CN118973598A - 用于预防或治疗龋病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗龋病的药学组合物及其用途，根据本发明的药学组合物作为有效成分包含由下述通式1的氨基酸序列组成的肽。K‑Y‑R1‑R2‑R3‑R4‑R5‑R6‑R7‑R8(通式1)在所述通式1中，R1为精氨酸(R)、赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)；R2为精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)；R3、R4及R5分别为精氨酸(R)或赖氨酸(K)；R6为天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)；以及R7及R8为赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。

Description

用于预防或治疗龋病的组合物

技术领域

本发明涉及一种药学组合物，更详细地，涉及一种不用去除感染的齿质的用于预防或治疗龋病的药学组合物。

背景技术

龋病作为最常见的慢性疾病中的一种，根据报道全球有35亿人罹患(aflection)该疾病(Dye 2017；Kassebaum et al.2015；World Health Organization 2017)。根据2013年韩国保健福祉部的资料调查，成年男性恒牙龋体验率约达87％，女性约为90％，呈现出了高罹患率。由于整体医疗技术的发达，延长了国民平均寿命，为了提高生活品质，口腔健康管理的重要性日益增大，尤其强调保存自然牙的重要性。虽然初期龋病没有症状，但随着疾病发展会诱发各种疼痛，最后会丧失牙齿，最终无齿颚状态导致进食障碍，成为严重阻碍整体生活品质的因素(Bortoluzzi et al.2012)。

通常，因非感染性原因引起的牙本质的损伤，单纯只要求消失的齿质的修复过程，但在罹患龋病时，应最小化构成罹患的齿质及感染的原因的细菌的影响，在这一点上，区别于其他非感染性原因导致的牙本质疾病的治疗方式。龋病与其他牙本质-牙髓疾病不同，始于由龋病的病原菌导致的齿质的感染。由于龋病是细菌导致的感染疾病，通过去除罹患的齿质最小化细菌的影响很重要，因此以往的龋病的治疗，通常适用去除感染的齿质，物理去除细菌感染源，并修复去除的齿质部位的治疗方法。

现在正在使用的普通龋病的治疗方法，存在对于牙科治疗的恐惧而延误治疗时期的问题，以及使用人工牙科材料所发生的问题。

牙齿由作为硬组织的牙釉质、牙本质、牙骨质和内部作为软组织的牙髓形成。牙髓的神经和血管发达，形成牙本质的成牙本质细胞位于牙髓和牙本质的边界部。考虑构成牙齿的结构的侵蚀与否等，龋病根据发展程度可区分为5阶段。具体可区分为，龋病的1阶段为限定在牙釉质的伴有细微的损伤但几乎没有自觉症状的阶段，2阶段伴有牙釉质和牙本质的边界附近的损伤同时有敏感性牙齿症状，3阶段为罹患至牙本质，出现牙本质损伤而能够对外部的刺激感到疼痛的阶段，4阶段为罹患至牙髓，即使没有外部刺激的状态下也会引起炎症的阶段，5阶段为牙髓坏死的同时伴有剧烈疼痛的阶段。通常，在相应于初期阶段的2阶段及3阶段方才自觉龋病的情况居多。2阶段及3阶段是适合治疗龋病的时期，可使龋病的病原菌的影响最小化。

据悉，即便可以通过自觉症状快速接受牙科治疗，但错过适当治疗阶段的情况频繁发生，这归咎于龋病的传统治疗方式。现在的龋病的治疗是通过机械性去除弱化的齿质，并以新材料填补其部位的过程来实现，大部分的牙科患者由于对牙科治疗的不安、担忧、恐惧及紧张而具有延误治疗时期的倾向。从而发生错过适当的治疗时期，在治疗过程中还需要去除齿质相当部分的情况。对于龋病的治疗的不安或担忧，从儿童到老年人表现在各种年龄层中。据悉，尤其心理和身体尚未成熟的幼年和少年层(0～14岁)的情况下，对于牙科治疗的恐惧很大。1984年Berggren和Meynert以20～40岁的成人为对象，调查了回避牙科治疗的原因并进行了报告，调查结果约85％的对象因童年时期的可怕的牙科治疗经历而对牙科治疗产生恐惧，尤其指出牙齿形成窝洞，或在麻醉或拔牙时经历的疼痛是恐惧牙科治疗的主要原因。儿童时期形成的对于牙科治疗的恐惧有可能持续到成人时期，因此有可能成为错过适当治疗时期的因素。

以往作为用于龋病的治疗的牙科材料，为了从牙齿损伤到牙齿的结构及功能的恢复，使用由汞合金、玻璃离子粘固剂、复合树脂、金、陶瓷等的各种成分形成的保存、修补用修复材料。就目前为止的牙科治疗中所使用的修复材料而言，长期来看，发生微细泄漏的可能性很高，因此牙齿的保存、修补修复用牙科材料的化学刺激、细微泄漏等有可能引起或恶化牙髓的病变。因此炎症反应发展导致牙髓的坏死，由于去除牙髓的根管治疗及追加去除牙齿而导致齿质损失。根据报告，老年多发的牙根的龋病，在修复时，防潮、确保视野、接近等困难，窝洞边缘部位于牙骨质和牙本质，因此牙根龋病与在牙釉质中的龋病不同，对于酸腐蚀的抵抗力弱，由于不完整的边缘，龋病复发很常见。而且由于位于难以维持修复形态的部位，而修复物容易脱落的情况下，牙根的到牙髓的齿质厚度不厚导致治疗后发生痛症的频率高，消除龋病时，容易暴露牙髓，使得过度到根管治疗的情况居多，因此难以保存自然牙齿。

在发生龋病初期，可能会感到一点疼痛或完全感觉不到疼痛。由于龋病没有发展至牙齿中具有神经和血管的牙髓，仅去除感染的部分并利用牙科材料进行填充。但是，当龋病侵袭至牙髓时，需要进行通常被称为神经治疗的根管治疗。根管治疗是指去除牙髓内的神经和血管组织全部，并用牙科材料填充的治疗。根管治疗结束后，以牙科材料填充被去除的牙齿部分。接受根管治疗的牙齿，如果仅进行填充治疗容易碎裂，因此在填充治疗后会套上铸造金属制成的金冠。如果龋病发展至牙髓的状态长期持续，牙根末端骨中产生脓包，脓通过骨流向牙床。此时也可通过根管治疗进行治疗，但如果骨内的脓包过大，则也会处于需进行去除脓包的手术或拔掉牙齿的状况。在并非保护牙髓细胞，而是进行去除牙髓细胞的根管治疗时，不会感觉到因自然牙齿而产生的咀嚼感，只能因异物感而感觉不便。相关于牙齿中的免疫反应，已知成牙本质细胞的自我吞噬作用有关于新成牙本质细胞的分化、细胞存活率、保护细胞免于死亡。从成牙本质细胞的保护和适应的观点来看，虽然期待成牙本质细胞的自我吞噬作用对于牙髓细胞和新成牙本质细胞的存活提供有利的效果，但按照以往的根管治疗方法，也只能去除成牙本质细胞，因此难以期待成牙本质细胞带来的有利效果。

在这种背景下，本发明人为了开发更加有效地治疗牙髓龋病的制剂，日以继夜研究开发的结果，开发出了用于促进牙本质或牙髓组织的再生的肽的对于预防、改善或治疗龋病的新用途，并完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供一种用于改善或治疗龋病及因其带来的痛症的用途，所述龋病包括牙根的龋病、面临脱落的幼齿的龋病、萌出中的牙齿的龋病。

本发明的另一目的在于，提供一种龋病的改善或治疗效果，增加因龋病而损伤的牙髓的治愈能力及减少炎症因子的表达，使得不发展为不可逆疼痛。

本发明的又一目的在于，提供一种用于改善或治疗龋病的用途，在因龋病而使牙髓损伤的环境下，其通过增加成牙本质细胞的自我吞噬作用，保护牙髓及再激活成牙本质细胞来实现。

本发明的目的不限于以上提及的内容，本发明所属技术领域的具有普通知识的人可以从以下记载明确理解未提及的其它目的。

问题的解决手段

本发明人经过各种研究，开发出一种包含由10个氨基酸组成的肽的用于预防、改善及治疗龋病的制剂及其用途。

可确认，所述肽可以增加作为成牙本质细胞分化标志基因的Dspp、Dmp1及Nestin基因的表达水平，表现出促进牙本质再生的效果的同时，对于牙髓组织的细胞，没有表现出任何细胞毒性。

而且，确认所述肽在生物体内形成与牙本质-牙髓组织最类似的形态的牙本质-牙髓样组织，增加胶原蛋白的形成水平，并确认到增加作为成牙本质细胞特异性分化标志基因的DSP的表达水平。

作为用于实现上述目的的一实施方式，本发明提供一种用于治疗龋病的药学组合物，其包含以下述通式1的氨基酸序列形成的肽。

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8(通式1)

在所述通式1中，

R1为精氨酸R、赖氨酸K或谷氨酰胺Q；

R2为精氨酸R或谷氨酰胺Q；

R3、R4及R5分别为精氨酸R或赖氨酸K；

R6为天冬酰胺N或丝氨酸S；以及

R7及R8为赖氨酸K或酪氨酸Y。

本发明的术语，"牙本质(dentine)"还被称为"齿质"，是指形成牙齿的大部分的、具有略显黄色的白色坚硬组织。所述牙本质在齿冠部中由牙釉质覆盖，在齿根部中由牙骨质覆盖，因此不露出于牙齿表面，但是随着年龄增加，若牙釉质磨损，则牙本质将暴露在牙冠的前端部或咬合面。虽然所述牙本质是一种骨组织，但是形成牙本质的细胞的本体位于牙髓内，并且仅有其突起向牙本质内延伸，在这一点上区别于通常的骨组织。

本发明的术语，“牙髓组织(dental pulp)”还被称为“牙髓”，是指存在于牙齿的内部的填满牙髓腔的柔软的结合组织。在解剖学上还可指神经和血管分布得丰富，并且达到牙本质的内侧面的位置的区域。

在本发明中提供的制剂中包含的肽，即没有表现出细胞毒性，又可增加作为成牙本质细胞分化标志基因的Dspp、Dmp1及Nestin基因的表达水平，与牙髓组织细胞一起移植到生物体内时，所述牙髓组织细胞可表现出形成牙本质/牙髓组织-样组织的特征。

在本发明中提供的制剂中包含的肽，只要是可表现出龋病治疗效果，就连构成其的氨基酸序列和一个以上的氨基酸残基具有不同的序列的突变体肽也包含在本发明中提供的肽的范畴内。

通常，在本发明所属技术领域中公知，在整体上未变更分子的活性的蛋白质及多肽中的氨基酸的交换。最普遍发生的交换为氨基酸残Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。并且，通过氨基酸序列上的突变或修饰可包含与肽的热、pH等有关的结构性稳定性增加或牙本质或牙髓组织的再生促进能力增加的肽。

例如，本发明中提供的作为位于序列编号1的肽的3号的酸性氨基酸的谷氨酰胺即使被作为碱性氨基酸的赖氨酸或精氨酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果；位于序列编号1的肽的4号或5号的作为碱性氨基酸的精氨酸即使被作为酸性氨基酸的谷氨酰胺或作为碱性氨基酸的赖氨酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果；位于序列编号1的肽的6号、7号或9号的作为碱性氨基酸的赖氨酸即使被作为碱性氨基酸的精氨酸或作为芳香族氨基酸的酪氨酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果；位于序列编号1的肽的8号的作为酸性氨基酸的天冬酰胺即使被作为中性氨基酸的丝氨酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果；位于序列编号1的肽的10号的作为芳香族氨基酸的酪氨酸即使被作为碱性氨基酸的赖氨酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果。

如上所述，在构成本申请发明的肽的酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳香族氨基酸即使分别被与其不同的酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸或芳香族氨基酸取代，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果，因此，构成本发明的肽的氨基酸序列和一个以上的氨基酸残基具有不同的序列的突变体肽也属于在本发明中提供的肽的范畴。

并且，本发明的制剂中包含的肽即使具有在它的N-末端或C-末端附加有任意氨基酸的形态，也可直接表现出在本发明中提供的肽的效果，因此，包含于在本发明中提供的肽的范畴。作为一例，可成为在所述肽的N-末端或C-末端附加有1至300个的氨基酸的形态，作为另一例，可成为在所述肽的N-末端或C-末端附加有1至100个氨基酸的形态，又作为另一例，可成为在所述肽的N-末端或C-末端附加有1至24个氨基酸的形态。

就相应于发明中提供的通式1的96种的肽，相较于在未处理肽的MDPC-23细胞(对照组)中测量的作为成牙本质细胞分化标志的Dspp基因的mRNA水平，在处理所述96种的肽的MDPC-23细胞中，具有所述Dspp基因的mRNA水平显著增加的值。

根据目前为止的报告，已知当DSPP的mRNA表达水平增加时，会促进成牙本质细胞分化及牙本质再生，因此可知，表现出增加所述Dspp基因的mRNA水平的效果的所述96种的肽，可表现出促进成牙本质细胞分化及牙本质再生的效果(Taduru Sreenath et al.,THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.278,No.27,Issue of July 4,pp.24874-24880,2003；William T.Butler et al,Connective Tissue Research,44(Suppl.1):171-178,2003)。

作为另一实施方式，本发明提供对所述肽进行编码的多核苷酸。

就所述多核苷酸而言，一个以上的碱基可通过取代，缺失，插入或它们的组合而进行突变。在化学合成核苷酸序列来制备的情况下，可使用在本发明所属领域中公知的合成法，例如在文献(Engels and Uhlmann,Angew Chem IntEd Engl.,37:73-127,1988)中记载的方法，并且可利用三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺以及H-磷酸盐方法、聚合酶链式反应(PCR)及其他自动引物方法、固体支撑物上的寡核苷酸合成法等来合成。例如，对本发明的肽进行编码的多核苷酸可包含序列编号4的碱基序列。

作为另一实施方式，本发明提供包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述表达载体的转化体及利用所述转化体来制备所述肽的方法。

本发明的术语“表达载体”是指作为在目的宿主细胞中可表达目的肽的重组载体，意指包含可操作地连接以表达基因插入物的必需调节元件的基因构建体。所述表达载体包含起始密码子、终止密码子、启动子、操纵基因等的表达调节元件，所述起始密码子及终止密码子通常被视为对多肽进行编码的核苷酸序列的一部分，并且当给予基因构建体时必须在个体呈现出作用，并且需与编码序列位于框架中(in frame)。载体的启动子可以为组成型或诱导型。

本发明的术语“可操作地连接(operably linked)”是指为了执行通常的功能使核酸表达调节序列和对目的蛋白质或RNA进行编码的核酸序列功能性地相连接(functionallinkage)的状态。例如，将启动子和对蛋白质或核糖核酸进行编码的核酸序列可操作地连接，可对编码序列的表达产生影响。与表达载体的可操作地连接可利用在本发明所属技术领域中公知的基因重组技术来制备，而位点-特异性DNA切割及连接可使用本发明所属技术领域中通常公知的酶等。

并且，为了促进从细胞培养液的肽的分离，所述表达载体可包含用于排出所述肽的信号序列。在进行所插入的核酸序列的有效的翻译时也会需要特异性起始信号。这些信号包含ATG起始密码子及相邻的序列。在有些情况下，需要提供可包含ATG起始密码子的外源翻译调节信号。这些外源翻译调节信号及起始密码子可以为多种天然及合成来源。可通过引入适当的转录或翻译增强子来增加表达效率。

并且，为了容易地检出所述肽，所述表达载体还可包含可使用内肽酶任选地去除的蛋白质标签。

本发明的术语“标签(tag)”是指呈现可进行定量的活性或特性的分子，可以为包括化学荧光物质(fluoracer)(如荧光素)和多肽荧光物质(如荧光蛋白质(GFP)或相关蛋白质)的荧光分子；还可以为Myc标签、Flag标签、组氨酸标签、亮氨酸标签、IgG标签、链霉亲和素标签等的表位标签。尤其，在使用表位标签的情况下，优选地可使用由6个以上的氨基酸残基构成的肽标签，更优选地可使用由8个至50个氨基酸残基构成的肽标签。

在本发明中，所述表达载体可包含对上述本发明的肽进行编码的核苷酸序列，所述肽为用于促进牙本质或牙髓组织的再生及用于治疗牙本质感觉过敏的肽，此时所使用的载体优选地可以为质粒DNA、噬菌体DNA等，更优选地可以为商业上开发的质粒(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP等)、大肠杆菌来源的质粒(pYG601 BR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源质粒(pUB110、pTP5等)、酵母-来源质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、噬菌体DNA(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)、动物病毒载体(逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)等)、昆虫病毒载体(杆状病毒(baculovirus)等)，但只要能够生产所述肽，则可不特别限制于此。所述表达载体根据宿主细胞呈现不同的蛋白质的表达量和修饰等，因此优选地选择使用最适合于目的的宿主细胞。

可向宿主导入在本发明中提供的表达载体来进行转化，从而可制备本发明中提供的转化体，通过使包含于所述表达载体的多核苷酸表达，来用于所述肽的生产。可通过多种方法进行所述转化，可使用CaCl₂沉淀法、在CaCl₂沉淀法中使用被称为二甲基亚砜(DMSO(dimethyl sulfoxide))的还原物质来提高效率的Hanahan方法、电穿孔法(electroporation)、磷酸钙沉淀法、原生质体融合法、使用碳化硅纤维的搅拌方法、土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化法、利用聚乙二醇(PEG)的转化法、硫酸葡聚糖、脂质体及干燥/抑制介导的转化方法等，但只要能够生产所述肽，就并不特别限定于此。并且，制备所述转化体中使用的宿主也是只要能够生产所述肽，就并不特别限定于此，但是可以为细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等；酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等；菌类细胞，如毕赤酵母(Pichia pastoris)等；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)、斜纹夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞等；动物细胞，如CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、293细胞、人黑色素瘤(Bowes melanoma)细胞等；或植物细胞。

所述转化体还可使用于生产如下本发明的肽的方法，其中所述肽为用于促进牙本质或牙髓组织的再生及用于治疗牙本质感觉过敏的肽。具体地，生产本发明的用于促进牙本质或牙髓组织的再生及用于治疗牙本质感觉过敏的肽的方法可包括：步骤(a)，通过培养所述转化体来获得培养物；以及步骤(b)，从所述培养物回收本发明的肽。

本发明的术语“培养”是指在适当地人工调节的环境条件下使微生物生长发育的方法。在本发明中，培养所述转化体的方法可利用在本发明所属技术领域中公知的方法来进行。具体地，就所述培养而言，在分批工艺或分批补料或重复分批补料工艺(fed batchor repeated fed batch proess)中，可进行连续式培养，但只要能通过表达本发明的用于促进牙本质或牙髓组织的再生及用于治疗牙本质感觉过敏的肽来进行生产，则并不特别限定于此。

使用于培养的培养基需要在包含适当的碳源、氮源、氨基酸、维生素等的通常的培养基中，在好氧性条件下，调节温度、pH等，并且以适当的方式满足特定菌株的条件。作为可使用的碳源，将葡萄糖及木糖的混合糖用作主碳源，除此之外，包含：糖和碳水化物，如蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；以及油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等；以及脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；以及醇，如甘油、乙醇；以及有机酸，如醋酸。这些物质可个别使用或作为混合物使用。作为可使用的氮源，可使用无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵；氨基酸，如谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺；以及有机氮源，如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼类或其分解产物、脱脂大豆饼或其分解产物等。这些氮源可单独或组合使用。在所述培养基中，作为磷源，可包含磷酸一钾、磷酸二钾及相应的含钠盐。作为可使用的磷源包含磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。并且作为无机化合物，可使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰及碳酸钙等。最后，在所述物质上可添加生长必需物质，如氨基酸及维生素来进行使用。

并且，在培养基中可使用适当的前体。所述的原料在培养过程中可通过适当的方式以分批式、流加式或连续式添加于培养物，但并不特别限定于此。可通过以适当的方式使用碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等；酸性化合物，如磷酸或硫酸等来调节培养物的pH。

并且，通过使用如脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来可抑制气泡生成。为了保持好气状态，向培养物内注入氧或含氧气体(例如空气)。通常培养物的温度为27℃至37℃，优选地，是30℃至35℃。且一直进行培养至所述肽的生成量成为最大值为止。以这种目的，通常可在10小时至100小时内实现。

并且，可通过本发明所属技术领域中公知的方法进行从培养物回收所述肽的步骤。具体地，只要可适用于所生产的所述肽的回收，就并不特别限制所述回收方法，优选地，可使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱(例如离子交换、亲和性、疏水性和大小排出)等方法。

本发明的药学组合物可促进牙髓组织细胞形成牙本质/牙髓组织-样组织，根据修补牙本质或牙髓组织的方法，可用于治疗龋病。

包含于所述药学组合物的肽能够以肽的单独形式使用，也能够以由所述肽重复连接2次以上的形态使用，还能够以呈现对龋病病原菌的抗菌作用的药物与所述肽的N-末端或C-末端相结合的复合物形态使用。

本发明的术语"龋病"可意指由栖息在牙齿表面上的细菌引起的感染性疾病。

本发明的术语"预防"意指，通过包含本发明的肽的用于预防或治疗龋病的药学组合物的给药，来抑制或延迟龋病发生的所有行为。

本发明的术语"治疗"是指，通过将作为有效成分包含本发明的肽的药学组合物，给药到需要治疗龋病的个体，从而促进牙本质或髓组织的再生，由此执行龋病治疗的所有行为。

本发明的药学组合物可制备成，在所述肽中还包含在药学组合物的制备中通常所使用的适当的载体(天然的或非天然的载体)、赋形剂或稀释剂的用于治疗龋病的药学组合物的形态。具体地，所述药学组合物可分别按通常的方法剂型化为能够给药到诱发龋病的部位的灭菌注射液的形态来使用。在本发明中，作为可包含于所述药学组合物的载体、赋形剂及稀释剂可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁，矿物油，胶原蛋白等。在制剂化本发明的肽时，可使用通常使用的填充剂、增亮剂、结合剂，润湿剂，崩解剂，表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。尤其可包含灭菌水溶液，非水性溶剂、悬浮剂，乳剂，冷冻干燥剂，坐剂，软膏剂(例如，牙髓移装材料等)等。作为非水性溶剂、悬浮剂可使用植物性油，如丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等；能够注射的酯，如油酸乙酯等。作为坐剂的基剂可使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯脂肪、甘油明胶等。

包含于本发明的药学组合物的肽的含量并不进行特别限定，但是以最终组合物总重量为基准，可包含0.0001重量％至50重量％的所述肽，更优选地可包含0.01至20重量％的所述肽。

所述本发明的药学组合物能够以药剂学上有效的量进行给药，本发明的术语“药剂学上有效的量”是指以能够适用于医学治疗或预防的合理的受益/风险比率，针对疾病的治疗或者预防充分的量，可根据疾病的严重度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率治疗期间、与所使用的本发明的组合物配合或包含同时使用的药物的要素及其他在医学领域中公知的要素确定有效用量水平。本发明的药学组合物可独立给药或与公知的用于治疗龋病的药学组合物并用给药。重要的是，考虑所述所有要素，以无副作用且以最少的量来可取得最大效果的量进行给药。

本发明所属技术领域的普通技术人员可考虑使用目的、疾病中毒程度、患者的年龄、体重、性别、既往症或作为有效成分使用的物质的种类等来确定本发明的药学组合物的给药量。例如，每一名成人可给药约0.1ng至约100mg/kg的本发明的药学组合物，优选地，能够以1ng至约10mg/kg给药，本发明组合物的给药频率并不特别限定于此，但是可以1天给药一次或分割用量来给药多次。所述给药量在任意方面都不限定本发明的范围。

作为再一实施方式，本发明提供一种龋病治疗方法，其包括以药剂学上有效的量向除患有龋病的人之外的个体给予所述药学组合物的步骤。

本发明的术语“个体”是指可无限制地包含包括需要治疗龋病的小鼠、家畜等的哺乳动物等，但是在发生所述疾病的个体中排除人类。

本发明的用于治疗龋病的药学组合物的给药途径，只要可达到目的组织，就可通过任意一般途径给药。本发明的药学组合物并不特别限定于此，但是可根据目的通过口腔内给药或口腔内注射等的途径来给药。

作为又一实施方式，本发明提供一种包含所述肽的用于预防或改善龋病的医药外品组合物。

本发明的术语“改善”是指至少减少与所治疗的状态相关的参数，例如，症状的程度的全部行为。

在本发明中，所述改善可作如下解释：将本发明的肽作为有效成分包含的药学组合物给药到需要治疗龋病的个体，来促进牙本质或牙髓组织再生，从而使龋病的症状好转或得到有利改变的全部行为。

本发明的术语“医药外品”是指在以对人或动物的疾病进行诊断、治疗、改善、减轻、处置或预防的目的使用的物品中，与医药品相比作用轻微的物品，例如根据药事法，医药外品是指除了作为医药品的用途使用的物品以外的物品，包括用于治疗或预防人/动物的疾病的纤维/橡胶产品、对人体的作用轻微或不直接作用的并非为器具或机械的物品和与此类似的物品、用于防止传染病的杀菌/杀虫剂等。

在本发明中，并不特别限定包含所述肽的医药外品组合物的种类或剂型，例如，可以为口腔用消毒清洁剂、口腔清洁用品、牙膏、牙线、口腔用软膏剂等。

作为又一实施方式，本发明提供一种包含所述肽的用于预防或改善龋病的保健功能性食品组合物。

本发明的术语“食品”有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类的奶制品、各种汤、饮料、茶、补液、酒精饮料、维生素复合剂、保健功能食品及保健食品等，包括常规意义上的所有食品。

所述保健功能(性)食品(functional food)作为和特定保健用食品(food forspecial health use,FoSHU)相同的术语，是指使之除了供给营养之外，还可以为了有效地呈现生物体调节功能而加工的医学、医疗效果高的食品。其中，所谓“功能(性)”是指调节营养素(对人体的结构及功能)或在保健用途(如生理学作用等)中取得有用的效果。可通过本发明所属技术领域中通常所使用的方法制备本发明的食品，进行所述制备时可添加通常会添加的原料及成分来制备。并且，作为所述食品的剂型而言，只要是可认定为食品的剂型，就可无限制地进行制备。本发明的食品用组合物具有如下优点：能够制备成多种形式的剂型，与普通药品不同，可将食品作为原料，从而没有长期服用药品时可能发生的副作用等，并且便携性优秀，因此本发明的食品可作为增进用于预防或改善龋病的效果的辅助剂来摄取。

所述保健食品(health food)意指与普通食品相比，具有积极的维持健康或增进健康的效果的食品，保健辅助食品(health supplement food)意指健康辅助目的的食品。根据情况，可混用保健功能食品、保健食品、保健辅助食品的术语。

具体地，所述保健功能食品意指将本发明的肽添加于饮料，茶类，香辛料、口香糖类、饼干类等食品材料或作为利用胶囊化、粉末化、悬浮液等制备的食品，在摄取所述食品的情况下，在健康方面带来特定的效果，但是与普通药品不同，将食品作为原料，因此具有在长期服用药品时不会产生副作用的优点。

本发明的食品组合物可日常摄取，因此可期望对于预防或改善龋病的良好效果，由此可非常有效地使用。

所述食品组合物还可包含生理学上可接受的载体，载体的种类并不受特别限制，只要是在本发明所属技术领域中通常所使用的载体，就都可任意使用。

并且，所述食品组合物可包含可通常用于食品组合物以提高气味、味道、视觉等的添加成分。例如，可包含维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸(niacin)、生物素(biotin)、叶酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)等。并且，可包含矿物质，如锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)、铬(Cr)等。并且，可包含氨基酸，如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等。

并且，所述食品组合物可包含食品添加剂(food additives)，如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢醋酸钠等)、杀菌剂(漂白粉与高效漂白粉、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)、着色剂(焦油色素等)、显色剂(亚硝酸钠、亚醋酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调料(MSG谷氨酸钠等)、甜味剂(甘素、环己基氨基磺酸盐、糖精、钠等)、香料(香草醛、内酯类等)、膨胀剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)、强化剂、乳化剂、增稠剂(糊料)、被膜剂、胶基础剂、泡沫抑制剂、溶剂、改良剂等。可根据食品的种类筛选并使用适当的量的所述添加物。

本发明的肽可直接添加或与其他食品或食品成分一同使用，并可按照常规的方法适当地使用。可根据其使用目的(预防、健康或治疗性处理)适当地确定有效成分的混合量。通常，当制备食品或饮料时，相对于食品或饮料，本发明的食品组合物可添加50重量份以下，具体地，可添加20重量份以下的量。但是，在以健康及卫生为目的长时间摄取的情况下，可包含所述范围以上以下的量，由于在安全性方面没有任何问题，作为有效成分还可使用所述范围以上的量。

作为本发明的食品组合物的一例，可用作保健饮料组合物使用，在所述情况下，可与一般的饮料一样，含有多种香味剂或天然碳水化物等作为添加成分。所述天然碳水化合物可以为单糖，如葡萄糖、果糖；二糖，如麦芽糖、蔗糖；多糖，如糊精、环糊精；糖醇，如木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等。甜味剂可使用天然甜味剂，如奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物；合成甜味剂，如糖精、阿斯巴甜等。所述天然碳水化合物的比率在每100mL的本发明的保健饮料组合物中通常可以为约0.01g至0.04g，具体地可以为约0.02g至0.03g。

除了上述之外，保健饮料组合物可包含多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、褐藻酸、褐藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇或碳酸化剂等。除此之外，还可包含用于制备天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这种成分可独立使用或混合使用。虽然这种添加剂的比率并不是特别重要，但是通常每100重量份的本发明的保健饮料组合物中，在0.01至0.1重量份的范围内进行选择。

若本发明的食品组合物可呈现预防或改善龋病的效果，则可以以多种重量％包含本发明的肽，具体地，基于食品组合物的总重量，可包含0.00001至100重量％或0.01至80重量％的本发明的肽，但是并不限定于此。

发明效果

本发明可提供一种用于改善或治疗龋病及因其导致的痛症的用途，所述龋病包含牙根的龋病，面临脱落的幼齿的龋病、萌出中的牙齿的龋病。

本发明的另一目的在于，提供一种龋病的改善或治疗效果，增加因龋病而损伤的牙髓的治愈能力及减少炎症因子的表达，使得不发展为不可逆疼痛。

本发明可提供一种用于改善或治疗龋病的用途，在因龋病而使牙髓损伤的环境下，其通过增加成牙本质细胞的自我吞噬作用，保护牙髓及再激活成牙本质细胞来实现。

本发明的效果不限于以上提及的内容，本发明所属技术领域的具有普通知识的人可以从以下记载明确理解未提及的其它效果。

附图说明

图1a及图1b是在各个龋病环境下观察根据本发明的实施例的药学组合物中包含的肽(序列编号96)的渗透性及稳定性的结果，图1a是在作为从人拔出的牙齿，且表现出牙本质龋病(龋病的2～3阶段)阶段病情的牙齿上，涂敷结合有作为荧光色素的罗丹明的肽之后，约过一分钟之后，以4％多聚甲醛固定，利用数字低速金刚石切割机向矢状面方向以0.1mm的厚度切割制造牙齿的切片，并在共焦显微镜下观察的结果，图1b是通过MALDI-TOF分析来确认在作为龋病的病原菌的S.Mutans存在的环境下的药学组合物内的肽的稳定性的结果。

图2a是在龋病大鼠(rat)模型中按照龋病的各个阶段处理根据本发明的实施例的药学组合物的结果，图2b是在龋病大鼠模型中在罹患龋病的牙齿上处理根据本发明的实施例的药学组合物时，对炎症细胞的数量进行比较的结果。

图3是以模拟因相应于4阶段的龋病而引起的牙髓炎症的细胞实验，示出在炎症环境下对于人牙髓细胞处理根据本发明的实施例的药学组合物时，对炎症因子相关的基因表达产生的影响的图标。

图4是以模拟因相应于4阶段的龋病而引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，示出在炎症环境下对于人牙髓细胞处理根据本发明的实施例的药学组合物时，对牙髓细胞的存活率产生的影响的图标。

图5是以模拟因相应于4阶段的龋病而引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，示出在炎症环境下对于损伤的人牙髓细胞处理根据本发明的实施例的药学组合物时，对牙髓细胞的恢复产生的影响的结果。

图6是以模拟因相应于4阶段的龋病而引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，观察对于人牙髓细胞的矿化能力产生的影响的结果。

具体实施方式

如果参考后面与附图一同详细叙述的实施例，本发明的目的以及效果、用于达成其的技术构成将会明确。在说明本发明方面，当判断认为对公知功能或构成的具体说明有可能不必要地混淆本发明要旨时，将省略该详细说明。而且，后述的术语，作为考虑到在本发明中的功能而定义的术语，可根据使用者、运用者的意图或惯例等而有所不同。

但是，本发明并非限定于以下公开的实施例，可以以互不相同的多样形态体现。只是，本实施例是为了使本发明的公开更完整，为了向本发明所属技术领域的具有普通知识的人完整地说明发明的范畴而提供的，且本发明只由权利要求的范畴所定义。因此应基于本说明书整体内容而进行该定义。

以下通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是这些实施例只用于示例性地说明本发明，而不是以这些实施例限定本发明的范围。

实施例1：肽的合成

本发明人通过9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,Fmoc)方法合成表现出牙本质或牙髓组织的再生促进效果的肽(序列编号1)，并且取代所述合成的肽的氨基酸从而合成了各组的肽(表1至12)。

N-KYQRRKKNKY-C(序列编号1)

首先，组1的肽为序列编号1的肽，或以赖氨酸或精氨酸取代所述序列编号1的肽的第5至7位的氨基酸而合成(表1)。

【表1】

组1的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列编号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组2的肽(表2)。

【表2】

组2的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列编号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以酪氨酸取代第9位的氨基酸，从而合成了组3的肽(表3)。

【表3】

组3的肽

然后，以赖氨酸或精氨酸取代序列编号1的肽的第5至7位的氨基酸，并以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组4的肽(表4)。

【表4】

组4的肽

然后，以精氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，从而合成了组5的肽(表5)。

【表5】

组5的肽

然后，以精氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组6的肽(表6)。

【表6】

组6的肽

然后，以精氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组7的肽(表7)。

【表7】

组7的肽

然后，以精氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组8的肽(表8)。

【表8】

组8的肽

然后，以赖氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，从而合成了组9的肽(表9)。

【表9】

组9的肽

然后，以赖氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，从而合成了组10的肽(表10)。

【表10】

组10的肽

然后，以赖氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组11的肽(表11)。

【表11】

组11的肽

最后，以赖氨酸取代序列编号1的肽的第3位的氨基酸，并以谷氨酰胺取代第4位的氨基酸，以赖氨酸或精氨酸取代第5至7位的氨基酸，以丝氨酸取代第8位的氨基酸，以酪氨酸取代第9位的氨基酸，以赖氨酸取代第10位的氨基酸，从而合成了组12的肽(表12)。

【表12】

组12的肽

实施例2：药学组合物的制备

根据本发明的实施例的药学组合物(KH002)的制备方法如下。药学组合物(KH002)通过混合于约1.5％的羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose,西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，C5678)来进行了制备。就羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose，西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich),C5678)而言，以约3％来混合于蒸馏水，在100℃下煮沸之后，在加压条件下进行灭菌处理，制备成与在根据实施例1制备的肽中序列编号96的肽(KH001)混合时，最终浓度为约1.5％。

实施例3：在龋病环境下药学组合物的渗透性及稳定性

实施例3-1：在龋病环境下的药学组合物的渗透性

在拔出的患有牙本质龋病(龋病2～3阶段)的人的牙齿上，涂敷包含结合有作为荧光色素的罗丹明的肽(KH001)的药学组合物(KH002)，一分钟之后以4％的多聚甲醛固定。之后利用数字低速金刚石切割机向矢状面方向以约0.1mm的厚度切割制造牙齿的切片，并在共焦显微镜下进行观察(图1a)。

通过图1a可观察到染为红色的状态，并可确认根据实施例2的药学组合物中包含的肽(KH001)的成分有效渗透罹患龋病的齿质，到达至牙髓。

实施例3-2：在龋病环境下的药学组合物的稳定性分析

一.通过实施例2提供的药学组合物内的肽的稳定性分析

在本实验中使用的标准菌株变形链球菌(Streptococcus mutans(S.mutans,KCOM1054))是从韩国口腔微生物资源银行(Korean Collection of Oral Microbiology；KCOM)购买使用的。含有约20％的蔗糖的轻唾杆菌肽(mitis salivariusbacitracin(MSB；杆菌肽(bacitracin)浓度为0.5μg/ml))涂抹于琼脂平板培养基，在约37℃的烛罐(Candle jar)中培养其约48小时，在胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth(TSB；BDDIFCO，美国))培养液中培养单个菌落约24小时，并使用于实验。培养变形链球菌(S.mutans)菌株直至吸光度(OD600)值为1.0为止，在培养的100ul的菌株和1.5％的羧甲基纤维素混合100ug的药学组合物(KH002)，实施MALDI-TOF分析(UltraflexⅢTOF/TOF(Bruker Daltonics))，从而分析了按照与菌株反应的时间的药学组合物(KH002)内包含的肽(KH001)的稳定性。

二.分别按照1分钟、5分钟、15分钟、30分钟的间距获得项一的组合物，以约15,000rpm实施离心分离约10分钟并回收上清液

三.将2ul的项二中回收的各上清液与2ul的基质溶液(在0.1％TFA/CAN中添加10mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA))(1:1,v/v))混合并实施MALDI-TOF分析(UltraflexⅢTOF/TOF(Bruker Daltonics))(图1b)

通过图1b确认到，通过实施例2提供的药学组合物(KH002)内的肽(KH001)在作为龋病的病原菌的S.Mutans环境下保持稳定。

实施例4：药学组合物的按照各龋病阶段的处理结果分析

实施例4-1：准备按照各阶段的龋病的大鼠模型

在图2a，在龋病大鼠模型中将牙本质龋病的阶段，以牙本质厚度的1/3划分，分别分为初期(Early)、中期(Moderate)、后期(Advanced)，并将牙髓上方的牙本质完全罹患龋病直至侵蚀到牙髓的情况分类为最为严重的重症(Severe)阶段并分别进行了准备(n＝4)。像这样的分类，在人的龋病阶段中，初期与龋病2阶段、中期及后期与龋病3阶段、重症与龋病4阶段属于几乎类似的状态。

实施例4-2：观察按照各大鼠模型的药学组合物的处理结果

对照组是罹患龋病但未涂敷根据实施例2制备的药学组合物(KH002)的组，下面的组织照片为，在初期、中秋、后期、重症阶段，在每个牙齿涂敷3ug的药学组合物(KH002)并在4周之后牺牲大鼠，固定并脱钙之后，制作组织载片进行苏木精和伊红染色。

在未处理根据实施例2制备的药学组合物(KH002)的对照组中，在牙髓内部观察到液化性坏死，在罹患龋病的部分下方，可观察到成牙本质细胞的栅栏状态损伤，炎症细胞还扩散至牙髓内部的情况。而且，在处理药学组合物(KH002)的组中，罹患龋病的下方的成牙本质细胞均示出栅栏状态，在初期及中期阶段牙髓整体上也观察到作为健康的牙髓的特征的星形细胞，即使在牙髓上方的牙本质均罹患龋病的重症状态下，也可在牙齿根部确认到维持有健康的牙髓。

处理药学组合物(KH002)时，在所有阶段的龋病中，可观察到牙本质得到再生，在重症状态的牙齿模型中，也可观察到在保存的牙髓上方形成有作为龋病的防御作用之一的牙本质桥。

实施例4-3：根据龋病的炎症细胞观察

以百分比比较整个牙髓细胞数量与炎症细胞的数量(以个体数为基准n＝4、以牙齿数为基准n＝6)。随机指定牙髓内部的3个部位，由3名研究人员进行读取，为了准确读取实施盲法。

图2a为在龋病大鼠(rat)模型中，按照各个龋病的阶段，处理根据本发明的实施例的药学组合物的结果。参考图2a，可确认到与未处理药学组合物(KH002)的对照组相比，在处理药学组合物(KH002)的实验组中，ED1染色的炎症细胞的比率显著减少。基于这种结果，可预测药学组合物(KH002)的处理可有效恢复因龋病引起的炎症。

图2b作为在相应于人龋病3阶段的深度的大鼠龋病模型中处理药学组合物(KH002)的结果，确认了扩散到牙髓内部的炎症细胞的数量，用以定量化龋病的炎症程度，是以免疫染色化学法比较作为代表性的牙髓炎症细胞标志的ED1的结果。

实施例5：对于龋病的炎症因子的表达的影响分析

在罹患龋病后引起炎症的4阶段龋病中，为了确认药学组合物(KH002)的预防、治疗效果，在人牙髓细胞处理脂多醣(LPS(Lipopolysaccharide))及药学组合物(KH002)之后比较了炎症因子的表达。

利用人牙髓细胞的所有实验，得到了首尔大学牙科医院的器官生命伦理审议委员会(Institutional Review Board,IRB；S-D20140007)的认可，并按照该机关的指引和规制进行。从首尔大学牙科医院撰写同意书的患者拔出第三大臼齿(智齿)并分离牙髓细胞，分离方法采用的是早先报告的方法(Choung et al.,2016)。切割牙齿并用镊子分离内部的牙髓，将牙髓组织切碎到直径为60-mm的细胞培养皿中。之后用盖玻片覆盖切碎的牙髓组织，在细胞培养液中培养并分离出人牙髓细胞。将人牙髓细胞在6孔皿(well dish)中以1×10⁵cells/well进行细胞接种之后，阴性对照组只处理在培养皿中，对于阳性对照组分别只处理10μg/mL的脂多醣(LPS)、10μg/mL的药学组合物(KH002)，作为实验组，为了确认预防效果，同时处理10μg/mL的脂多醣(LPS)和10μg/mL的药学组合物(KH002)。实验组的情况下，为了确认治疗效果，先处理脂多醣(LPS)24小时之后进行了药学组合物(KH002)的处理。

为了比较炎症因子的表达，进行了RT-PCR，为了定量比较各因子的表达量，确认了与GAPDH的表达量的比率(图3)。

在人牙髓细胞只处理脂多醣(LPS)的情况下，确认到作为炎症因子的TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL10、iNOS和COX2的表达显著增加。对比于此，先处理脂多醣(LPS)后适用药学组合物(KH002)时和同时处理脂多醣(LPS)和药学组合物(KH002)时，均确认到表现出与未进行任何处理的阴性对照组类似的表达状态。这种结果示出了在罹患龋病之后引起炎症时，药学组合物(KH002)具有对于龋病相关的炎症的在预防、治疗上的缓解效果。

对于各因子的RT-PCR的引物序列如下(表13)。

【表13】

实施例6：对于牙髓细胞的存活率的影响的分析

相关于在罹患龋病之后引起炎症的4阶段龋病，确认了对于在人牙髓细胞的炎症环境下的细胞存活率的药学组合物(KH002)的效果。

为了测量细胞存活率，将人牙髓细胞在96孔板(well plate)以5×10³cells/well进行细胞接种之后，分别在第1天、第3天、第5天处理150μL的MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide solution),Medifab)约2小时之后，测量溶解于DMSO的溶液在570nm下的吸光度。

利用人牙髓细胞的所有实验，得到了首尔大学牙科医院的器官生命伦理审议委员会(Institutional Review Board,IRB；S-D20140007)的认可，并按照该机关的指引和规制进行。从首尔大学牙科医院撰写同意书的患者拔出第三大臼齿(智齿)并分离牙髓细胞，分离方法采用的是早先报告的方法(Choung et al.,2016)。切割牙齿并用镊子分离内部的牙髓，将牙髓组织切碎到直径为60-mm的细胞培养皿中。之后用盖玻片覆盖切碎的牙髓组织，在细胞培养液中培养并分离出人牙髓细胞。将人牙髓细胞在6孔皿中以1×10⁵cells/well进行细胞接种之后，阴性对照组只处理在培养皿中，对于阳性对照组分别只处理10μg/mL的脂多醣(LPS)、10μg/mL的药学组合物(KH002)，作为实验组，为了确认预防效果，同时处理10μg/mL的脂多醣(LPS)和10μg/mL的药学组合物(KH002)。实验组的情况下，为了确认治疗效果，先处理脂多醣(LPS)24小时之后进行了药学组合物(KH002)的处理。

图4是以模拟因相应于4阶段的龋病引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，示出在炎症环境下对于人牙髓细胞的药学组合物(KH002)的处理，对牙髓细胞的存活率产生的影响的图标。

以10μg/mL的浓度处理药学组合物(KH002)的实验组没有示出与阴性对照组大的差异。处理10μg/mL的脂多醣(LPS)的组与阴性对照组相比，牙髓细胞的存活率显著减少，同时处理10μg/mL的脂多醣(LPS)和10μg/mL的药学组合物(KH002)的组的牙髓细胞的存活率恢复到与阴性对照组类似的程度。

这样的结果意味着，在罹患龋病之后引起炎症时，药学组合物(KH002)通过提高人牙髓细胞的存活率可提供保护牙髓及缓解炎症的功能。

实施例7：对于牙髓细胞的恢复的影响的分析

确认了在人牙髓细胞的伤口愈合模型中，在炎症环境下和药学组合物(KH002)处理时，对伤口愈合能力产生的影响。

将人牙髓细胞在6孔板中以1×10⁵cells/well进行接种之后，次日以200uL的移液管尖端刮擦中央部分之后，在24小时之后，比较了细胞生长进来的速度。

利用人牙髓细胞的所有实验，得到了首尔大学牙科医院的器官生命伦理审议委员会(Institutional Review Board,IRB；S-D20140007)的认可，并按照该机关的指引和规制进行。从首尔大学牙科医院撰写同意书的患者拔出第三大臼齿(智齿)并分离牙髓细胞，分离方法采用的是早先报告的方法(Choung et al.,2016)。切割牙齿并用镊子分离内部的牙髓，将牙髓组织切碎到直径为60-mm的细胞培养皿中。之后用盖玻片覆盖切碎的牙髓组织，在细胞培养液中培养并分离出人牙髓细胞。将人牙髓细胞在6孔皿中以1×10⁵cells/well进行细胞接种之后，阴性对照组只处理在培养皿中，对于阳性对照组分别只处理10μg/mL的脂多醣(LPS)、10μg/mL的药学组合物(KH002)，作为实验组，为了确认预防效果，同时处理10μg/mL的脂多醣(LPS)和10μg/mL的药学组合物(KH002)。实验组的情况下，为了确认对于牙髓细胞的恢复产生的效果，先处理脂多醣(LPS)24小时之后进行了药学组合物(KH002)的处理。

采用10x的物镜，以光学显微镜拍摄细胞的照片，拍摄的照片采用ImageJ程序进行分析。

图5是以模拟因相应于4阶段的龋病引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，示出在炎症环境下对于损伤的人牙髓细胞处理根据本发明的实施例的药学组合物时，对牙髓细胞的恢复产生的影响的结果。

将实验组的伤口愈合能力定量化为与对照组的比率的结果，只处理药学组合物(KH002)的组与对照组没有大的差异，但处理脂多醣(LPS)的组的伤口愈合能力显著降低为对照组的50％的程度。同时处理脂多醣(LPS)和药学组合物(KH002)的组中，伤口愈合能力恢复至约90％，因此可确认药学组合物(KH002)在龋病引起的炎症环境下也可恢复人牙髓细胞的伤口愈合能力。

实施例8：对于牙髓细胞的矿化能力的影响分析

确认了在罹患龋病之后引起炎症时，进行药学组合物(KH002)处理对于人牙髓细胞的矿化能力产生的影响。

为此，将人牙髓细胞分别在6孔皿中以1×10⁵cells/well进行接种之后，从次日开始，在含有抗坏血酸(50μg/mL)、β-甘油磷酸(10mM)的分化培养基中培养了7天、14天、21天。

利用人牙髓细胞的所有实验，得到了首尔大学牙科医院的器官生命伦理审议委员会(Institutional Review Board,IRB；S-D20140007)的认可，并按照该机关的指引和规制进行。从首尔大学牙科医院撰写同意书的患者拔出第三大臼齿(智齿)并分离牙髓细胞，分离方法采用的是早先报告的方法(Choung et al.,2016)。切割牙齿并用镊子分离内部的牙髓，将牙髓组织切碎到直径为60-mm的细胞培养皿中。之后用盖玻片覆盖切碎的牙髓组织，在细胞培养液中培养并分离出人牙髓细胞。将人牙髓细胞在6孔皿中以1×10⁵cells/well进行细胞接种之后，对于阴性对照组只处理在培养皿中，对于阳性对照组分别只处理10μg/mL的脂多醣(LPS)、10μg/mL的药学组合物(KH002)，作为实验组，为了确认预防效果，同时处理10μg/mL的脂多醣(LPS)和10μg/mL的药学组合物(KH002)。实验组的情况下，为了确认对于矿化能力产生的效果，先处理脂多醣(LPS)24小时之后进行了药学组合物(KH002)的处理。

为了比较矿化基质的量，以4％的PFA在4℃下固定过夜之后，将校正为pH4.2的40mM的茜素红(alizarin red)S在25℃下处理30分钟。之后适用溶解于0.5N的盐酸的0.5mL的十二烷基硫酸钠，在摇床处理30分钟后，在405nm下测量了吸光度。

图6是以模拟因相应于4阶段的龋病引起牙髓炎症时的情况的细胞实验，观察对于人牙髓细胞的矿化能力产生的影响的结果。参考图6，与对照组相比，处理药学组合物(KH002)的组，在第21天矿物结节的大小增加，在第7天、第14天、第21天矿化基质的量也显著增加。相比于其，在处理脂多醣(LPS)的组中，第21天的矿物结节的大小和在第7天、第14天、第21天矿化基质的量相比于对照组显著减少。同时处理脂多醣(LPS)和药学组合物(KH002)的组与处理脂多醣(LPS)的组相比，在第21天的矿物结节的大小增加，矿化基质的量在第7天、第14天恢复到与阴性对照组几乎类似的程度。在实验组的情况下，经过21天之后，虽然未能恢复得与对照组相同，但与只处理脂多醣(LPS)的组相比，表现出统计学意义的增加。通过这样的结果，确认到药学组合物(KH002)在因龋病引起的炎症环境状态下的人牙髓细胞中，恢复及提升成牙本质细胞的牙本质分泌能力，使得可提供恢复损伤的牙本质的厚度的效果。

根据本发明的实施例的药学组合物可防止或预防难以适用常规龋病的治疗方法的老年层的牙根龋病，将幼年和少年患者中出现龋病的幼齿维持到脱落时期为止等，可使用于各种龋齿疾病的预防及治疗。

而且，根据本发明的实施例的药学组合物的情况下，作为严重的龋病阶段，在引发以常规的龋病治疗无法恢复到自然牙齿状态的炎症的情况下，也可保护成牙本质细胞，并能够一并提供全新形成的成牙本质细胞的自我吞噬作用，由此能够提供通过牙髓细胞的保护来治疗龋病的效果。

在本说明书和附图中公开了本发明的优选实施例，虽然使用了特定的术语，但这仅仅是为了容易地说明本发明的技术内容并为了有助于理解发明而以一般的含义进行使用的，并非用于限定本发明的范围。除了在此公开的实施例之外，也可实施基于本发明的技术思想的其他变形例，这对于本发明所属技术领域的具有普通知识的人是显而易见的。

Claims (8)

1.一种用于预防或治疗龋病的药学组合物，其作为有效成分包含由下述通式1的氨基酸序列组成的肽，其中，

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8(通式1)

在所述通式1中，

R1为精氨酸(R)、赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)；

R2为精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)；

R3、R4及R5分别为精氨酸(R)或赖氨酸(K)；

R6为天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)；以及

R7及R8为赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。

2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗龋病的药学组合物，其特征在于，

所述肽由序列编号1至96中的任意一个氨基酸序列构成。

3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗龋病的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物包含所述肽重复连接的多肽。

4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗龋病的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物包含对于口腔细菌具有抗菌作用的药物与所述肽相结合的复合物。

5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗龋病的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物还包含药学上接受的载体、赋形剂或稀释剂。

6.一种包含权利要求1或2所述的肽的用于预防或改善龋病的医药外品组合物。

7.一种包含权利要求1或2所述的肽的用于预防或改善龋病的保健功能性食品组合物。

8.一种预防或治疗龋病的方法，其使用用于预防或治疗龋病的药学组合物处理除了人以外的个体，其中，作为有效成分包含由下述通式1的氨基酸序列组成的肽，

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8(通式1)

在所述通式1中，

R1为精氨酸(R)、赖氨酸(K)或谷氨酰胺(Q)；

R2为精氨酸(R)或谷氨酰胺(Q)；

R3、R4及R5分别为精氨酸(R)或赖氨酸(K)；

R6为天冬酰胺(N)或丝氨酸(S)；以及

R7及R8为赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。