CN119320745A - 一种生理性精子制动液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，提供了一种生理性精子制动液及其制备方法和应用。所述生理性精子制动液包括基础组分和核心组分；所述基础组分包括无机盐、能量成分和蛋白；所述核心组分包括限速剂、缓冲剂、营养物质。其制备方法包括如下步骤：(1)将核心组分溶于水并搅拌，得第一混合液；(2)将基础组分溶于水并搅拌，得第二混合液；(3)将第一混合液与第二混合液混合、定容和过滤后，得生理性精子制动液。本发明所述的生理性精子制动液不仅解决了精子制动过程中外源性物质和两性有机缓冲剂对精子和卵母细胞的损伤及营养物质支撑精卵结合不足的问题而且成分更安全、且可显著降低异常受精率、提高囊胚率，增加可用胚胎的利用率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种生理性精子制动液及其制备方法和应用。
背景技术
研究发现，与常规体外受精(IVF)技术相比，胞浆内单精子注射(ICSI)技术不能提高第一次移植后的活产率，获得的可利用胚胎数较少、移植率较低，而且后续观察到的累积活产率也相对较低。然而影响ICSI技术与IVF技术差距受诸多因素影响，如卵母细胞状态、精子活力和形态、操作人员的熟练程度等。其中精子制动环节也是制约ICSI技术的一个因素。而精子制动环节可能涉及限速剂、缓冲体系、营养物质3个方面，下面详细介绍这三个方面的研究现状。
(1)限速剂
商品化的精子制动液或类似物产品通过添加浓度为7％和10％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为限速剂，降低精子运动速度，从而捕获精子将其注入卵母细胞内。在注射过程中，会有小部分PVP随精子注入到卵母细胞内，由于PVP不能扩散出去，也不能被溶酶体酶消化，它将在卵母细胞中停留很长时间，即使低浓度的PVP也会对精子质膜、顶体及核造成损伤，延迟卵子钙离子震荡和精核去凝集的发生，进而影响受精及胚胎发育(卵胞质内单精子注射(ICSI)技术中国专家共识)。因此，首先需要寻找一种替代PVP的生理替代方法来降低精子活力，以促进ICSI捕获精子。理想情况下，该产品应具有以下特点：①具有粘性，减缓精子活力，足够吸入ICSI移液管；②能够防止精子粘在移液管上；③此物质为人体本身存在物质，非外源性物质。
然而有学者提出可用低浓度或不含PVP的溶液进行操作。如Y Barak发表在HumanFertility上名为“A physiological replacement for polyvinylpyrrolidone(PVP)inassisted reproductive technology(辅助生殖技术中聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的生理替代品)”的文章发现透明质酸盐(HA)溶液在促进注射过程方面与PVP一样有效，其对精子活力的作用易于逆转，并且在受精，怀孕和活产率方面，其使用不会影响治疗周期的结果。因为HA是一种高分子量的糖胺聚糖，是人类卵母细胞周围基质的主要成分。在生理受精过程中，精子通过其HA受体与卵丘的细胞外基质结合。只有成熟的精子才能结合并消化HA，穿过卵丘最终到达，并使卵母细胞受精。因此，HA在精子选择过程中起着重要的作用。体外研究已证实，能够与HA结合的精子已经结束了其质膜重塑、细胞质挤压和核成熟，并显示出较低的染色体失衡风险。原有的ICSI过程，仅在形态学和活力方面评估精子，而HA作为限速剂可以在成熟度方面进一步评估，为下一步精卵结合提供保障。同时，含HA的产品可以充分减缓精子的运动，使精子能够被注射移液管捕获，易于从移液管中吸入和排出，防止精子粘附在塑料或玻璃器皿上，并且不影响注射后受精卵的发育。
(2)缓冲体系
ICSI注射使用的微滴通常由4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲体系组成，大气条件下提供了酸碱度(pH)的稳定性，允许在溶液中有效地获得和释放游离的H+离子，便于操作人员长时间操作。然而，这些两性离子缓冲剂可能不是ICSI手术的最佳选择，HEPES和MOPS在pH控制外对细胞功能有显著影响。如Robert J.Mendola在2024年发表在Journal of Assisted Reproduction and Genetics期刊上名为“Infux ofzwitterionic bufer after intracytoplasmic sperminjection(ICSI)membranepiercing alters the transcriptome of human oocytes.(卵胞浆内单精子注射(ICSI)膜穿刺后两性离子缓冲液的流入后改变了人类卵母细胞的转录组)”的文章，该研究表明，HEPES和MOPS可以抑制蛋白质转运体和交换体，抑制Cl-阴离子膜通道；抑制线粒体中的电子传递途径；抑制连接蛋白通道和缝隙连接；与对胚胎发育至关重要的金属离子相互作用，如Ca2+和Fe3+；与DNA相互作用形成复合物；产生氧自由基。MOPS和HEPES与脂质相互作用，增加膜厚度，降低膜电位和通透性。同时，ICSI膜穿刺后注入两性离子蛋白可改变人类卵母细胞的转录组，超出操作人员控制范围，无法评估潜在的危害。因此，需要采用生理性缓冲对替代HEPES/MOPs；
而碳酸氢盐是维持所有哺乳动物pH值的生理缓冲剂，对抗酸中毒，细胞内采用钠依赖的碳酸氢盐/Cl交换器(HCE)和Na+/H+逆向转运体，它们分别在细胞内添加和去除碳酸氢盐和氢离子。为了对抗碱中毒，细胞可能含有碳酸氢盐/Cl交换器。而两性离子缓冲液HEPES和MOPs用于大气条件下的pH维持，不提供任何营养益处。有文献表明当碳酸氢盐存在时，HEPES的存在支持胚胎发育，但当碳酸氢盐缺失时，则不支持胚胎发育。
(3)营养物质：在商品化的精子制动液相关产品中，成分简单，由无机盐、缓冲体系、限速剂、人血白蛋白、抗生素组成，没有提供额外的营养物质在这个阶段支持精子和卵母细胞更好的结合，增加后续的囊胚形成。因此，需要寻找一种生理性的营养物质支持胚胎后续发育。
而瘦素(leptin)由肥胖(ob)基因编码，是一种主要从脂肪组织分泌的16kDa脂肪因子蛋白，对调节食物摄入和能量消耗起着至关重要的作用。瘦素存在于人类和小鼠卵母细胞、人类卵泡液以及人类颗粒细胞和卵丘细胞中。人类子宫内膜和胎盘是局部产生瘦素的部位，也是循环瘦素的靶组织，可能与人类植入过程和母婴相互作用有关。如Craig等人2005年在Molecular and Cellular Endocrinology上发表了名为“Leptin enhancesporcine preimplantation embryo development in vitro(瘦素促进猪体外植入前胚胎发育)”的文章，该文章展示了瘦素对猪植入前胚胎发育的影响。研究发现与不含瘦素的胚胎相比，在培养基中加入瘦素不仅显著增加了胚胎分裂，而且显著增加了体外受精后囊胚发育。再如专利CN 117281108A公开了瘦素在冷冻保存山羊精液中的应用、山羊精液冷冻稀释液及应用和山羊精液的冷冻保存方法，该发明能够提高山羊精液冷冻解冻后活力、质膜完整性、顶体完整性以及线粒体膜电位，降低冷冻保存过程中活性氧(ROS)，减少氧化应激损伤等作用；另外，添加瘦素的冻精进行体外受精，能够提高受精效果，显著提高囊胚发育率。
但是目前对HA、碳酸氢盐、瘦素在精子制动液中的含量、所处环境、制备方法及共同在精子制动液中的应用还没有具体的研究。
综上，亟需解决精子制动过程中外源性物质PVP和两性有机缓冲剂对精子和卵母细胞的损伤及营养物质支撑精卵结合不足问题和找到精子制动液的制备环境、所需用量、制备方法，本发明需要提供一种可解决此问题的生理性精子制动液及其制备方法和应用。
发明内容
基于现有的不足，为解决精子制动过程中外源性物质PVP和两性有机缓冲剂对精子和卵母细胞的损伤、营养物质支撑精卵结合不足问题和找到精子制动液的制备环境、所需用量、制备方法，本发明旨在提供一种生理性精子制动液及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种生理性精子制动液，所述的生理性精子制动液包括基础组分、核心组分和溶剂。其中，所述核心组分包括限速剂、缓冲剂和营养物质；所述基础组分包括无机盐、能量成分和蛋白；所述溶剂为符合中国药典的纯化水、注射用水或灭菌注射用水。
优选地，所述核心组分中的限速剂为HA及其盐或衍生物，再优选为透明质酸钠。优选地，透明质酸钠的终浓度为1g/L-10g/L；再优选地，终浓度为2g/L-5g/L；进一步优选地，透明质酸钠的终浓度为2.5g/L。
优选地，所述核心组分中的缓冲剂为碳酸氢盐，优选为碳酸氢钠。优选地，碳酸氢钠的终浓度为20-30mM；再优选地，其终浓度为22.5-27.5mM；进一步优选地，其终浓度为25mM。
优选地，所述核心组分中的营养物质为瘦素。优选地，瘦素的终浓度为10-500μg/L；进一步优选地，其终浓度为50-200μg/L；进一步优选地，其终浓度为100μg/L；
优选地，所述基础组分中的无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙及其衍生物中至少一种。优选地，所述基础组分中的无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙。进一步优选所含成分终浓度：氯化钠81.28-121.92mM、氯化钾3.75-5.63mM、硫酸镁0.16-0.24mM、磷酸二氢钾0.29-0.45mM和氯化钙1.63-2.45mM。
优选地，所述基础组分中的能量成分选自葡萄糖、乳酸钠和丙酮酸钠中的至少一种。再一步优选为乳酸钠、葡萄糖和丙酮酸钠，进一步优选所含成分终浓度为乳酸钠17.12-25.68mM、葡萄糖2.22-3.34mM和丙酮酸钠0.26-0.4mM。
优选地，所述基础组分中的蛋白选自人血白蛋白、重组人血白蛋白和球蛋白中的至少一种。再优选为人血白蛋白，进一步优选其终浓度为2.5-7.5g/L。
进一步优选地，生理性精子制动液包括如下终浓度的成分：
核心组分：透明质酸钠2.5g/L、碳酸氢钠25mM和瘦素100μg/L。
基础组分：氯化钠101.6mM、氯化钾4.69mM、硫酸镁0.2mM、磷酸二氢钾0.37mM、氯化钙2.04mM、乳酸钠21.4mM、葡萄糖2.78mM、丙酮酸钠0.33mM、人血白蛋白5g/L；
优选地，所述溶剂为注射用水。
优选地，所述生理性精子制动液的在20-30℃大气环境下时pH为7.2-8.4。进一步优选地，所述生理性精子制动液的在20-30℃大气环境下时pH为7.2-7.5。
优选地，所述生理性精子制动液经含5-7％ CO2的CO2培养箱或三气培养箱平衡后，pH为7.2-7.6。进一步优选地，所述生理性精子制动液经含5-7％ CO2的CO2培养箱或三气培养箱平衡后，pH为7.2-7.4。
优选地，所述生理性精子制动液的渗透压为280-360mOsm/kg。进一步优选地，所述生理性精子制动液的渗透压为300-330mOsm/kg。
优选地，所述生理性精子制动液的黏度在20-30℃下为50-500cP。进一步优选地，所述生理性精子制动液的黏度在20-30℃下为100-400cP。
第二方面，本发明提供了上述生理性精子制动液的制备方法，制备包括如下步骤：
(1)分别称取限速剂、缓冲剂和营养物质加入溶剂中，搅拌至完全溶解，分别得到限速剂溶液、缓冲剂溶液、营养物质溶液；将三种溶液混合得第一混合液；
(2)将无机盐、能量成分和蛋白混合后加入溶剂，搅拌至完全溶解，得到第二混合液；
(3)将第一混合液和第二混合液混合，定容，过滤，灭菌，即得所述生理性精子制动液。
优选地，上述步骤(1)中称取透明质酸钠溶于注射用水时，注射用水的温度为50-60℃，再优选为60℃。
优选地，上述步骤(1)中搅拌器搅拌时的转速为300-600rpm，再优选为500rpm。
优选地，上述步骤(1)中碳酸氢钠溶于注射用水时，搅拌加热的温度为50℃。
优选地，上述步骤(3)中所述的灭菌为：在百级条件及0.8-1.2bar的CO2保护气体层流下，采用过滤膜过滤除菌。再优选地，CO2保护气体层的压强为1bar。
优选地，上述步骤(3)中过滤时滤膜的孔径为0.2-0.3μM，再优选为0.22μM。
第三方面，本发明提供了上述生理性精子制动液在ICSI过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所提供的生理性精子制动液中的核心组分包括的透明质酸钠、碳酸氢钠和瘦素均为体内存在物质，即“生理性”物料，更自然、更安全。无常规精子制动或类似物产品添加的非“生理性”物质，如PVP、HEPES和MOPS。
2、本发明所提供的生理性精子制动液根据成熟精子携带透明质酸受体，可以与透明质酸结合特性，能够识别成熟精子，降低精子的DNA片段化率，显著降低异常受精率，获得质量更好的胚胎。
3、本发明所提供的生理性精子制动液采用碳酸氢钠作为缓冲体系，为细胞发育过程中所需物质，减少卵母细胞转录组发生变化的风险。
4、本发明所提供的生理性精子制动液添加的瘦素可以提高囊胚率，增加可用胚胎的利用率。
附图说明
图1为使用实施1的生理性精子制动液获得的囊胚；
图2为对使用实施1的生理性精子制动液获得的囊胚进行染色计数。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照下述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对下述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
下述实施例中，未作特殊说明，所用原料均来自商购或者通过本领域的常规方法制备而得，其中，透明质酸钠为注射级玻璃酸钠，来源于华熙生物科技股份有限公司；瘦素为重组人瘦素(HY-P7232)，来源于MCE公司。
实施例1-3和对比例1-8提供了一种生理性精子制动液，其具体成分及终浓度如下表1所示。
制备方法为：
(1)精密称取透明质酸钠，溶于60℃的400mL注射用水中，使用上搅拌器搅拌，转速为500rpm，搅拌均匀，得澄清透明的透明质酸钠溶液；称取碳酸氢钠，溶于100mL注射用水中，加热至50℃左右搅拌均匀，得碳酸氢钠溶液；精密称取瘦素溶于注射用水中，配制成浓储液(100×)，吸取1×瘦素浓储液，加入注射用水中，搅拌均匀，得瘦素溶液；将透明质酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、瘦素溶液混合，得第一混合液；
(2)称定氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、人血白蛋白，加入200mL注射用水中，得第二混合液；
(3)将第一混合液和第二混合液混合，采用注射用水定容至1L，最后在百级条件下，在1bar的CO2保护气体层流下，采用0.22μM过滤膜过滤除菌，即得所述生理性精子制动液。
表1
对比例1一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于：除用相同质量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)替代透明质酸钠外，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例2一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于：使用相同浓度的牛磺酸替代瘦素作为营养物质，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例3一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于：除用21mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)替代21mM碳酸氢钠外，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例4一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于：除用21mM的3-吗啉丙磺酸(Mops)替代21mM碳酸氢钠外，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例5一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于：除碳酸氢钠和透明质酸钠的浓度与实施例1不同，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例6一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于除碳酸氢钠和透明质酸钠的浓度与实施例1不同，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例7一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于除瘦素浓度与实施例1不同，其他组分浓度且配制方法一致。
对比例8一种生理性精子制动液及其制备方法(1L)
与实施例1相比其区别在于除瘦素浓度与实施例1不同，其他组分浓度且配制方法一致。
效果实验：
试验例效果测试
评价内容：
1、精子制动液的pH：依据中国药典2020版《0631pH值测定法》进行生理性精子制动液pH检测，pH应为7.2-8.4。
2、精子制动液的渗透压：依据中国药典2020版《0632渗透压摩尔浓度测定法》进行精子制动液渗透压检测，渗透压应为280-360mOsm/kg。
3、精子制动液的黏度：依据中国药典2020版《0633黏度测定法》进行精子制动液黏度检测，黏度应为50-500cP。
4、精子制动液的无菌：依据中国药典2020版《1101无菌检查法》进行精子制动液无菌检测，应无菌。
5、精子制动液的内毒素：依据中国药典2020版《1143细菌内毒素检查法》进行精子制动液内毒素检测，内毒素＜0.15EU/mL。
6、将实施例1-3和对比例1-8的配方进行ICSI试验，由经过ICSI操作系统培训的同一试验人员对精子制动效果进行检测：
实验方法：
实施例1-3和对比例1-2,5-8使用方法：在经5-7％ CO2平衡的生理性精子制动液微滴中加入1-2μL经梯度密度分离液和上游法处理后精子悬液，培养数分钟，使精子迁移到液滴外侧，达到分离死活精子目的，成熟的精子的尾巴在液滴中呈现小幅度的摆动，未成熟的精子尾巴在液滴中自由卷曲摆动。使用ICSI注射针压住成熟精子尾巴，破膜制动，抽吸精子注入到卵母细胞中。将注射过的精子的卵母细胞置于培养液中。
对比例3、4使用方法：在37℃大气环境中孵育的精子制动液微滴中加入1-2μL经梯度密度分离液和上游法处理后精子悬液，培养数分钟，使精子迁移到液滴外侧，达到分离死活精子目的。使用ICSI注射针压住成熟精子尾巴，破膜制动，抽吸精子注入到卵母细胞中。将注射过的精子的卵母细胞置于培养液中。观察并统计后续受精率、囊胚发育率。
实验结果：
上述检测结果见表2和表3
表2
表3
结果分析：
由上述表2和表3可知：在3个实施例中，实施例1效果最好，受精率为93.33％±2.08％，囊胚率为97.49％±0.68％，优于实施例2-3，表明实施例1的组分浓度配比最佳。
与实施例1相比，对比例1为用相同质量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)替代透明质酸钠，受精率降低53.21％，囊胚率降低30.09％，表明实施例1的组分透明质酸钠优于现有市场使用的PVP。
与实施例1相比，对比例2使用牛磺酸替代瘦素作为营养物质，受精率降低57.12％，囊胚率降低31.66％，表明实施例1的组分瘦素影响受精率和囊胚率，对可用囊胚发育有显著性影响。
与实施例1相比，对比例3用21mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)替代21mM碳酸氢钠，受精率降低6.06％，囊胚率降低21.69％，表明HEPES降低受精率和囊胚率，实施例1的组分碳酸氢钠优于HEPES。
与实施例1相比，对比例4用21mM的3-吗啉丙磺酸(MOPS)替代21mM碳酸氢钠，受精率降低21.07％，囊胚率降低16.91％，表明Mops降低受精率和囊胚率，实施例1的组分碳酸氢钠优于MOPS。
与实施例1相比，对比例5的透明质酸钠低于本发明所限浓度范围，碳酸氢钠高于本发明所限浓度范围，受精率降低47.85％，囊胚率降低19.93％，表明精子制动液中限速剂与缓冲剂的浓度需在本发明所限范围内，才可提高受精率和囊胚率。
与实施例1相比，对比例6的透明质酸钠高于本发明所限浓度范围，碳酸氢钠低于本发明所限浓度范围，受精率降低48.92％，囊胚率降低20.54％，表明精子制动液中限速剂与缓冲剂的浓度需在本发明所限范围内，才可提高受精率和囊胚率。
与实施例1相比，对比例7的瘦素高于本发明所限浓度范围，受精率降低20.36％，囊胚率降低14.16％，表明精子制动液中瘦素的浓度需在本发明所限范围内，才可提高受精率和囊胚率。
与实施例1相比，对比例8的瘦素低于本发明所限浓度范围，受精率降低37.14％，囊胚率降低16.16％，表明精子制动液中瘦素的浓度需在本发明所限范围内，才可提高受精率和囊胚率。
以上说明本发明所提供的生理性精子制动液更自然和更安全、可降低精子的DNA片段化率和异常受精率、可减少卵母细胞转录组发生变化的风险且可以提高囊胚率，增加可用胚胎的利用率，从而可获得质量更好的胚胎。
Claims (15)
1.一种生理性精子制动液，其特征在于，所述的生理性精子制动液包括基础组分、核心组分和溶剂；所述核心组分包括限速剂、缓冲剂和营养物质；所述基础组分包括无机盐、能量成分和蛋白；所述溶剂为纯化水或注射用水；所述的限速剂终浓度为1g/L-10g/L，所述的缓冲剂终浓度为20-30mM，所述的营养物质终浓度为10-500μg/L。
2.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的限速剂为透明质酸及其盐或衍生物，所述的缓冲剂为碳酸氢盐。
3.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的限速剂为透明质酸钠，所述的缓冲剂为碳酸氢钠，所述的营养物质为瘦素。
4.根据权利要求3所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的透明质酸钠的终浓度为2g/L-5g/L，所述的碳酸氢钠的终浓度为22.5-27.5mM，所述的瘦素的终浓度为50-200μg/L。
5.根据权利要求3所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的透明质酸钠的终浓度为2.5g/L，所述的碳酸氢钠的终浓度为25mM，所述的瘦素的终浓度为100μg/L。
6.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙中至少一种；所述的能量成分选自葡萄糖、乳酸钠和丙酮酸钠中的至少一种；所述的蛋白选自人血白蛋白、重组人血白蛋白和球蛋白中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙的混合物；所述的能量成分为乳酸钠、葡萄糖和丙酮酸钠的混合物；所述的蛋白为人血白蛋白。
8.根据权利要求7所述的生理性精子制动液，其特征在于：所述的氯化钠的终浓度为81.28-121.92mM；所述的氯化钾的终浓度为3.75-5.63mM；所述的硫酸镁的终浓度为0.16-0.24mM；所述的磷酸二氢钾的终浓度为0.29-0.45mM；所述的氯化钙的终浓度为1.63-2.45mM；所述的乳酸钠的终浓度为17.12-25.68mM；所述的葡萄糖的终浓度为2.22-3.34mM；所述的丙酮酸钠的终浓度为0.26-0.4mM；所述的人血白蛋白的终浓度为2.5-7.5g/L。
9.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于，所述生理性精子制动液的在20-30℃大气环境下时pH为7.2-8.4；经含5-7％CO2的CO2培养箱或三气培养箱平衡后，pH为7.2-7.6；所述生理性精子制动液的渗透压为280-360mOsm/kg；所述生理性精子制动液的黏度在20-30℃下为50-500cP；所述生理性精子制动液的内毒素＜0.15EU/mL。
10.根据权利要求1所述的生理性精子制动液，其特征在于，所述生理性精子制动液在20-30℃大气环境下时pH为7.2-7.5；经含5-7％CO2的CO2培养箱或三气培养箱平衡后，pH为7.2-7.4；所述生理性精子制动液的渗透压为300-330mOsm/kg；所述生理性精子制动液的黏度在20-30℃下为100-400cP。
11.权利要求1-10任一项所述的生理性精子制动液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别称取限速剂、缓冲剂和营养物质加入溶剂中，搅拌至完全溶解，分别得到限速剂溶液、缓冲剂溶液、营养物质溶液；将三种溶液混合得第一混合液；
(2)将无机盐、能量成分和蛋白混合后加入溶剂，搅拌至完全溶解，得到第二混合液；
(3)将第一混合液和第二混合液混合，定容，过滤，灭菌，即得所述生理性精子制动液。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：将所述的限速剂加入溶剂中时，溶剂的温度为50-60℃，所述的搅拌的搅拌速度为300-600rpm。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：将所述的缓冲剂加入溶剂中后，需在加热条件下搅拌，所述的加热的温度为45-55℃。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的灭菌为：在百级条件及0.8-1.2bar的CO2保护气体层流下，采用0.22μM过滤膜过滤除菌。
15.权利要求1-10任一项所述的生理性精子制动液在胞浆内单精子注射技术或辅助生殖中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202411428845.0A CN119320745A (zh) | 2024-10-14 | 2024-10-14 | 一种生理性精子制动液及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202411428845.0A CN119320745A (zh) | 2024-10-14 | 2024-10-14 | 一种生理性精子制动液及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN119320745A true CN119320745A (zh) | 2025-01-17 |
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ID=94231466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202411428845.0A Pending CN119320745A (zh) | 2024-10-14 | 2024-10-14 | 一种生理性精子制动液及其制备方法和应用 |
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-
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- 2024-10-14 CN CN202411428845.0A patent/CN119320745A/zh active Pending
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