[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN118909867A - 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法 - Google Patents

一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118909867A
CN118909867A CN202411138818.XA CN202411138818A CN118909867A CN 118909867 A CN118909867 A CN 118909867A CN 202411138818 A CN202411138818 A CN 202411138818A CN 118909867 A CN118909867 A CN 118909867A
Authority
CN
China
Prior art keywords
component
culture medium
parts
culture
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411138818.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李应伟
白和超
周晓舟
唐浩
蔡峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Original Assignee
CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD filed Critical CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority to CN202411138818.XA priority Critical patent/CN118909867A/zh
Publication of CN118909867A publication Critical patent/CN118909867A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种百日咳杆菌的无动物源性培养基，它主要由质量比19.65～48.6：0.077～0.281的组分A和组分B组成。将百日咳杆菌的无动物源性培养基与特定菌种制备工艺和发酵培养工艺相结合，能使百日咳杆菌在培养过程中生长速率和最高菌浓度较高，抗原表达量也高。

Description

一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法
技术领域
本发明具体涉及一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法。
背景技术
百日咳是由百日咳杆菌(Bordetella pertussis，Bp)感染引起，在各个年龄段均可发病，人是该菌的唯一宿主，具有高度传染性。我国自1978年实施百日咳疫苗计划免疫以来，百日咳的年发病率从20世纪六七十年代的100/10万～200/10万降至2018年的0.5/10万以下。近年，百日咳发病率逐渐上升,且病例分布向青少年和成人转移，出现“百日咳重现”。
目前，国内百日咳疫苗生产企业普遍采用共纯化工艺，即在提取过程中同时提取并纯化百日咳毒素(pertusssis toxin，PT)和丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)两种抗原成分。这种工艺的优势在于能够一次性获得所需的抗原，并且通过梯度离心等技术手段提高纯度和收获率。然而，共纯化工艺也存在一些问题，例如批次间抗原比例可能不稳定，这导致了产品质量的一致性问题。欧美等发达国家采用了最新一代分组分纯化工艺，即通过柱层析分别制备抗原PT和FHA，这使得疫苗配制时能够定量加入各种百日咳抗原成分，疫苗中的抗原成分比例恒定，因此，该工艺制备的百日咳疫苗具有副作用更小，安全性更高，批间一致性更好的特点。这也是目前国内疫苗企业正在发展的新一代百日咳疫苗制备工艺，同时该工艺的发展也能为青少年和成人百日咳疫苗的研制奠定基础。但是，由于分组分纯化工艺复杂，抗原收率低等原因，导致以该工艺生产的百日咳疫苗生产成本较高。为了提高组分百日咳疫苗规模化生产的效率，降低其生产成本，首先需要提高百日咳杆菌培养阶段的生产效率，提高发酵罐培养阶段的抗原PT和FHA表达水平。
百日咳杆菌为专性需氧菌，体积较小(0.2～0.5um×0.5～1.5um)，生长过程中存在糖酵解功能障碍，通常只能利用氨基酸作为碳源、氮源和能量来源，细菌生长的营养要求较高，易受环境影响发生相变异和基因调控，导致PT表达低或不表达。目前百日咳疫苗生产厂家一般通过将百日咳杆菌接种到含羊血的包姜氏培养基或活性炭半综合培养基(含牛源的酸水解酪蛋白)进行菌种复苏和菌种扩增，扩增后菌种通过接种到液体SS培养基及其改良培养基中培养表达抗原PT和FHA，这一工艺培养时，细菌生长效率较低，下罐菌浓不高(OD550一般在5.0～6.0)，所表达的抗原水平较低(PT：1～5ug/ml发酵液)。另外，抗原FHA为丝状结构(宽2nm，长45-50nm)，在培养过程中极易受物理剪切力破坏，比如培养过程中气泡破裂和搅拌桨叶产生的物理剪切力等，均可导致其降解。因此，百日咳杆菌的培养和抗原的发酵罐制备阶段实现高表达均存在较高难度。
发明内容
本发明目的在于提供一种百日咳杆菌的无动物源性培养基，以及利用该培养基支持抗原高效表达的发酵罐培养方法，以提高发酵罐制备阶段百日咳杆菌的高菌浓度，和抗原高表达。
本发明提供了一种百日咳杆菌的无动物源性培养基，它主要由组分A和组分B组成；
所述组分A是由如下重量份的原料组成：
组分A：谷氨酸钠10.0～20.0份，脯氨酸0.1～0.6份，NaCl 2～7份，KH2PO40.4～1.2份，KCl 0.1～0.5份，MgCl2·6H2O 0.05～0.3份，Tris 6.0～10.0份，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0～2.0份，酵母胨0～7.0份；
所述组分B是由如下重量份的原料组成：
半胱氨酸盐酸盐0.01～0.05份，还原谷胱甘肽0.05～0.15份，FeSO4.7H2O0.005～0.025份，抗坏血酸0.01～0.05份，烟酸0.002～0.006份；
所述组分A和组分B的质量比19.65～48.6：0.077～0.281。
进一步地，所述组分A是由如下重量份的原料组成：
谷氨酸钠12.0份，脯氨酸0.3份，NaCl 2.5份，KH2PO4 0.6份，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O 0.25份，Tris 6.1份，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0份，酵母胨5.0份；
所述组分B是由如下重量份的原料组成：
半胱氨酸盐酸盐0.04份，还原谷胱甘肽0.1份，FeSO4.7H2O 0.015份，抗坏血酸0.02份，烟酸0.004份；
所述组分A和组分B的质量比27.95：0.179。
更进一步地，它还包括组分C；所述组分C是10.0～20.0份琼脂粉，优选15.0份琼脂粉；所述组分C与组分A和组分B的质量比为10.0～20.0：19.65～48.6：0.077～0.281，优选15.0：27.95：0.179。
更进一步地，所述脯氨酸为L-脯氨酸；所述半胱氨酸盐酸盐为L-半胱氨酸盐酸盐；所述抗坏血酸为L-抗坏血酸。
本发明还提供了一种前述的培养基在发酵培养百日咳杆菌中的用途。
本发明还提供了一种百日咳杆菌的发酵培养方法，它包括如下步骤：
1)取百日咳杆菌菌种接种于固体培养基上培养48～72h，用水洗下菌苔，接种于液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，培养至OD550达到4～6，取菌液再接种于液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，通气搅拌培养至OD550达到4～6，得发酵用菌种；
2)取步骤1)所得发酵用菌种，接种到装有液体培养基的发酵罐中，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方通气并搅拌培养，期间控制DO在30％～50％，pH值7.2～7.6，细菌停止生长，即可；
所述固体培养基是前述培养基加水溶解除菌制成；
所述液体培养基是前述培养基加水溶解除菌制成。
进一步地，所述固体培养基的制备方法为：
取组分A和组分C混匀，加38～40℃注射用水溶解，调pH至7.1～7.3，高压灭菌，冷却至40～50℃得A液；取组分B，加38～40℃注射用水溶解，过滤得B液；A液和B液混匀，凝固即得；
所述液体培养基的制备方法为：
取组分A和组分B混合，加38～40℃注射用水溶解，调pH至7.1～7.3，过滤即得。
进一步地，步骤1)所述培养的温度为35～37℃。
进一步地，步骤2)所述pH值用酸调节。
进一步地，所述酸为盐酸溶液或乳酸溶液。
本发明在Stainer-Scholte液体培养基(SS培养基)的基础上，通过加入特定的无动物源性蛋白胨——酵母胨，并相应调整其他成分用量配比，使百日咳杆菌培养过程中生长速率和最高菌浓度较高，抗原表达量也高。以其发酵得到的上清液作为疫苗制备的原料，由于不含有动物源成分，安全性高，同时由于抗原表达量高为百日咳分组分纯化工艺奠定了基础。
将本发明培养基用于百日咳杆菌发酵用菌种制备，在一代固体培养和多代液体培养扩增的模式下，极大提高了菌种的制备效率，使制备周期由传统的7～9天缩短到5～6天，同时由于菌种液体培养阶段更加容易检测和控制细菌的浓度，所以极大提高了菌种制备过程的过程控制能力，使发酵用菌种批间一致性更好；在发酵罐培养阶段通过优化培养过程的通气模式、溶氧水平控制和pH控制方式等，使本发明培养基对支持细菌生长和抗原表达的能力都得到充分发挥，奠定了组分百日咳疫苗将来具备菌种制备工艺和发酵工艺等几方面的开发的基础，极大了提高了菌种制备效率和抗原表达水平。组分百日咳疫苗将来具备规模化量产的能力，也将有利于企业降本增效，具备实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1不同种类蛋白胨加入SS培养基中对抗原PT表达的影响；
图2不同稀释倍数的百日咳杆菌在不同盐浓度的PP1SM平板培养基上的生长情况(a.百日咳杆菌菌液103×稀释接种PP1SM固体培养基；b.百日咳杆菌菌液103×稀释接种低盐PP1SM固体培养基；c.百日咳杆菌菌液107×稀释接种PP1SM固体培养基；d.百日咳杆菌菌液107×稀释接种低盐PP1SM固体培养基)；
图3细菌生长曲线。
具体实施方式
实施例1本发明百日咳杆菌的液体培养基制备
1L培养基配方：
组分A：谷氨酸钠12.0g，L-脯氨酸0.3g，NaCl 2.5g，KH2PO4 0.6g，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O 0.25g，Tris 6.1g，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0g，酵母胨5.0g；
组分B：L-半胱氨酸盐酸盐0.04g，还原谷胱甘肽0.1g，FeSO4.7H2O0.015g，L-抗坏血酸0.02g，烟酸0.004g；
制备方法：取组分A和组分B混合，加800ml，38～40℃注射用水溶解混匀后，用盐酸溶液调pH至7.1～7.3，然后用38～40℃的注射用水定容到1L，最后过滤除菌即得。
实施例2本发明百日咳杆菌的固体培养基制备
1L固体培养基配方：
组分A：谷氨酸钠12.0g，L-脯氨酸0.3g，NaCl 2.5g，KH2PO4 0.6g，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O 0.25g，Tris 6.1g，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0g，酵母胨5.0g；
组分B：L-半胱氨酸盐酸盐0.04g，还原谷胱甘肽0.1g，FeSO4.7H2O0.015g，L-抗坏血酸0.02g，烟酸0.004g；
组分C：琼脂粉15.0g。
制备方法：
1)取组分A和组分C混匀，加700ml，38～40℃注射用水混匀后，用盐酸溶液调pH至7.1～7.3，然后用38～40℃的注射用水定容到900ml，最后121℃高压灭菌30min，即得A液；
2)取组分B，加100ml，38～40℃注射用水溶解混匀，过滤得B液；
3)取步骤1)所得A液冷却至40～50℃，加入步骤2)所得B液混匀，分装到平皿，凝固即得。
实施例3本发明百日咳杆菌的发酵培养
1)取百日咳杆菌冻干菌种接种于实施例2所得固体培养基上，在35～37℃培养48～72h，用无菌水洗下菌苔，接种于实施例1所得液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃培养至OD550达到4～6，取菌液再传代接种于实施例1所得液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃通气搅拌培养至OD550达到4～6，得发酵用菌种。
2)取步骤1)所得菌液接种到发酵罐，发酵罐中培养基配方为实施例1所得液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方通气，并搅拌培养，培养过程控制发酵液中的溶解氧(Dissolved Oxygen，DO)在30％～50％，用盐酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
实施例4本发明百日咳杆菌的发酵培养
1)取百日咳杆菌冻干菌种接种于实施例2所得固体培养基上，在35～37℃培养48～72h，用水洗下菌苔，接种于实施例1所得液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃培养至OD550达到4～6，取菌液再接种于实施例1所得液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃通气搅拌培养至OD550达到4～6，得发酵用菌种。
2)取步骤1)所得菌液接种到发酵罐，发酵罐中培养基配方为实施例1所得液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方通气，并搅拌培养，培养过程控制DO在30％～50％，用乳酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1组分无细胞百日咳疫苗的无动物源性培养基和培养工艺开发一、无动物源性培养基研究
1、培养基中无动物源性蛋白胨筛选
在前期实验的基础上，以SS培养基(每升培养基配方为：谷氨酸钠10.7g，L-脯氨酸0.24g，NaCl 2.5g，KH2PO4 0.5g，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O 0.1g，CaCl2 0.02g，Tris 6.1g，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.04g，还原谷胱甘肽0.1g，FeSO4.7H2O0.01g，L-抗坏血酸0.02g，烟酸0.004g)为基础培养基，对十多种不同来源的无动物源性蛋白胨通过摇瓶培养实验进行筛选，结果见图1。
从图1可见，用含有酵母胨的SS培养基发酵培养百日咳杆菌，培养上清液中PT表达量高达12μg/ml菌液以上，显著高于了含有其他无动物源性蛋白胨的SS培养基，因此，确定了酵母胨用于百日咳杆菌培养用培养基配方的开发。
2.百日咳杆菌培养用培养基配方开发
以添加了酵母胨的SS培养基为基础，通过DOE(均匀试验设计)对培养基中的8个培养基成分，分别设计了6个试验水平，安排12组试验，通过摇瓶实验对百日咳杆菌培养用培养基配方进行筛选，具体见表1。
L-半胱氨酸盐酸盐0.04g，还原谷胱甘肽0.1g，FeSO4.7H2O 0.015g，L-抗坏血酸0.02g，烟酸0.004g，酵母胨5.0g，用800ml 38～40℃注射用水溶解混匀后，用盐酸溶液调pH到7.1-7.3，然后用38～40℃注射用水定容到1000ml，最后过滤除菌。对于百日咳杆菌发酵培养最有利，能获得OD550>7的菌体浓度，抗原PT和FHA表达均高于20μg/ml发酵液，因此，将其作为用于百日咳杆菌培养用培养基进一步优化的基础，该培养基配方命名为PP1SM培养基。
3.培养基中盐浓度考察
通过在PP1SM培养基中加入1.5％琼脂粉制备成固体培养基，同时对配方中的NaCl浓度进行调整(浓度分别为7.0g/L和2.5g/L)，考察PP1SM培养基中的NaCl浓度对百日咳杆菌生长的影响，即菌落的颜色、形态、光泽度和形成单菌落数量等的影响。固体培养基的制备方法为：
1)取谷氨酸钠，L-脯氨酸，NaCl，KH2PO4，KCl，MgCl2·6H2O，Tris，2,6-二-O-甲基-β-环糊精、酵母胨和琼脂粉，加38～40℃注射用水混匀后，用盐酸溶液调pH至7.1～7.3，然后用38～40℃的注射用水定容，最后121℃高压灭菌30min，即得A液；
2)取L-半胱氨酸盐酸盐，还原谷胱甘肽，FeSO4.7H2O，L-抗坏血酸和烟酸，加38～40℃注射用水溶解混匀，过滤得B液；
3)取步骤1)所得A液冷却至40～50℃，加入步骤2)所得B液混匀，分装到平皿，凝固即得。
结果见图2，从图2可见：两组培养基培养形成的菌落均为细小灰白色露珠状菌落，边缘整齐，有光泽，半透明，均符合百日咳菌落的特征。当NaCl浓度为7.0g/L时菌落形成数量较少，不利于百日咳杆菌的生长，降低NaCl浓度到2.5g/L菌落形成数量明显增加，更有利于百日咳杆菌的生长。
4.培养基中盐浓度和缓冲体系浓度对抗原表达的影响
在四联平行罐上，对PP1SM培养基中的NaCl浓度和Tris浓度进行考察，生长曲线见图3，最高菌浓(OD550)和抗原表达水平结果见表2。
表2不同NaCl浓度和Tris浓度对百日咳杆菌发酵培养的影响
从图3可见，第一组和第四组平行罐细菌生长速率更快，从表2可见：第四组平行罐中菌浓度(OD550)和PT抗原表达均较高。结合“3.培养基中盐浓度考察”中，当NaCl浓度为2.5g/L时更有利于细菌在PP1SM平板培养基上生长。因此，选用第四组培养基配方用于百日咳杆菌的发酵罐培养和菌种培养，将其命名为mPP1SM液体培养基，即每升培养基配方和配制方法为：谷氨酸钠12.0g，L-脯氨酸0.3g，NaCl 2.5g，KH2PO4 0.6g，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O0.25g，Tris 6.1g，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.04g，还原谷胱甘肽0.1g，FeSO4.7H2O 0.015g，L-抗坏血酸0.02g，烟酸0.004g，酵母胨5.0g，用800ml 38～40℃注射用水溶解混匀后，用盐酸溶液调pH到7.1-7.3，然后用38～40℃注射用水定容到1000ml，最后过滤除菌即为mPP1SM液体培养基。
二、百日咳杆菌发酵培养工艺研究
1.方法
1.1发酵用菌种制备工艺
一代菌种培养(菌种复苏)：将I相百日咳鲍特氏菌CS株(CMCC 58003)的冻干菌种接种于mPP1SM固体培养基(前述mPP1SM液体培养基中加入1.5％琼脂粉)上，置35～37℃孵箱中恒温培养48～72h用于传代；
二代菌种培养：将一代菌苔洗下，接种到mPP1SM液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃恒温振荡培养15～20h，OD550达到4～6用于传代；
三代菌种培养：将二代菌种接种到mPP1SM液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，35～37℃通气搅拌培养15～24h，OD550达到4～6用于接种发酵罐。
1.2.发酵罐培养工艺研究
发酵罐培养1：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程模拟摇瓶和传统发酵罐培养工艺，对DO不进行控制，全程不改变搅拌速度和通气量，用盐酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养2：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，罐底深层通气搅拌培养，培养过程控制DO在80％～100％，用盐酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养3：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程控制DO在80％～100％，用盐酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养4：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程控制DO在30％～50％，用盐酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养5：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程控制DO在30％～50％，全程不调控pH，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养6：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程控制DO在30％～50％，用乳酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
发酵罐培养7：将三代菌种接种到发酵罐，发酵罐中培养基为mPP1SM液体培养基，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方表层通气搅拌培养，培养过程控制DO在30％～50％，用磷酸溶液控制pH在7.2～7.6，细菌生长停止结束发酵培养。
1.3发酵菌液测试
菌液中的细菌浓度通过分光光度计进行检测，测量波长在550nm下的光密度，即OD550值，当菌液光密度值大于0.8时，需要将菌液进行稀释到光密度在0.2∽0.8之间进行检测，测定光密度值与稀释倍数的乘积即为所测菌液的OD550值。
培养上清中的抗原PT和FHA表达量分别通过ELISA法进行定量检测，具体方法：包被液分别稀释PT或FHA单抗后加入酶标板进行酶标板包被；加封闭液封闭酶标板；菌液离心上清稀释后加入酶标板；酶标板中分别加入用辣根过氧化物酶标记的PT或FHA单抗；加入TMB显色液显色；加入硫酸溶液终止显色；在双波长为450nm/630nm测定OD值；最后通过PT或FHA标准品绘制的标准曲线对菌液中的PT和FHA含量进行计算，同时设置PT或FHA阳性质控，控制回收率在90-110％范围。
2、结果
菌液测试结果具体见表3。
表3不同发酵培养工艺的菌液中细菌浓度和抗原表达水平
注：[1]杨勇,吴永超,张飞伟等.培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素及丝状血凝素表达的影响[J].中国生物制品学杂志，2021，34(7)：816-823.
从表3结果可见：使用mPP1SM培养基，可在5-6d就能获得发酵用菌种，结合发酵培养工艺4和6，细菌的生长速率更快，最高菌浓更高，OD550达到11～14，抗原PT和FHA表达水平大幅提高，PT达到22～25ug/ml发酵液，FHA达到50v80ug/ml发酵液。
综上，本发明在Stainer-Scholte液体培养基(SS培养基)的基础上，通过加入特定的无动物源性蛋白胨，并相应调整其他成分用量配比，使百日咳杆菌培养过程中生长速率和最高菌浓度较高，抗原表达量也高。以其发酵得到的上清液作为疫苗制备的原料，由于不含有动物源成分，安全性高，同时由于抗原表达量高为百日咳分组分纯化工艺奠定了基础。

Claims (10)

1.一种百日咳杆菌的无动物源性培养基，其特征在于：它主要由组分A和组分B组成；
所述组分A是由如下重量份的原料组成：
组分A：谷氨酸钠10.0～20.0份，脯氨酸0.1～0.6份，NaCl 2～7份，KH2PO40.4～1.2份，KCl 0.1～0.5份，MgCl2·6H2O 0.05～0.3份，Tris 6～10份，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0～2.0份，酵母胨0～7.0份；
所述组分B是由如下重量份的原料组成：
半胱氨酸盐酸盐0.01～0.05份，还原谷胱甘肽0.05～0.15份，FeSO4 .7H2O0.005～0.025份，抗坏血酸0.01～0.05份，烟酸0.002～0.006份；
所述组分A和组分B的质量比19.65～48.6：0.077～0.281。
2.根据权利要求1所述的无动物源性培养基，其特征在于：所述组分A是由如下重量份的原料组成：
谷氨酸钠12.0份，脯氨酸0.3份，NaCl 2.5份，KH2PO4 0.6份，KCl 0.2g，MgCl2·6H2O0.25份，Tris 6.1份，2,6-二-O-甲基-β-环糊精1.0份，酵母胨5.0份；
所述组分B是由如下重量份的原料组成：
半胱氨酸盐酸盐0.04份，还原谷胱甘肽0.1份，FeSO4 .7H2O 0.015份，抗坏血酸0.02份，烟酸0.004份；
所述组分A和组分B的质量比27.95：0.179。
3.根据权利要求1或2所述的无动物源性培养基，其特征在于：它还包括组分C；所述组分C是10.0～20.0份琼脂粉，优选15.0份琼脂粉；
所述组分C与组分A和组分B的质量比为10.0～20.0：19.65～48.6：0.077～0.281，优选15.0：27.95：0.179。
4.根据权利要求1或2所述的无动物源性培养基，其特征在于：所述脯氨酸为L-脯氨酸；所述半胱氨酸盐酸盐为L-半胱氨酸盐酸盐；所述抗坏血酸为L-抗坏血酸。
5.权利要求1～4任一项所述的无动物源性培养基在发酵培养百日咳杆菌中的用途。
6.一种百日咳杆菌的发酵培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取百日咳杆菌菌种接种于固体培养基上培养48～72h，用水洗下菌苔，接种于液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，培养至OD550达到4～6，取菌液再接种于液体培养基中，起始OD550控制在0.1～0.2，通气搅拌培养至OD550达到4～6，得发酵用菌种；
2)取步骤1)所得发酵用菌种，接种到装有液体培养基的发酵罐中，起始OD550控制在0.1～0.2，液面上方通气并搅拌培养，期间控制DO在30％～50％，pH值7.2～7.6，细菌停止生长，即可；
所述固体培养基是权利要求3所述培养基加水溶解制成；
所述液体培养基是权利要求1或2所述培养基加水溶解制成。
7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于：所述固体培养基的制备方法为：
取组分A和组分C混匀，加38～40℃注射用水溶解，调pH至7.1～7.3，高压灭菌，冷却至40～50℃得A液；取组分B，加38～40℃注射用水溶解，过滤得B液；A液和B液混匀，凝固即得；
所述液体培养基的制备方法为：
取组分A和组分B混合，加38～40℃注射用水溶解，调pH至7.1～7.3，过滤即得。
8.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于：步骤1)所述培养的温度为35～37℃。
9.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于：步骤2)所述pH值用酸调节。
10.根据权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于：所述酸为盐酸溶液或乳酸溶液。
CN202411138818.XA 2024-08-19 2024-08-19 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法 Pending CN118909867A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411138818.XA CN118909867A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411138818.XA CN118909867A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118909867A true CN118909867A (zh) 2024-11-08

Family

ID=93300913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411138818.XA Pending CN118909867A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118909867A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080248542A1 (en) Clostridium difficile culture and toxin production methods
CN112342151B (zh) 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法
JP2022024051A (ja) 微生物の改善された発酵プロセス
CN109536413B (zh) 寡养单胞菌hy-2及其在降解有机物中的应用
JP6582020B2 (ja) 発酵方法
CN112359002A (zh) 一株小白链霉菌及其在生产ε-聚赖氨酸中的应用
CN102952834B (zh) 利用胶质类芽孢杆菌生产微生物多糖发酵液的方法
US5338670A (en) Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
CN118909867A (zh) 一种百日咳杆菌的无动物源性培养基及发酵培养的方法
CN103122324A (zh) 鸡大肠杆菌培养方法
CN109554321B (zh) 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用
CN109355221B (zh) 一种用于高密度发酵制备霍乱弧菌菌影的培养基和方法
CN102793915A (zh) 一种无细胞百日咳疫苗的生产方法
CN113174342A (zh) 高效降解氨基甲酸乙酯的菌株及其应用
CN113337417A (zh) 一种高效降解氨基甲酸乙酯的农杆菌及其应用
CN103146787A (zh) 一种制备重组人干扰素α2b的发酵培养基及发酵方法
CN108865941B (zh) 一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法
EP3768821A1 (en) Methods of cultivating bordetella species
RU2803269C1 (ru) Питательная среда для культивирования пастерелл в промышленных биореакторах
CN117256728B (zh) 一种凹凸棒石表面活性素及其制备和应用
CN117821342B (zh) 一种14型肺炎链球菌的发酵方法
CN113785046A (zh) 发酵法
CN107603905A (zh) 禽鼻气管鸟疫杆菌a/b型菌株高密度发酵培养基及其应用
CN115058474A (zh) 一种提高crm197蛋白产量的发酵培养方法
CN107118994B (zh) 一种调控酪酸菌发酵效率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication