CN119095970A - Aav衣壳3d分子表面特征映射 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于获得和映射病毒衣壳(例如，AAV衣壳)的3D分子表面特征的组合物和方法。

Description

AAV衣壳3D分子表面特征映射

优先权的要求

本申请要求于2022年4月25日提交的美国临时申请第63/334,590号的权益；于2022年4月25日提交的第63/334,595号；以及于2022年4月25日提交的第63/334,596号。前述的全部内容通过引用并入本公开。

技术领域

本公开涉及用于获得和映射病毒衣壳(例如，AAV衣壳)的3D特征的组合物和方法。

背景技术

使用腺相关病毒(AAV)作为载体的基因疗法已成为一种新的治疗性方式，其具有实现许多单基因疾病和治愈中的实质性疾病修饰的潜力。

AAV疗法在广泛的应用中显示出了前景，诸如恢复血友病患者的凝血功能，恢复Leber先天性黑蒙症(一种罕见的遗传性失明)患者的视力，以及阻止婴儿脊髓性肌萎缩症的发展，为患者带来真正的突破性创新。

然而，使用AAV疗法的许多疾病的处理受到AAV衣壳变体的组织或细胞类型选择性的限制。基因疗法治疗剂特别表现出非常低的向性，尤其是对于中枢神经系统相关疾病。

通过开发用于靶向递送治疗剂至所期望的器官、组织或细胞类型的AAV衣壳变体，将极大地促进罕见疾病、癌症和其他器官、组织或细胞类型受限疾病状态的处理。

因此，本领域需要映射AAV衣壳的3D分子特征的方法，用于开发AAV衣壳变体。

发明内容

本公开涉及使用DNA编码文库(DEL)的结合特性获得和分析AAV(腺相关病毒)衣壳变体的3D分子表面特征的方法，该DNA编码文库诸如DNA编码化学文库(DECL)和DNA编码抗体文库(DEAL)、噬菌体展示文库、DNA适配体文库(单链和圆形适配体)、RNA适配体文库(单链和圆形适配体)或其组合。

因此，本公开提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将AAV衣壳与靶向一种或多种AAV衣壳的适配体文库接触；

b)去除未结合的适配体；

c)洗脱结合的适配体；

d)鉴定与AAV衣壳结合的适配体；

e)确定所鉴定的适配体的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的适配体的存在和/或水平表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，步骤a)-c)重复1次、2次、3次或更多次。

在一些实施方案中，洗脱的适配体通过PCR反应扩增。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体是线性适配体或圆形适配体。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括至少一个引物结合区域和随机序列。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的引物结合区域的长度为约20bp。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的随机序列的长度为约36至约40bp。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括双链寡核苷酸序列。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括单链寡核苷酸序列。

在一些实施方案中，适配体文库的至少一个适配体能够通过随机序列与AAV衣壳上的靶标结合。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括与DNA适配体的包括5’-延伸区域的区域互补的单链DNA(Guard-DNA或G-DNA)。

在一些实施方案中，当AAV衣壳与适配体文库接触时，单链G-DNA分子被释放。

在一些实施方案中，结合AAV衣壳的适配体的鉴定包括：将步骤a)中获得的混合物与RNase H和与G-DNA互补的单链RNA接触，其中荧光团和淬灭剂分别被标记在单链RNA的5’端和3’端处；以及测量混合物的荧光强度。

在一些实施方案中，其中荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

在一些实施方案中，猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。

在一些实施方案中，通过测序来进行与AAV衣壳结合的适配体的鉴定。

在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序或液滴测序。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的靶标是已知的。

在一些实施方案中，不必知道适配体文库中的适配体的精确靶标。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与适配体文库接触之前处于溶液中。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与适配体文库接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D分子表面特征。

本公开还提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将AAV衣壳与DNA编码的化学文库(DECL)接触，该化学文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的化学结合剂的池；

b)去除未结合的DNA编码的化学结合剂；

c)洗脱结合的DNA编码的化学结合剂；

d)鉴定与AAV衣壳结合的DNA编码的化学结合剂；

e)确定所鉴定的DNA编码的化学结合剂的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的DNA编码的化学结合剂的存在和/或水平，表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，步骤a)-c)重复1次、2次、3次或更多次。

在一些实施方案中，DECL中的每种DNA编码的化学结合剂包括：

a)能够与AAV衣壳上的一个或多个靶标结合的化合物；

b)DNA条形码；以及

c)连接体。

在一些实施方案中，洗脱的DNA编码的化学结合剂的DNA条形码通过PCR反应扩增。

在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。

在一些实施方案中，每种DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列与化学结合剂的身份相关。

在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的鉴定是通过DNA条形码序列的测序来进行的。

在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序、液滴测序或单细胞测序。

在一些实施方案中，DECL中的DNA编码的化学结合剂的靶标是已知的。

在一些实施方案中，不必知道适配体文库中的DNA编码的化学结合剂的精确靶标。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与DECL接触之前处于溶液中。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与DECL接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，连接体是可裂解的连接体。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D分子表面特征。

本公开还提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将AAV衣壳与DNA编码的抗体文库(DEAL)接触，该抗体文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的抗体结合剂的池；

b)去除未结合的DNA编码的抗体结合剂；

c)洗脱结合的DNA编码的抗体结合剂；

d)鉴定与AAV衣壳结合的DNA编码的抗体结合剂；

e)确定所鉴定的DNA编码的抗体结合剂的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的DNA编码的抗体结合剂的存在和/或水平，表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，步骤a)-c)重复1次、2次、3次或更多次。

在一些实施方案中，DECL中的每种DNA编码的抗体结合剂包括：

a)能够与AAV衣壳上的一个或多个靶标结合的抗体或其抗原结合片段；

b)DNA条形码；以及

c)连接体。

在一些实施方案中，洗脱的DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码通过PCR反应扩增。

在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。

在一些实施方案中，通过测序来进行DNA编码的抗体结合剂的鉴定。

在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序或液滴测序。

在一些实施方案中，DEAL中的DNA编码的抗体结合剂的靶标是已知的。

在一些实施方案中，不必知道DEAL文库中的DNA编码的抗体结合剂的精确靶标。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与DEAL接触之前处于溶液中。

在一些实施方案中，AAV衣壳在与DEAL接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，连接体是可裂解的连接体。

在一些实施方案中，连接体包括至少一种核酸分子，该核酸分子包括酶可裂解序列(CL)。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D分子表面特征。

本公开还提供了富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的结合文库的方法，包括：

(a)将结合试剂的池与AAV衣壳的第一群体接触；

(b)富集与AAV衣壳的第一群体结合的结合剂的子池，从而富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的结合文库。

在一些实施方案中，该方法还包括：

(c)将与AAV衣壳的第一群体结合的结合剂的子池与AAV衣壳的第二群体接触；以及

(d)耗尽对AAV衣壳的第二群体显示亲和力的结合剂的第二子池，从而选择对AAV衣壳的第一群体具有优先亲和力的结合剂的群组。

在一些实施方案中，结合试剂的文库是适配体文库、DNA编码的化学文库(DECL)或DNA编码的抗体文库(DEAL)。

在一些实施方案中，AAV衣壳或AAV衣壳的第一群体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12和AAV13中的一种或多种以及源自突变、肽插入或改组的其他变体。

在一些实施方案中，3D分子表面特征是文库的结合特性。

在一些实施方案中，结合特性是所结合的结合试剂的数目、序列和拷贝数。

在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征指示向性特性和/或中和特性(例如，逃避中和抗体的能力)。

本公开还提供了用于执行富集本公开所描述的结合文库的方法的试剂盒。

除非另有定义，本公开所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本公开描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。本公开所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据文库条目和其他参考文献均通过引用整体并入本公开。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

从下面的详细描述和附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

图1A是线性适配体文库中的适配体的示意图示。

图1B是圆形适配体文库中的适配体的示意图示。

图2A是针对AAV样品(AAV Mix 01)的适配体文库的富集的示意图示。

图2B是针对AAV样品(AAV Mix 02)的适配体文库的富集的示意图示。

图2C显示了从本公开所描述的适配体富集中获得的示例性原始数据。

图3显示了来自本公开所描述的每轮富集的前100个富集的适配体的计数。

图4显示了来自每轮富集的前100个富集的适配体的序列组成标志。

图5显示了本公开所描述的前500个富集的适配体的计数。

图6显示了来自线性适配体文库的任一轮富集的富集适配体的数目。

图7A-7B显示了相对于两个AAV样品(AAV Mix 01和AAV Mix02)的经富集的圆形适配体的计数差异。y轴显示计数的差异(通过C2*C0/C1^2，C0＝1/数目的富集的适配体序列计算)。C1是第一轮富集中经富集的适配体的数目。C2是第二轮富集中经富集的适配体的数目。X轴显示了针对两种不同AAV样品的富集适配体文库之间共享适配体的DNA序列ID，其中适配体计数大于50。

图7C-7D显示了富集的线性适配体相对于两个AAV样品(AAV Mix 01和AAV Mix02)的计数差异。y轴显示计数的差异(通过C2*C0/C1^2，C0＝1/数目的富集的适配体序列计算)。C1是第一轮富集中经富集的适配体的数目。C2是第二轮富集中经富集的适配体的数目。X轴显示了针对两种不同AAV样品的富集适配体文库之间共享适配体的DNA序列ID，其中适配体计数大于50。

图8A-8B显示了线性适配体文库中经富集的适配体的计数分布。

图9A-9B显示了圆形适配体文库中经富集的适配体的计数分布。

图10是DNA编码的化学文库(DECL)的示意图示。

图11是使用DECL表征AAV衣壳的3D分子表面特征的示意图示。

图12是将AAV衣壳的3D分子表面特征转化到DECL空间的示意图示。

图13是使用DECL和DEAL结合基于液滴的测序来表征AAV衣壳的3D分子表面特征的示意图示。

图14显示了市售的DNA编码文库的示例描述。

图15显示了富集的DECL化学结合剂对四个AAV样品的文氏图。

图16A-16D显示了使用主成分分析(PCA)执行的富集的DECL化学结合剂的聚类分析。

具体实施方式

本公开涉及使用DNA编码文库(DEL)分析在溶液或固体支持物中的AAV(腺相关病毒)衣壳变体的3D分子表面特征的方法，诸如DNA编码化学文库(DECL)和DNA编码抗体文库(DEAL)、噬菌体展示文库、DNA适配体文库(单链和圆形适配体)、RNA适配体文库(单链和圆形适配体)或其组合。更具体而言，本公开涉及使用结合文库的组合物和方法，该结合文库单独地或以组合方式选择性地结合AAV衣壳变体的表面，以将AAV衣壳变体的3D表面分子特征转化为结合特性，从而描绘和映射3D分子表面特征。

本公开所描述的方法提供了将AAV衣壳3D分子表面特征空间转化为由检测文库与AAV样品的结合所定义的特异性蛋白-DNA编码分子或蛋白-适配体亲和相互作用特征的方法。本公开所描述的方法可还包括由蛋白-DNA-编码分子或蛋白-适配体复合物编码的DNA序列信息的液滴和/或单细胞样测序。本公开提供了对AAV衣壳进行功能性注释的手段和帮助重组DNA载体工程改进基因递送应用的可视化平台。

腺相关病毒

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvoviridae)的单链DNA包装病毒，并且属于依赖细小病毒属(Dependoparvovirus)。基于AAV的载体正被开发并且被用作基因递送生物制剂来处理多种单基因疾病。已经描述了13种人类和灵长类AAV血清型和许多基因组分离物，并且将其归入6个进化支A-F或单个克隆分离物。AAV的病毒体由非包膜衣壳组成，该非包膜衣壳具有T＝1的二十面体对称性，并且它们由60种病毒蛋白(VP)以大约1:1:10的比例组装而成：VP1(≈82kDa)、VP2(≈73kDa)和VP3(≈61kDa)。VP有一个共同的C末端，包括整个VP3。与VP3相比，在VP1(VP1u)的情况下，VP1和VP2在其N-末端处延伸，具有共享的≈65个氨基酸(aa)区域和VP2的附加的≈137个aa N-末端。VP1和VP2的N-末端区域包含AAV感染性所需的保守元件，诸如磷脂酶A2(PLA2)结构域、钙结合结构域和核定位信号。总体而言，AAV血清型的VP1氨基酸序列同一性在57％与99％之间变化。

已经通过X射线晶体学和/或冷冻电子显微镜(cryo-EM)确定了若干种天然人类和灵长类AAV血清型AAV1-AAV6、AAV8、AAV9、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.39的衣壳结构。不管用什么方法确定结构，除了第一个≈15个氨基酸外，只有氨基酸序列的VP3是有序的。VP3结构由一个反平行的八链(βB至βI)β桶基序组成，其中BIDG片形成衣壳的内表面。另一条链βA与βB链反向平行。此外，所有的AAV均保守位于βC与βD之间的α螺旋(αA)。在各个β链之间，插入了大环，该大环由AAV之间的高度序列和结构可变性来表征。这些圆形成衣壳的外表面，并且以其侧翼的β链命名。例如，HI环的侧翼是βH和βI链。不同AAV的序列可变性造成这些环的选择性构象，这造成AAV血清型特异性衣壳分子表面特征。通过结构比对，这些环顶点的9个显著差异的区域被定义为可变区域(VR)。尽管VR的结构不同，但是整体衣壳形态是保守的。这些包括在二十面体5-折叠对称轴上的圆柱形通道，由去环(VR-II)形成，被大部分由HI环勾勒的凹陷所包围。5-折叠通道被认为是细胞进入后内/溶酶体运输期间基因组DNA包装和VP1u外化的途径。在2-折叠对称轴上，凹陷的两侧是围绕3-折叠对称轴的突起，在2-折叠轴与5-折叠轴之间的凸起衣壳区域被称为2/5-折叠壁。3-折叠区域和2/5-折叠壁已被鉴定为许多AAV血清型的受体结合位点，并且作为细胞和组织嗜性的决定因素。细胞受体包括唾液酸、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、末端半乳糖、硫酸化N-乙酰乳糖胺、AAVR、层粘连蛋白、αvβ1整合素、αvβ5整合素、肝细胞生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体和血小板衍生生长因子受体。除了受体结合之外，衣壳的表面，包括5-折叠区域，展示了由宿主免疫反应产生的抗体的抗原位点。

在最近的研究中，通过cryo-EM确定了AAV7、AAV11、AAV12和AAV13衣壳的结构，以努力完成所定义的AAV血清型的可用结构。这四种AAV血清型的空的和含基因组的衣壳结构被重建为2.54至之间的分辨率。所有密度图均显示了明确的氨基酸侧链密度，并且显示了AAV衣壳的特征，包括5-折叠轴上的通道、2-折叠轴上和5-折叠轴周围的凹陷以及3-折叠轴周围的突起。空的(无DNA)和完整的(基因组包装的)衣壳结构的比较表明，除了在完整衣壳和可选择的侧链方向的情况下在先前描述的核苷酸(nt)结合口袋处的有序核苷酸之外，VP单体没有结构差异。与AAV2相比，由于aa插入或缺失以及序列差异，主要在3-折叠突起和2/5-折叠壁处观察到显著的结构差异。AAV7、AAV11、AAV12和AAV13结构的这种表征完成了确定血清型的文库。

关于AAV衣壳及其结构的更多细节是本领域已知的，并且可以在综述文章中找到，综述文章诸如Mietzsch等人，Viruses.2021Jan；13(1):101；Cotmore S.F.等人，J.Gen.Virol.2019；100:367–368.doi:10.1099/jgv.0.001212；Wang D.等人，Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.Nat.Rev.DrugDiscov.2019；18:358–378；Gao G等人，J.Virol.2004；78:6381–6388.doi:10.1128/JVI.78.12.6381-6388.2004；Mietzsch M.，Twenty-five years of structuralparvovirology.Viruses.2019；11:362；Snijder J.等人，Defining the stoichiometryand cargo load of viral and bacterial nanoparticles by orbitrap massspectrometry.J.Am.Chem.Soc.2014；136:7295–7299；Girod A.等人，The VP1 capsidprotein of adeno-associated virus type 2is carrying a phospholipase A2 domainrequired for virus infectivity.Pt 5J.Gen.Virol.2002；83:973–978；Popa-Wagner R.等人，Impact of VP1-specific protein sequence motifs on adeno-associated virustype 2intracellular trafficking and nuclear entry.J.Virol.2012；86:9163–9174；以及Daya S.等人，Gene therapy using adeno-associated virusvectors.Clin.Microbiol.Rev.2008；21:583–593；每个专利均通过引用整体并入本公开。

AAV衣壳的3D分子表面特征

腺相关病毒(AAV)已经成为许多当前基因疗法方法的选择载体。AAV具有很强的传染性，但是在没有辅助病毒的情况下具有天然的复制缺陷，并且其基因组易于操作。为了生成重组AAV(rAAV)载体，用转基因表达盒替换病毒基因，同时保留衣壳化所需的侧翼反向末端重复序列(ITR)。反式提供用于包裹载体DNA的病毒体衣壳蛋白，随后纯化所得rAAV。迄今为止，rAAV载体的安全性已在数十年的研究和200多项临床试验中得到充分证实。更多的即将到来的许多研究新药申请在不同阶段的审查。AAV介导的基因转移通过介导转基因的长期表达使许多患有遗传疾病的个体受益。然而，仍然存在一些障碍，诸如对rAAV衣壳的预先存在的免疫性和对转基因产物的不希望的免疫反应。

AAV衣壳的不同亚型可以将DNA递送至多种细胞和组织，而特定的细胞和组织因亚型而异。这是由于二十面体形状衣壳的组织形成了围绕DNA有效载荷的包膜，并且经由衣壳表面突出的刺突结构与靶细胞上的特定分子相互作用。许多基因疗法面临的一个挑战是AAV病毒被不应当成为靶标的细胞吸收。这会降低病毒在预期靶标位点的效率，并且在其他细胞和组织类型中引起不期望的反应。这些还包括可以触发免疫反应的免疫系统细胞和免疫记忆，该免疫记忆在以后防止治疗性病毒被第二次提供，如果这是必要的话。

因此，本公开提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法。本公开所使用的3D分子表面特征是指AAV衣壳的任何结构、化学和功能性特征(一个或多个)。例如，AAV衣壳的3D分子表面特征可以包括AAV衣壳的成分(例如，AAV衣壳的VP蛋白组成)，AAV衣壳的二级或三级蛋白结构，AAV衣壳的生物物理属性(例如，其在体外和体内结合受体、小分子或其他蛋白的能力)，AAV的病毒嗜性，以及AAV的抗体中和或免疫原性特征。这些3D分子表面特征可用于预测不同组织和细胞的免疫反应和递送效率。

在暴露于流通的野生型AAV的人群中，在相当大比例的人群中发现了针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体。这些抗体大大降低了rAAV的转导效率，并且可以阻止转基因在这些个体中的成功递送。因此，抗体结合特性对于AAV衣壳的工程化是重要的。

在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征是AAV的抗体结合特性。在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征指示了AAV的抗体结合偏好。

虽然rAAV载体传统上被认为是无免疫原性的，但是可以对AAV本身和/或转基因产物生成免疫应答。最近在rAAV衣壳上发现了翻译后修饰，这可以有助于在一些基因疗法接受者中看到的不期望的免疫原性。

在选择用于基因递送的最合适的rAAV血清型时，病毒嗜性，或感染特定组织或细胞类型的能力，是要考虑的关键因素。病毒的嗜性主要由rAAV衣壳决定，并且已经鉴定了多种不同的衣壳血清型。当在实验室中生产rAAV载体时，AAV2 ITR基因组被改造成包含感兴趣的转基因，并且所得重组基因组被包裹在优选的衣壳中。根据所期望的靶细胞或组织，不同的血清型可以是优选的。针对rAAV表达的转基因产物的免疫原性的另一个潜在来源与脱靶递送有关。抗原呈递细胞(APC)的无意转导可造成向免疫系统的呈递，并且触发免疫反应。

在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征是AAV的病毒嗜性。在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征指示AAV(例如，rAAV)的向性。

虽然主要用于处理单基因疾病，但是rAAV介导的基因转移也可用于递送免疫治疗剂，诸如单克隆抗体。针对感兴趣的病原体的适当表征的保护性/中和抗体的编码序列可以经由rAAV递送，从而旨在预防或处理感染性疾病并且赋予持久的免疫力。

在AAV与其人类宿主之间存在持续的免疫和分子竞赛。本领域需要更安全和更广泛适用的疗法。

在一些实施方案中，本公开所描述的方法表征了AAV衣壳的群体的3D分子表面特征。在一些实施方案中，在AAV衣壳的群体中有约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种类型的AAV衣壳。在一些实施方案中，群体中AAV衣壳的类型选自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12和AAV13。在一些实施方案中，群体中的AAV衣壳是野生型AAV衣壳。在一些实施方案中，群体中的一种或多种AAV衣壳包括衣壳蛋白中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或超过10个突变。在一些实施方案中，突变是单点突变。在一些实施方案中，突变在AAV衣壳蛋白的多个氨基酸残基上。

在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹个、10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约或至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹个或10²⁰个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约1至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10²至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10³至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁴至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁵至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁶至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁷至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁸至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁹至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁰至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹¹至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹²至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹³至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁴至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁵至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁶至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁷至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁸至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10¹⁹至约10²⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10²至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10³至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁴至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁵至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁶至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁷至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁸至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。在一些实施方案中，AAV衣壳的群体包含约10⁹至约10¹⁰个或更多个AAV衣壳。

本公开所描述的方法(例如，使用适配体文库、DECL、DEAL和/或噬菌体展示文库来表征病毒衣壳的3D分子表面特征)可用于表征用于基因递送目的的任何合适的病毒颗粒、病毒样颗粒、自组装蛋白的3D分子表面特征。

利用核酸适配体文库表征AAV衣壳的3D分子表面特征

适配体是通过SELEX(通过指数富集的配体系统进化)在体外常规选择的核酸种类。自从由Gold和Szostak小组引入以来(Tuerk和Gold，Science,vol.249,pp.505-510,(1990))，适配体已经被开发作为分子识别元件来检测几乎任何感兴趣的靶标，从小分子到蛋白甚至细胞和组织。适配体很容易通过化学合成以低成本再生。此外，它们具有理想的储存特性，在生物学环境中很少或没有引起免疫原性。它们在治疗学和诊断学中的应用已经显著扩展。最近，适配体固有的信号传导属性的缺乏已经促进了各种策略的发展，这些策略用于将靶标结合事件转导为生物技术和生物医学应用中容易测量的信号(参见，例如，Navani和Li，Curr.Opin.Chem.Biol.,vol.10,pp.272-281(2006))。

使用荧光报道分子的方法已被证明在基于适配体的生物传感器的生成中特别有用；这些方法包括单发色团方法(参见，例如，Jhaveri等人，J.Am.Chem.Soc.,vol.122,pp.2469-2473(2000))、适配体信标工程(参见，例如，Hamaguchi等人，Anal.Biochem.,vol.294,pp.126-131(2001))、结构切换信号(参见，例如，Nutiu和Li，J.Am.Chem.Soc.,vol.125,pp.4771-4778(2003))、原位标记(参见，例如，Merino和Weeks，J.Am.Chem.Soc.,vol.125,pp.12370 -12371(2003))、变构嵌合体(参见，例如，Wu和Curran，Nucleic AcidsRes.,vol.27,pp.1512-1516(1999))、染料染色方法(参见，例如，Li等人，Chem.Commun.,pp.73-75(2007))，以及基于聚合物共轭物的荧光化学传感器(参见，例如，Ho和Leclerc，J.Am.Chem.Soc.,vol.126,pp.1384-1387(2004))。虽然这些系统一般以化学计量的方式产生信号，但是已经尝试通过结合近感连接分析来放大信号(参见，例如，Fredriksson等人，Nature Biotechnol.,vol.20,pp.473-477(2002))或核酸外切酶保护试验(参见，例如，Wang等人，Anal.Chem.,vol.76,pp.5605-5610(2004))。此外，整合了分子信标的DNA-聚合酶分析已被用于适配体与靶标小分子之间识别的扩增检测(参见，例如，Shlyahovsky等人，J.Am.Chem.Soc.,vol.129,pp.3814-3815(2007))。对于开发简单并且易于应用的基于适配体的方法来说，这类技术是持续的需求，这些方法可以便于准确和特异性的生物分析。

在一个方面中，本公开提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：a)将AAV衣壳与靶向一种或多种AAV衣壳的适配体文库接触；b)去除未结合的适配体；c)洗脱结合的适配体；d)鉴定与AAV衣壳结合的适配体；e)确定所鉴定的适配体的存在和/或水平；以及f)基于所鉴定的适配体的存在和/或水平表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，针对AAV样品的适配体文库的富集(即接触、洗涤和洗脱步骤(步骤a-c))重复1次、2次、3次、4次、5次或更多次。

本公开所描述的方法可以在任何合适的溶液或缓冲液中被执行。在一些实施方案中，针对AAV样品的适配体文库的富集在DPBS缓冲液(例如，1.47mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、138mM NaCl、2.67mM KCl、0.5mM MgCl₂、0.9mM CaCl₂，pH7.4)中被执行。本领域普通技术人员应容易理解，任何其他合适的缓冲液和缓冲液中的试剂范围均可以用于本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，针对AAV样品的适配体文库的富集在室温下被执行。本领域普通技术人员将容易理解，可以使用任何其他合适的温度来执行本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，洗脱的适配体通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。在一些实施方案中，聚合酶链式反应(PCR)包括基于PCR的方法，诸如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)等，以及电场驱动聚合酶链式反应(ePCR)。

本公开所描述的方法的文库中的适配体可以是本领域已知的任何合适的适配体。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体是线性适配体。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体是圆形适配体。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括至少一个引物结合区域和随机序列。在一些实施方案中，适配体的随机序列能够与AAV衣壳上的一个或多个靶标结合。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的随机序列的长度为约30bp至约50bp。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的随机序列的长度为约30bp至约40bp。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的随机序列的长度为约36至约40bp。在一些实施方案中，本公开所描述的方法还包括排除适配体序列(例如，在洗脱的结合适配体测序之前或之后)。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的引物结合区域的长度为约或至少10bp、约或至少15bp、约或至少20bp、约或至少25bp、约或至少30bp、约或至少35bp、约或至少40bp。在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的引物结合区域的长度为约20bp。

适配体文库中的适配体可以是双链或单链的。在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括双链寡核苷酸序列。在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括单链寡核苷酸序列。

本公开所描述的方法中使用的适配体或DEL化学结合剂可以直接或间接连接到固体表面或底物上。固体表面或底物可以是任何物理上可分离的固体，结合剂可以直接或间接附着于其上，包括但不限于由微阵列和孔提供的表面，颗粒诸如珠、柱、光纤、擦拭物、玻璃和改性或功能化的玻璃、石英、云母、重氮化膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、涂覆的珠或颗粒、其他色谱材料、磁性颗粒；塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆材料等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括聚合物诸如聚吡咯和聚吲哚)；微米或纳米结构表面，诸如核酸平铺阵列、纳米管、纳米线或纳米颗粒修饰的表面；或者多孔表面或凝胶，诸如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或其他纤维或多股聚合物。此外，如本领域已知的，可以用任何数目的材料，包括聚合物，诸如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖，使用被动或化学衍生的涂层来涂覆底物。这类涂层可以便于阵列与生物样品的使用。

适配体或其他有用的结合剂可以与可检测的实体或标记结合。

合适的标记包括但不限于磁性标记、荧光基团、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶体颗粒、聚合染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其他纳米颗粒，包括量子点或金颗粒、荧光团、量子点或放射性标记。蛋白标签包括绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)；以及发光蛋白如荧光素酶，如下所述。放射性标记包括但不限于放射性同位素(放射性核素)，诸如³H、¹¹C、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³³Xe、¹⁷⁷Lu、²¹¹At或²¹³Bi。荧光标记包括但不限于稀土螯合物(例如，铕螯合物)、罗丹明(rhodamine)；荧光素类型包括但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型，包括但不限于TAMRA；丹磺酰；Lissamine；花青素(cyanines)；藻红蛋白；德克萨斯红；Cy3、Cy5、dapoxyl、NBD、Cascade Yellow、dansyl、PyMPO、芘(pyrene)、7-二乙氨基香豆素-3-羧酸和其他香豆素衍生物、Marina Blue^TM、Pacific Blue^TM、Cascade Blue^TM、2-蒽磺酰基、PyMPO、3,4,9,10-苝-四羧酸、2,7-二氟荧光素(Oregon Green^TM488-X)、5-羧基荧光素、Texas Red^TM-X、Alexa Fluor 430、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、BODIPY FL、bimane和AlexaFluor350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700和750，以及它们的衍生物，在许多其他方面。参见，例如，“手册-荧光探针和标记技术指南”，第十版，可在因特网上的probes(dot)invitrogen(dot)com/handbook获得。荧光标记可以是FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540和LIZ中的一种或多种。

使用常规技术，可以直接或间接标记适配体，例如，通过生物素-链霉亲和素将标记附着于适配体上(例如，合成生物素化的适配体，其然后能够结合链霉亲和素分子，链霉亲和素分子本身缀合到可检测的标记上；非限制性示例是链霉亲和素、藻红蛋白缀合物(SAPE)。使用多步骤程序的化学偶联方法包括生物素化、三硝基酚(TNP)或地高辛配基的偶联，例如使用这些化合物的琥珀酰亚胺酯。生物素化可以通过例如使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺来完成。琥珀酰亚胺基团在高于7的pH值下有效地与氨基反应，并且优选地在约pH 8.0至约pH 8.5之间。另选地，适配体不被标记，但是在第一抗体与感兴趣的抗原结合后，随后与被标记的第二抗体接触。

各种酶-底物标记也可以与本公开所描述的组合物或方法结合使用。这种酶一般催化可以用各种技术测量的生色底物的化学变化。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，这可以用分光光度法测量。另选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记的示例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的示例包括，但是不限于，以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；以对硝基苯磷酸为显色底物的碱性磷酸酶；以及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。

适配体(一种或多种)可以连接到底物上，诸如平面底物。平面阵列一般包含阵列形式的生物分子的可寻址位置(例如，垫、地址或微位置)。阵列的大小将取决于阵列的组成和最终用途。阵列可以包含从2种至数千种不同的分子。一般而言，根据阵列的最终用途和制造方法，阵列包括2至多达100,000个或更多个分子。

在一些实施方案中，适配体文库中的每个适配体包括与包括5’-延伸区域的DNA适配体区域互补的单链DNA(Guard-DNA或G-DNA)。

在一些实施方案中，当AAV衣壳与适配体文库接触时，单链G-DNA分子被释放，结合试剂的鉴定包括：将步骤a)中获得的混合物与RNase H和与G-DNA互补的单链RNA接触，其中荧光团和淬灭剂分别被标记在单链RNA的5’端和3’端处；以及测量混合物的荧光强度；

在一些实施方案中，荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

任何合适的猝灭剂均可以用于本公开所描述的方法中。在一些实施方案中，猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。

在一些实施方案中，结合剂的鉴定是通过测序进行的。

在一些实施方案中，本公开所描述的方法包括鉴定靶标特异性的适配体特性。在一个实施方案中，针对AAV样品的适配体的池被选择，并且被与参照样品(例如，非AAV样品或不同的AAV样品)进行比较，可以使用常规测序技术对与AAV样品中的组分结合但不与参照样品中的组分(一种或多种)结合的亚组中的适配体进行测序，以鉴定结合的亚组，从而鉴定特定AAV样品的适配体特性。以这种方式，适配体特性提供了用于表征AAV样品中AAV衣壳的3D分子表面特征的个体化平台。此外，通过选择合适的参考或对照样品，适配体特性可以为AAV样品(例如，其包括AAV衣壳的群体)提供预测模型，以表征附加的测试AAV样品。

在一些实施方案中，适配体的池可包括任意数目的所期望的序列，例如，起始池中可存在至少10个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹个或至少10²⁰个寡核苷酸。可以重复步骤(a)-(c)以进一步磨练适配体的池。在一个实施方案中，这些步骤重复至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。

各种测序、扩增和杂交技术可用于鉴定洗脱的适配体。例如，当使用寡核苷酸的大池时，可以通过高通量方法诸如下一代测序或经由杂交进行寡核苷酸鉴定。在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序、液滴测序或单细胞测序。

在一些实施方案中，适配体文库中的适配体的靶标是已知的。在一些实施方案中，不必知道适配体文库中的适配体的精确靶标。

本公开所描述的方法中的AAV衣壳可以是任何合适的形式。在一些实施方案中，AAV衣壳在与适配体文库接触之前处于溶液中。在一些实施方案中，AAV衣壳在与适配体文库接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D特征。AAV样品的适配体结合特性可用作唯一的标志来鉴定AAV样品并且将其与其他AAV样品(一种或多种)区分开。在一些实施方案中，适配体结合特性包括针对一种特定AAV样品的结合适配体的序列(一种或多种)。在一些实施方案中，适配体结合特性包括针对一个特定AAV样品的每个结合的适配体的拷贝。在一些实施方案中，适配体结合特性中的一个或多个参数可用于鉴定AAV样品(例如，AAV衣壳的群体)。

在一些实施方案中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由本公开所描述的方法中约10个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹个或至少10²⁰个洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²⁰个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁵个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁰个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁵个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁴个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10³个经洗脱的适配体来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²个经洗脱的适配体来表征。

在一个方面中，本公开提供了用于检测和表征样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征并且适用于权利要求1的方法的DNA适配体文库，其包括1)DNA双链体，该DNA双链体由(a)DNA适配体文库和(b)单链DNA(G-DNA)组成，该DNA适配体文库包括AAV衣壳变体结合所需的序列和从靶标结合序列的5’端延伸的序列，该单链DNA(G-DNA)与包括5’延伸区域的DNA适配体区域互补；2)与G-DNA互补的单链RNA，用荧光团和淬灭剂标记；以及3)RNase H，并且其中单链RNA的长度不长于单链DNA的长度。

在一些实施方案中，荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

在一些实施方案中，猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。在一些实施方案中，猝灭剂是荧光团，在荧光共振能量转移(FRET)机制中充当荧光受体。在一些实施方案中，AAV衣壳变体颗粒是蛋白复合物，包括衣壳蛋白和DNA基因组序列。

在一个方面中，本公开提供了一种使用包括5’-延伸的DNA适配体检测AAV衣壳变体的3D分子表面特征的方法。一个与荧光团共价连接的寡核苷酸与5’-延伸同源，而另一个与淬灭剂共价连接的寡核苷酸与靶标结合结构域同源。在与靶标反应时，适配体解离并且生成信号。

在一些实施方案中，探针与AAV衣壳变体表面上的特定序列杂交。探针随后被切开或裂解，并且从靶标上解离下来。探针片段的解离允许对它们进行检测。在一些实施方案中，单链RNA探针用于删除靶标DNA序列。RNA酶H特异性降解RNA探针，与靶标DNA形成异源双链体。DNA可以结合另一个RNA探针，造成信号放大。

在一个方面中，本公开提供了一种检测AAV衣壳变体的3D分子表面特征的方法，该方法通过在样品中存在其他分子的情况下，放大当DNA适配体结合AAV衣壳变体的3D分子表面特征时生成的荧光信号。该方法包括以下步骤：1)形成由以下组成的DNA双链体：(a)包括靶标结合所需序列和从靶标结合序列的5’端延伸的序列的DNA适配体(5’Ex_适配体)，以及(b)与包括5’-延伸区域的DNA适配体区域互补的单链DNA(Guard-DNA或G-DNA)；2)将包含AAV衣壳变体颗粒的样品与步骤1)的DNA双链体混合，其中释放单链G-DNA分子；3)将步骤2)中获得的混合物与RNase H和与G-DNA互补的单链RNA(F-RNA-Q)混合，其中荧光团和淬灭剂分别被标记在单链RNA的5’端和3’端处；以及4)测量步骤3)中获得的混合物的荧光强度。

在一个方面中，本公开提供了用于检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征并且适用于本公开所提供的方法的文库。该文库包括：1)DNA双链体，该DNA双链体由(a)DNA适配体和(b)单链DNA(G-DNA)组成，该DNA适配体包括靶标结合所需的序列和从靶标结合序列的5’-端延伸的序列，该单链DNA(G-DNA)与包括5’-延伸区域的DNA适配体区域互补；2)与G-DNA互补的单链RNA，用荧光团和淬灭剂标记；以及3)RNase H，并且其中单链RNA的长度不长于单链DNA的长度。

在一些实施方案中，基于荧光强度测定的生物传感器用于测量样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征。

步骤1)的DNA适配体是在已建立的适配体(5’Ex_适配体)的5’端具有延伸序列的分子。该实施方案中的G-DNA是与包括5’-延伸区域的DNA适配体区域互补的单链DNA分子。所建立的适配体是结合AAV衣壳变体的3D分子表面特征的适配体。由DNA适配体和G-DNA组成的DNA双链体可以通过加热包含DNA适配体和G-DNA的水溶液并且在室温下缓慢冷却来形成。

步骤2)的AAV衣壳变体颗粒可以是蛋白复合物，包括衣壳蛋白和DNA基因组序列。

在一些实施方案中，步骤3)的F-RNA-Q是一种RNA序列，其具有附着于其5’端处的荧光团和附着于其3’端处的淬灭剂。在一些实施方案中，荧光团是常规荧光材料，诸如荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红。在优选的实施方案中，猝灭剂可以是常规的猝灭剂，诸如dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂。猝灭剂可以是在荧光共振能量转移(FRET)机制中作为荧光受体的另一种荧光团。相关领域的技术人员已知的任何更多的荧光团和荧光猝灭剂可用于本发明。

在一些实施方案中，该实施方案的RNase H是识别RNA/DNA双链并仅降解双链的RNA部分，但是不降解单链RNA的酶。在本公开中，RNase H用于降解F-RNA-Q/G-DNA双链的F-RNA-Q。

本公开中使用的DNA适配体、G-DNA、F-RNA-Q和RNase H可以是市售的。

在一些实施方案中，荧光强度可以通过相关领域技术人员已知的荧光计来测量，诸如三元多模检测器、Wal-lac/Victor荧光和Perkin-Elmer LB50B发光光谱仪。

本发明用于检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征的方法将在下文中更详细地解释。

在步骤2)中，在AAV衣壳变体的3D分子表面特征的存在下，部分双链结构的含5’端适配体的复合物优选形成蛋白-5’端适配体复合物；这造成单链G-DNA分子的释放。在步骤3)中，该实施方案的生物传感器系统包括单链RNA探针F-RNA-Q，其在5’端处附加有荧光团(F)。该荧光团的强度被3’-端的淬灭剂(Q)完全降低。然后形成RNA-DNA双链体，因为F-RNA-Q的序列与释放的G-DNA互补。RNA-DNA双链体(其中荧光被淬灭)被RNase H降解；这造成从淬灭剂中分离出含荧光团的RNA片段，并且用于生成荧光信号。如果样品中不存在AAV衣壳变体颗粒，则不会生成荧光信号，因为DNA适配体仍然与G-DNA结合，并且不能与F-RNA-Q形成RNA-DNA双链体。由于RNA酶H对F-RNA-Q的降解不会破坏G-DNA，因此可以与另一个F-RNA-Q分子进行双链体重组，RNA-DNA双链体形成的循环以及随后的RNA酶H消化产生了荧光信号放大的机制。

此外，本公开所描述的方法可用于定量分析AAV衣壳变体的3D分子表面特征，因为荧光信号的强度与AAV衣壳变体颗粒的量成比例增加。同时，如果F-RNA-Q比G-DNA长得多，则G-DNA和F-RNA-Q可以形成双链，从而即使当样品中不存在AAV衣壳变体颗粒时，也可以诱导RNase H的催化作用，生成假阳性信号。因此，单链RNA的长度不比G-DNA的长度长。当G-DNA的量高于DNA适配体的量时，与DNA适配体结合后剩余的过量G-DNA可以与F-RNA-Q结合，并且RNase H可以被激活以生成假阳性信号。

因此，在本发明的方法中，DNA适配体和G-DNA优选以相同的量使用。由于所公开的方法是在均相溶液中被执行的，因此与用附加的洗涤步骤执行的ELISA(酶联免疫吸附测定)相比，它更方便。

在一些实施方案中，由于DNA适配体对AAV衣壳变体颗粒的高选择性，除非样品中存在靶蛋白，否则不会发生荧光信号的扩增。在常规的化学计量检测方法中，AAV衣壳变体的3D分子表面特征的可检测量根据AAV衣壳变体颗粒与适配体的结合强度而变化。相反，即使当AAV衣壳变体颗粒的浓度低于AAV衣壳变体颗粒-适配体复合物的解离常数时，通过使用本发明的信号扩增方法也可以检测到非常少量的AAV衣壳变体的3D分子表面特征。通过RNA酶H对F-RNA-Q的降解循环获得荧光扩增，RNA酶H由结合AAV衣壳变体颗粒时从DNA适配体释放的少量G-DNA触发。例如，通过使用本发明，可以容易地检测浓度为10nM的凝血酶，该浓度远小于适配体-凝血酶复合物的解离常数(～100nM)。用本公开所描述的方法可以非常快速地检测AAV衣壳变体的3D分子表面特征。

本公开所描述的用于检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征的文库适用于本公开所提供的方法，并且特征性地包括：1)DNA双链体，该DNA双链体由(a)DNA适配体和(b)单链DNA组成，该DNA适配体包括靶标结合所需的序列和从靶标结合序列的5’端延伸的序列，该单链DNA与包括5’延伸区域的DNA适配体区域互补；2)与G-DNA互补的单链RNA，用荧光团和淬灭剂标记；以及3)RNase H，并且其中单链RNA的长度不长于单链DNA的长度。

AAV衣壳变体颗粒可以是蛋白复合物，包括衣壳蛋白和DNA基因组序列。

使用液滴和/或单细胞测序技术可以检测DNA适配体与任何AAV衣壳变体的相互作用。液滴和/或单细胞测序技术允许以很高的测序精度对单个AAV-适配体复合物进行大量测序。

利用DNA编码化学文库表征AAV衣壳的3D分子表面特征

DNA编码文库(DEL)是共价连接到DNA上的小分子的集合，具有关于每个文库成员的身份和结构的独特信息。小分子通常由较小构建嵌段的组合装配来制备，DEL允许针对感兴趣的蛋白靶标对数千亿个小分子化合物的快速和同时筛选。DEL用于药物研发项目，并且为生物特征的检测和表征提供工具。

如本公开所用，DECL指包括多种DNA编码的化学结合剂的文库。本领域普通技术人员可以理解，任何合适的小分子均可以用作DNA编码的化学结合剂来构建DNA编码的化学文库。例如，在PCT公开号WO 2009/077173 A2中公开了DECL结构的详细描述，其全部内容并入本公开。

在一个方面中，本公开提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：a)将AAV衣壳与DNA编码的化学文库(DECL)接触，该化学文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的化学结合剂的池；b)去除未结合的DNA编码的化学结合剂；c)洗脱结合的DNA编码的化学结合剂；d)鉴定与AAV衣壳结合的DNA编码的化学结合剂；e)确定所鉴定的DNA编码的化学结合剂的存在和/或水平；以及f)基于所鉴定的DNA编码的化学结合剂的存在和/或水平，表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，针对AAV样品的DECL富集(例如，接触、洗涤和洗脱步骤(步骤a-c))重复1次、2次、3次、4次、5次或更多次。

本公开所描述的方法可以在任何合适的溶液或缓冲液中被执行。在一些实施方案中，针对AAV样品的适配体文库的富集在DPBS缓冲液(例如，1.47mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、138mM NaCl、2.67mM KCl、0.5mM MgCl₂、0.9mM CaCl₂，pH7.4)中被执行。本领域普通技术人员将容易理解，任何其他合适的缓冲液和缓冲液中的试剂范围均可以用于本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，相对于AAV样品的DECL的富集在室温下被执行。本领域普通技术人员将容易理解，可以使用任何其他合适的温度来执行本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，经洗脱的DNA编码的化学结合剂的DNA条形码通过PCR反应扩增。在一些实施方案中，聚合酶链式反应(PCR)包括基于PCR的方法，诸如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)等，以及电场驱动聚合酶链式反应(ePCR)。

在一些实施方案中，DECL中的每种DNA编码的化学结合剂包括：a)能够与AAV衣壳上的一个或多个靶标结合的化合物；b)DNA条形码；以及c)连接体。

在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约40bp。在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约30bp。在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约20bp。在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的DNA条形码序列的长度为约或至少5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp或超过40bp。

在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的鉴定是通过DNA条形码序列的测序来进行的。在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序、液滴测序或单细胞测序。本公开所描述的和本领域已知的任何其他合适的测序技术可用于对条形码序列进行测序。

在一些实施方案中，DECL中的DNA编码的化学结合剂的靶标是已知的。在一些实施方案中，不必知道DECL文库中的DNA编码的化学结合剂的精确靶标。

本公开所描述的方法中的AAV衣壳可以是任何合适的形式。在一些实施方案中，AAV衣壳在与DECL接触之前处于溶液中。在一些实施方案中，AAV衣壳在与DECL接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D特征。AAV样品的DECL结合特性可用作唯一的标志来鉴定AAV样品并且将其与其他AAV样品(一种或多种)区分开。在一些实施方案中，DECL结合特性包括针对一个特定AAV样品的结合的DNA编码的化学结合剂的序列(一种或多种)。在一些实施方案中，DECL结合特性包括针对一种特定AAV样品的每种结合的DNA编码的化学结合剂的拷贝。在一些实施方案中，DECL结合特性中的一个或多个参数可用于鉴定AAV样品(例如，AAV衣壳的群体)。

任何合适的化合物均可以用于本公开所描述的DNA编码的化学结合剂。在一些实施方案中，化学化合物是小分子。在一些实施方案中，小分子能够结合AAV衣壳表面上的一个或多个靶标。

任何合适的连接体均可以用于本公开所描述的DECL。在一些实施方案中，连接体是可裂解的连接体。连接体可以是执行将化学部分有效连接到DNA部分的功能的任何部分。

连接体在结构和长度上可以变化，并且至少有两个特征：(1)与化合物的可操作链接和(2)与DNA部分的可操作链接。由于化学链接的性质是多种多样的，因此可以使用多种化学物质中的任何一种来实现对化合物和DNA条形码的所指示的可操作链接。就化学部分和DNA部分之间的长度而言，连接体部分的大小可以变化很大。在一些实施方案中，链接不超过足以提供所指示的链接功能的长度。因此，在一些实施方案中，连接体的链长为至少1至约20个原子。

典型的连接体可以是氨基修饰剂(诸如3’-氨基修饰剂C3、3’-氨基修饰剂C6 dC、3’-氨基修饰剂C6 dT、3’-氨基修饰剂C7、3'-PT-氨基修饰剂C3、3'-PT-氨基修饰剂C6、5’-氨基-dT-CE、5’-氨基修饰剂5、5’-氨基修饰剂C12、5’-氨基修饰剂C3、5’-氨基修饰剂C6、氨基修饰剂C2 dT、氨基修饰剂C6 dA、氨基修饰剂C6 dC、氨基修饰剂C6 dG、氨基修饰剂C6dT、氨基修饰剂C6-U、5’-氨基修饰剂C12)、硫醇修饰剂(例如3’-硫醇修饰剂C3 S-S₁ 5’-硫醇修饰剂C6、3’-C6-硫醇修饰剂S-S、3’-C6硫醇修饰剂、5’-C6硫醇修饰剂S-S、5’-C6硫醇修饰剂)、羧基修饰剂(例如3¹-羧酸盐光不稳定C6、5’-羧基修饰剂C10、羧基-dT)、或醛修饰剂(例如5’-醛修饰剂C2)。其他合适的连接体是本领域已知的。

组合小分子文库的DNA展示依赖于文库的多步、分裂和池合成，并且结合编码合成步骤和所用构建嵌段的DNA标签的酶促添加。典型地进行并且编码若干个(例如，3或4个)合成步骤，这些步骤包括多样性位置，例如通过将具有例如胺或羧酸盐官能团的构建嵌段偶联到化学支架上而形成的位置，该化学支架以确定的方向展示附着的构建嵌段。组合文库中常用的支架(一个或多个)的一个示例是三嗪部分，它可以在其环结构的三个位置上被正交衍生。

文库形成的过程可以是耗时的，产物通常纯化效率低，结果是可以发生未知的反应，创建不希望的和/或未知的分子附着于DNA上。从文库中筛选和测序命中结果的最终结果是必须采用大规模平行测序，因为两种DNA都有固有的“噪音”，它们附着于非预期的分子上(例如，未反应的或副产物)或被错误标记的分子上。

在一些实施方案中，构建小分子文库的起始寡核苷酸包含共价闭合的双链寡核苷酸形式的用于聚合酶扩增(例如，PCR)的引物结合区域。

组合化学，例如，涉及拆分和混合化学，可用于合成大量的化合物。以这种方式制备的化合物可用于药物化学领域，在该领域中，可以对化合物的各种生物化学活性进行筛选。这些活性包括与一种或多种蛋白结合，其中蛋白在进行筛选测试时是已知的。另选地，只有在检测到结合事件后，才能鉴定被测试化合物结合的蛋白。

构建DECL的详细方法在例如PCT公开号WO 2009/077173 A2中公开，其全部内容并入本公开。

在一个方面中，本公开提供了产生用于检测和表征AAV衣壳的3D分子表面特征的DNA编码的化学文库的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)使双功能连接体的第一官能团与第一化学构建嵌段反应，其中双功能连接体具有与化学构建嵌段反应的单个官能团和与核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物反应的单个官能团；b)使双功能连接体的第二官能团与单链发夹寡核苷酸反应，该发夹寡核苷酸包括(i)自身互补区和(ii)包括至少一种天然核苷或核苷类似物的单链环，从而形成缀合物；c)在适于在缀合物的第一化学结构单元和第二化学结构单元之间形成共价键的条件下，使第二化学结构单元与缀合物的第一化学结构单元反应；以及d)将第一寡核苷酸标签连接到缀合物的单链发夹寡核苷酸上，其中寡核苷酸标签包括编码第一化学构建嵌段的身份和/或第二化学构建嵌段的身份的区域，从而形成DNA编码的化学实体，其中步骤(a)和(b)和/或步骤(c)和(d)可以按任何顺序被执行。

在一些实施方案中，步骤(d)的连接包括非酶连接。

在一些实施方案中，步骤(d)的寡核苷酸标签包括荧光标签或生物素标记。

在一些实施方案中，步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括编码第一构建嵌段身份的区域。在一些实施方案中，步骤(b)的单链发夹寡核苷酸和/或步骤(d)的寡核苷酸标签被修饰以增加DNA编码的化学结合剂在有机条件下的溶解度。在一些实施方案中，发夹寡核苷酸的单链环包括可作为扩增的引物结合区域的序列。在一些实施方案中，步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括T或C核苷酸，其在C5位置处包括脂肪链。在一些实施方案中，步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括偶氮苯。

在一些实施方案中，双功能连接体被修饰以增加DNA编码的化学结合剂在有机条件下的溶解度。在一些实施方案中，双功能连接体包括一个或多个烷基链、聚乙二醇单元、带正电荷的分支物质或疏水环结构。在一些实施方案中，双功能连接体包括约10至约50个聚乙二醇单元。在一些实施方案中，双功能连接体包括约12至约45个聚乙二醇单元。

在一些实施方案中，步骤(d)的寡核苷酸标签包括编码第一化学构建嵌段身份的区域。在一些实施方案中，步骤(d)的寡核苷酸标签包括编码第二化学构建嵌段身份的区域。

在一些实施方案中，步骤(c)的合适条件包括有机溶剂。

在一些实施方案中，双功能连接体附着于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的5’端处；双功能连接体包埋在步骤(b)的单链发夹寡核苷酸中；或者双功能连接体位于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的中间。

在一些实施方案中，双功能连接体附着于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的5’端。在一些实施方案中，双功能连接体被包埋在步骤(b)的单链发夹寡核苷酸中。在一些实施方案中，双功能连接体位于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的中间。

在一些实施方案中，步骤(d)的寡核苷酸标签包括在C5位置包括脂肪链的T或C核苷酸。

在一些实施方案中，该方法还包括将编码第二化学构建嵌段身份的第二寡核苷酸标签连接到第一寡核苷酸标签上。

在一些实施方案中，该方法还包括：(e)使第三化学结构单元与第一化学结构单元或第二化学结构单元反应。在一些实施方案中，该方法还包括：(f)将第三寡核苷酸标签连接到第二寡核苷酸标签上，其中第三寡核苷酸标签编码第三化学构建嵌段的身份，其中步骤(e)和(f)可以按任何顺序被执行。

在一些实施方案中，该方法还包括：(e)使一种或多种附加的化学结构单元与缀合物的化学结构单元反应。在一些实施方案中，方法还包括：(f)将一个或多个寡核苷酸标签连接到缀合物的寡核苷酸标签上，其中每个寡核苷酸标签编码一个或多个附加构建嵌段中的一个的身份，其中步骤(e)和(f)可以按任何顺序被执行。

在一些实施方案中，该方法产生多种DNA编码的化学结合剂。

本公开所描述的DNA编码的化学结合剂的池可以包括任何合适数目的DNA编码的化学结合剂。在一些实施方案中，DNA编码的化学结合剂的池包括至少10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种、至少10²⁰种或更多种不同的DNA编码的化学结合剂。

在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一种或多种3D分子表面特征由约10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种或至少10²⁰种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²⁰种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁵种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁰种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁵种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁴种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10³种DNA编码的化学结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²种DNA编码的化学结合剂来表征。

使用DNA编码抗体文库(DEAL)表征AAV衣壳的3D分子表面特征

基于抗体的反应广泛用于疾病诊断。例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹和间接荧光抗体试验对于鉴定单一靶蛋白非常有用。对多种抗体的存在进行快速和同时的样品筛选在研究和临床应用中均是有益的。聚合酶链式反应(PCR)和其他形式的靶标扩增使得用于检测和定量感兴趣的DNA靶标的强大工具的开发取得了快速进展。蛋白的可比靶标扩增方法的发展可以显著改善检测和定量靶标诸如AAV衣壳的方法。

在一个方面中，本公开提供了表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：a)将AAV衣壳与DNA编码的抗体文库(DEAL)接触，该抗体文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的抗体结合剂的池；b)去除未结合的DNA编码的抗体结合剂；c)洗脱结合的DNA编码的抗体结合剂；d)鉴定与AAV衣壳结合的DNA编码的抗体结合剂；e)确定所鉴定的DNA编码的抗体结合剂的存在和/或水平；以及f)基于所鉴定的DNA编码的抗体结合剂的存在和/或水平，表征AAV衣壳的3D分子表面特征。

在一些实施方案中，针对AAV样品的DEAL富集(即接触、洗涤和洗脱步骤(步骤a-c))重复1次、2次、3次、4次、5次或更多次。

本公开所描述的方法可以在任何合适的溶液或缓冲液中被执行。在一些实施方案中，针对AAV样品的适配体文库的富集在DPBS缓冲液(例如，1.47mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、138mM NaCl、2.67mM KCl、0.5mM MgCl₂、0.9mM CaCl₂，pH7.4)中被执行。本领域普通技术人员将容易理解，任何其他合适的缓冲液和缓冲液中的试剂范围均可以用于本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，针对AAV样品的DEAL富集在室温下被执行。本领域普通技术人员将容易理解，可以使用任何其他合适的温度来执行本公开所描述的方法。

在一些实施方案中，DEAL中的每种DNA编码的抗体结合剂包括：a)能够结合AAV衣壳上的一个或多个靶标的抗体或其抗原结合片段；b)DNA条形码；以及c)连接体。

在一些实施方案中，洗脱的DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码通过PCR反应扩增。在一些实施方案中，聚合酶链式反应(PCR)包括基于PCR的方法，诸如实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)等，以及电场驱动聚合酶链式反应(ePCR)。

在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约40bp。在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约30bp。在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列为约5bp至约20bp。在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的DNA条形码序列的长度为约5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp或更长。

在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的鉴定是通过DNA条形码序列的测序来进行的。在一些实施方案中，测序包括执行高通量测序、液滴测序或单细胞测序。本公开所描述的和本领域已知的任何其他合适的测序技术可用于对条形码序列进行测序。

在一些实施方案中，DEAL中的DNA编码的抗体结合剂的靶标是已知的。在一些实施方案中，不必知道DEAL文库中的DNA编码的抗体结合剂的精确靶标。

本公开所描述的方法中的AAV衣壳可以是任何合适的形式。在一些实施方案中，AAV衣壳在与DEAL接触之前处于溶液中。在一些实施方案中，AAV衣壳在与DEAL接触之前被固定在支持物上。

在一些实施方案中，该方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D特征。AAV样品的DEAL结合特性可用作唯一的标志，以鉴定AAV样品并且将其与其他AAV样品(一种或多种)区分开。在一些实施方案中，DEAL结合特性包括针对一种特定AAV样品的结合的DNA编码的抗体结合剂的序列(一种或多种)。在一些实施方案中，DEAL结合特性包括针对一个特定AAV样品的每种结合的DNA编码的抗体结合剂的拷贝。在一些实施方案中，DEAL结合特性中的一个或多个参数可用于鉴定AAV样品(例如，AAV衣壳的群体)。

本公开所描述的DNA编码的抗体结合试剂的池可以包括任何合适数目的DNA编码的抗体结合试剂。在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂的池包括至少10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种、至少10²⁰种或更多种不同的DNA编码的抗体结合剂。

在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一种或多种3D分子表面特征由约或至少10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种或10²⁰种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²⁰种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁵种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10¹⁰种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁵种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10⁴种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10³种DNA编码的抗体结合剂来表征。在一些实施方案中，在本公开所描述的方法中，AAV衣壳的一个或多个3D分子表面特征由约10至约10²种DNA编码的抗体结合剂来表征。

本公开所描述的任何合适的连接体可用于本公开所描述的DEAL中。在一些实施方案中，连接体是可裂解的连接体。连接体可以是执行将抗体或其抗原结合片段可操作地连接到DNA条形码的功能的任何部分。

连接体在结构和长度上可以变化，并且具有至少两个特征：(1)与抗体或其抗原结合片段的可操作链接，以及(2)与DNA条形码的可操作链接。由于化学链接的性质是多种多样的，因此可以使用多种化学物质中的任何一种来实现对化合物和DNA条形码的所指示的可操作链接。就抗体或抗原结合片段与DNA条形码之间的长度而言，连接体部分的大小可以变化很大。在一些实施方案中，链接不超过足以提供所指示的链接功能的长度。因此，在一些实施方案中，连接体的链长为至少1至约20个原子。

术语“抗体”在本公开中用于指具有抗原结合区域的任何抗体样分子，并且该术语包括抗体片段，该抗体片段包括抗原结合结构域，诸如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DAB或VHH)、TandAbs二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段、双抗体、三抗体(分别为scFv-Fab融合体、双特异性或三特异性抗体)；sc-双抗体；κ(λ)体(scFv-CL融合体)；DVD-Ig(双可变域抗体，双特异性形式)；SIP(小免疫蛋白，一种微型抗体)；SMIP(“小模块免疫药物”scFv-Fc二聚体；DART(ds-稳定的双抗体“双重靶向”)；包括一个或多个CDR等的小抗体模拟物。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域众所周知的。

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。为了制备可用于本发明的单克隆抗体，以合适的时间间隔(例如，每周两次、每周两次、每月两次或每月一次)用感兴趣的抗原形式免疫小鼠或其他合适的宿主动物。动物可在处死后一周内接受最后一次抗原“加强”。在免疫过程中经常需要使用免疫佐剂。合适的免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、Ribi佐剂、Hunter’s titer max、皂苷佐剂诸如QS21或Quil A，或含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其他合适的佐剂是本领域众所周知的。动物可以通过皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、鼻内或其他途径免疫。特定的动物可以通过多种途径用多种形式的抗原进行免疫。简而言之，感兴趣的重组抗原可以通过用重组细胞系表达来提供。感兴趣的抗原可以按在其表面表达感兴趣的抗原的人类细胞的形式提供。感兴趣的抗原的重组形式可以使用任何先前描述的方法来提供。在免疫方案之后，从动物的脾脏、淋巴结或其他器官中分离淋巴细胞，并且使用诸如聚乙二醇的试剂将其与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。如(Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice:Production and Application ofMonoclonal Antibodies in Cell Biology,Biochemistry and Immunology,3rdedition,Academic Press,New York,1996(编码，单克隆抗体：原理与实践：单克隆抗体在细胞生物学、生物化学和免疫学中的生产和应用，第3版，学术出版社，纽约，1996年))所述的，融合后，使用标准方法将细胞置于允许杂交瘤生长但不允许融合配偶体生长的培养基中。培养杂交瘤后，分析细胞上清液中是否存在所期望的特异性的抗体，即选择性结合抗原的抗体。合适的分析技术包括ELISA、流式细胞术、免疫沉淀和蛋白印迹。其他筛选技术是本领域众所周知的。优选的技术是那些确认抗体与构象完整、天然折叠的抗原结合的技术，例如非变性ELISA、流式细胞术和免疫沉淀。

重要的是，如本领域众所周知的，抗体分子中只有一小部分，即抗原决定簇，参与抗体与其抗原决定簇的结合(一般而言参见Clark,W.R.(1986)The ExperimentalFoundations of Modern Immunology Wiley&Sons,Inc.,New York；Roitt,I.(1991)Essential Immunology,7th Ed.,Blackwell Scientific Publications,Oxford)。例如，Fc’和Fc区域是补体级联反应的效应器，但是不参与抗原结合。pFc’区被酶切掉的抗体，或没有pFc’区的抗体，称为F(ab’)2片段，保留了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，Fc区被酶切掉的抗体，或产生的没有Fc区的抗体，称为Fab片段，保留了完整抗体分子的一个抗原结合位点。另外而言，Fab片段由共价结合的抗体轻链和抗体重链的一部分组成，称为Fd。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(在不改变抗体特异性的情况下，单个Fd片段可以与多达10个不同的轻链相关联)，并且Fd片段在分离时保留表位结合能力。

因此，在一些实施方案中，本公开所描述的方法中的抗体或其抗原结合片段指F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段。使用常规技术确实可以将抗体片段化。例如，F(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体来生成。可以处理所得的F(ab’)2片段以还原二硫键，从而产生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可造成Fab片段的形成。Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚体、小抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术合成或化学合成。用于产生抗体片段的技术是众所周知的，并且在本领域中有所描述。例如，Beckman等人，2006年；Holliger&Hudson，2005年；Le Gall等人，2004年；Reff&Heard，2001年；Reiter等人，1996年；以及Young等人，1995中的每一项还描述并且使能了有效的抗体片段的产生。各种抗体分子和片段可以来源于任何公知的免疫球蛋白类别，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也为本领域技术人员所熟知，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

本公开所描述的抗体或其抗原结合片段还包括所谓的单链抗体。术语“单结构域抗体”(sdAb)或“VHH”是指在天然缺乏轻链的骆驼科哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变结构域。这种VHH也被称为根据本发明，sdAb尤其可以是骆马sdAb。

在一些实施方案中，抗体是靶向一种或多种AAV衣壳蛋白(一种或多种)或其片段的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是中和抗体或其片段。

本公开所描述的抗体或其抗原结合片段可以靶向蛋白靶标、碳水化合物靶标或糖基化蛋白。例如，抗体可以靶向AAV衣壳蛋白的糖基化基团。

在一些实施方案中，DNA编码的抗体结合剂也被称为缀合抗体或“DNAb”

本公开还涉及与至少一种核酸分子(例如，DNA条形码)缀合的抗体及其在表征AAV衣壳的3D分子表面特征中的用途。具体而言，本公开涉及利用DNA条形码检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征的抗体(命名为DNAbs)。所要求保护的方法至少部分基于抗体的识别能力，并且依赖于这样的一般思想，即每种所述抗体可以与不同的寡核苷酸DNA条形码相关联，从而允许揭示和定量样品中的多个AAV衣壳。

因此，在一个方面中，本公开涉及与连接体(例如，至少一种核酸分子，该核酸分子包括酶可裂解序列(CL))和DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n缀合的抗体，其中N表示核苷酸，N是大于4的整数。

在一个实施方案中，抗体或抗体组合能够区分活性形式或非活性形式的AAV颗粒。因此，这种抗体的使用可能与确定所述AAV变体是否被激活特别相关。因此，DNAb可用作传感器，并且可用于筛选AAV变异体的感染性。

利用噬菌体展示文库表征AAV衣壳的3D分子表面特征

最初开发在噬菌体表面表达转基因肽的噬菌体展示文库是为了映射免疫球蛋白的表位结合位点。这类文库可以通过将随机寡核苷酸插入编码噬菌体表面蛋白的cDNAs中来生成，从而生成展示具有排列的独特肽的噬菌体颗粒集合。

除了鉴定对器官、组织或细胞类型具有选择性的单个靶向肽，该系统还被用于鉴定在小鼠体内表达的内皮细胞表面标记。在小鼠模型系统中，治疗剂与靶向肽的附着造成治疗剂选择性递送至所期望的器官、组织或细胞类型。将化疗药物和促凋亡肽靶向递送至位于肿瘤血管生成性脉管系统中的受体，造成荷瘤小鼠模型中治疗性效果的显著增加和全身毒性的降低。

先前用于噬菌体展示筛选的体内方法造成相对高的非特异性噬菌体结合背景。对于属于网状内皮系统的组织尤其如此。存在对改进的噬菌体展示方法的需求，以减少非特异性噬菌体结合，同时保留靶向肽和细胞受体之间的特异性相互作用。还需要将器官、组织或细胞类型中特定细胞群的受体作为靶标。在许多情况下，组织或器官可以包含不同细胞类型的高度异源群体。需要能够将噬菌体展示筛选靶向特定细胞群体。

鉴定以前未知的受体和以前未表征的配体是一个非常缓慢和费力的过程。这种新的受体和配体可以为使用噬菌体展示的基于亲和力的表面作图的新方法提供基础。

因此，在一个方面中，本公开提供了包括多个病毒颗粒的病毒颗粒文库，所述病毒颗粒在其表面展示多个不同的融合蛋白，其中每个融合蛋白包括蛋白III或蛋白VIII丝状噬菌体外壳蛋白和异源多肽的至少一部分，其中所述异源多肽融合到所述丝状噬菌体外壳蛋白的羧基末端。

所要求保护的文库和方法通过提供用于鉴定和使用对AAV衣壳变体的3D表面具有选择性的靶向肽的组合物和方法，解决了本领域的长期需求。在一些实施方案中，所述方法涉及选择性相互作用配体的生物筛选和快速分析(BRASIL)，一种用于噬菌体展示的新方法，其造成非特异性噬菌体结合的背景降低，同时保留噬菌体与AAV衣壳变体的3D表面的选择性结合。在一些实施方案中，通过将受试者暴露于噬菌体展示文库，收集一种或多种AAV衣壳变体文库的样品，将样品分离成悬浮在水相中的分离的AAV颗粒和噬菌体，将水相在有机相上分层，将两相离心，使得AAV-噬菌体复合物在离心管的底部沉淀，并且从沉淀中收集AAV-噬菌体复合物，来鉴定靶向肽。在一些实施方案中，有机相是邻苯二甲酸二丁酯。

在一些实施方案中，结合特定AAV衣壳变体的噬菌体可以针对纯化的特定AAV衣壳变体(纯度可以达到接近100％)进行预筛选或后筛选。可以对与纯化的特异性AAV衣壳变体结合的噬菌体进行测序，并且将其用作鉴定该特异性AAV衣壳变体的组合DNA标志。

在一些实施方案中，在混合和孵育后，可以使用液滴和/或单细胞测序技术从一种或多种AAV衣壳变体文库中回收靶向噬菌体。液滴和/或单细胞测序技术允许以很高的测序精度对单个AAV-噬菌体复合物进行大量测序。

在一些实施方案中，制备展示来自文库的AAV衣壳变体的3D表面的抗原结合部分的噬菌体展示文库，针对AAV衣壳变体的一个或一个以上3D表面筛选所述文库，并且收集结合抗原的噬菌体。在更优选的实施方案中，抗原是来自AAV衣壳变体3D表面的3D肽组合。

在一些实施方案中，所述方法和组合物可一用于鉴定AAV衣壳变体的3D表面的一种或多种3D表面抗原。在一些实施方案中，所述组合物和方法可以用于鉴定已知或新所鉴定的AAV衣壳变体的3D表面的天然存在的3D表面抗原。

在一些实施方案中，该方法可以包括接触部分AAV衣壳，其是AAV衣壳变体文库的一部分。在备选实施方案中，靶向肽可以包含随机氨基酸序列。

技术人员应认识到，接触步骤可以利用完整和完全的AAV衣壳变体，或者可以选择性地利用部分完整的AAV衣壳变体。在一些实施方案中，待接触的AAV颗粒可以被遗传工程化以表达靶向肽的重组肽。在一些实施方案中，靶向肽用反应性部分修饰，这允许其共价附着于AAV衣壳变体的3D表面。在一些实施方案中，反应性部分是光反应性基团，当被光激活时，该光反应性基团与受体共价附着。在一些实施方案中，肽附着于固体支持物，受体通过亲和层析纯化。在一些实施方案中，固体支持物包括磁珠、琼脂糖珠、琼脂糖珠、硝酸纤维素膜、尼龙膜、柱色谱基质、高效液相色谱(HPLC)基质或快速高效液相色谱(HPLC)基质。本领域技术人员将认识到，AAV衣壳变体的活性可以通过本领域已知的多种方法来测定，包括但不限于催化活性、结合活性和TCID50测定法。

在一些实施方案中，可以通过公开的方法和组合物鉴定一种或多种感兴趣的AAV衣壳变体。可以通过噬菌体展示和体内或体外生物淘选来鉴定模拟了AAV衣壳变体的天然存在的3D表面的部分或全部的一种或多种靶向肽。

在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征指示了AAV的向性特性和/或中和特性(例如，逃避中和抗体的能力)。

富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的文库的方法

本公开还提供了富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的结合文库的方法，包括：(a)将结合试剂的池与AAV衣壳的第一群体接触；(b)富集与AAV衣壳的第一群体结合的结合剂的子池，从而富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的结合文库。

在一些实施方案中，该方法还包括：(c)将结合AAV衣壳的第一群体的结合剂的子池与AAV衣壳的第二群体接触；以及(d)耗尽对AAV衣壳的第二群体显示亲和力的适配体的第二子池，从而选择对AAV衣壳的群体具有优先亲和力的结合剂的群组。

在一些实施方案中，阳性和阴性选择重复约或至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或更多次。

本公开所描述的结合剂的池可以包括任何合适数目的结合剂。在一些实施方案中，结合剂的池包括至少10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种、至少10²⁰种或更多种结合剂。

本公开所描述的结合剂的子池可以包括任何合适数目的结合剂。在一些实施方案中，结合剂的子池包括至少10种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10¹⁶种、10¹⁷种、10¹⁸种、10¹⁹种、至少10²⁰种或更多种结合剂。

本公开所描述的第一和/或AAV衣壳的第二群体可以包括任何合适数目的AAV衣壳。在一些实施方案中，第一和/或第二AAV衣壳的群体包括至少10个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹、至少10²⁰个或更多个AAV衣壳。

使用本公开所描述的方法可以富集本公开所描述的或本领域已知的任何合适的结合文库。在一些实施方案中，结合试剂的文库是适配体文库、DNA编码的化学文库(DECL)、噬菌体展示文库或DNA编码的抗体文库(DEAL)。

在一些实施方案中，第一和/或第二AAV衣壳的群体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12和AAV13中的一种或多种或其组合。在一些实施方案中，第一和/或第二AAV衣壳的群体包括源自突变、肽插入或改组的其他变体。

在一些实施方案中，3D分子表面特征是文库的结合特性。在一些实施方案中，结合特性是所结合的结合试剂的数目、序列和拷贝数。

在一些实施方案中，AAV衣壳的3D分子表面特征指示了向性特性和/或中和特性(例如，逃避中和抗体的能力)。

本公开还提供了包括本公开所描述的富集结合文库的试剂盒。本公开还提供了用于进行本公开所述结合文库的富集的试剂盒。本公开还提供了用于对本公开所述AAV衣壳的3D分子表面特征进行表征的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种缓冲液、引物、探针、荧光团、淬灭剂、适配体、DNA编码的化学结合剂、DNA编码的抗体结合剂和AAV样品。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于实施本公开所描述的方法的手册。

实施例

在以下实施例中还描述了本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1：使用适配体文库映射AAV衣壳的3D特征

材料和方法

在以下实施例中使用了以下材料和方法。

DPBS缓冲液(1.47mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、138mM NaCl、2.67mM KCl、0.5mM MgCl₂、0.9mM CaCl₂，pH7.4)被用于适配体文库筛选。筛选在室温下被执行。

线性适配体文库中的表示性适配体如图1A所示。圆形适配体文库中的表示性适配体如图1B所示。

适配体文库的富集通过以下步骤进行：

第1周：圆形适配体文库针对AAV Mix 01被富集。富集进行三轮，分别获得池-1、池-2和池-3。

第一轮：

a)将5OD文库溶解在450μL的DPBS缓冲液中。在PCR机器中执行复性；

b)通过Amicon(100kDa)系统过滤经复性的文库；

c)将过滤的液体转移到2mL Eppendorf管中，并且加入50μLAAV混合物(适配体和病毒颗粒的比例≥10:1)，在室温下在振荡器中孵育1小时；

d)孵育后，通过Amicon系统过滤混合物；

e)用450μL DPBS缓冲液洗涤AAV-适配体复合物三次(洗涤1、洗涤2、洗涤3)；

f)用200μL DPBS重悬AAV-适配体复合物，并且收集在1.5mL离心管中；

g)在沸水浴中加热10分钟(洗脱)；

h)通过电场驱动的聚合酶链式反应(ePCR)扩增洗脱产物8-12个循环，通过SDS-PAGE电泳和透析获得单链文库池-1；

i)池-1的浓度在OD260下测定。

第二轮和第三轮富集的步骤与第一轮相同，每轮使用0.1OD适配体。对所得的池-2和池-3进行测序。适配体文库的筛选和富集如图2A所示。

第2周：圆形适配体文库针对AAV Mix 02被富集。富集进行三轮，分别获得池-4、池-5和池-6。第一轮、第二轮和第三轮富集的步骤与第一周富集的步骤相同。适配体文库的筛选和富集如图2B所示。

第3周：线性适配体文库针对AAV Mix 01被富集。富集进行三轮，分别获得池-7、池-8和池-9。第一轮、第二轮和第三轮富集的步骤与第一周富集的步骤相同。

第4周：线性适配体文库针对AAV Mix 02被富集。富集进行三轮，分别获得池-10、池-11和池-12。第一轮、第二轮和第三轮富集的步骤与第一周富集的步骤相同。

AAV Mix 01和AAV Mix 02中的样品如表1所示。

表1.AAV Mix 01和AAV Mix 02中的样品

样品ID

病毒1

病毒2

病毒3

病毒4

病毒5

病毒6

AAV Mix 01

AAV1

--

--

--

--

--

AAV Mix 02

--

AAV2

AAV3

AAV4

AAV5

AAV6

样品ID

病毒7

病毒8

病毒9

病毒10

病毒11

病毒12

AAV Mix 01

--

--

AAV9

AAV-rh10

AAV-PHP.eB

--

AAV Mix 02

AAV7

AAV8

--

--

--

AAV2.7m8

筛选和富集文库的细节还被显示在表2中。

表2.适配体文库的筛选和富集

表3.富集的适配体文库

下面是用于每个富集池测序的DNA引物序列。例如，LibP1S021是标记为池01-1的样品的正向测序引物(见上表3)；LibP1S025是空白对照样品的引物序列。

LibP1样品

LibP1S021 ATATCATTCAGCACTCCACGCATAGC池1序列引物

LibP1S022 ATCTCCTTCAGCACTCCACGCATAGC池2序列引物

LibP1S023 ATGTCGTTCAGCACTCCACGCATAGC池4序列引物

LibP1S024 ATTTCTTTCAGCACTCCACGCATAGC池5序列引物

LibP1S025 CAATGATTCAGCACTCCACGCATAGC Mix1序列引物

LibTOR样品

LibTORS021 ATATCACCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT池7序列引物

LibTORS022 ATCTCCCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT池8序列引物

LibTORS023 ATGTCGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT池10序列引物

LibTORS024 ATTTCTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT池11序列引物

LibTORS025 CAATGACCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATMix2序列引物

相同适配体文库针对两种不同AAV样品的富集

图6显示了相同圆形适配体文库的针对两种不同AAV样品(AAV Mix 01和AAV Mix02)的富集结果，以及两种样品的富集文库之间共有适配体序列的分布。显示了两轮富集的结果，并且在两个平行实验中重复富集。

具体而言，在第一个平行实验中，在任一轮富集中，有161个富集的适配体的计数大于50。在第二个平行实验中，在任一轮富集中，有172个富集的适配体的计数大于50。这些结果显示了适配体文库的富集的良好重复性。

对于针对AAV Mix 01的圆形适配体文库的富集，在第一平行实验中有80个适配体在第二轮富集后被富集，并且在第二平行实验中有86个适配体在第二轮富集后被富集，指示富集的良好重复性。

对于针对AAV Mix 02的圆形适配体文库的富集，在第一平行实验中有69个适配体在第二轮富集后被富集，并且在第二平行实验中有73个适配体在第二轮富集后被富集，指示富集的良好重复性。

对两种不同的AAV样品(AAV Mix 01和AAV Mix 02)进行相同线性适配体文库的富集，并且再次分析这两种样品的富集文库之间共有适配体序列的分布。显示了两轮富集的结果，并且在两个平行实验中重复富集。

具体而言，在第一个平行实验中，在任一轮富集中，有49个富集的适配体的计数大于50。在第二个平行实验中，在任一轮富集中，有49个富集的适配体的计数大于50。这些结果显示了适配体文库的富集的良好重复性。

对于针对AAV Mix 01的线性适配体文库的富集，在第一平行实验中有45个适配体在第二轮富集后被富集，并且在第二平行实验中有41个适配体在第二轮富集后被富集，指示富集的良好重复性。

对于针对AAV Mix 02的线性适配体文库的富集，在第一平行实验中有45个适配体在第二轮富集后被富集，并且在第二平行实验中有40个适配体在第二轮富集后被富集，指示富集的良好重复性。

总之，针对两种不同AAV样品的富集适配体文库之间的共享适配体序列的数目在多次平行实验中保持相对恒定，指示AAV样品特异性适配体文库的富集是可重复的和有效的。

接下来，针对两种不同的AAV样品，分析富集的适配体文库之间的共享适配体序列的计数，以确定它们区分两种AAV样品的能力。

如图7A-7B所示，每个富集的适配体文库中共享圆形适配体序列的计数显著不同(第一轮和第二轮的p值分别为9.9×10^-12和3.8×10^-12)。

如图7C-7D所示，每个富集的适配体文库中共享的线性适配体序列的计数显著不同(第一轮和第二轮的p值分别为0.02和0.01)。

数据质量分析

评估富集的适配体文库的质量，并且结果被显示在表4中。具体而言，计算长度在36-45bp范围之外的适配体序列的百分比。

表4.富集的适配体文库的质量

	第一轮	第二轮
			环状文库	0.039	0.06
线性文库	0.048	0.091

对于富集的适配体，对每个富集的圆形和线性文库映射计数和对应于计数的序列数的分布。图8A-8B分别显示了第一轮和第二轮富集的富集的圆形文库的分布。图9A-9B分别显示了第一轮和第二轮富集的富集线性文库的分布。基于这些数据，用于另外分析的富集适配体的计数的临界值50是合理的。

实施例2：使用DNA编码文库(DEL)映射AAV衣壳的3D映射图材料和方法

在以下实施例中使用了以下材料和方法。图10-13显示了本公开所述DECL文库的富集的示意图示。

DPBS缓冲液(1.47mM KH₂PO₄、8mM Na₂HPO₄、138mM NaCl、2.67mM KCl、0.5mM MgCl₂、0.9mM CaCl₂，pH7.4)用于针对AAV靶标的适配体文库筛选和富集。筛选在室温下被执行。

具体而言，将一管DEL文库(3.23nmol/管)以12000rpm离心10分钟，并且溶解在150μL DPBS中。溶解的DEL文库在4℃溶解过夜。

四个AAV样品用于富集：野生型AAV2、具有单点突变的AAV2突变体AAV2.7m8、野生型AAV9和具有单点突变的AAV9突变体AAV-PHP.eB。每个样品使用两个试管(每个试管50μL)，并且每个样品获得100μL。

13个离心管(每个2mL)被标记为管1-13。向每个试管中加入460μL DPBS和10μLDEL文库。如表5所示，向每个试管中加入30升AAV样品。

表5.用于富集DEL文库的AAV样品

将每个独立组中的500μL液体加入100kDa Amicon Ultra-0.5系统并过滤，以14000g离心5分钟。离心后，向每个试管中加入450μL DPBS并轻轻混合。混合物孵育30分钟，然后以14000g离心5分钟。该洗涤步骤重复两次，使得每个样品总共洗涤三次。

洗涤步骤后，收集每个超速离心管中约30μL的AAV-DEL混合物用于PCR扩增。从试剂盒中取出正向引物(引物F)(4nmol/管)和反向引物(引物R)(4nmol/管)，以12000rpm离心10分钟，并且加入到400μL ddH₂O中溶解。获得10μM的每种引物。

在上述步骤中获得的AAV-DEL混合物用作PCR扩增的模板。PCR反应如表6所示。

表6.AAV-DEL混合物的PCR扩增

PCR扩增条件如表7所示。

表7.PCR扩增条件

使用QIAGEN-MinElute试剂盒(QIAGEN，28006)纯化PCR产物。从每个反应中获得10升纯化产物。这些试管被标记为独立的组1-13。

DEL试剂盒的包装清单如图14所示。QIAGEN-MinElute试剂盒的方案如下所示：

MinElute PCR纯化试剂盒(cot.编号28004和28006)可在室温15-25℃下储存长达12个月，除非标签上另有说明。到达后，将旋转柱储存在2-8℃的环境中。

开始前的注意事项：

·该方案适用于最多5μg PCR产物(70bp至4kb)的纯化。

·使用前，添加乙醇(96-100％)来缓冲PE浓缩物(体积见瓶标)。

·所有离心步骤均是在室温(15-25℃)下，在常规台式微量离心机中以17,900x g(13,000rpm)的速度进行的。

·向缓冲液PB中加入1:250体积的pH指示剂I。将pH指示剂I添加到整个缓冲液内容物中。不要向缓冲液等分试样中添加pH指示剂I。带有pH指示剂I的缓冲液PB的黄色指示pH值为5,7.5。只有在pH值为5,7.5时，膜对DNA的吸附才是有效的。

注意：如果纯化的PCR产物用于敏感的微阵列应用，使用缓冲液PB而不添加pH指示剂I可以是有益的。

下表8显示了纯化前后PCR产物的质量检查。

表8.纯化前后的PCR产物质量

针对AAV的样品富集的DEL文库。

在该实验中，使用了四组AAV样品：野生型AAV2、具有单点突变的AAV2突变体AAV2.7m8、野生型AAV9和具有单点突变的AAV9突变体AAV-PHP.eB。对每组AAV样品进行三个平行实验，并且包括一个对照样品。

13组样品分别与10¹⁴个候选物的相同DEL文库一起孵育。对每组中结合的候选物进行测序，结果如表9所示。

表9.DEL与AAV样品的结合

样品	在1个样品中富集	在2个样品中富集	在3个样品中富集
				DL 2-4	21379	131	8
DL 5-7	13699	609	88
				DL 8-10	25039	209	9
DL 11-13	12694	191	14

在表9中，“在1个样品中富集”栏显示从3个样品中的1个获得的DEL条形码的数目，“在2个样品中富集”栏显示从3个样品中的2个获得的DEL条形码的数目，“在3个样品中富集”栏显示从所有3个样品获得的DEL条形码的数目。

图15显示了每组测序的DEL条形码的文氏图。在聚类分析中进一步分析从每组中的2或3个样品获得的1056个重叠序列。结果如图16A-16D所示。使用主成分分析(PCA)进行聚类分析。富集的DEL条形码序列被投影到5个维度中，并且在第一个实验中，其中从每组中的2或3个样品获得的重叠序列被分析，第一轴上的31％的数据落在第一主成分(PC)中，12％落在第二主成分中，10％落在第三主成分中，8％落在第四主成分中，7％落在5％主成分中。前五个主成分(PC)的解释方差比是[0.31003056 0.121422140.102502430.08667515 0.07822148]。在第二个实验中，分析了从每组中的2个样品获得的重叠序列，第一轴上的36％数据落在第一主成分(PC)中，13％落在第二主成分中，10％落在第三主成分中，8％落在第四主成分中，5％落在5％主成分中。前五个主成分(PC)的解释方差比是[0.36153258 0.13173036 0.10887119 0.08723116 0.05947605]。

其他实施方案

应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

另外的实施方案

实施方案A1.一种病毒颗粒文库，包括多个病毒颗粒，该病毒颗粒在其表面展示多个不同的融合蛋白，其中每个融合蛋白包括蛋白III或蛋白VIII丝状噬菌体外壳蛋白和异源多肽的至少一部分，其中所述异源多肽融合到所述丝状噬菌体外壳蛋白的羧基末端。

实施方案A2.根据实施方案A1的文库，其中融合蛋白包括全长噬菌体外壳蛋白。

实施方案A3.根据实施方案A1的文库，其中噬菌体外壳蛋白是野生型蛋白。

实施方案A4.根据实施方案A1的文库，其中异源多肽包含约4至约80个氨基酸残基。

实施方案A5.根据实施方案A1的文库，其中异源多肽包含至少约100个氨基酸残基。

实施方案A6.根据实施方案A1的文库，其中异源多肽通过连接体肽附着于外壳蛋白。

实施方案A7.根据实施方案A6的文库，其中连接体肽具有约4至约30个残基。

实施方案A8.根据实施方案A7的文库，其中连接体肽具有约8至约20个残基。

实施方案A9.根据实施方案A6的文库，其中连接体肽中超过约50％的残基是甘氨酸或丝氨酸。

实施方案A10.根据实施方案A1的文库，其中丝状噬菌体选自由M13、fl和fd丝状噬菌体组成的组。

实施方案A11.一种包括经修饰的AAV衣壳蛋白的组合物，其中衣壳蛋白包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和源自突变、肽插入或改组的其他变体：

实施方案A12.一种药物制剂，包括实施方案A11的组合物，还包括一种或多种药学上可接受的载体、缓冲剂、稀释剂或赋形剂。

实施方案A13.一种包括核酸区段的核酸载体，该核酸区段编码修饰的AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和源自突变、肽插入或改组的其他变体。

实施方案A14.根据实施方案A13的核酸载体，其中核酸区段被整合到宿主细胞中。

实施方案A15.根据实施方案A14的核酸载体，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。

实施方案A16.一种药物制剂，包括实施方案A14的宿主细胞，还包括一种或多种药学上可接受的载体、缓冲剂、稀释剂或赋形剂。

实施方案A17.一种从由多个AAV颗粒或噬菌体病毒生成的序列文库中富集条形码构建体的方法，包括通过靶向一个或多个AAV颗粒鉴定条形码和/或靶标转录物从文库中捕获DNA文库分子。

实施方案A18.根据实施方案A17的方法，其中该方法是将任何大小的AAV变体文库(从包含一种类型的AAV变体的文库到包含许多不同类型的AAV变体的文库)与噬菌体展示文库混合的方法，该噬菌体展示文库可以是用于亲和筛选的任何噬菌体展示文库。

实施方案A19.根据实施方案A18的方法，其中该方法是从至少一种噬菌体病毒或噬菌体病毒亚群中鉴定AAV颗粒基因组的方法，所述方法包括基于一种或多种唯一的AAV颗粒鉴定条形码从至少一种噬菌体病毒或噬菌体病毒亚群中富集文库分子，其中靶向条形码鉴定测序文库中表示的单个噬菌体的转录物。

实施方案A20.根据实施方案A17-A19中任一实施方案的方法，包括：

a)通过单液滴测序技术和/或经修改的单细胞测序技术，从AAV文库和噬菌体展示文库的混合物中同时捕获AAV颗粒基因组序列和噬菌体DNA文库分子；

b)对捕获的DNA文库分子进行测序，捕获的DNA文库分子包含AAV衣壳基因组序列和噬菌体基因组序列；

c)鉴定与捕获的噬菌体DNA文库分子相关的AAV颗粒鉴定条形码；以及

d)通过靶向所鉴定的AAV颗粒鉴定条形码从噬菌体展示文库中捕获噬菌体DNA文库分子，

由此富集了与单个AAV变体相关的噬菌体DNA构建体。

实施方案A21.根据实施方案A17-A20中任一项的方法，其中捕获包括利用与一个或多个AAV颗粒和噬菌体DNA文库分子中的每项互补的引物对来对一个或多个AAV颗粒和噬菌体DNA文库分子进行PCR扩增，其中引物对包括一个引物，该引物包括AAV颗粒和噬菌体鉴定条形码的全部或部分的互补序列或一个或多个AAV颗粒和噬菌体DNA文库分子中的每项的靶标转录序列的互补序列。

实施方案A22.根据实施方案A17至A21中任一项的方法，其中捕获包括对AAV变体文库和噬菌体展示文库的至少一个单个或亚群特异的一种或多种AAV颗粒和噬菌体DNA文库分子的PCR扩增。

实施方案A23.根据实施方案A22的方法，其中PCR扩增包括将文库与5’引物和3’引物接触，其中5’引物或3’引物包括与来自AAV变体文库和噬菌体展示文库的单个病毒基因组的独特条形码互补的核苷酸序列；以及扩增包括单个AAV颗粒的独特条形码和噬菌体DNA的文库分子；从而从单个AAV颗粒和噬菌体DNA中获得多个转录物。

实施方案A24.根据实施方案A23的方法，其中：

a)5’引物包括与被包含在每个文库分子中的5’通用引物位点互补的核苷酸序列以及与独特条形码互补的核苷酸序列，并且3’引物包括与被包含在每个文库分子中的3’通用引物位点互补的核苷酸序列；

b)5’引物包括与被包含在每个文库分子中的5’通用引物位点互补的核苷酸序列，并且3’引物包括与被包含在每个文库分子中的3’通用引物位点互补的核苷酸序列以及与独特条形码互补的核苷酸序列；

c)5’引物包括与不同于被包含在每个文库分子中的5’通用引物位点的5’通用引物位点互补的核苷酸序列以及与独特条形码互补的核苷酸序列，并且3’引物包括与被包含在每个文库分子中的3’通用引物位点互补的核苷酸序列；或者

d)5’引物包括与被包含在每个文库分子中的5’通用引物位点互补的核苷酸序列，并且3’引物包括与不同于被包含在每个文库分子中的3’通用引物位点的3’通用引物位点互补的核苷酸序列以及与独特条形码互补的核苷酸序列。

实施方案A25.根据实施方案A1-A24中任一项的方法，其中AAV变体衣壳的单一或组合能够通过噬菌体展示DNA和/或肽序列的任何组合的组合索引来鉴定，组合索引表示任何AAV变体颗粒及其相应噬菌体病毒之间的不同结合亲和力，其可在结合亲和力方面变化。

实施方案A26.根据实施方案A25的方法，其中任何给定AAV变体颗粒的噬菌体展示DNA和/或肽序列的这种组合索引被用作训练数据和测试数据，以用于使用各种深度学习算法计算预测其他AAV衣壳向性。

实施方案A27.一种抗体，与至少一种核酸分子缀合，至少一种核酸分子包括酶可裂解序列(CL)和DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数。

实施方案A28.根据实施方案A27的抗体，其选自由以下项组成的组：单克隆抗体、包括抗原结合结构域的抗体片段诸如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DAB或VHH)、TandAbs二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段、双抗体、三抗体(分别为scFv-Fab融合体、双特异性或三特异性)；sc-双抗体；κ(λ)体(scFv-CL融合体)；DVD-Ig(双可变域抗体，双特异性形式)；SIP(小免疫蛋白，一种微型抗体)；SMIP(“小模块免疫药物”scFv-Fc二聚体；DART(ds-稳定的双抗体“双重靶向”)；包括一个或多个CDR的小抗体模拟物。

实施方案A29.根据实施方案A28的抗体，其可以是单克隆和/或多克隆抗体。

实施方案A30.根据实施方案A27的抗体，其中核酸分子经由连接试剂与抗体中存在的受体谷氨酰胺残基结合。

实施方案A31。一种抗体，其包括经由连接试剂利用核酸分子功能化的受体谷氨酰胺，该核酸分子包括酶可裂解序列(CL)和DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数。

实施方案A32.根据实施方案A27-A31中任一项的抗体，其中连接体共价结合至抗体一级序列内的受体谷氨酰胺的侧链。

实施方案A33.根据实施方案A27-A32中任一项的抗体，其中连接体共价结合至CH2结构域内的氨基酸的侧链。

实施方案A34.根据实施方案A27-A33中任一项的抗体，其中受体谷氨酰胺在融合到CH3结构域的C末端的酶识别标签内。

实施方案A35.根据实施方案A27-A34的抗体，其中受体谷氨酰胺在融合到Cκ结构域的C末端的酶识别标签内。

实施方案A36.根据实施方案A35的抗体，其中根据Kabat EU编号，受体谷氨酰胺在CH2的一级序列中对应于残基Q295的位置。

实施方案A37.根据实施方案A27-A36中任一项的抗体，其中CH2结构域不含N-连接的糖基化。

实施方案A38.根据实施方案A27-A36中任一项的抗体，其中CH2结构域包括N-连接的糖基化。

实施方案A39.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中抗体包括具有式IVa的功能化受体谷氨酰胺：

(Q)-NH-(C)-(CL-(P¹-Z-P²))_q 式IVa

其中：

-Q是抗体中存在的谷氨酰胺残基；

-C是键或连接部分

-q是选自1、2、3或4的整数；

-CL是酶可裂解的核酸序列；

-P¹独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸；

-Z是DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数；以及

-P²独立地不存在或具有至少10个核苷酸的核酸。

实施方案A40.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中抗体包括具有式IVb的功能化受体谷氨酰胺残基，

(Q)-NH-(C)-((M))_q 式IVb

其中：

-Q是抗体中存在的谷氨酰胺残基；

-C是键或连接部分

-q是选自1、2、3或4的整数；

-M独立地是：(RR')-C'-(CL'-(P¹-Z-P²)_q'，

-其中

-(RR')是R和互补反应部分R’之间的加成产物；

-C’是键或连接部分；

-CL’是酶可裂解的核酸序列；

-P¹独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸；

-Z是DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数；

-P²独立地不存在或具有至少10个核苷酸的核酸；以及

-q’是选自1、2、3或4的整数。

实施方案A41.一种具有通式Ia的连接试剂或抗体缀合的连接试剂：

G-NH-C-(CL-(P¹-Z-P²))_q 式Ia

其中：

-G是H、胺保护基团，或者在结合时，是经由酰胺键附着的抗体或抗体片段；

-C是键或连接部分；

-q是选自1、2、3或4的整数；

-CL’独立地不存在，或酶可裂解的核酸序列；

-P¹独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸；

-Z是DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数；以及

-P²独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸。

实施方案A42.根据实施方案A39-A41的抗体或连接试剂，其中C是取代或未取代的烷基或杂烷基链，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。

实施方案A43.根据实施方案A39-A41中任一项的抗体或连接试剂，其中C包括单元：-(C)_n-X-L-，

其中：(C)_n是取代或未取代的烷基或杂烷基链，任选其中该链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代；n是选自2至20范围内的整数；X是NH、O、S、不存在、或者键；L独立地不存在、键或键的延续、或在一个或多个原子上被取代的5至200个原子的含碳框架，任选地，其中含碳框架包括任选地在一个或多个原子上被取代的5至30个碳原子的线性框架，任选地，其中含碳框架是线性烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、线性或支链寡糖(不对称支链或对称支链)、其他天然线性或支化低聚物(不对称支化或对称支化)，或由任何链增长或逐步增长聚合过程产生的二聚体、三聚体或更高级低聚物(线性、不对称支化或对称支化)。

实施方案A44.根据实施方案A40或A42-A43中任一项的抗体，其中RR’包括硫代-马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)加成的加成产物，例如N,S-二取代-3-硫代-吡咯烷-2,5-二酮；Staudinger连接，例如，N,3-或N,4-取代的-5-二苯基膦氧化物-苯甲酰胺；Huisgen 1,3-环加成(点击反应)，例如N,S-二取代-3-硫代-吡咯烷-2,5-二酮、1,4-二取代-1,2,3-三唑、3,5-二取代-异噁唑或3,5-二取代-四唑；Diels-Alder环加成加合物，例如O或N-取代的-5-降冰片烯-2-羧酸酯或酰胺、N-取代的-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亚胺、O或N-取代的-7-氧代降冰片烯-5-羧酸酯或酰胺、或N-取代的-7-氧代降冰片烯-5,6-二羧酸酰亚胺与9-取代的蒽或3-取代的1,2,4,5-四嗪之间的2,4-环加成产物；或任何高产率的选择性酰胺化或酰亚胺化反应。

实施方案A45.根据实施方案A40或A42-A43中任一项的抗体，其中RR’包括炔烃与叠氮化物反应的结果。

实施方案A46.根据实施方案A45的抗体，其中RR’包括以下结构：

实施方案A47.一种具有下式III结构的化合物，

R'-L-(CL-(P¹-Z-P²))_q 式III

其中：

R'是反应性基团；

L独立地不存在，或在一个或多个原子上被取代的1至200个原子的含碳框架，任选地，其中含碳框架包括任选地在一个或多个原子上被取代的5至30个原子的线性框架，任选地，其中含碳框架是线性烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、线性或支链寡糖(不对称支链或对称支链)、其他天然线性或支链低聚物(不对称支链或对称支链)，或者由任何链增长或逐步增长聚合过程产生的二聚体、三聚体或更高级的低聚物(线性的、不对称支化的或对称支化的)；

CL独立地不存在，或酶可裂解的核酸序列；

P¹独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸；

Z是DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数；

P²独立地不存在或具有至少10个核苷酸的核酸；以及

q是选自1、2、3或4的整数。

实施方案A48.根据上述实施方案中任一项的抗体，其对免疫细胞调节分子、癌症抗原、病毒抗原、细菌抗原或CD分子具有特异性。

实施方案A49.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中酶可裂解序列CL包括限制性酶切割位点。

实施方案A50.根据实施方案A49的抗体，其中酶促可裂解序列选自表B。

实施方案A51.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中DNA条形码包括5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。

实施方案A52.根据实施方案A51的抗体，其中序列P1包括10至15个核苷酸。

实施方案A53.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中核酸分子还包括至少10个核苷酸的序列P1。

实施方案A54.根据实施方案A50或A52的抗体，其中核酸分子具有通式：3'-CL-P1-N₁N₂N₃N₄N_n-5'。

实施方案A55.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中核酸分子还包括具有至少10个核苷酸的第二序列P2。

实施方案A56.根据实施方案A55的抗体，其中序列P2包括10至15个核苷酸。

实施方案A57.根据实施方案A56的抗体，其中核酸分子具有通式：3'-CL-P1-N₁N₂N₃N₄N_n-P2-5'，其中

-CL表示酶可裂解的序列

-P1表示能够与第一正向引物杂交的第一序列

-N₁N₂N₃N₄N_n表示DNA条形码，其中N表示核苷酸，并且n是大于4的整数

-P2表示能够与第二反向引物杂交的第二序列

实施方案A58.根据上述实施方案中任一项的抗体，其中核酸分子包括序列：

GAATTCCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNATCACCGACTGCCCATAGAGAGG。

实施方案A59.一种用于将DNA条形码序列缀合到抗体上的方法，包括以下步骤：

a)提供具有至少一个受体谷氨酰胺残基的抗体；

b)在TGase存在下，在足以获得包括经由连接试剂与所述DNA条形码序列连接的受体谷氨酰胺的抗体的条件下，使所述抗体与包括伯胺和化合物的连接试剂反应，该化合物包括(i)包括酶可裂解序列(CL)和DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n的核酸分子，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数。

实施方案A60.一种用于将DNA条形码序列缀合到抗体上的方法，包括以下步骤：

a)提供具有至少一个受体谷氨酰胺残基的抗体；

b)在TGase存在下，在足以获得包括经由连接试剂与反应基团(R)连接(共价)的受体谷氨酰胺的抗体的条件下，使所述抗体与包括伯胺和反应基团(R)的连接试剂反应；以及

c)在足以获得抗体的条件下，使步骤b)中获得的抗体与化合物反应，该化合物包括(i)包括酶可裂解序列(CL)和DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n的核酸分子，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数，以及(ii)能够与反应基团R反应的反应基团(R’)，该抗体包括经由连接试剂与所述DNA条形码序列连接的受体谷氨酰胺。

实施方案A61.根据实施方案A59或A60的方法，其中步骤(a)的连接试剂共价结合至抗体一级序列内的受体谷氨酰胺的侧链。

实施方案A62.根据实施方案A59或A60的方法，其中步骤(a)的连接试剂共价结合至CH2结构域内的氨基酸的侧链。

实施方案A63.根据实施方案A59或A60的方法，其中受体谷氨酰胺在融合到CH3结构域的C末端的酶识别标签内。

实施方案A64.根据实施方案A59或A60的方法，其中受体谷氨酰胺在融合到Cκ结构域的C末端的酶识别标签内。

实施方案A65.根据实施方案A64的方法，其中受体谷氨酰胺在CH2的一级序列中对应于根据Kabat EU编号的残基Q295的位置。

实施方案A66.根据实施方案A59-A65中任一项的方法，其中CH2结构域不含N-连接的糖基化。

实施方案A67.根据实施方案A59-A65中任一项的方法，其中CH2结构域包括N-连接的糖基化。

实施方案A68.根据实施方案A59-A65中任一项的方法，其中包括反应性基团的连接试剂具有通式Ib：

G-NH-(C)-(R)q 式Ib

其中：

G是H、胺保护基团，或者在结合时，是经由酰胺键附着的抗体或抗体片段；

C是键或连接部分；

q是选自1、2、3或4的整数；以及

R是反应性部分。

实施方案A69.根据实施方案A58的抗体或连接试剂，其中C包括单元：-(C)_n-X-L-，

其中：

(C)_n是取代或未取代的烷基或杂烷基链，任选其中该链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代；

n是选自2至20范围内的整数；

X是NH、O、S、不存在、或者键；

L独立地不存在、或是键或键的延续、或在一个或多个原子上被取代的5至200个原子的含碳框架，任选地，其中含碳框架包括任选地在一个或多个原子上被取代了的5至30个碳原子的线性框架，任选地，其中含碳框架是线性烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、线性或支链寡糖(不对称支链或对称支链)，其他天然线性或支化低聚物(不对称支化或对称支化)，或由任何链增长或逐步增长聚合过程产生的二聚体、三聚体或更高级低聚物(线性、不对称支化或对称支化)。

实施方案A70.根据实施方案A59-A69中任一项的方法，其中包括DNA条形码序列和反应性基团(R’)的化合物具有通式III：

R'-L-(CL-(P¹-Z-P²))_q 式III

其中：

R'是反应性基团；

L独立地不存在，或是在一个或多个原子上被取代了的1至200个原子的含碳框架，任选地，其中含碳框架包括任选地在一个或多个原子上被取代了的5至30个原子的线性框架，任选地，其中含碳框架是线性烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、线性或支链寡糖(不对称支链或对称支链)、其他天然线性或支链低聚物(不对称支链或对称支链)，或者由任何链增长或逐步增长聚合过程产生的二聚体、三聚体或更高级的低聚物(线性的、不对称支化的或对称支化的)；

CL独立地不存在，或酶可裂解的核酸序列；

P¹独立地不存在，或具有至少10个核苷酸的核酸；

Z是DNA条形码序列N₁N₂N₃N₄N_n，其中N表示核苷酸，并且n表示大于4的整数；

P²独立地不存在或具有至少10个核苷酸的核酸；以及

q’是选自1、2、3或4的整数。

实施方案A71.根据实施方案A59-A70中任一项的方法获得的抗体。

实施方案A72.一种用于检测样品(此处样品指溶液或固体支持物中的AAV颗粒)中至少一种抗原(此处抗原指AAV衣壳变体的3D分子表面特征)的存在的方法，包括以下步骤：提供至少一种实施方案A27-A58或A71中任一项的对该抗原特异的抗体，在有效地允许抗体和抗原之间结合的条件下，使样品与一定量的所述至少一种抗体接触，洗涤样品以除去未结合的抗体，使样品与能够裂解序列C1的酶接触，分离释放的DNA条形码，并且对DNA条形码测序，其中条形码的存在和数目指示样品中抗原的存在和数目。

实施方案A73.根据实施方案A72的方法，其中抗原由DNAb-AAV颗粒携带。

实施方案A74.根据实施方案A72-A73中任一项的方法，其中样品由异质的DNA b-AAV-颗粒混合物组成。

实施方案A75.根据实施方案A74的方法，其中将异源DNAb-AAV-颗粒混合物随机或以一定顺序分成空间分离的单细胞，放入多孔板、微阵列、微流体装置或载玻片中。

实施方案A76.根据实施方案A75的方法，其中微阵列包括微孔，每个微孔刚好大到足以容纳单个细胞。

实施方案A77.根据实施方案A72-A76中任一项的方法，其中预先用微流控分选仪、通过流式细胞术或显微镜对细胞进行分选。

实施方案A78.根据实施方案A72-A77中任一项的方法，其允许在单次测试中检测和定量至少5、10、30、50或甚至更多抗原。

实施方案A79.根据实施方案A72-A78中任一项的方法，其中至少2种；3种；4种；5种；6种；7种；8种；9种；10种；11种；12种；13种；14种；15种；16种；17种；18种；19种；20种；21种；22种；23种；24种；25种；26种；27种；28种；29种；30种；31种；32种；33种；34种；35种；36种；37种；38种；39种；40种；41种；42种；43种；44种；45种；46种；47种；48种；49种；或者50种抗体被提供，所述抗体中的每种抗体与唯一的DNA条形码结合。

实施方案A80.根据实施方案A72-A79中任一项的方法，其中通过深度高通量测序对释放的DNA条形码进行测序。

实施方案A81.根据实施方案A80的方法，其中在测序之前扩增DNA条形码。

实施方案A82.一种试剂盒，包括实施方案A27-A58或A71中任一项的抗体、限制性核酸内切酶和任选的一对引物。

实施方案B1.一种检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征的方法，包括以下步骤：

1)形成由以下组成的DNA双链体：(a)包括AAV衣壳变体结合所需序列和从靶标结合序列的5’端延伸的序列的DNA适配体文库，以及(b)与包括5’延伸区域的DNA适配体区域互补的单链DNA(Guard-DNA或G-DNA)；

2)将包含靶AAV衣壳变体的样品与步骤1)的DNA双链体混合，其中释放单链G-DNA分子；

3)将步骤2)中获得的混合物与RNase H和与G-DNA互补的单链RNA混合，其中荧光团和淬灭剂分别被标记在单链RNA的5’端和3’端处；以及

4)测量步骤3)中获得的混合物的荧光强度；此外，执行液滴和/或单细胞测序技术。

实施方案B2.根据实施方案B1的方法，其中单链RNA的长度不长于单链DNA的长度。

实施方案B3.根据实施方案B1的方法，其中荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

实施方案B4.根据实施方案B1的方法，其中猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。

实施方案B5.根据实施方案B1的方法，其中猝灭剂是在荧光共振能量转移(FRET)机制中充当荧光受体的荧光团。

实施方案B6.根据实施方案B1的方法，其中AAV衣壳变体颗粒是抗体、配体、天然化合物、合成肽或新药的候选化合物。

实施方案B7.根据实施方案B1的方法，其中通过荧光计测量荧光强度。

实施方案B8.一种用于检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征并且适用于权利要求1的方法的DNA适配体文库，包括

1)DNA双链体，该DNA双链体由(a)DNA适配体文库和(b)单链DNA(G-DNA)组成，该DNA适配体文库包括AAV衣壳变体结合所需的序列和从靶标结合序列的5’-末端延伸的序列，该单链DNA(G-DNA)与包括5’-延伸区域的DNA适配体区域互补；

2)与G-DNA互补的单链RNA，用荧光团和淬灭剂标记；以及

3)RNase H，并且其中单链RNA的长度不长于单链DNA的长度。

实施方案B9.根据实施方案B8的文库，其中荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

实施方案B10.根据实施方案B8的文库，其中猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。

实施方案B11.根据实施方案B8的文库，其中猝灭剂是在荧光共振能量转移(FRET)机制中充当荧光受体的荧光团。

实施方案B12.根据实施方案B1-B8中任一项的文库，其中AAV衣壳变体颗粒是蛋白复合物，包括衣壳蛋白和DNA基因组序列。

实施方案B13.一种检测样品中AAV衣壳变体的3D分子表面特征的方法，包括以下步骤：

1)将包括DNA和/或RNA寡聚物的一种或多种DNA适配体文库与溶液中的一种或多种AAV衣壳变体颗粒混合，以及

2)使用液滴和/或改良的单细胞测序技术鉴定DNA和/或RNA适配体与一种或多种AAV衣壳变体颗粒的相互作用。液滴和/或改良的单细胞测序技术在这里是指以高测序精度大量鉴定待测序液滴中的单个AAV-DNA/RNA-适配体复合物的技术和方法，包括但不限于NGS(下一代测序)、PacBio或纳米孔测序技术和方法。

实施方案C1.一种产生DNA编码的化学实体的方法，包括：

a)使双功能连接体的第一官能团与第一化学构建嵌段反应，其中双功能连接体具有与化学构建嵌段反应的单个官能团和与核苷酸、核苷酸类似物、核苷或核苷类似物反应的单个官能团；

b)使双功能连接体的第二官能团与单链发夹寡核苷酸反应，该发夹寡核苷酸包括(i)自身互补区和(ii)包括至少一种天然核苷或核苷类似物的单链环，从而形成缀合物；

c)在适于在缀合物的第一化学结构单元和第二化学结构单元之间形成共价键的条件下，使第二化学结构单元与缀合物的第一化学结构单元反应；以及

d)将第一寡核苷酸标签连接到缀合物的单链发夹寡核苷酸上，其中寡核苷酸标签包括编码第一化学构建嵌段的身份和/或第二化学构建嵌段的身份的区域，从而形成DNA编码的化学实体，

其中步骤(a)和(b)和/或步骤(c)和(d)可以按任何顺序被执行。

实施方案C2.根据实施方案C1的方法，其中步骤(d)的连接包括非酶连接。

实施方案C3.根据实施方案C1的方法，其中步骤(d)的寡核苷酸标记包括荧光标记或生物素标记。

实施方案C4.根据实施方案C1的方法，其中步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括编码第一构建嵌段身份的区域。

实施方案C5.根据实施方案C1的方法，其中双功能连接体被修饰以增加DNA编码的化学实体在有机条件下的溶解度。

实施方案C6.根据实施方案C5的方法，其中双功能连接体包括烷基链、聚乙二醇单元、带正电荷的支链物质或疏水环结构中的一种或多种。

实施方案C7.根据实施方案C6的方法，其中双功能连接体包括12至45个聚乙二醇单元。

实施方案C8.根据实施方案C1的方法，其中步骤(b)的单链发夹寡核苷酸和/或步骤(d)的寡核苷酸标签被修饰以增加DNA编码的化学实体在有机条件下的溶解度。

实施方案C9.根据实施方案C1的方法，其中步骤(d)的寡核苷酸标签包括编码第一化学构建嵌段身份的区域。

实施方案C10.根据实施方案C1的方法，其中步骤(d)的寡核苷酸标签包括编码第二化学构建嵌段身份的区域。

实施方案C11.根据实施方案C1的方法，其中步骤(c)的合适条件包括有机溶剂。

实施方案C12.根据实施方案C1的方法，其中发夹寡核苷酸的单链环包括可用作扩增的引物结合区域的序列。

实施方案C13.根据实施方案C1的方法，其中双功能连接体附着于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的5’端处；双功能连接体包埋在步骤(b)的单链发夹寡核苷酸中；或者双功能连接体位于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的中间。

实施方案C14.根据实施方案C13的方法，其中双功能连接体附着于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的5’端处。

实施方案C15.根据实施方案C13的方法，其中双功能连接体包埋在步骤(b)的单链发夹寡核苷酸内。

实施方案C16.根据实施方案C13的方法，其中双功能连接体置于步骤(b)的单链发夹寡核苷酸的中间。

实施方案C17.根据实施方案C1的方法，其中步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括T或C核苷酸，其在C5位置包括脂肪链。

实施方案C18.根据实施方案C1的方法，其中步骤(b)的单链发夹寡核苷酸包括偶氮苯。

实施方案C19.根据实施方案C1的方法，其中步骤(d)的寡核苷酸标签包括在C5位置包括脂肪链的T或C核苷酸。

实施方案C20.根据实施方案C9的方法，其中该方法还包括将编码第二化学构建嵌段的身份的第二寡核苷酸标签连接到第一寡核苷酸标签。

实施方案C21.根据实施方案C20的方法，其中该方法还包括：

(e)使第三化学结构单元与第一化学结构单元或第二化学结构单元反应。

实施方案C22.根据实施方案C21的方法，其中该方法还包括：

(f)将第三寡核苷酸标签连接到第二寡核苷酸标签上，其中第三寡核苷酸标签编码第三化学构建嵌段的身份，

其中步骤(e)和(f)可以按任何顺序被执行。

实施方案C23.根据实施方案C1的方法，其中该方法还包括：

(e)使一种或多种附加的化学结构单元与缀合物的化学结构单元反应。

实施方案C24.根据实施方案C23所述的方法，其中该方法还包括：

(f)将一个或多个寡核苷酸标签连接到缀合物的寡核苷酸标签上，其中每个寡核苷酸标签编码一个或多个附加构建嵌段中的一个的身份，

其中步骤(e)和(f)可以按任何顺序被执行。

实施方案C25.根据实施方案C1的方法，其中DNA编码的化学实体具有1.0至2.5的辛醇:水系数。

实施方案C26.根据实施方案C1的方法，其中该方法产生多种DNA编码的化学实体。

实施方案C27.根据实施方案C26的方法，其中所述多个包括至少1,000,000种不同的DNA编码的化学实体。

实施方案C28.根据实施方案C1-C27中任一项的方法，其中DNA编码的化学实体和/或文库用于在溶液中和/或固体支持物上与任何AAV衣壳变体混合。

实施方案C29.根据实施方案C28的方法，其中通过液滴和/或单细胞样测序技术对溶液中和/或固相支持物上的DNA编码的化学实体和/或文库与任何AAV衣壳变体的混合物进行测序。

Claims (58)

1.一种表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将所述AAV衣壳与靶向一种或多种AAV衣壳的适配体文库接触；

b)去除未结合的适配体；

c)洗脱结合的适配体；

d)鉴定与所述AAV衣壳结合的所述适配体；

e)确定所鉴定的所述适配体的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的所述适配体的所述存在和/或水平，表征所述AAV衣壳的所述3D分子表面特征。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)-c)被重复1次、2次、3次或更多次。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中洗脱的所述适配体通过PCR反应而被扩增。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的所述适配体是线性适配体或圆形适配体。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的每个适配体包括至少一个引物结合区域和随机序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述适配体文库中的所述适配体的所述引物结合区域的长度为约20bp。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述适配体文库中的所述适配体的所述随机序列为约36至约40bp。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的每个适配体包括双链寡核苷酸序列。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的每个适配体包括单链寡核苷酸序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的至少一个适配体能够通过所述随机序列与所述AAV衣壳上的靶标结合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的每个适配体包括与所述DNA适配体的区域互补的单链DNA(Guard-DNA或G-DNA)，所述区域包括所述5’-延伸区域。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述AAV衣壳与所述适配体文库接触的情况下，所述单链G-DNA分子被释放。

13.根据权利要求10或11所述的方法，其中与所述AAV衣壳结合的所述适配体的所述鉴定包括：

将步骤a)中获得的混合物与RNase H以及与所述G-DNA互补的单链RNA接触，其中荧光团和淬灭剂分别被标记在所述单链RNA的所述5’端和3’端处；以及

测量所述混合物的所述荧光强度。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光团选自由荧光素、四甲基罗丹明、Cy5、Cy3和德克萨斯红组成的组。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述猝灭剂选自由dabsyl、dabcyl和黑色猝灭剂组成的组。

16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中与所述AAV衣壳结合的所述适配体的所述鉴定通过测序来进行。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述测序包括执行高通量测序或液滴测序。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的所述适配体的所述靶标是已知的。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的所述适配体的精确靶标不必已知。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述适配体文库接触之前处于溶液中。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述适配体文库接触之前被固定在支持物上。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括表征额外的AAV衣壳的3D分子表面特征。

23.一种表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将所述AAV衣壳与DNA编码的化学文库(DECL)接触，所述化学文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的化学结合剂的池；

b)去除未结合的DNA编码的化学结合剂；

c)洗脱结合的DNA编码的化学结合剂；

d)鉴定与所述AAV衣壳结合的所述DNA编码的化学结合剂；

e)确定所鉴定的所述DNA编码的化学结合剂的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的所述DNA编码的化学结合剂的所述存在和/或水平，表征所述AAV衣壳的所述3D分子表面特征。

24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤a)-c)被重复1次、2次、3次或更多次。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述DECL中的每种DNA编码的化学结合剂包括：

a)能够与所述AAV衣壳上的一个或多个靶标结合的化合物；

b)DNA条形码；以及

c)连接体。

26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述洗脱的DNA编码的化学结合剂的所述DNA条形码通过PCR反应而被扩增。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述DNA编码的化学结合剂的所述DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。

28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中每种DNA编码的化学结合剂的所述DNA条形码序列与所述化学结合剂的身份相关。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述DNA编码的化学结合剂的所述鉴定是通过对所述DNA条形码序列进行测序来进行的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述测序包括执行高通量测序、液滴测序或单细胞测序。

31.根据权利要求23-30中任一项的方法，其中所述DECL中的所述DNA编码的化学结合剂的所述靶标是已知的。

32.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中所述适配体文库中的所述DNA编码的化学结合剂的所述精确靶标不必已知。

33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述DECL接触之前处于溶液中。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述DECL接触之前被固定在支持物上。

35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中所述连接体是可裂解的连接体。

36.根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中所述方法还包括表征额外的AAV衣壳的3D分子表面特征。

37.一种表征AAV衣壳的3D分子表面特征的方法，包括：

a)将所述AAV衣壳与DNA编码的抗体文库(DEAL)接触，所述抗体文库包括靶向一种或多种AAV衣壳的DNA编码的抗体结合剂的池；

b)去除未结合的DNA编码的抗体结合剂；

c)洗脱结合的DNA编码的抗体结合剂；

d)鉴定与所述AAV衣壳结合的所述DNA编码的抗体结合剂；

e)确定所鉴定的所述DNA编码的抗体结合剂的存在和/或水平；以及

f)基于所鉴定的所述DNA编码的抗体结合剂的所述存在和/或水平，表征所述AAV衣壳的所述3D分子表面特征。

38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤a)-c)被重复1次、2次、3次或更多次。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述DECL中的每种DNA编码的抗体结合剂包括：

a)能够与所述AAV衣壳上的一个或多个靶标结合的抗体或其抗原结合片段；

b)DNA条形码；以及

c)连接体。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述洗脱的DNA编码的抗体结合剂的所述DNA条形码通过PCR反应而被扩增。

41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述DNA编码的抗体结合剂的所述DNA条形码序列的长度为约5bp至约15bp。

42.根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述DNA编码的抗体结合剂的所述鉴定通过测序来进行。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述测序包括执行高通量测序或液滴测序。

44.根据权利要求37-43中任一项的方法，其中所述DEAL中的所述DNA编码的抗体结合剂的所述靶标是已知的。

45.根据权利要求37-44中任一项所述的方法，其中所述DEAL文库中的所述DNA编码的抗体结合剂的精确靶标不必已知。

46.根据权利要求37-45中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述DEAL接触之前处于溶液中。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述AAV衣壳在与所述DEAL接触之前被固定在支持物上。

48.根据权利要求39-47中任一项所述的方法，其中所述连接体是可裂解的连接体。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述连接体包括至少一种核酸分子，所述核酸分子包括酶可裂解的序列(CL)。

50.根据权利要求37-49中任一项所述的方法，其中所述方法还包括表征额外的AAV衣壳(一种或多种)的3D分子表面特征。

51.一种富集用于表征AAV衣壳的3D分子表面特征的结合文库的方法，包括：

(a)将结合试剂的池与AAV衣壳的第一群体接触；

(b)富集与AAV衣壳的所述第一群体结合的结合剂的子池，从而富集用于表征所述AAV衣壳的3D分子表面特征的所述结合文库。

52.根据权利要求51所述的方法，还包括：

(c)将与AAV衣壳的所述第一群体结合的结合剂的所述子池与AAV衣壳的第二群体接触；以及

(d)耗尽对AAV衣壳的所述第二群体显示亲和力的结合剂的第二子池，从而选择对AAV衣壳的所述第一群体具有优先亲和力的结合剂的群组。

53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述结合剂的所述文库是适配体文库，包括DNA编码的化学文库(DECL)或DNA编码的抗体文库(DEAL)。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳或AAV衣壳的所述第一群体包括以下中的一种或多种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、AAV11、AAV12和AAV13以及源自突变、肽插入或改组的其他变体。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述3D分子表面特征是所述文库的结合特性。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述结合特性是所结合的所述结合试剂的数目、序列和拷贝数。

57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳的所述3D分子表面特征指示所述向性特性和/或中和特性(例如，逃避中和抗体的能力)。

58.一种用于执行根据权利要求51-57中任一项的富集结合文库的方法的试剂盒。