CN110004161B - 一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β‑酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明还提供了上述方法构建得到的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明的构建方法简单易操作，且得到的基因工程菌能够表达高活性的冰核蛋白。

Description

一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

自然界中的水在0℃不会结冰，而是处于一种超临界状态，直至-15℃～-2℃才可结冰；纯水则需要在-40℃才可结冰。冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)是一类可以使水在较高温度下(-5℃～-2℃)形成冰晶的特殊蛋白质，对于冰核蛋白的利用，多是以冰核细菌为载体，冰核细菌主要包括草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和菠萝泛菌(Pantoea ananas)等，其在人工降雨降雪、食物冷冻保鲜及高敏检测等方面具有远大的应用前景，如：在杀虫方面，提高农业害虫的越冬死亡率是有效控制虫害的可行方法，构建促冻杀虫的基因工程菌，并使其在害虫肠道内有效定殖，可提高害虫的过冷却点，实现低温冻杀的效果，为越冬妨害提供一条途径；在食品行业，常规的低温冷冻食品，在冻结过程中因形成较大的冰晶，造成细胞损伤，解冻时细胞内容物流失，不仅破坏食品的风味，更导致营养流失，冰核蛋白能够使食物在较高的温度下快速结冰，将冰河活性细菌用于食品冷藏，不但改善了冷冻食品的品质，也节省了能源和时间；在人工降雪与降雨方面，利用冰核细菌提高液体过冷却点的特性，可以用于人工降雪和人工降雨，不但可调节天气，还可应用于体育娱乐以及北极的冰川构建等方面。

冰核蛋白的利用主要是通过调整温度、pH值等发酵条件促进冰核细菌中冰核蛋白的表达，或者通过提取纯化冰核蛋白来实现，但是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和菠萝泛菌(Pantoea ananas)等冰核细菌的遗传背景复杂，基因改造存在一定的难度，以此为工程菌对其进行改造限制了冰核活性的提高和冰核蛋白的最大性利用。纯化冰核蛋白虽然可以确保其安全性，但研究表明冰核蛋白需要和细胞膜的脂质结合才能最大程度的发挥作用，因此必须有载体菌才能实现冰核蛋白活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述大肠杆菌为E.coliMG1655、E.coli DH5α或E.coli BW25113中的任一种。

进一步，所述大肠杆菌为E.coli MG1655。

进一步，所述β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述硫酯酶基因为拟南芥硫酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，冰核蛋白基因为来自菠萝泛菌的冰核蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步，通过P1噬菌体转导或Red重组技术敲除β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)。

进一步，所述硫酯酶表达载体的构建方法为将硫酯酶基因与质粒pBAD43连接。

进一步，所述冰核蛋白基因表达载体的构建方法为将冰核蛋白基因与载体pQE30连接。

本发明还提供了上述方法构建得到的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

本发明的有益效果是：发明人意外的发现载体菌的脂肪酸链长较短、饱和程度较高有利于冰核蛋白活性的提高，在构建冰核蛋白工程菌的过程中，将工程菌的fadR和fabF基因敲除，并表达硫酯酶基因，可以提高冰核蛋白工程菌的冰核蛋白活性，并且以大肠杆菌作为初发菌株，其遗传背景清晰，工程菌的构建方法简单、可操作性强、效率高。灭活的大肠杆菌安全性强、可用范围较广。

附图说明

图1为本发明实施例2中MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体的PCR凝胶电泳图，其中M为marker，泳道1-3为用fadR的引物对(FadR-F+FadR-R)进行扩增的产物，泳道4-6为用fabF的引物对(FabF-F+FabF-R)进行扩增的产物，泳道1和4为对照MG1655野生型菌株的PCR结果，泳道2和5为双基因敲除后在柠檬酸钠和卡那抗性板上筛选得到的未进行卡那抗性切除的阳性克隆的PCR结果，泳道3和6为切除卡那抗性后的阳性克隆的PCR结果；

图2为本发明实施例2中MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体的脂肪酸组分分析结果图；

图3为本发明实施例5中不同的工程菌冰核蛋白活性检测结果。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

冰核细菌一般包括草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、菠萝泛菌(Pantoea ananas)等，但是这些野生菌遗传背景复杂，不利于基因改造。发明人在利用大肠杆菌构建冰核蛋白工程菌的过程中发现，以大肠杆菌为出发菌株，对其中的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)进行敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，可以得到表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

以下实施例中涉及的菌株和质粒来源如下：

E.coli MG1655、E.coli DH5α和E.coli BW25113均购自中科院微生物所菌种保藏中心；

BW25113-△fadR和BW25113-△fabF购自BW25113keio单基因突变体文库。

实施例1出发菌株的选择与优化

大肠杆菌虽然为条件致病菌，但其灭活菌株不具致病性，且灭活菌株亦可保证冰核蛋白活性，并且大肠杆菌遗传背景清晰，基因改造的安全性高、可操作性强，且高效，因此选择将大肠杆菌作为冰核蛋白工程菌的出发菌株。

野生型大肠杆菌MG1655、DH5α和BW25113均可作为出发菌株。

发明人研究发现，冰核蛋白菌株的冰核蛋白活性与菌株的脂肪酸饱和程度以及平均链长有关，菌株自身的脂肪酸饱和程度越高，平均链长越短，冰核蛋白的活性越高，因此，在其中一个最优选方案中，比较三株野生型大肠杆菌MG1655、DH5α、BW25113的链长以及饱和程度，选择脂肪酸链长较短、且饱和程度较高的菌株作为遗传改造的出发菌株。

脂肪酸含量和种类的检测方法如下：

1、脂肪酸的提取和甲酯化：取野生型大肠杆菌E.coli MG1655、E.coli DH5α和E.coli BW25113各1mL，加入2.4mL 2％乙酸溶液(溶于甲醇)，1mL氯仿，加入0.2mg C_20:0甲酯作为内标，涡旋；加入1.5mL氯仿，1.2mL水，涡旋，4000rpm离心10min，分层；取出下层溶液至新管①中，加入1mL氯仿至原管中，涡旋，4000rpm离心10min，取出下层溶液合并至管①中，混匀，真空干燥，即可得到所有的脂类；按每5mL(色谱级)中加入2滴乙酰氯的比例配制形成HCL-CH₃OH溶液，向每个管①中加入3mL HCL-CH₃OH溶液，涡旋震荡混匀，室温静置过夜，酯化；次日，真空干燥，并加入1mL正己烷和2mL ddH₂O，涡旋，4000rpm离心10min；取出上层，至新管②中；在剩余溶液中加入1mL正己烷，涡旋，4000rpm离心10min；取出上层，至新管②中真空干燥；加入400μL正己烷，溶解，得到甲酯化的脂肪酸。

2、气相色谱检测脂肪酸甲酯

取1μL上述甲酯化的脂肪酸样品，高效气相色谱检测脂肪酸的组成和含量。色谱条件如下：TR-Wax MS GC毛细管色谱柱(30m，0.25mm，0.25μm，美国Agilent 6897)，载气：高纯氮气(99.999％)，进样器温度：250℃，检测器温度：300℃，载气柱头压：10psi；程序升温：起始75℃，20℃/min升至250℃，停留2min。

3、脂肪酸各组分含量的检测和计算

利用脂肪酸标准品，绘制大肠杆菌六种脂肪酸(分别为十二烷酸(C12:0)、十四烷酸(C14:0)、十六烷酸(C16:0)、十六烯酸(C16:1)、十八烷酸(C18:0)和十八烯酸(C18:1))的标准曲线，将通过上述方法得到的三种野生型大肠杆菌的脂肪酸的峰面积与标准曲线做对比，用二十烷酸(C20：0)作为内标，计算脂肪酸每种成分的含量，结果如表1所示：

表1 MG1655,DH5α和Bw25113三种野生型大肠杆菌的脂肪酸组成及含量

结果显示，三株野生型大肠杆菌菌株中，MG1655脂肪酸的饱和程度最高，为88.88％，且短链脂肪酸(C12+C14+C16)最高，为76.2％，因此在最优方案中，选择大肠杆菌MG1655作为起始菌株进行改造。

实施例2构建MG1655-△fadR-△fabF双敲突变体

为了获得链长较短、饱和程度较高的脂肪酸，对MG1655中的两个基因β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)进行敲除，其中β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

SEQ ID NO.1

ATGTTGTCTCCTGTCGGCAATACCGTAGAGTCTACCTGGAAAGCTCTGCTTGCCGGTCAGAGTGGCATCAGCCTAATCGACCATTTCGATACTAGCGCCTATGCAACGAAATTTGCTGGCTTAGTAAAGGATTTTAACTGTGAGGACATTATCTCGCGCAAAGAACAGCGCAAGATGGATGCCTTCATTCAATATGGAATTGTCGCTGGCGTTCAGGCCATGCAGGATTCTGGCCTTGAAATAACGGAAGAGAACGCAACCCGCATTGGTGCCGCAATTGGCTCCGGGATTGGCGGCCTCGGACTGATCGAAGAAAACCACACATCTCTGATGAACGGTGGTCCACGTAAGATCAGCCCATTCTTCGTTCCGTCAACGATTGTGAACATGGTGGCAGGTCATCTGACTATCATGTATGGCCTGCGTGGCCCGAGCATCTCTATCGCGACTGCCTGTACTTCCGGCGTGCACAACATTGGCCATGCTGCGCGTATTATCGCGTATGGCGATGCTGACGTGATGGTTGCAGGTGGCGCAGAGAAAGCCAGTACGCCGCTGGGCGTTGGTGGTTTTGGCGCGGCACGTGCATTATCTACCCGCAATGATAACCCGCAAGCGGCGAGCCGCCCGTGGGATAAAGAGCGTGATGGTTTCGTACTGGGCGATGGTGCCGGTATGCTGGTACTTGAAGAGTACGAACACGCGAAAAAACGCGGTGCGAAAATTTACGCTGAACTCGTCGGCTTTGGTATGAGCAGCGATGCTTATCATATGACGTCACCGCCAGAAAATGGCGCAGGCGCAGCTCTGGCGATGGCAAATGCTCTGCGTGATGCAGGCATTGAAGCGAGTCAGATTGGCTACGTTAACGCGCACGGTACTTCTACGCCGGCTGGCGATAAAGCTGAAGCGCAGGCGGTGAAAACCATCTTCGGTGAAGCTGCAAGCCGTGTGTTGGTAAGCTCCACGAAATCTATGACCGGTCACCTGTTAGGTGCGGCGGGTGCAGTAGAATCTATCTACTCCATCCTGGCGCTGCGCGATCAGGCTGTTCCGCCAACCATCAACCTGGATAACCCGGATGAAGGTTGCGATCTGGATTTCGTACCGCACGAAGCGCGTCAGGTTAGCGGAATGGAATACACTCTGTGTAACTCCTTCGGCTTCGGTGGCACTAATGGTTCTTTGATCTTTAAAAAGATCTAA

SEQ ID NO.2

ATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCCGGCGGGTTTCGCGGAAGAGTACATTATTGAAAGTATCTGGAATAACCGCTTCCCTCCCGGGACTATTTTGCCCGCAGAACGTGAACTTTCAGAATTAATTGGCGTAACGCGTACTACGTTACGTGAAGTGTTACAGCGTCTGGCACGAGATGGCTGGTTGACCATTCAACATGGCAAGCCGACGAAGGTGAATAATTTCTGGGAAACTTCCGGTTTAAATATCCTTGAAACACTGGCGCGACTGGATCACGAAAGTGTGCCGCAGCTTATTGATAATTTGCTGTCGGTGCGTACCAATATTTCCACTATTTTTATTCGCACCGCGTTTCGTCAGCATCCCGATAAAGCGCAGGAAGTGCTGGCTACCGCTAATGAAGTGGCCGATCACGCCGATGCCTTTGCCGAGCTGGATTACAACATATTCCGCGGCCTGGCGTTTGCTTCCGGCAACCCGATTTACGGTCTGATTCTTAACGGGATGAAAGGGCTGTATACGCGTATTGGTCGTCACTATTTCGCCAATCCGGAAGCGCGCAGTCTGGCGCTGGGCTTCTACCACAAACTGTCGGCGTTGTGCAGTGAAGGCGCGCACGATCAGGTGTACGAAACAGTGCGTCGCTATGGGCATGAGAGTGGCGAGATTTGGCACCGGATGCAGAAAAATCTGCCGGGTGATTTAGCCATTCAGGGGCGATAA

1、构建MG1655-△fadR单敲除突变体

(1)在LB培养基中分别培养供体菌(BW25113-△fadR)和受体菌(MG1655)，过夜；

(2)按1％的比例将供体菌(BW25113-△fadR)接种到3mL的LB无抗培养基(含10mMMgCl₂，5mM CaCl₂，0.1％葡萄糖)上，37℃扩大培养1h；

(3)加入500μL P1噬菌体，37℃培养3h，直至OD₆₀₀不再升高。加入100μL氯仿，震荡混匀10min，14000rpm离心2min，取出上清备用；

(4)用4000rpm离心5min收集受体菌，用原1/3体积的LB培养基(含10mM MgSO₄，5mMCaCl₂)，重悬细菌；将P1噬菌体与受体菌按照1：1至1：50的比例混合，37℃培养30min；加入200μL 1M柠檬酸钠(pH为5.5)和1mL LB培养基，37℃培养1h；

(5)7000rpm离心5min，弃上清；加入100μL LB培养基(含0.1M柠檬酸钠)，重悬细胞，涂布到卡那抗性平板，过夜培养；

(6)在含柠檬酸钠和卡那抗性平板上，挑选单克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系参见见表2，所用引物为FadR-F(5’-CGTAGTTAGCCCTCTGGTATGA-3’，SEQ ID NO.5)和FadR-R(5’-TCGTTTGAGGGGTTTGCTCT-3’,SEQ ID NO.6)；反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸10min；16℃保温；

(7)转化温敏型质粒pCP20质粒到以上鉴定的阳性克隆中，用于切除基因组上的卡那抗性基因，并进行PCR鉴定，反应体系、反应程序和引物均同上；

(8)将阳性克隆接种到LB液体培养基中，在42℃培养，传代两次，划单克隆，以去掉温敏型质粒pCP20质粒。

表2 PCR反应体系

2、构建MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体

选择MG1655-△fadR作为受体菌，BW25113-△fabF作为供体菌，利用P1噬菌体将fabF缺失转移到MG1655-△fadR中，具体步骤同上。

将在含柠檬酸钠和卡那抗性的平板上挑选的阳性克隆以及切除掉卡那抗性的阳性克隆分别用FadR的引物对和FabF的引物对进行PCR验证是否得到MG1655-△fadR-△fabF双敲除菌株，PCR体系及反应程序均同上。

FadR的引物对为：

FadR-F：5’-CGTAGTTAGCCCTCTGGTATGA-3’，SEQ ID NO.5

和FadR-R：5’-TCGTTTGAGGGGTTTGCTCT-3’,SEQ ID NO.6

FabF的引物对为：

FabF-F：5’-GGCGCGGATTCTCTTGACAC-3’，SEQ ID NO.7

和FabF-R：5’-CGGCCACAGTCGATGAATCC-3’，SEQ ID NO.8。

PCR结果如图1所示，通过平板筛选到的MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体中的fadR基因和fabF基因已经被敲除。

3、MG1655-△fadR-△fabF双敲突变体的脂肪酸组成分析

对双敲除突变体MG1655-△fadR-△fabF的脂肪酸组分进行分析，结果如图2所示，与野生型MG1655相比，MG1655-△fadR-△fabF的C18：C16下降了77.8％，UFA:SFA(不饱和脂肪酸：饱和脂肪酸)下降了49.5％，双敲除的突变体的脂肪酸饱和度增加、平均链长缩短。

实施例3将硫酯酶基因转入MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体中

以拟南芥的基因组为模板克隆硫酯酶基因AtFat，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：

ATGTGACTGATTCTAAGTTACAGAGAAGCTTACTCTTCTTCTCCCATTCATATCGATCTGATCCGGTGAATTTCATCCGTCGGAGAATTGTCTCTTGTTCTCAGACGAAGAAGACAGGTTTGGTTCCTTTGCGTGCTGTTGTATCTGCTGATCAAGGAAGTGTGGTTCAAGGTTTGGCTACTCTCGCGGATCAGCTCCGATTAGGTAGTTTGACTGAAGATGGTTTATCTTATAAAGAGAAGTTTGTTGTTAGATCTTACGAAGTGGGTAGTAACAAAACCGCTACTGTTGAAACCATTGCTAATCTTTTACAGGAGGTGGGATGTAATCATGCACAAAGTGTTGGTTTTTCGACTGATGGGTTTGCAACAACAACTACTATGAGGAAGTTGCATCTCATTTGGGTTACTGCGAGAATGCATATCGAGATCTATAAGTACCCTGCTTGGGGTGATGTGGTTGAGATAGAGACTTGGTGTCAGAGTGAAGGAAGGATTGGGACAAGGCGTGATTGGATTCTTAAGGATTCTGTCACTGGTGAAGTCACTGGCCGTGCTACAAGCAAGTGGGTGATGATGAACCAAGACACGAGACGGCTTCAGAAAGTTTCTGATGATGTTCGGGACGAGTACTTGGTCTTCTGTCCTCAAGAACCGAGGTTAGCATTTCCGGAAGAGAATAACAGAAGCTTGAAGAAAATCCCGAAACTCGAAGATCCGGCTCAGTATTCAATGATTGGGCTTAAGCCTAGACGAGCTGATCTCGACATGAACCAGCATGTCAATAATGTCACCTATATTGGATGGGTTCTCGAGAGCATACCACAAGAAATTGTAGACACGCACGAGCTTCAGGTCATAACTCTGGATTATAGAAGAGAATGTCAACAAGACGATGTGGTGGATTCACTCACCACCACCACCTCTGAAATTGGTGGAACCAATGGCTCTGCCACGTCTGGCACACAGGGCCACAACGATAGCCAGTTCTTGCACCTCCTGAGGTTGTCTGGAGATGGTCAGGAGATCAACCGCGGGACAACTCTGTGGAGAAAGAAGCCTTCAAGTTAA

扩增Atfat基因所用引物为：

Atfat-F：5’—GGGGTACCAAGGAGTGAAGCTTTCGTGTAATGTGACT—3’，SEQ ID NO.9；

Atfat-R：5’—GGCTGCAGTTAACTTGAAGGCTTCTTTCTCCAC—3’，SEQ ID NO.10。

载体选择pBAD43质粒(Ara启动子，spec抗性)，用Kpn I和PstI同时酶切目的DNA片段和载体pBAD43质粒，连接转化，并进行PCR鉴定。在MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体中表达pBAD43-AtFat，对脂肪酸的组分进行分析，结果显示：表达Atfat后，双敲除突变体的脂肪酸总量升高至200％，而且，通过硫酯酶特异性切割脂肪酸代谢途径中的十二碳酰基ACP和十四碳酰基ACP，产生游离的十二碳酸和十四碳酸，从而使游离的十二碳酸和十四碳酸所占比例由5％左右提高至50％左右。

实施例4将冰核蛋白基因转入MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体中

以菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的基因组DNA做模板，扩增冰核蛋白(INP)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：

ATGAAAGAAGACAAGGTTTTAATATTACGTACCTGTGCTAATAATATGGCCGATCACGGCGGAATCATCTGGCCGTTAAGCGGTATCGTAGAGTGTAAATACTGGAAGCCGGTTAAAGGCTTTGAGAACGGACTAACGGGGCTAATCTGGGGAAAAGGATCGGATTCACCGCTGAGCCTGCACGCTGATGCCAGGTGGGTTGTCGCTGAAGTGGATGCCGATGAGTGTATCGCTATTGAAACTCATGGCTGGATTAAATTTCCCCGTGCTGAGGTTCTTCACGTTGGAACGAAAACCAGTGCGATGCAATTTATCCTGCACCATCGGGCTGATTACGTTGCCTGTACGGAAATGCAGGCCGGGCCTGGAGCGCCTGATGTCACTTCAGAGGTAAAGGCAGGCAATCGATCGCTGCCTGTAACAGATGATATTGATGCGACCATCGAATCAGGCAGTACGCAGCCGACACAAACGATTGAAATCGCAACCTATGGCAGTACGCTCAGCGGCACGCATCAGAGTCAGCTGATTGCCGGATATGGCAGTACTGAGACGGCGGGTGATAGCAGCACATTAATTGCCGGTTACGGTAGCACCGGTACAGCGGGATCAGACAGCACATTAGTCGCGGGCTACGGCAGTACCCAAACCGCAGGTGAAGAGAGCAGCCAGATGGCGGGTTACGGCAGCACGCAGACCGGCATGAAAGGCAGCGATCTCACCGCCGGTTACGGCAGTACCGGCACGGCGGGCGCCGACAGCTCCCTGATCGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACGGCGGGCGAAGACAGCTCGCTGACAGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACCGCGCAGAAGGGCAGCGATCTTACGGCCGGTTATGGCAGTACCGGCACGGCGGGTGCCGACAGTTCATTAATCGCGGGCTACGGCAGCACCCAGACGGCCGGGGAAGAGAGCACCCAGACAGCCGGTTATGGCAGCACGCAGACCGGCATGAAAGGCAGCGATCTCACCGCCGGTTACGGCAGTACCGGCACGGCGGGCGCCGACAGCTCCCTGATCGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACGGCGGGAGAAGACAGCTCGCTGACAGCCGGTTACGGCAGCACGCAGACCGCGCAGAAGGGCAGCGATCTTACCGCGGGTTATGGCAGTACCGGCACGGCGGGTGCCGACAGTTCATTAATCGCGGGCTACGGCAGCACCCAGACGGCCGGGGAAGAGAGCACCCAGACAGCCGGTTATGGCAGCACCCAGACCGCGCAGAAGGGCAGCGACCTTACGGCCGGTTACGGCAGTACCGGTACGGCGGGTGACGACAGCTCCCTGATCGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACGGCAGGCGAAGGCAGCTCGCTGACAGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACCGCGCAGAAGGGCAGCGATCTTACGGCCGGTTATGGCAGTACCTCTACGGCAGGCTATGAAAGTTCATTGATCGCGGGCTATGGCAGTACCCAGACAGCGGGTTACGGTAGCACGCTGACAGCGGGTTACGGCAGTACGCAGACCGCGCAGAACGAAAGCGATCTCATCACCGGCTATGGCAGTACGTCTACAGCCGGGGCAAATAGTTCACTGATCGCAGGCTATGGCAGCACGCAGACAGCCAGCTACAACAGTGTGCTAACGGCGGGCTACGGCAGTACCCAGACGGCGAGAGAAGGCAGTGACCTCACTGCCGGGTACGGCAGCACCGGCACGGCAGGCTCGGACAGCTCAATCATTGCAGGTTACGGCAGCACCCAGACCGCCAGCTATCACAGTAGTCTGACGGCGGGTTACGGCAGTACGCAGACGGCGCGCGAACAGAGTGTGCTGACGACCGGCTACGGCAGCACCTCAACCGCCGGCGCCGACAGTTCTCTGATTGCAGGCTACGGCAGCACGCAGACAGCGGGTTATAACAGCATCCTGACGGCCGGTTACGGCAGCACCCAGACGGCGCAGGAGGGCAGCGATCTCACCGCAGGTTATGGCAGTACCTCAACCGCCGGTGCCGACAGCTCCGTGATTGCGGGCTACGGCAGCACCCAGACCGCCAGCTATCACAGTAGCCTGACGGCGGGTTACGGCAGTACGCAGACGGCGCGCGAACAGAGTGTGCTGACGACCGGCTACGGCAGCACCTCAACCGCCGGTGCCGACAGCTCCCTGATTGCGGGCTATGGCAGCACGCAGACAGCGGGTTACAACAGCATCCTGACGGCCGGTTACGGCAGCACCCAGACGGCGCAGGAGAATAGCGATCTGACCACGGGCTACGGCAGTACCTCGACGGCGGGTTACGACAGCTCGTTAATCGCGGGCTACGGCAGCACGCAGACAGCGGGTTACAACAGCATCCTGACGGCCGGTTACGGCAGCACCCAGACGGCGCAGGAGAATAGCGATCTGACCACGGGCTACGGCAGTACCTCGACGGCGGGTTACGACAGCTCGCTAATCGCGGGCTACGGCAGCACGCAGACCGCCGGTTATCACAGTATTCTGACGGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACGGCGCAGGAGCACAGCGATCTGACCACCGGCTACGGCAGTACCTCGACGGCAGGTTACGACAGCTCCCTGATCGCGGGCTACGGCAGCACGCAGACCGCGGGTTACGACAGTATTCTGACGGCCGGTTACGGCAGCACCCAGACGGCGCAGGAGAATAGCGATCTGACGACCGGCTACGGCAGTACTTCTACGGCAGGTTATGAGAGTTCACTGATCGCAGGCTACGGCAGCACCCAGACCGCCAGTTTTAAAAGTACGTTGATGGCTGGTTACGGGAGTTCGCAGACGGCCAGAGAACAGAGTTCGTTGACTGCCGGATACGGCAGTACCTCAATGGCCGGTTATGACAGCTCATTGATTGCCGGTTACGGCAGTACCCAGACGGCGGGTTATCAAAGTACGCTGACAGCCGGTTACGGCAGCACGCAAACGGCCGAGCACAGTAGTACGCTAACGGCAGGTTACGGCAGTACCGCAACGGCGGGCGCCGACAGCTCCCTGATCGCAGGCTACGGCAGTTCGCTGACCAGCGGTATTCGCAGCTTCCTGACGGCGGGTTATGGCAGTTCGTTGATCAGCGGACTTCGCAGCGTACTCACCGCCGGTTACGGAAGCAGCCTGATTTCGGGCAGACGCAGTAGCCTGACGGCGGGATATGGCAGTAATCAGATCGCCAGCCACCGAAGCTCGTTGATTGCTGGCCCGGAAAGCACCCAGATCACCGGCAACCGCAGCATGCTGATTGCGGGAAAGGGCAGCTCACAAACGGCGGGTTATCGCAGCACATTGATCTCCGGGGCAGACAGCGTGCAAATGGCCGGAGAGCGCGGCAAGCTGATTGCCGGAGCGGACAGCACCCAAACCGCCGGGGATCGCAGCAAGCTTCTGGCAGGCAACAACAGCTACCTCACCGCTGGCGATCGCAGCAAACTCACGGCAGGCAATGACTGCATCCTCATGGCGGGAGACCGAAGCAAGCTGACGGCCGGCATCAACAGCACTCTCACCGCCGGATGCCGTAGCAAGCTGATAGGAAGCAATGGTTCAACCCTGACCGCCGGGGAAAACTCAGTTCTGATTTTTCGCTGCTGGGATGGAAAGCGCTACACTAATGTGGTCGCTAAAACCGGAAAGGGGGGAATAGAAGCGGATATGCCTTACCAGATGGATGAGGACAATAATATCGTGAATAAACCCGAAGAATAA

扩增冰核蛋白基因所用的引物为：

INP-F：5’—CGGGATCCAAGGATGAAAGAAGACAAGGTTTTA—3’，SEQ ID NO.11；

INP-R：5’—AAGCTTGGCTGCAGTTATTCTTCG—3’，SEQ ID NO.12。

载体选择pQE30质粒，利用BamH I和Hind III同时酶切INP基因和pQE30载体(T5启动子，Amp抗性)，连接构建pQE30-INP表达质粒，并将其转化实施例3中获得的表达硫酯酶的MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体，获得本发明的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

实施例5冰核蛋白活性检测

实验组(MG1655-△fadR-△fabF w/INP+FAT)：实施例4中得到的可以表达硫酯酶和冰核蛋白的MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体

对照组1(MG1655-△fadR-△fabF w/INP)：可以表达冰核蛋白的MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体；

对照组2(MG1655-△fadR w/INP)：可以表达冰核蛋白的MG1655-△fadR单敲除突变体；

对照组3(MG1655w/INP)：可以表达冰核蛋白的MG1655.

将实验组和对照组菌株分别培养至OD₆₀₀＝1.0，混匀菌液，并用EppendorfResearch plus的8道排枪迅速取16滴菌液，每滴20ul，直接加到微量恒温可视金属浴(专利号：ZL201720826549.5)的微量检测孔中，记录恒定温度下样品达到10％-100％结冰所需的时间，每组实验重复3次，结果如图3所示，在MG1655-△fadR-△fabF双敲突变体中，INP的冰核活性显著上升，尤其过量表达了硫酯酶后，样品的结冰时间显著降低，以50％样品结冰时间计算，冰核蛋白活性升高了98.7％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgttgtctc ctgtcggcaa taccgtagag tctacctgga aagctctgct tgccggtcag 60

agtggcatca gcctaatcga ccatttcgat actagcgcct atgcaacgaa atttgctggc 120

ttagtaaagg attttaactg tgaggacatt atctcgcgca aagaacagcg caagatggat 180

gccttcattc aatatggaat tgtcgctggc gttcaggcca tgcaggattc tggccttgaa 240

ataacggaag agaacgcaac ccgcattggt gccgcaattg gctccgggat tggcggcctc 300

ggactgatcg aagaaaacca cacatctctg atgaacggtg gtccacgtaa gatcagccca 360

ttcttcgttc cgtcaacgat tgtgaacatg gtggcaggtc atctgactat catgtatggc 420

ctgcgtggcc cgagcatctc tatcgcgact gcctgtactt ccggcgtgca caacattggc 480

catgctgcgc gtattatcgc gtatggcgat gctgacgtga tggttgcagg tggcgcagag 540

aaagccagta cgccgctggg cgttggtggt tttggcgcgg cacgtgcatt atctacccgc 600

aatgataacc cgcaagcggc gagccgcccg tgggataaag agcgtgatgg tttcgtactg 660

ggcgatggtg ccggtatgct ggtacttgaa gagtacgaac acgcgaaaaa acgcggtgcg 720

aaaatttacg ctgaactcgt cggctttggt atgagcagcg atgcttatca tatgacgtca 780

ccgccagaaa atggcgcagg cgcagctctg gcgatggcaa atgctctgcg tgatgcaggc 840

attgaagcga gtcagattgg ctacgttaac gcgcacggta cttctacgcc ggctggcgat 900

aaagctgaag cgcaggcggt gaaaaccatc ttcggtgaag ctgcaagccg tgtgttggta 960

agctccacga aatctatgac cggtcacctg ttaggtgcgg cgggtgcagt agaatctatc 1020

tactccatcc tggcgctgcg cgatcaggct gttccgccaa ccatcaacct ggataacccg 1080

gatgaaggtt gcgatctgga tttcgtaccg cacgaagcgc gtcaggttag cggaatggaa 1140

tacactctgt gtaactcctt cggcttcggt ggcactaatg gttctttgat ctttaaaaag 1200

atctaa 1206

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat tgaaagtatc 60

tggaataacc gcttccctcc cgggactatt ttgcccgcag aacgtgaact ttcagaatta 120

attggcgtaa cgcgtactac gttacgtgaa gtgttacagc gtctggcacg agatggctgg 180

ttgaccattc aacatggcaa gccgacgaag gtgaataatt tctgggaaac ttccggttta 240

aatatccttg aaacactggc gcgactggat cacgaaagtg tgccgcagct tattgataat 300

ttgctgtcgg tgcgtaccaa tatttccact atttttattc gcaccgcgtt tcgtcagcat 360

cccgataaag cgcaggaagt gctggctacc gctaatgaag tggccgatca cgccgatgcc 420

tttgccgagc tggattacaa catattccgc ggcctggcgt ttgcttccgg caacccgatt 480

tacggtctga ttcttaacgg gatgaaaggg ctgtatacgc gtattggtcg tcactatttc 540

gccaatccgg aagcgcgcag tctggcgctg ggcttctacc acaaactgtc ggcgttgtgc 600

agtgaaggcg cgcacgatca ggtgtacgaa acagtgcgtc gctatgggca tgagagtggc 660

gagatttggc accggatgca gaaaaatctg ccgggtgatt tagccattca ggggcgataa 720

<210> 3

<211> 1070

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

atgtgactga ttctaagtta cagagaagct tactcttctt ctcccattca tatcgatctg 60

atccggtgaa tttcatccgt cggagaattg tctcttgttc tcagacgaag aagacaggtt 120

tggttccttt gcgtgctgtt gtatctgctg atcaaggaag tgtggttcaa ggtttggcta 180

ctctcgcgga tcagctccga ttaggtagtt tgactgaaga tggtttatct tataaagaga 240

agtttgttgt tagatcttac gaagtgggta gtaacaaaac cgctactgtt gaaaccattg 300

ctaatctttt acaggaggtg ggatgtaatc atgcacaaag tgttggtttt tcgactgatg 360

ggtttgcaac aacaactact atgaggaagt tgcatctcat ttgggttact gcgagaatgc 420

atatcgagat ctataagtac cctgcttggg gtgatgtggt tgagatagag acttggtgtc 480

agagtgaagg aaggattggg acaaggcgtg attggattct taaggattct gtcactggtg 540

aagtcactgg ccgtgctaca agcaagtggg tgatgatgaa ccaagacacg agacggcttc 600

agaaagtttc tgatgatgtt cgggacgagt acttggtctt ctgtcctcaa gaaccgaggt 660

tagcatttcc ggaagagaat aacagaagct tgaagaaaat cccgaaactc gaagatccgg 720

ctcagtattc aatgattggg cttaagccta gacgagctga tctcgacatg aaccagcatg 780

tcaataatgt cacctatatt ggatgggttc tcgagagcat accacaagaa attgtagaca 840

cgcacgagct tcaggtcata actctggatt atagaagaga atgtcaacaa gacgatgtgg 900

tggattcact caccaccacc acctctgaaa ttggtggaac caatggctct gccacgtctg 960

gcacacaggg ccacaacgat agccagttct tgcacctcct gaggttgtct ggagatggtc 1020

aggagatcaa ccgcgggaca actctgtgga gaaagaagcc ttcaagttaa 1070

<210> 4

<211> 3777

<212> DNA

<213> 菠萝泛菌(Pantoea ananas)

<400> 4

atgaaagaag acaaggtttt aatattacgt acctgtgcta ataatatggc cgatcacggc 60

ggaatcatct ggccgttaag cggtatcgta gagtgtaaat actggaagcc ggttaaaggc 120

tttgagaacg gactaacggg gctaatctgg ggaaaaggat cggattcacc gctgagcctg 180

cacgctgatg ccaggtgggt tgtcgctgaa gtggatgccg atgagtgtat cgctattgaa 240

actcatggct ggattaaatt tccccgtgct gaggttcttc acgttggaac gaaaaccagt 300

gcgatgcaat ttatcctgca ccatcgggct gattacgttg cctgtacgga aatgcaggcc 360

gggcctggag cgcctgatgt cacttcagag gtaaaggcag gcaatcgatc gctgcctgta 420

acagatgata ttgatgcgac catcgaatca ggcagtacgc agccgacaca aacgattgaa 480

atcgcaacct atggcagtac gctcagcggc acgcatcaga gtcagctgat tgccggatat 540

ggcagtactg agacggcggg tgatagcagc acattaattg ccggttacgg tagcaccggt 600

acagcgggat cagacagcac attagtcgcg ggctacggca gtacccaaac cgcaggtgaa 660

gagagcagcc agatggcggg ttacggcagc acgcagaccg gcatgaaagg cagcgatctc 720

accgccggtt acggcagtac cggcacggcg ggcgccgaca gctccctgat cgccggttac 780

ggcagtaccc agacggcggg cgaagacagc tcgctgacag ccggttacgg cagtacccag 840

accgcgcaga agggcagcga tcttacggcc ggttatggca gtaccggcac ggcgggtgcc 900

gacagttcat taatcgcggg ctacggcagc acccagacgg ccggggaaga gagcacccag 960

acagccggtt atggcagcac gcagaccggc atgaaaggca gcgatctcac cgccggttac 1020

ggcagtaccg gcacggcggg cgccgacagc tccctgatcg ccggttacgg cagtacccag 1080

acggcgggag aagacagctc gctgacagcc ggttacggca gcacgcagac cgcgcagaag 1140

ggcagcgatc ttaccgcggg ttatggcagt accggcacgg cgggtgccga cagttcatta 1200

atcgcgggct acggcagcac ccagacggcc ggggaagaga gcacccagac agccggttat 1260

ggcagcaccc agaccgcgca gaagggcagc gaccttacgg ccggttacgg cagtaccggt 1320

acggcgggtg acgacagctc cctgatcgcc ggttacggca gtacccagac ggcaggcgaa 1380

ggcagctcgc tgacagccgg ttacggcagt acccagaccg cgcagaaggg cagcgatctt 1440

acggccggtt atggcagtac ctctacggca ggctatgaaa gttcattgat cgcgggctat 1500

ggcagtaccc agacagcggg ttacggtagc acgctgacag cgggttacgg cagtacgcag 1560

accgcgcaga acgaaagcga tctcatcacc ggctatggca gtacgtctac agccggggca 1620

aatagttcac tgatcgcagg ctatggcagc acgcagacag ccagctacaa cagtgtgcta 1680

acggcgggct acggcagtac ccagacggcg agagaaggca gtgacctcac tgccgggtac 1740

ggcagcaccg gcacggcagg ctcggacagc tcaatcattg caggttacgg cagcacccag 1800

accgccagct atcacagtag tctgacggcg ggttacggca gtacgcagac ggcgcgcgaa 1860

cagagtgtgc tgacgaccgg ctacggcagc acctcaaccg ccggcgccga cagttctctg 1920

attgcaggct acggcagcac gcagacagcg ggttataaca gcatcctgac ggccggttac 1980

ggcagcaccc agacggcgca ggagggcagc gatctcaccg caggttatgg cagtacctca 2040

accgccggtg ccgacagctc cgtgattgcg ggctacggca gcacccagac cgccagctat 2100

cacagtagcc tgacggcggg ttacggcagt acgcagacgg cgcgcgaaca gagtgtgctg 2160

acgaccggct acggcagcac ctcaaccgcc ggtgccgaca gctccctgat tgcgggctat 2220

ggcagcacgc agacagcggg ttacaacagc atcctgacgg ccggttacgg cagcacccag 2280

acggcgcagg agaatagcga tctgaccacg ggctacggca gtacctcgac ggcgggttac 2340

gacagctcgt taatcgcggg ctacggcagc acgcagacag cgggttacaa cagcatcctg 2400

acggccggtt acggcagcac ccagacggcg caggagaata gcgatctgac cacgggctac 2460

ggcagtacct cgacggcggg ttacgacagc tcgctaatcg cgggctacgg cagcacgcag 2520

accgccggtt atcacagtat tctgacggcc ggttacggca gtacccagac ggcgcaggag 2580

cacagcgatc tgaccaccgg ctacggcagt acctcgacgg caggttacga cagctccctg 2640

atcgcgggct acggcagcac gcagaccgcg ggttacgaca gtattctgac ggccggttac 2700

ggcagcaccc agacggcgca ggagaatagc gatctgacga ccggctacgg cagtacttct 2760

acggcaggtt atgagagttc actgatcgca ggctacggca gcacccagac cgccagtttt 2820

aaaagtacgt tgatggctgg ttacgggagt tcgcagacgg ccagagaaca gagttcgttg 2880

actgccggat acggcagtac ctcaatggcc ggttatgaca gctcattgat tgccggttac 2940

ggcagtaccc agacggcggg ttatcaaagt acgctgacag ccggttacgg cagcacgcaa 3000

acggccgagc acagtagtac gctaacggca ggttacggca gtaccgcaac ggcgggcgcc 3060

gacagctccc tgatcgcagg ctacggcagt tcgctgacca gcggtattcg cagcttcctg 3120

acggcgggtt atggcagttc gttgatcagc ggacttcgca gcgtactcac cgccggttac 3180

ggaagcagcc tgatttcggg cagacgcagt agcctgacgg cgggatatgg cagtaatcag 3240

atcgccagcc accgaagctc gttgattgct ggcccggaaa gcacccagat caccggcaac 3300

cgcagcatgc tgattgcggg aaagggcagc tcacaaacgg cgggttatcg cagcacattg 3360

atctccgggg cagacagcgt gcaaatggcc ggagagcgcg gcaagctgat tgccggagcg 3420

gacagcaccc aaaccgccgg ggatcgcagc aagcttctgg caggcaacaa cagctacctc 3480

accgctggcg atcgcagcaa actcacggca ggcaatgact gcatcctcat ggcgggagac 3540

cgaagcaagc tgacggccgg catcaacagc actctcaccg ccggatgccg tagcaagctg 3600

ataggaagca atggttcaac cctgaccgcc ggggaaaact cagttctgat ttttcgctgc 3660

tgggatggaa agcgctacac taatgtggtc gctaaaaccg gaaagggggg aatagaagcg 3720

gatatgcctt accagatgga tgaggacaat aatatcgtga ataaacccga agaataa 3777

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtagttagc cctctggtat ga 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgtttgagg ggtttgctct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgcggatt ctcttgacac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggccacagt cgatgaatcc 20

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggtaccaa ggagtgaagc tttcgtgtaa tgtgact 37

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctgcagtt aacttgaagg cttctttctc cac 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggatccaa ggatgaaaga agacaaggtt tta 33

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagcttggct gcagttattc ttcg 24

Claims (6)

1.一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因和脂肪酸降解抑制因子基因同时敲除，并转入硫酯酶基因表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌；

所述大肠杆菌为E.coli MG1655；

所述β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述脂肪酸降解抑制因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述硫酯酶基因为拟南芥硫酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述冰核蛋白基因为来自菠萝泛菌的冰核蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，通过P1噬菌体转导或Red重组技术敲除β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因和脂肪酸降解抑制因子基因。

4.根据权利要求1所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述硫酯酶表达载体的构建方法为将硫酯酶基因与质粒pBAD43连接。

5.根据权利要求2所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述冰核蛋白基因表达载体的构建方法为将冰核蛋白基因与载体pQE30连接。

6.一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法构建得到。

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