J＝8.2Hz,2H),7.26(d,J＝7.1Hz,4H),7.15-7.10(m,2H),6.99-6.75(m,1H),6.63(s,1H),5.90(ddt,J＝16.7,10.9,5.5Hz,1H),5.29-5.25(m,2H),5.14(d,J＝10.4Hz,2H),4.77-4.72(m,2H),4.52-4.45(m,4H),4.03(s,1H),3.92(d,J＝5.8Hz,2H),3.84(s,3H),3.74(bs,1H),3.60(bs,1H),3.09(d,J＝3.2Hz,2H),2.48-2.38(m,2H),2.00(bd,J＝42.2Hz,3H),1.40(d,J＝4.9Hz,3H),0.94(dd,J＝17.7,6.2Hz,6H).
LC/MS：保留时间2.67min.(ESI)C42H50N5O12:[M+H]+816；实测值816.
3.12 4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-5-((双(烯丙氧基)磷酰基)氧基)-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(19a)
将粗品7a(0.05mmol)、18(0.02mmol)和DIEA(0.035mL,0.1mmol)溶解在无水DMF(0.2mL)中。加入HATU(30mg,0.08mmol)并将混合物搅拌过夜。反应混合物未经后处理并在下一步骤中原样使用。
3.13 4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(20a)
用DMF(1mL)稀释19a的反应混合物，加入吡咯烷(0.008mL,0.1mmol)，然后加入四(三苯基膦)钯(5.6mg,0.005mmol)。30分钟后，将反应混合物在EZ Prep上纯化(Gemini 30x150mm柱)(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％TFA)，得到20a(20.5mg,99％收率)，含有未知杂质。在下一步中按原样使用。
LC/MS：保留时间2.56min.(ESI)C51H57ClN6O13P:[M+H]+1027；实测值1027.
3.14 4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基(6aR)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-13-氧代-6,6a,7,12,12a,13-六氢-5H-苯并[b]萘并[2,3-e]氮杂卓-5-羧酸酯(21a/D826)
将粗品20a(20.5mg,0.02mmol)溶解在DMF(0.4mL)中，加入DIEA(0.01mL,0.06mmol)，然后加入MAL-8-NHS酯(20.7mg,0.03mmol)。2小时后，将反应混合物直接加载并在EZ Prep上纯化(Gemini 30x 150mm柱)(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％TFA)，得到21a(3.9mg,12％收率)。
LC/MS：保留时间2.42min.(ESI)C77H98ClN8O25PNa:[M+Na]+1624；实测值1624.
3.15 4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-((甲氧基羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(19b)
将粗品7b(0.04mmol)、18(0.03mmol)和DIEA(0.027mL,0.16mmol)溶解在无水DMF(0.2mL)中。加入HATU(60mg,0.16mmol)并将混合物搅拌过夜。将反应混合物直接加载并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)纯化，得到19b(16.4mg,48％收率)。
LC/MS：保留时间3.38min.(ESI)C57H61ClN6O14Na:[M+Na]+1111；实测值1111.
3.16 4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-((甲氧基羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(20b)
在Ar下，向19b的DCM(2mL)溶液中加入Bu3SnH(0.005mL,0.02mmol)，然后加入四(三苯基膦)钯(8mg,0.007mmol)。30分钟后，将反应混合物浓缩，溶解在DMSO(1mL)中，并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)纯化，得到20b(7.7mg,52％收率)。
LC/MS：保留时间2.53min.(ESI)C53H58ClN6O12:[M+H]+1005；实测值1005.
3.17 4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基(6aS)-6-羟基-3-(4-((S)-5-羟基-1-(羟甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(21b/D824)
向20b(7.2mg,0.007mmol)的DMF(0.1mL)溶液中加入DIEA(0.003mL,0.02mmol)，然后加入MAL-8-NHS酯(9.9mg,0.014mmol)。3小时后，将反应混合物直接加载并通过反相色谱法纯化(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)，得到21b(1.6mg,14％收率)和21b的另外的较低纯度的部分(含1％20b)(2.3mg,20％收率)。
LC/MS：保留时间3.05min.(ESI)C79H99ClN8O24Na:[M+Na]+1601；实测值1601.
3.18 4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-((4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(19c)
将7c(0.04mmol)、18(0.03mmol)和DIEA(0.028mL,0.16mmol)溶解在无水DMF(0.2mL)中。加入HATU(61mg,0.16mmol)并将混合物搅拌过夜。将反应混合物直接加载并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)纯化，得到19c(16.0mg,40％收率)，被酸18污染。
LC/MS：保留时间2.63min.(ESI)C61H70ClN8O13:[M+H]+1157；实测值1157.
3.19 4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-((4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(20c)
向不纯的19c(16mg,0.15mmol)的二噁烷/THF/H2O(0.4mL)溶液中依次加入Et3N(0.014mL,0.096mmol)、甲酸(0.014mL,0.36mmol)、PPh3(1.3mg,0.0048mmo)和四(三苯基膦)钯(1.3mg,0.001mmol)。16小时后，加入另外的四(三苯基膦)钯(2mg,0.002mmol)并再搅拌3小时。浓缩反应混合物，溶于DMSO(1mL)中，并通过EZ Prep纯化(Gemini30x 150mm柱)(5→95％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)，得到含有未知量的杂质的20c(16mg)。
LC/MS：保留时间2.16min.(ESI)C57H65ClN8O11Na:[M+Na]+1095；实测值1095.
3.20 4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-((4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(21c/D828)
将粗品20c(16mg,0.015mmol)溶解在DMF(0.2mL)中，加入吡啶(0.003mL,0.04mmol)，接着加入MAL-8-NHS酯(20.5mg,0.03mmol)的DMF溶液(0.05mL)。45分钟后，将反应在冰箱中储存18小时，然后直接在EZ Prep上加载并纯化(Gemini 30x 150mm柱)(30→60％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)，21c(4.8mg,20％收率)。
LC/MS：保留时间2.41min.(ESI)C83H108ClN10O23:[M+H]+1647；实测值1647.
3.21 4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(6aS)-3-(4-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-6-羟基-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(20d)
在Ar下，向19b(10.3mg,0.0095mmol)的DCM(0.5mL)溶液中加入吡咯烷(0.001mL,0.014mmol)，然后加入四(三苯基膦)钯(0.6mg,0.0005mmol)。30分钟后，浓缩反应混合物，溶解在DMSO(0.5mL)中，并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)纯化。将所需级分冻干，得到20d(5.8mg,65％收率)。
LC/MS：保留时间2.59min.(ESI)C51H56ClN6O10:[M+H]+947；实测值947.
3.22 4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基(6aS)-6-羟基-3-(4-((S)-5-羟基-1-(羟甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-4-氧代丁氧基)-2-甲氧基-14-氧代-6,6a,7,12-四氢苯并[5,6][1,4]二氮杂卓并[1,2-b]异喹啉-5(14H)-羧酸酯(21d/D822)
向20d(5.4mg,0.006mmol)的DMF(0.1mL)溶液中加入吡啶(0.0012mL,0.014mmol)，然后加入MAL-8-NHS酯(7.9mg,0.011mmol)。3小时后，将反应混合物直接加载并通过反相色谱法(0→100％ACN的H2O溶液，各自含有0.05％HOAc)纯化，得到21d(0.5mg,6％收率,93％纯@254nm)和21d的另外的较低纯度部分(1.6mg,18％收率,89％纯@254nm)。
LC/MS：保留时间2.99min.(ESI)C77H97ClN8O22Na:[M+Na]+1543；实测值1543.
实施例5-3G7-(IQB-CBI)(抗体-药物偶联物)的制备
使用Millipore,15mL,30kDa装置，经由2个循环的分子量截止过滤(MWCO)，将嵌合的和人源化的、cys-取代的(S156C)、抗-IL1RAP抗体(“Chi3G7/hu3G7-IQB-CBI”)(5.0mg,1.68mg/mL,PBS)交换到硼酸盐缓冲液中(50mM,pH 8.5,1mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA))。向新的3G7-S156C-CYSMAB抗体溶液(5.0mg/mL,硼酸盐缓冲液(50mM,pH8.5,1mM DTPA))中加入二硫苏糖醇(DTT)溶液(33μL,50.0equiv.,50mM)，并将所得溶液轻轻振动过夜。抗体3G7具有如本文所述的氨基酸序列。
如前所述(Junutula et al.,2008,Nature Biotech,26,925-932)，通过rp-LCMS证实了链间二硫键的完全还原和S156C半胱氨酸/谷胱甘肽加合物的去除。然后使用PBS作为交换缓冲液，使用Millipore,15mL,30kDa装置，通过3个循环的分子量截止过滤(MWCO)，从溶液中除去DTT。向5mg/ml的完全还原的3G7-S156C-CYSMAB抗体溶液中加入脱氢抗坏血酸(dhAA)溶液(33μL,50.0equiv.,50mM)。将所得溶液轻轻振动3小时。通过rp-LCMS监测再氧化。一旦认为再氧化完成，用丙二醇将反应混合物稀释至50％v/v，并以DMSO溶液的形式加入IQB-CBI(10.0equiv.,10mM，于DMSO中)。将反应在环境温度下搅拌1小时。然后将混合物用活性炭在环境温度下处理1小时。然后通过过滤除去活性炭。然后使用Millipore,15mL,30kDa装置，通过多个循环的分子量截止过滤(MWCO)，将偶联物交换到PBS中。然后将溶液进行无菌过滤，得到所需的偶联物(0.974mL,2.16mg/mL)。体积：0.974mL。浓度：2.16mg/mL(A280＝0.145,20-倍稀释)。药物与抗体比(DAR)为1.7-2.0(通过rp-LCMS测定)。通过尺寸排阻色谱法(SEC)确认ADC的单体形式：96％。表征数据在下表II中提供。
表II.
实施例6–3G7-(IQB-CBI ADCs与细胞的结合：D816、D818、D820、D822、D826、D824、D828
图15和16显示了作为平均荧光强度的函数的人源化(hu3G7)或嵌合(Chi3G7)抗IL1RAP抗体与各种细胞系的结合。HL-60细胞(人早幼粒细胞白血病细胞)、EOL1细胞(人嗜酸性粒细胞白血病细胞)和SK-MEL-5细胞(人黑色素瘤细胞系)表达IL1RAP，并且EOL1细胞高表达。C0抗体是非结合对照IgG1。D212是具有下式的组合物：
将细胞重悬于含有5％NHS(正常人血清)的结合缓冲液(PBS，2％FBS)中至2×106个细胞/mL。向50μL的细胞中加入50μL的一抗/ADC，并在4°孵育30分钟。孵育后，将细胞用结合缓冲液洗涤2次，然后重悬，并与第二抗体(抗人APC，1:400于结合缓冲液中)在4°孵育30分钟。用结合缓冲液洗涤细胞，并重悬于200μL的含碘化丙锭的结合缓冲液中。立即将细胞应用于流式细胞术用于分析。测量染色样品的平均荧光强度(MFI)。
实施例7–Chi3G7-(IQB-CBI)ADC选择性细胞毒性：D816、D818、D820、D822、D826、D824、D828
包含Chi3G7抗IL1RAP嵌合抗体(人恒定结构域，小鼠可变结构域)和各种IQB-CBI二聚体连接基-有效负载(D816、D818、D820、D822、D826、D824、D828)的ADC的选择性显示于图17-23。用IL1RAP-选择性细胞毒性抗体-药物偶联物，Chi3G7-(IQB-CBI)ADC和对照抗体-药物偶联物，C0-(IQB-CBI)ADC或C0-D212ADC在37℃下以不同浓度连续5天处理HL-60细胞、EOL1细胞和SK-MEL-5细胞(人黑色素瘤细胞系)。
图17显示与对照C0-D212和C6-D212ADC相比，Chi3G7-D816ADC、hu3G7-D816(人源化)靶向依赖性细胞杀伤。
图18显示与C0-D212和C6-D212相比，Chi3G7-D818ADC和hu3G7-D818(人源化3G7)靶向依赖性细胞杀伤。
图19显示与C0-D212和Chi3G7-D212相比，Chi3G7-D820ADC靶向依赖性细胞杀伤。
实施例8-Chi3G7-CLT-(IQB-CBI)ADC或Hu3G7-CLT-(IQB-CBI)ADC靶向依赖性细胞毒性
在表达或不表达IL1RAP的细胞系中测试Chi3G7-CLT-(IQB-CBI)或Hu3G7-CLT-(IQB-CBI)ADC和非结合对照ADC的细胞毒性。结果显示在图17-23中。EOL1细胞表达高拷贝数的IL1RAP，而HL60和SK-MEL-5细胞表达低拷贝数的IL1RAP。图17-23显示与非结合C0-D212或C0-CLT-(IQB-CBI)对照ADC相比，Chi3G7-CLT-(IQB-CBI)或Hu3G7-CLT-(IQB-CBI)ADC显示靶向依赖性杀伤。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。
虽然本文已经显示和描述了本发明的某些实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在会想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (53)

1.通式I化合物：
其中：
·在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间显示的点状键独立地为单键或双键；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在双键时，所述–C(Ra)-是烯属的并具有取代基Ra，并且所述-N(Rb)-中的Rb不存在；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在单键时，所述–C(Ra)-为饱和的并除了所述Ra取代基之外还具有氢取代基，并且所述-N(Rb)-中的Rb存在；
·Ra独立地为H或OH；
·如果存在，则Rb为H、–L-Rx或–L-Sc；
·-L-Rx是与反应性部分Rx连接的连接基L，以及-L-Sc是与物质Sc连接的连接基L；其中L是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地引入醚、氧代、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、杂环、芳族或杂芳族部分；Rx是反应性部分；Sc是选自蛋白质、蛋白质的一部分、肽或核酸的靶标结合剂；
·R2选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基；
·R3、R3’、R4、R4’、R6和R6’各自独立地选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，或者如果Y为N，则不存在；
·R5或R5’中的每一个独立地为NH2、CO2H、H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-L-Rx或-L-Sc，或者如果Y为N，则不存在；
·R7为H；
·G’-Rb’为OH、O-L、O-L-Rx、O-L-Sc、NH2、NH-L、NH-L-Rx或NH-L-Sc；
·每个Y独立地为N或C；
·每个D独立地为(CH2)n，其中n＝0-4，前提是至少一个D为(CH2)n，其中n＝1-4；
·X1为选自如下的间隔基：
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述通式I化合物具有S,S立体化学。
3.如权利要求1所述的化合物，其中Rb为–L-Rx或–L-Sc。
4.如权利要求1所述的化合物，其中G’-Rb’为O-L、O-L-Rx、O-L-Sc、NH-L、NH-L-Rx或NH-L-Sc。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R2、R3、R3’、R4、R4’、R5、R5’、R6和R6’各自为H。
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有下列化学结构中的任一个：
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有通式IV的化学结构：
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述化合物具有选自如下的化学结构式：
9.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有通式V的化学结构：
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述化合物具有选自如下的化学结构式：
11.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自如下化学结构
12.如权利要求1所述的化合物，其中L为具有如下结构的连接基：
-YL-XAA-PEG-，
其中：
YL为将XAA的氨基酸单元与所述IQB单元连接的间隔基分子；
XAA为具有1至12个氨基酸的氨基酸序列；以及
PEG为具有如下结构的聚乙二醇部分：
–(CH2CH2O)x–，其中x为1-50。
13.如权利要求12所述的化合物，其中YL为选自如下的间隔基分子：
14.如权利要求13所述的化合物，其中YL具有如下结构：
15.如权利要求12所述的化合物，其中XAA为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽序列。
16.如权利要求15所述的化合物，其中XAA为二肽。
17.如权利要求12所述的化合物，其中XAA单元中的每个氨基酸独立地选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或瓜氨酸(Cit)。
18.如权利要求12所述的化合物，其中XAA选自Ala-Val、Val-Ala和Val-Cit。
19.如权利要求12所述的化合物，其中PEG为具有选自如下结构的聚乙二醇部分：–(CH2CH2O)x–、–HN–(CH2CH2O)x–C(O)–或–HN–(CH2CH2O)x–CH2CH2–C(O)–，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
20.如权利要求12所述的化合物，其中PEG为具有选自如下结构的聚乙二醇部分：–(CH2CH2O)x–、–HN–(CH2CH2O)x–C(O)–或–HN–(CH2CH2O)x–CH2CH2–C(O)–，其中x为8。
21.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自如下化学结构：
22.如权利要求1所述的化合物，其中G’-Rb’选自：
23.具有通式II的结构的抗体-药物偶联物：
其中：
为抗体或抗体片段；
W-RM是由W和Rx形成的连接部分，其中W是连接所述抗体/抗体片段的天然或非天然氨基酸残基的部分，Rx是琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、环辛炔基、氨基氧基、二磺酰基、磺酰基或异硫氰酸酯部分，使得W-RM是二硫化物、硫醇化的琥珀酰亚胺基、氨基取代的琥珀酰亚胺基、(环辛基)-1,4-三唑基、肟取代的N-聚糖、肟、取代的双-磺丙基、磺酰胺基、酰胺或硫代氨基甲酸酯部分；
L是连接基L；其中所述连接基L是键或是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地引入醚、氧代、羧酰胺基、氨基甲酸乙酯基、氨基酸、杂环、芳族或杂芳族部分；
IQB-CBI是具有通式I结构的化合物：
其中：
·在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间显示的点状键独立地为单键或双键；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在双键时，所述–C(Ra)-是烯属的并具有取代基Ra，并且所述-N(Rb)-中的Rb不存在；
ο当在–C(Ra)-和–N(Rb)-之间存在单键时，所述–C(Ra)-为饱和的并除了Ra取代基之外还具有氢取代基，并且所述-N(Rb)-中的Rb存在；
·Ra独立地为H或OH；
·如果存在，则Rb为H或为与连接基L连接的键；
·R2选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基；
·R3、R3’、R4、R4’、R6和R6’各自独立地选自H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，或者如果Y为N，则不存在；
·R5或R5’中的每一个独立地为NH2、CO2H、H、OH、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，为与连接基L连接的键，或者如果Y为N，则不存在；
·R7为H；
·G’-Rb’选自OH、O-L、NH2或NH-L，其中L是所述连接基L；
·每个Y独立地为N或C；
·每个D独立地为(CH2)n，其中n＝0-4，前提是至少一个D为(CH2)n，其中n＝1-4；
·X1为选自下列的间隔基：
其中Rb、R5、R5’和G-Rb’中的至少一个是与连接基L连接的键或包含连接基L。
24.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体为半胱氨酸取代的抗体。
25.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体特异性结合癌症标志物。
26.如权利要求25所述的抗体-药物偶联物，其中所述癌症标志物为GPR114、CLL-1、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、路易斯Y抗原、LIV c-RET、DLL3、EFNA4或内皮唾液酸蛋白/CD248、Ly6e(RIG-e)、CD79a、CD274(PD-L1)、CD38、DLL4、CD319(SLAM7)。
27.如权利要求26所述的抗体-药物偶联物，其中所述癌症标志物为IL1RAP或CLL-1。
28.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗体片段为抗-IL1RAP或抗-CLL1。
29.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中所述IQB-CBI化合物具有S,S立体化学。
30.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中L为具有如下结构的连接基：
-YL-XAA-PEG-，
其中：
YL为将XAA的氨基酸单元与所述IQB单元连接的间隔基分子；
XAA为具有1至12个氨基酸的氨基酸序列；
PEG为具有如下结构的聚乙二醇部分：
–(CH2CH2O)x–，其中x为1-50。
31.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中YL为选自如下的间隔基分子：
32.如权利要求31所述的抗体-药物偶联物，其中YL具有如下结构：
33.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中XAA为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽序列。
34.如权利要求33所述的抗体-药物偶联物，其中XAA为二肽。
35.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中所述XAA单元中的每个氨基酸独立地选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或瓜氨酸(Cit)。
36.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中XAA选自Ala-Val、Val-Ala和Val-Cit。
37.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中PEG为具有结构–(CH2CH2O)x–的聚乙二醇部分，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
38.如权利要求30所述的抗体-药物偶联物，其中PEG为具有选自如下结构的聚乙二醇部分：–HN–(CH2CH2O)x–C(O)–或–HN–(CH2CH2O)x–CH2CH2–C(O)–，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
39.如权利要求38所述的抗体-药物偶联物，其中PEG为具有结构–HN–(CH2CH2O)x–C(O)–的聚乙二醇部分，其中x为8。
40.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中RM为具有如下结构的连接基团：
其中：Z选自-C1-C10亚烷基-、-C3-C8环烃基-、-O-(C1-C8烷基)-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；并且r为1-10的整数。
41.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中RM具有选自如下的结构：
42.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中L为包含聚乙二醇和1-10个氨基酸的连接基。
43.如权利要求23所述的抗体-药物偶联物，其中
·W-RM为硫醇化的琥珀酰亚胺基。
44.药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物或权利要求23所述的偶联物，和药学上可接受的载体或赋形剂。
45.权利要求1所述的化合物或权利要求23所述的偶联物在制备药物中的用途。
46.治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的权利要求1所述的化合物或权利要求23所述的偶联物。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述治疗的癌症是白血病、淋巴瘤或实体瘤。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述治疗的癌症是骨髓增生性癌症。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述骨髓增生性癌症选自急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓性白血病、慢性粒单核细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述偶联物包含特异性结合肿瘤相关抗原或癌症干细胞相关抗原的抗体。
51.如权利要求46所述的方法，其中所述治疗的癌症是黑素瘤。
52.抑制细胞分裂的方法，其包括使细胞与权利要求1所述的化合物或权利要求23所述的偶联物接触。
53.试剂盒，其包含含有多个第二容器的第一容器，每个第二容器含有单位剂量的权利要求23所述的组合物。
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