CN1189750C - 色谱检定片及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的色谱检定片10具有：添加液体试样的试样添加部位2、保持标识试剂的标识物保持部位3、标识试剂与分析对象起结合反应的反应层4、反应层4区域中保持特异性蛋白质的特异性蛋白固定化部位5、吸收试样的吸水部位6。干燥时能呈固态的表面活性剂溶液渗透到上述反应层4后，进行干燥处理则得到所述的色谱检定片。这样构成的色谱检定片10能够实现反应层4的渗透速度和渗透性的提高、渗透的均匀化以及测定性能的提高。

Description

色谱检定片及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种定性或定量分析液体试样用的色谱检定片及其制造方法，尤其涉及使液体试样在检定片上均匀展开的色谱检定片及其制造方法。

背景技术

迄今，利用抗原抗体反应、酶反应的色谱检定法正被广泛用作实施水质检测、尿液检查等液体试样的化验或临床检查的方法。通常所谓色谱(或层析)法，是指按其构成成分分离混合物的方法。

图8示出迄今借助色谱法测定中使用的色谱检定片。

图8中的色谱检定片100具有：支承色谱材料的反应层承载基片101、添加液体试样的试样添加部位102、保持可借液体试样的浸渍而移动的标识试剂的标识物保持部位103、具有与分析对象(含在流动的液体试样中)发生特异性结合的物质的标识试剂和分析对象起结合反应的反应层104、起特异性结合反应(在反应层104的区域，就反应形式来讲，与诸如抗体或抗原的分析对象起特异性结合反应)而使特异性蛋白固定化的特异性蛋白固定化部位105、以及吸收流动的液体试样的吸水部位106。

下面，就迄今借助色谱检定片100的测定方法进行说明。

当液体试样添加在试样添加部位102时，该液体试样就渗进试样添加部位102，达到标识物保持部位103。接着，保持在标识物保持部位103区域的标识试剂借助液体试样的渗透而溶解，与液体试样一起渗进反应层104。在反应层104区域上有特异性蛋白质固定化的特异性蛋白固定化部位105，当上述液体试样含有分析对象时，该特异性蛋白质与分析对象-标识试剂复合体起抗原抗体反应，在特异性蛋白固定化部位105区域可见某些显色反应。用目测法或检测装置测定该显色反应。而当液体试样不含分析对象时，就不起抗原抗体反应，也不见显色反应。然后，液体试样最终被吸水部位106吸收，反应结束。如上所述，借助色谱检定片的测定方法，检定结果(显色反应)极易判定，应用范围广，能适合于各种分析对象的检定。但是，借助色谱检定片的测定是使液体试样在上述检定片上展开、确认显色反应，所以为得到正确的测定结果，该检定片上的液体试样必须有比较均匀的展开形状。而且由于液体试样的展开速度会影响反应层104中标识试剂与该液体试样的反应，所以也需要提高液体试样对该反应层104的渗透性。

作为色谱检定片迄今的例子，可以举出例如特开昭62-71861和特开平11-153601号公报。

在特开昭62-71861中公开了在用免疫原理的测定中添加亲水亲油平衡(HLB)值大于20的表面活性剂来促进反应从而迅速检出分析对象的方法，而且，特开平11-153601中公开了在试样添加部位至反应层之间设置一个保持表面活性剂等的添加剂浸渍部位，防止底色着色、空白发生的信噪(S/N)比降低和误动作从而正确、迅速地检出分析对象的方法。

但是，迄今为止，由于色谱检定片没有机械上控制液体试样的渗透速度的手段，所以不能人为地控制渗透速度，液体试样的渗透速度不得不受检定片的渗透性左右。因此，液体试样渗透检定片需要很长时间，且向反应层104的渗透不均匀，在特异性蛋白固定化部位105等的反应成分固定化部位上产生一些未渗透区，导致测定的正确性不足。解决的办法是用表面活性剂处理色谱检定片，设法提高其渗透性，但在上述表面活性剂处理中所用的表面活性剂本来是液态或糊状的，让它干燥到绝干状态是不可能的。由此，在色谱检定片的保存期间出现了诸如固定化抗体渐渐失活、检定片的性能恶化、品质保持期缩短或保管条件受到限制等问题。

再者，色谱测定是在检定片上添加液体试样后经过一定时间起显色反应的显色区域上进行的，因此，用表面活性剂处理检定片时，标识试剂与反应层104发生非特异性吸附而作为底色残留在反应层上，用检测仪测定该显色区域时，此底色值给显色度带来误差，发生定量性能降低的问题。而且，用目测法判断显色反应时，底色的显色使显色状况的判断发生错误。

再者，采用特开昭62-71861中公开的方法时，检定片的渗透性和渗透速度确因HLB值大于20的表面活性剂的添加而得到提高，但由于其渗透速度过快，测定所需的反应进行得不充分，发生了测定正确性不足的问题。

再者，特开平11-153601中公开了用表面活性剂浸渍检定片上反应层以前的部位，特异性蛋白固定化部位等的反应成分固定化部位上没有表面活性剂，所以减轻底色的影响且检定片的反应成分不致失活或变性。但是，在渗透过程中，由于试样没有充分渗透到固定化区域中的反应成分中而使反应不均匀，导致其测定的正确性不足。

鉴于上述问题，本发明的目的是提供一种底色中标识试剂残留量降至最低、反应性因液体试样渗透性的提高和液体试样更均匀的展开而提高，而且保存稳定性提高的色谱检定片及其制造方法。

发明内容

(1)一种色谱检定片，它是用可湿性多孔材料多层层合而成或用单层多孔材料构成，至少一种色谱分析用的反应成分被固定的反应层含有干燥时能呈固态的表面活性剂。

因此，借助反应层渗透性的提高、试样均匀渗透，能够提高色谱检定片的反应性，所以能够实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。再者，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分失活，能够实现上述色谱检定片保存稳定性的提高、品质保持期的延长以及保管条件的缓和。

(2)(1)的色谱检定片，所述表面活性剂中含有HLB值在20以下的表面活性剂。

因此，连(1)的效果在内，还能防止反应层液体试样浸渍速度过快而反应不充分，并借助选择上述HLB值，调节到适中的反应速度，就能实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。

(3)(1)或(2)的色谱检定片，所述表面活性剂中含有非离子表面活性剂。

因此，连同(1)的效果在内，还能防止标识试剂非特异性吸附在反应层上，防止标识试剂作为底色残留在反应层上，所以依靠更高灵敏度、更高性能的色谱检定片的测定成为可能。

(4)(1)-(3)任一项的色谱检定片，所述表面活性剂中含有胆酸系表面活性剂。

因此，连同(1)的效果在内，还能减弱对蛋白质的影响，能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质的变性或失活，实现反应层的长期性能保持。

(5)(1)-(4)任一项的色谱检定片，所述表面活性剂中含有亲水部分带糖的表面活性剂。

因此，连同(1)的效果在内，还能因糖的作用提高溶解性，增强渗透性，且能够降低对蛋白质的影响，所以能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质的变性或失活，能实现反应层的长期性能保持。

(6)(1)-(5)任一项的色谱检定片，所述反应层作为整体，全部含有上述表面活性剂。

因此，借助反应层渗透性的提高和试样均匀的渗透，能提高色谱检定片的反应性，能实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。并且，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分失活，能够实现色谱检定片保存稳定性的提高、品质保持期的延长以及保管条件的缓和。

(7)(1)-(5)任一项的色谱检定片，所述反应层的一部分含有上述表面活性剂。

因此，借助反应层渗透性的提高和试样均匀的渗透，能提高色谱检定片的反应性，能实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。并且，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分失活，实现色谱检定片保存稳定性的提高、品质保持期的延长以及保管条件的缓和。

(8)一种色谱检定片制造方法，在具有至少一种色谱分析用反应成分被固定化的反应层的色谱检定片制造方法中，包括：用干燥时能呈固态的表面活性剂溶解得到的表面活性剂溶液浸渍或涂布上述色谱检定片反应层的工序，和使上述浸渍或涂布在上述反应层上的表面活性剂溶液干燥的工序。

因此，借助反应层渗透性的提高和试样均匀的渗透，能提高色谱检定片的反应性，能制出更高灵敏度、更高性能的色谱检定片。并且，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分失活，制出实现保存稳定性提高、品质保持期延长以及保管条件缓和的色谱检定片。

(9)(8)的色谱检定片制造方法，所述表面活性剂中含有HLB值在20以下的表面活性剂。

因此，连(8)的效果在内，还能防止反应层液体试样渗透速度过快而反应不充分，并借助选择上述HLB值，调节到适中的反应速度，就能制出更高灵敏度、更高性能的色谱检定片。

(10)(8)或(9)的色谱检定片制造方法，所述表面活性剂中含有非离子表面活性剂。

因此，连(8)的效果在内，还能避免标识试剂非特异性吸附到反应层上，防止标识试剂残留在反应层上形成底色，所以能制出更高灵敏度、更高性能的色谱检定片。

(11)(8)-(10)任一项的色谱检定片制造方法，所述表面活性剂中含有胆酸系表面活性剂。

因此，连(8)的效果在内，能减弱对蛋白质的影响，能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质的变性或失活，制出长期保持性能的色谱检定片。

(12)(8)-(11)任一项的色谱检定片制造方法，所述表面活性剂中含有亲水部分带糖的表面活性剂。

因此，连(8)的效果在内，还能因糖的作用提高溶解性，增强渗透性，且减小对蛋白质的影响。所以能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质变性或失活，制出长期保持性能的色谱检定片。

(13)(8)-(12)任一项的色谱检定片制造方法，其中上述反应层的干燥是自然干燥。

因此，连(8)的效果在内，还能将固定在反应层上的反应成分的负载抑制得较低，能制出可长期保持经过处理的反应层性能的色谱检定片。

(14)(8)-(12)任一项的色谱检定片制造方法，其中上述反应层的干燥是通风干燥。

因此，连(8)的效果在内，还能缩短所需的干燥时间，能最大限度抑制干燥中固定化的反应成分失活或变性，能制出可以长期保持经过处理的反应层性能的色谱检定片。

(15)(8)-(12)任一项的色谱检定片制造方法，其中上述反应层的干燥是冷冻干燥。

因此，连(8)的效果在内，还能大致保持固定化反应成分的性质，能制出长期保持经过处理的反应层性能的色谱检定片。

(16)(8)-(15)任一项的色谱检定片制造方法，其中用上述表面活性剂溶液浸渍或涂布上述反应层的全部。

因此，借助反应层渗透性的提高和试样均匀的渗透，能提高色谱检定片的反应性，能制出更高灵敏度、更高性能的色谱检定片。并且，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分的失活，能够制出实现保存稳定性提高、品质保持期延长以及保管条件缓和的色谱检定片。

(17)(8)-(15)任一项的色谱检定片制造方法，其中用上述表面活性剂溶液浸渍或涂布上述反应层的一部分。

因此，借助反应层渗透性的提高和试样均匀的渗透，能提高色谱检定片的反应性，能制出更高灵敏度、更高性能的色谱检定片。并且，借助把干燥时能呈固态的表面活性剂用作上述表面活性剂，就能最大限度抑制固定在反应层上的反应成分的失活，能够制出实现保存稳定性提高、品质保持期延长以及保管条件缓和的色谱检定片。

附图说明

图1按照本发明实施方式1的横向型色谱检定片构成透视图

图2按照本发明实施方式2的纵向型色谱检定片构成透视图

图3按照本发明实施方式2的纵向型色谱检定片透视图

图4按照本发明实施方式2的纵向型色谱检定片透视图

图5按照本发明实施方式2的使用酶的纵向型色谱检定片构成透视图

图6按照本发明实施方式2的使用酶的纵向型色谱检定片透视图

图7按照本发明实施例制得检定片的定量性能示意图：(a)不用表面活性剂处理反应层的场合，(b)用表面活性剂处理的场合

图8迄今的色谱检定片构成透视图

具体实施方式

以下，就本发明的实施方式，参照附图进行说明。不过，此处所示的实施方式毕竟只是一个例子，本发明并不限于这些实施方式。

实施方式1

图1示出，按照本发明的实施方式1，用可湿性单层多孔材料制成的横向型色谱检定片。

图1中，横向型色谱检定片10具有：反应层承载基片1、试样添加部位2、标识物保持部位3、反应层4、特异性蛋白固定化部位5以及吸水部位6。

反应层承载基片1用不透过液体的塑料等制成，用来承载色谱材料。试样添加部位2是用吸收能力强的无纺布等制成的，液体试样就添加或涂布在这个部位上。标识物保持部位3把能溶于液体试样的标识试剂保持在无纺布等上面。反应层4是用硝化纤维素等制成的，而且用干燥时能呈固态的表面活性剂溶解得到的表面活性剂溶液浸渍后干燥。此处所示的表面活性剂是一类能够改变界面或表面诸性质的物质总称，其分子内有与水分子亲合性强的亲水基，和与水分子亲合性弱的疏水基，而且所谓上述干燥时能呈固态的表面活性剂指的是将高浓度状态的表面活性剂在真空中或冷冻干燥或常压加热或常温常压诸条件下干燥时，能成为块、粒、粉末的固体状态的表面活性剂。并且，所谓对反应层4的浸渍处理，是指用表面活性剂溶液浸渍反应层4。特异性蛋白固定化部位5是把特异性蛋白质固定化在上述反应层4的区域上，该蛋白质就反应形式来讲，与象抗体或抗原那样的分析对象特异性地发生结合反应。吸水部位6是最终吸收液体试样的部位。然后，把上述试样添加部位2、标识物保持部位3、具有特异性蛋白固定部位5的反应层4以及吸水部位6粘贴在上述反应层承载基片1的上部，就形成了上述横向型色谱检定片10。

上述色谱检定片10上的标识物保持部位3上保持的标识试剂、以及上述特异性蛋白固定化部位5上固定的特异性蛋白质两者，必须根据分析试样以及分析对象作出恰当的选择。

在浸渍上述反应层4的表面活性剂溶液中适用的表面活性剂包括干燥时呈固态、且HLB值在20以下的表面活性剂、或非离子表面活性剂、胆酸系表面活性剂、亲水部分含糖的表面活性剂等。

此处就适用于上述表面活性剂溶液的表面活性剂举出更优选的例子，就含HLB值在20以下表面活性剂的物质而言，更优选的是那种含HLB值接近20且有多个亲水基的表面活性剂的物质。并且就含上述胆酸系表面活性剂的物质而言，更优选的是采用那种含以N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺或N，N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)脱氧胆酰胺等胆酸为母核的表面活性剂物质。而且就含上述亲水部分带糖的表面活性剂的物质而言，更优选的是那种含带蔗糖单月桂酸酯或正辛基-β-D-硫葡糖苷等糖链的表面活性剂的物质。但是上述各表面活性剂的名称，不过是举个例子而已。

还有，对上述反应层4的表面活性剂处理，既可按表面活性剂溶液浸渍反应层4的浸渍处理进行，也可按表面活性剂溶液涂布反应层4的涂布处理进行。而且对上述反应层4的表面活性剂处理，既可对反应层4的一部分进行，也可对其整体进行。

并且，就渗进反应层4中的表面活性剂溶液的干燥处理而言，有例如常温常压放置干燥的自然干燥、任意温度下施加一定风力进行干燥的通风干燥、或冷冻干燥等。

然后，任意多孔载体构成的色谱材料诸如硝化纤维素、玻璃纤维滤纸等用作上述横向型色谱检定片10。

其次，就使用本实施方式1的横向型色谱检定片10的色谱分析方法进行说明。

图1中，当液体试样添加在试样添加部位2时，该液体试样就渗进试样添加部位2，到达标识物保持部位3。其次，保持在标识物保持部位3区域的标识试剂由于液体试样的浸渍而溶解，与液体试样一起浸渍反应层4。然后，与液体试样的浸渍同时，含在反应层4中的表面活性剂溶解。在溶解的表面活性剂的作用下，反应层4中的浸润加速进行。对于液体试样的渗透，渗透的液体的前端以均匀的状态且无滞后地前进。在反应层4的区域，存在着特异性蛋白质固定化的特异性蛋白固定化部位5，当液体试样含有分析对象时，特异性蛋白质与分析对象-标识试剂复合体起抗原抗体反应，在特异性蛋白固定化部位5的区域可见某些显色反应。当液体试样不含分析对象时，就不起抗原抗体反应，也不见显色反应。然后液体试样最终被吸水部位6吸收，反应结束。

如上所述，按照本实施方式1制得的横向型色谱检定片10，借助表面活性剂溶液对色谱检定片10上的反应层4的浸渍处理和干燥处理，色谱检定片10的渗透性得到提高，更均匀的渗透成为可能。此渗透性的提高及液体试样的均匀渗透能够获得的效果是，使色谱检定片10上的反应性提高，实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。

而且，作为用于浸渍反应层4的表面活性剂溶液的表面活性剂，借助选用含有干燥时能呈固态的表面活性剂的物质，反应层4就能处于完全干燥状态一直到添加的液体试样渗透反应层4为止，因此能最大限度抑制固定化特异性蛋白质的失活，能够实现色谱检定片10保存稳定性的提高、品质保持期的延长以及保管条件的缓和。

再者，借助采用含HLB值在20以下的表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，就能避免上述反应层4中液体试样的渗透速度过快而反应不充分。而且，如能选择上述HLB值来调节到适中的反应速度，就能实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。

再者，借助采用含非离子表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，就能避免标识试剂非特异性吸附到上述反应层4上，因此能防止标识试剂残留在反应层4上形成底色而导致特异性蛋白固定化部位5的显色反应的测定出现误差。其结果，色谱检定片10使更高灵敏度、更高性能的测定成为可能。

再者，借助采用含胆酸系表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，就能减弱对蛋白质的影响，能最大限度抑制上述特异性蛋白固定化部位5的固定化特异性蛋白质的变性或失活，能实现上述反应层4的长期性能保持。

再者，借助采用含亲水部分带糖的表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，因糖的作用提高溶解性，增强渗透性，且对蛋白质的影响小，因此能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质的变性或失活，能实现上述反应层4的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层4的自然干燥，能将固定在该层上的特异性蛋白质的负载抑制得较低，能实现上述检定片10的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层4的通风干燥，能够缩短干燥时间，能最大限度抑制特异性蛋白质在干燥期的失活或变性，实现检定片10的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层4的冷冻干燥，能够大致保持特异性蛋白质的性质，实现检定片10的长期性能保持。

还有，在本实施方式1中，对色谱分析使用的反应成分-特异性蛋白质已经举例说明。但是，在反应前后发生某些变化的物质，例如酶，也可用作上述反应成分。此时，用上述酶来代替特异性蛋白质，固定在上述横向型色谱检定片10的上述特异性蛋白固定化部位5上，用与上述酶起反应的反应试剂来代替标识试剂，保持在上述标识物保持部位3上，该反应试剂能溶于液体试样并能与测定对象结合。

实施方式2

以下，就按照本发明的实施方式2的纵向型色谱检定片，参照图2、图3及图4进行说明。

图2为表示本实施方式2的可湿性多孔材料多层层合而成的纵向型色谱检定片构成的透视图。图3为表示从试样添加部位一侧所见的纵向型色谱检定片的透视图。图4为表示从最终吸收试样的吸水部位一侧所见的纵向型色谱检定片的透视图。

在图2中，纵向型色谱检定片20具有：试样添加部位11、标识物保持部位12、表面活性处理部位8、特异性蛋白固定化部位13、反应层14及吸水部位15。

试样添加部位11是用吸收能力强的无纺布等制成的，液体试样就添加或涂布在此部位上。标识物保持部位12是把可溶的标识试剂保持在无纺布等上面。反应层14是用硝化纤维素等制成的，在其区域上具有表面活性处理部位8和标识物保持部位13。上述表面活性处理部位8是用干燥时能呈固态的表面活性剂溶解形成的表面活性剂溶液涂布上述反应层14后再进行干燥处理得到的。此处所示的表面活性剂及上述干燥时能呈固态的表面活性剂是实施方式1中述及的物质。特异性蛋白固定化部位13是将特异性蛋白质固定在上述反应层14的表面活性处理部位8的区域上的部位，该蛋白质就反应形式来讲，与分析对象如抗体或抗原发生特异性结合反应。吸水部位15设有一个“结果确认窗”16，该窗用于观察上述反应层14上的反应结果，液体试样最终在此被吸收。然后，使上述试样添加部位11、标识物保持部位12、包含特异性蛋白固定化部位13及表面活性处理部位8的反应层14、以及吸水部位15层合，形成纵向型色谱检定片20。

上述纵向型色谱检定片20的标识物保持部位12上保持的标识试剂、以及上述特异性蛋白固定化部位13上固定的特异性蛋白质两者，必须根据分析试样以及分析对象作出恰当的选择。

再者，对上述反应层14的表面活性剂处理，既可按表面活性剂溶液涂布反应层14的涂布处理进行，也可按实施方式1中表面活性剂溶液浸渍反应层14的浸渍处理进行。而且对上述反应层14的表面活性剂处理，既可按本实施方式2对反应层14的一部分进行，也可按实施方式1对反应层整体进行。

而且，对上述反应层14涂布的表面活性剂溶液中所含的表面活性剂、上述表面活性剂溶液涂布在反应层14后的干燥处理以及上述纵向型色谱检定片20的材料，都与实施方式1相同，所以此处从略。

其次，就使用本实施方式2的纵向型色谱检定片20的色谱分析方法进行说明。

在图2、图3及图4所示纵向型色谱检定片20上，当液体试样添加在试样添加部位11时，该液体试样就渗进试样添加部位11，到达标识物保持部位12。然后，保持在标识物保持部位12区域的标识试剂由于液体试样的浸渍而溶解，与液体试样一起渗进反应层14。然后，与液体试样的浸渍同时，含在表面活性处理部位8中的表面活性剂溶解。在溶解的表面活性剂的作用下，反应层14的浸润加速进行。对于液体试样的渗透，渗透的液体的前端以均匀的状态且无滞后地前进。在反应层14的区域，存在着特异性蛋白质固定的特异性蛋白固定化部位13，当液体试样含有分析对象时，特异性蛋白质与分析对象-标识试剂复合体起抗原抗体反应，在特异性蛋白固定化部位13区域可见某些显色反应。此显色反应通过设在吸水部位15上的“结果确认窗”16能够见到。当液体试样不含分析对象时，就不起抗原抗体反应，也不见显色反应。然后，液体试样最终被吸水部位15吸收，反应结束。

如上所述，按照本实施方式2制得的纵向型色谱检定片20，借助表面活性剂溶液对纵向型色谱检定片20的浸渍处理和干燥处理，使反应层14的渗透性得到提高，更均匀的渗透成为可能。此渗透性的提高及均匀渗透获得的效果是，使色谱检定片20的反应性提高，实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。

而且，作为用于涂布反应层14的表面活性剂溶液的表面活性剂，借助选用含干燥时能呈固态的表面活性剂的物质，反应层14就能处于完全干燥状态一直到添加的液体试样浸透反应层14为止，因此能最大限度抑制固定化特异性蛋白质的失活，实现色谱检定片20保存稳定性的提高、品质保持期的延长以及保管条件的缓和。

再者，借助采用含HLB值在20以下的表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，能避免上述反应层14的液体试样的渗透速度过快而反应不充分。而且，如选择上述HLB值来调节反应速度达到适中，就能实现更高灵敏度、更高性能的色谱测定。

再者，借助采用含非离子表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，就能避免标识试剂非特异性吸附到上述反应层14上，因此能防止标识试剂残留在反应层14上形成底色而导致特异性蛋白固定化部位13的显色反应的测定出现误差。其结果，色谱检定片20使更高灵敏度、更高性能的测定成为可能。

再者，借助采用含胆酸系表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，就能减弱对蛋白质的影响，最大限度抑制上述特异性蛋白固定化部位13上固定化的特异性蛋白质的变性或失活，实现上述表面活性处理部位8的长期性能保持。

再者，借助采用含亲水部分带糖的表面活性剂的物质作为上述表面活性剂，因糖的作用而提高溶解性，增强渗透性且对蛋白质的影响小，因此能最大限度抑制固定化的特异性蛋白质的变性或失活，实现上述表面活性处理部位8的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层14的自然干燥，能将固定在该层上的固定化特异性蛋白质的负载抑制得较低，实现检定片20的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层14的通风干燥，能够缩短干燥时间，能最大限度抑制特异性蛋白质在干燥期的失活或变性，实现检定片20的长期性能保持。

再者，借助进行上述反应层14的冷冻干燥，能够大致保持特异性蛋白质的性质，实现检定片20的长期性能保持。

再者，在本实施方式2中，对色谱分析使用的反应成分-特异性蛋白质已经举例说明。但与实施方式1相同，在反应前后发生某些变化的物质，例如酶，也可用作上述反应成分。

此处，参照图5、图6，就酶用作反应成分的色谱分析方法进行说明。

图5及图6为表示用酶的纵向型色谱检定片构成的透视图。

色谱检定片30具有：试样添加部位11、反应试剂浸渍部位17、反应层14、表面活性处理部位8、酶固定化部位7及吸水部位15。上述反应试剂浸渍部位17把能溶于添加在试样添加部位11的液体试样的反应试剂保持在无纺布等上面，上述酶固定化部位7把酶固定化保持在反应层14区域上，该酶从反应形式来讲，与分析对象发生结合反应。还有，在上述色谱检定片30中，除上述酶固定化部位7及反应试剂浸渍部位17以外，上述试样添加部位11、反应层14、表面活性处理部位8、吸水部位15，都与上述纵向型色谱检定片20相同，所以此处从略。

上述用酶的纵向型色谱检定片30的色谱分析方法与上述纵向型色谱检定片20相同。当液体试样含有分析对象时，浸渍在反应试剂浸渍部位17的反应试剂与固定在酶固定化部位7的酶发生作用，在酶固定化部位7的区域可见某些显色反应。

再者，与纵向型色谱检定片20相同，这种使用酶的色谱检定片30也是用干燥时能呈固态的表面活性剂溶解形成的表面活性剂溶液涂布反应层14后再干燥处理得到的。这样能获得与上述纵向型色谱检定片20所得效果同样的效果。

实施例

参照以下实施例，对本发明的实施方法进行更详细的说明。

血浆中hCG的定量

制造一种横向型免疫色谱检定片，其中，在硝化纤维素膜中包括抗hCG-β抗体固定化线、及抗hCG-α抗体与胶态金复合物的宽带。此检定片示于图1。图中的检定片10在作为硝化纤维素膜的反应层4上包括作为抗hCG-β抗体固定化线的特异性蛋白固定化部位5、其前方的作为含抗hCG-α抗体与胶态金复合物区域的标识物保持部位3、其前后的由无纺布构成的试样添加部位2、玻璃纤维滤纸制成的吸水部位6。此检定片10的制法如下。

实施例1

横向型免疫色谱检定片的制备

用磷酸缓冲溶液稀释调节浓度，制备抗hCG-β抗体溶液。用溶液放出装置将此抗体溶液涂布在硝化纤维素膜上。从而在硝化纤维素膜上制得检定用抗体固定化线。待此硝化纤维素膜干燥后，将其浸渍在含1％脱脂乳的三(羟甲基)甲胺(Tris-HCl)缓冲液中缓缓摇动30分钟。30分钟后，使上述硝化纤维素膜在Tris-HCl缓冲液槽中移动，缓缓摇动10分钟后，转入另一Tris-HCl缓冲液槽中再缓缓摇动10分钟，完成硝化纤维素膜的洗净操作。二次洗净后，将其浸渍在含0.05％蔗糖单月桂酸酯(同仁化学公司制)的Tris-HCl缓冲液中缓缓摇动10分钟，然后将上述硝化纤维素膜从液槽中取出，室温下干燥。从而在作为反应层4的硝化纤维素膜上制得特异性蛋白固定化部位5。

胶态金的制法如下：向0.01％氯金酸的100℃的回流溶液中添加1％柠檬酸溶液，回流30分钟后冷却，用0.2M K₂CO₃溶液调到pH9。向所得胶态金溶液中添加抗hCG-α抗体，搅拌数分钟后，加10％牛血清清蛋白(BSA)溶液(pH9)，其用量使其最终浓度为1％，经搅拌制得抗体胶态金复合物(标识抗体)。将上述标识抗体溶液经4℃、20000G下离心分离50分钟，使标识抗体从上述抗体溶液中离析出来，将其悬浮在洗净缓冲液(1％BSA·磷酸缓冲液)中后，进行上述离心分离操作，将标识抗体洗净离析出来。将此标识抗体悬浮在洗净缓冲液中，用0.8μm过滤器过滤后，配制成当初胶态金溶液量的十分之一，于4℃下贮藏。

将上述标识抗体溶液放置在溶液放出装置中，在离开抗hCG-β抗体固定化干燥膜上的抗体固定化位置的位置上涂布后，使膜干燥。从而在固定化膜上制得标识抗体保持部位3。

把这样制备的含标识抗体保持部位3的抗体固定化膜粘贴在反应层承载基片1上，附加上无纺布作为试样添加部位2、玻璃纤维滤纸作为吸水部位6，然后切割成0.5cm宽的细片，从而制得检定片10。

实施例2

试样的制备

加入了抗凝血剂肝素的人血液经4000rpm的转速离心分离5分钟，分离出血细胞，制得血浆。把已知浓度的hCG溶液加到此血浆中以制备各种已知浓度的hCG溶液。

实施例3

免疫色谱检定片上显色程度的测定

把200μl以上的含hCG血浆添加到检定片10上的试样添加部位1上，向吸水部位6方向作展开处理，使发生抗原抗体反应，在抗hCG-β抗体被固定的特异性蛋白固定化部位5起显色反应。然后用反射分光光度计(CS9300；岛津制作所制)仪表测定从试样加到上述检定片10起5分钟后的显色状况，计算出显色度。

在本实施例中，将含0、100、1000、10000U/l hCG的血浆加到检定片10上，使之展开，用反射分光光度计测定相对于各hCG浓度的血浆的检定片10上的抗体固定化部位5的显色状况。用反射分光光度计测定520nm波长的吸光度，代入预先制成的hCG浓度与吸光度关系的校准曲线。其结果示于图7。本来，例如含1000U/l hCG的血浆加到各检定片10上，测定各检定片10的显色区域的吸光度，将其代入校准曲线求hCG浓度，其值理应皆为1000U/l，但实际上根据各检定片10上的反应状态代入校准曲线所得的值比1000U/l稍有偏离。就是说，按照其偏离的大小，即能了解各检定片10的测定的正确性。

图7示出，用上述方法制得的免疫色谱检定片的定量性能：(a)为不用表面活性剂处理反应层的场合，(b)为用表面活性剂处理的场合。横轴表示向检定片10添加的试样的hCG浓度，纵轴表示将检定片10上的显色区域的标识物的吸光度代入校准曲线求出的抗原浓度的换算值。

下面就上述免疫色谱检定片10，不用表面活性剂处理反应层4，和用表面活性剂处理两者的效果进行说明。此处所示的用表面活性剂处理的反应层是指：实施例1中用Tris-HCl缓冲液两次洗净后，在含0.05％蔗糖单月桂酸酯的Tris-HCl缓冲液中浸渍，平稳摇动10分钟后室温放置干燥的反应层；所谓的未处理的反应层是指用Tris-HCl缓冲液两次洗净后室温放置干燥的反应层。

图7表示，以向免疫色谱检定片10添加液体试样5分钟后的显色程度的测定值为基础，换算成分析对象浓度的结果。此时所用的标识试剂，图7(a)、(b)都是同样的抗体-胶态金复合体。首先，与用表面活性剂处理反应层4的场合(图7(b))的CV值(偏差系数)为0-7％相比，不用表面活性剂处理反应层的场合(图7(a))的CV值为15-35％，显示很大的偏离，可见其定量性能差。从以上结果可知，就上述免疫色谱检定片10而言，采用经表面活性剂浸渍处理的反应层，在提高定量性能上起了重大作用。本实施例中就定量性能进行了比较说明，而就定性检测而言，采用具有经表面活性剂浸渍处理的反应层的色谱检定片，也能获得更加正确的测定结果。

还有，本实施例中由于把胶态金用作标识物，所以测定520nm波长下的显色程度，只要是标识物所具有的吸收波长，则在什么样的波长下测吸光度都可以。

工业生产上利用的可能性

本发明的色谱检定片及其制造方法，对于实现色谱检定片反应层渗透速度和渗透性的提高、渗透性的均匀化以及色谱检定片测定性能的提高都是极为有用的。

Claims (9)

1.一种色谱检定片，其特征在于，它是用可湿性多孔材料多层层合而成或由单层多孔材料构成的，至少一种色谱分析用的反应成分被固定的反应层含有蔗糖单月桂酸酯或正辛基-β-D-硫葡糖苷。

2.按照权利要求1的色谱检定片，其特征在于，上述反应层作为整体，全部含有所述表面活性剂。

3.按照权利要求1的色谱检定片，其特征在于，上述反应层的一部分含有所述表面活性剂。

4.具有至少一种色谱分析用反应成分被固定的反应层的色谱检定片制造方法，其特征在于，该方法包括：蔗糖单月桂酸酯或正辛基-β-D-硫葡糖苷溶解得到的表面活性剂溶液浸渍或涂布所述色谱检定片反应层的工序，和使浸渍或涂布在所述反应层上的表面活性剂溶液干燥的工序。

5.按照权利要求4的色谱检定片制造方法，其特征在于，上述反应层的干燥是通过自然干燥进行的。

6.按照权利要求4的色谱检定片制造方法，其特征在于，上述反应层的干燥是通过通风干燥进行的。

7.按照权利要求4的色谱检定片制造方法，其特征在于，上述反应层的干燥是通过冷冻干燥进行的。

8.按照权利要求4～7任一项的色谱检定片制造方法，其特征在于用上述表面活性剂溶液浸渍或涂布所述反应层的全部。

9.按照权利要求4～7任一项的色谱检定片制造方法，其特征在于用上述表面活性剂溶液浸渍或涂布所述反应层的一部分。

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